一種禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種禽流感病毒檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]禽流感是由禽流感病毒引起的一種禽類(lèi)急性傳染病，同時(shí)某些亞型禽流感病毒也能感染人類(lèi)。禽流感病毒根據(jù)其表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原關(guān)系差異，可將其分為16種HA亞型和9種NA亞型。根據(jù)其致病性可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感，高致病性禽流感包括H5和H7亞型。特別是近年來(lái)頻繁爆發(fā)的H5亞型禽流感疫情給許多國(guó)家和地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)帶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前，檢測(cè)禽流感病毒的方法主要有:熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸、ELISA方法檢測(cè)病毒顆粒或者抗病毒抗體、膠體金檢測(cè)試劑、血凝抑制(HI)試驗(yàn)檢測(cè)抗血凝素(HA)抗體、瓊脂免疫擴(kuò)散(AGP)試驗(yàn)檢測(cè)抗核蛋白的抗體、病毒中和、補(bǔ)體結(jié)合、神經(jīng)氨酸酶抑制和單輻射溶血等方法。每種方法都有一定的缺陷，如熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)雖然最靈敏，但成本高，操作要求復(fù)雜，不容易推廣。膠體金檢測(cè)試劑存在敏感度低等缺點(diǎn)。AGP、HI和病毒中和等結(jié)果準(zhǔn)確，但都需要制備純化、濃縮完整的病毒作為檢測(cè)抗原，而禽流感病毒是高致病性病毒，需在P3實(shí)驗(yàn)室完成(生物安全防護(hù)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室)，不易生產(chǎn)、純化、成本較高，且存在感染性和容易散毒，在應(yīng)用中存在很大的局限性。此外機(jī)體感染禽流感病毒，第10天后開(kāi)始出現(xiàn)保護(hù)性抗體，檢測(cè)抗體不能達(dá)到早期檢出病毒的目的。
[0004]因此，需要制備出一種制備簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，檢測(cè)靈敏度高的禽流感檢測(cè)試劑合
ΙΤΓΤ.0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，能夠簡(jiǎn)單快速檢測(cè)出禽流感病毒。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的檢測(cè)探針、斑點(diǎn)金免疫集中滲濾裝置，所述的集中滲濾裝置由塑料小盒、點(diǎn)加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜和吸水墊三部分組成，所述塑料小盒的盒蓋中央有邊長(zhǎng)約0.6?1.0cm的正方形孔，盒底部有一位置與盒蓋上的方孔對(duì)應(yīng)的方形凹槽，大小與盒蓋上的方孔一樣大;吸水墊放置于盒的凹槽處，硝酸纖維素膜放在吸水墊與盒蓋之間，吸水墊的面積比硝酸纖維素膜小1/3到1/2。
[0007]所述點(diǎn)加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜采用如下方法制備得到:
[0008](I)禽流感病毒培養(yǎng):將禽流感病毒接種于10?12日齡的雞胚尿囊腔中，用石蠟封存后37°C孵育繁殖40h，再將雞胚置于0°C環(huán)境中1h，待紅血球凝固，取出，收獲尿囊液，SP得到禽流感病毒；
[0009](2)抗原提取與分離:將所得到的禽流感病毒溶于PBS緩沖液中，38?40°C，保溫20min，再按1:1的體積比加入弗氏佐劑，超聲處理lOmin，超聲頻率為12.8?24.6MHz;再用DEAE-葡聚糖凝膠作為交換劑，采用離子交換法進(jìn)行分離，得到禽流感病毒囊膜抗原；
[0010](3)抗原濃縮:將步驟(2)制備的禽流感病毒囊膜抗原冷卻成固體，緩慢溶解，不含抗原的純冰晶浮于液面，抗原則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，再次用稀釋液調(diào)節(jié)濃度至I.23?I.35yg/mL，即得抗原濃縮液，-10?-5°C保存；
[0011](4)抗原包被硝酸纖維素膜:將硝酸纖維素膜上放入調(diào)節(jié)好濃度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，靜置40?60min，待硝酸纖維素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于_15?-5°C低溫保存。
[0012]進(jìn)一步地，所述的禽流感病毒囊膜抗原濃度為1.75?1.85yg/mL。
[0013]進(jìn)一步地，所述的用于浸泡檢測(cè)探針的納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的濃度為0.82?0.86yg/mLo
[0014]進(jìn)一步地，所述的納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的檢測(cè)探針的制備方法為:先用王水浸泡容器，再經(jīng)超純水沖洗，烘干，加入氯金酸溶液，加熱至沸騰，迅速加入還原劑，繼續(xù)攪拌加熱至形成酒紅色溶液，攪拌冷卻，得到納米金溶液;將納米金溶液用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)其pH至8.0，將兔抗雞IgY抗體稀釋至0.80?0.90mg/ml，15000印111、4°(3條件下離心30111；[11，得上清液，迅速滴加到納米金溶液中，攪拌均勻，再按10:1的體積比加入聚乙二醇20000，再按1:1的體積比加入封閉液，室溫繼續(xù)孵育30?35min，15000rpm，4°C條件下離心30min，去除上清液，稀釋液重懸沉淀并洗滌一次，得到納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的檢測(cè)探針。
[0015]更進(jìn)一步地，所述的還原劑為檸檬酸和檸檬酸鈉的按1:9的混合液。
[0016]本發(fā)明的原理是:應(yīng)用斑點(diǎn)金免疫滲集中濾法進(jìn)行檢測(cè)，以硝酸纖維素膜為載體，在包被了抗原的滲濾裝置中，依次滴加待測(cè)標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因吸水墊置于硝酸纖維素膜底部，故待測(cè)標(biāo)本流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原快速結(jié)合，再與金標(biāo)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，吸水墊的面積相對(duì)硝酸纖維素膜較小，可以使發(fā)生反應(yīng)的抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物集中向中間部位聚集，并起到濃縮作用，進(jìn)一步增強(qiáng)顯色效果，達(dá)到快速檢測(cè)目的，陽(yáng)性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用禽流感病毒的囊膜具備抗原特性為基礎(chǔ)，制出禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜，再以納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體作為檢測(cè)探針，應(yīng)用斑點(diǎn)金免疫滲集中濾法進(jìn)行檢測(cè)，以硝酸纖維素膜為載體，在包被了抗原的滲濾裝置中，依次滴加待測(cè)標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因吸水墊置于硝酸纖維素膜底部，故待測(cè)標(biāo)本流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原快速結(jié)合，再與金標(biāo)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，吸水墊的面積相對(duì)硝酸纖維素膜較小，可以使發(fā)生反應(yīng)的抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物集中向中間部位聚集，并起到濃縮作用，進(jìn)一步增強(qiáng)顯色效果，達(dá)到快速檢測(cè)目的，陽(yáng)性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，靈敏度高，且整個(gè)檢測(cè)試劑盒制備簡(jiǎn)單，成本低。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1:
[0019]—種禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的檢測(cè)探針、斑點(diǎn)金免疫集中滲濾裝置，所述的集中滲濾裝置由塑料小盒、點(diǎn)加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜和吸水墊三部分組成，所述塑料小盒的盒蓋中央有邊長(zhǎng)約
0.6cm的正方形孔，盒底部有一位置與盒蓋上的方孔對(duì)應(yīng)的方形凹槽，大小與盒蓋上的方孔一樣大;吸水墊放置于盒的凹槽處，硝酸纖維素膜放在吸水墊與盒蓋之間，吸水墊的面積比硝酸纖維素膜小1/3;所述的禽流感病毒囊膜抗原濃度為1.75yg/mL;所述的用于浸泡檢測(cè)探針的納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的濃度為0.82yg/mLo
[0020]所述點(diǎn)加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜采用如下方法制備得到:
[0021](I)禽流感病毒培養(yǎng):將禽流感病毒接種于10日齡的雞胚尿囊腔中，用石蠟封存后37°C孵育繁殖40h，再將雞胚置于0°C環(huán)境中10h，待紅血球凝固，取出，收獲尿囊液，即得到禽流感病毒；
[0022](2)抗原提取與分離:將所得到的禽流感病毒溶于PBS緩沖液中，38°C，保溫20min，再按1:1的體積比加入弗氏佐劑，超聲處理lOmin，超聲頻率為12.8MHz;再用DEAE-葡聚糖凝膠作為交換劑，采用離子交換法進(jìn)行分離，得到禽流感病毒囊膜抗原；
[0023](3)抗原濃縮:將步驟(2)制備的禽流感病毒囊膜抗原冷卻成固體，緩慢溶解，不含抗原的純冰晶浮于液面，抗原則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，再次用稀釋液調(diào)節(jié)濃度至1.23yg/mL，即得抗原濃縮液，_10°C保存；
[0024](4)抗原包被硝酸纖維素膜:將硝酸纖維素膜上放入調(diào)節(jié)好濃度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，靜置40min，待硝酸纖維素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-15°C低溫保存。
[0025]所述的納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的檢測(cè)探針的制備方法為:先用王水浸泡容器，再經(jīng)超純水沖洗，烘干，加入氯金酸溶液，加熱至沸騰，迅速加入還原劑，所述的還原劑為檸檬酸和檸檬酸鈉的按1:9的混合液。繼續(xù)攪拌加熱至形成酒紅色溶液，攪拌冷卻，得到納米金溶液;將納米金溶液用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)其PH至8.0，將兔抗雞IgY抗體稀釋至0.80mg/ml，15000rpm、4°C條件下離心30min，得上清液，迅速滴加到納米金溶液中，攪拌均勾，再按10:1的體積比加入聚乙二醇2 O O O O，再按1:1的體積比加入封閉液，室溫繼續(xù)孵育3 O m i η，15000rpm，4°C條件下離心30min，去除上清液，稀釋液重懸沉淀并洗滌一次，得到納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的檢測(cè)探針。
[0026]檢測(cè)方法為:用斑點(diǎn)金免疫滲集中濾法進(jìn)行檢測(cè)，以硝酸纖維素膜為載體，在包被了抗原的滲濾裝置中，依次滴加待測(cè)標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因吸水墊置于硝酸纖維素膜底部，故待測(cè)標(biāo)本流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原快速結(jié)合，再與金標(biāo)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，吸水墊的面積相對(duì)硝酸纖維素膜較小，可以使發(fā)生反應(yīng)的抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物集中向中間部位聚集，并起到濃縮作用，進(jìn)一步增強(qiáng)顯色效果，達(dá)到快速檢測(cè)目的，陽(yáng)性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。
[0027]實(shí)施例2:
[0028]—種禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的檢測(cè)探針、斑點(diǎn)金免疫集中滲濾裝置，所述的集中滲濾裝置由塑料小盒、點(diǎn)加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜和吸水墊三部分組成，所述塑料小盒的盒蓋中央有邊長(zhǎng)約
0.8cm的正方形孔，盒底部有一位置與盒蓋上的方孔對(duì)應(yīng)的方形凹槽，大小與盒蓋上的方孔一樣大;吸水墊放置于盒的凹槽處，硝酸纖維素膜放在吸水墊與盒蓋之間，吸水墊的面積比硝酸纖維素膜小5/12;所述的禽流感病毒囊膜抗原濃度為1.80yg/mL;所述的用于浸泡檢測(cè)探針的納米金標(biāo)記兔抗雞IgY抗體的濃度為0.84yg/mLo
[0029]所述點(diǎn)加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜采用如下方法制備得到:
[0030](I)禽流感病毒培養(yǎng):將禽流感病毒接種于11日齡的雞胚尿囊腔中，用石蠟封存后37°C孵育繁殖40h，再將雞胚置于0°C環(huán)