冠心病早期診斷標志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，設(shè)及一種用于冠屯、病診斷的分子標志物，具體設(shè)及血 液中的分子標志物-SPEG基因在制備診斷冠屯、病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠屯、病亦稱為缺血性屯、臟病（coronary hea;rt disease,CHD)，設(shè)及供應(yīng)屯、肌血液 的動脈發(fā)生粥樣硬化，即冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔狹窄或斑塊形成甚至破裂、完全堵 塞，限制或完全中斷了屯、肌的血液供應(yīng)，引起臨床上屯、絞痛、屯、肌梗死等一系列嚴重的屯、肌 缺血病癥。冠屯、病是現(xiàn)今威脅人類健康最嚴重的疾病之一，人類健康的主要殺手。隨著經(jīng)濟 快速發(fā)展，世界范圍的疾病譜發(fā)生了明顯的變化，屯、血管疾病逐漸成為了主要疾病。在2008 年大概有1730萬人死于屯、血管病，占全球死亡人數(shù)的30%。其中，死于冠屯、病的約有730萬， 占了總數(shù)的近42%。有流行病學研究顯示，到2020年，每年將有2500萬人死于屯、血管疾病， 且屯、血管疾病預(yù)計將超過傳染性疾病成為全球死亡和殘疾的主要原因。雖然據(jù)世界衛(wèi)生組 織MONICA資料統(tǒng)計，我國發(fā)病率較西方國家低，但我國冠屯、病發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。冠屯、 病的發(fā)生是許多因素參與的復(fù)雜過程，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。眾所周知， 冠屯、病的發(fā)病與吸煙，飲酒，肥胖，高血壓，糖尿病，血脂異常等有關(guān)。但遺傳因素起了獨特 的作用，特別是家族遺傳因素是冠屯、病的一個重要獨立危險因素?；驒z測可對冠屯、病防 治做出巨大貢獻，發(fā)展疾病診斷和治療新手段，具有很大前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于冠屯、病早期診斷的分子標志物。相比傳統(tǒng)的冠 屯、病的診斷方法，使用基因標志物來診斷冠屯、病具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患者 在疾病早期就能知曉疾病風險，針對風險高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0004] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明提供了檢測SPEG基因表達的產(chǎn)品在制備診斷冠屯、病的工具中的應(yīng)用。
[0006] 進一步，上面所提到的檢測SPEG基因表達的產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、 免疫檢測、原位雜交、忍片或高通量測序平臺檢測SPEG基因表達水平W診斷冠屯、病的產(chǎn)品。
[0007] 進一步，所述用RT-PCR診斷冠屯、病的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增SPEG基因的引 物;所述用實時定量PCR診斷冠屯、病的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增SPEG基因的引物;所述用 免疫檢測診斷冠屯、病的產(chǎn)品包括:與SPEG蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷冠 屯、病的產(chǎn)品包括:與SPEG基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷冠屯、病的產(chǎn)品包括： 蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括與SPEG蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因忍片包括與 SPEG基因的核酸序列雜交的探針。
[0008] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述用實時定量PCR診斷冠屯、病的產(chǎn)品至少包括一 對特異擴增SPEG基因的引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0009] 優(yōu)選地，所述診斷工具包括忍片、試劑盒、試紙或高通量測序平臺。其中，高通量測 序平臺是一種特殊的診斷工具，檢測SPEG基因表達的產(chǎn)品可W應(yīng)用于該平臺實現(xiàn)對SPEG基 因的表達情況的檢測。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為 十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異 常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知SPEG基因的異常與冠屯、病相關(guān)也屬于SPEG基因 的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種診斷冠屯、病的工具，所述診斷工具包括忍片、試劑盒、試紙、 或高通量測序平臺。
[0011] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測SPEG基因轉(zhuǎn)錄水平的針對 SPEG基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的SPEG蛋白 的特異性抗體;所述基因忍片可用于檢測包括SPEG基因在內(nèi)的多個基因（例如，與冠屯、病相 關(guān)的多個基因）的表達水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測包括SPEG蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì) (例如與冠屯、病相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達水平。通過將多個與冠屯、病的標志物同時檢測， 可大大提高冠屯、病診斷的準確率。
[0012] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測SPEG基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括SPEG蛋白的特 異性抗體。進一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或忍片方 法檢測SPEG基因表達水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對SPEG基因的引物 和/或探針。根據(jù)SPEG基因的核巧酸序列信息容易設(shè)計出可W用于檢測SPEG基因表達水平 的引物和探針。
[0013 ] 與SPEG基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍 生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié)合，任 何長度都可W。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長 度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交 效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過 30個堿基對，與目的核巧酸序列互補的長度W15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列 最好少于4個堿基對，W免影響雜交效率。
[0014] 所述高通量測序平臺包括檢測SPEG基因表達水平的試劑。
[0015] 所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核巧酸，所述寡核巧酸能夠檢測 SPEG基因的轉(zhuǎn)錄水平。
[0016] 進一步，所述SPEG蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述SPEG蛋白 的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scFvJab、F (ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與SPEG蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體 的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來制備所述抗體。
[0017] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對SPEG基因的引物序列如下：正向引物序列 如SEQ ID NO. 3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。
[0018] 用于診斷冠屯、病的SPEG基因及其表達產(chǎn)物的來源包括但不限于血液、組織液、尿 液、唾液、脊髓液等可W獲得基因組DNA的體液。在本發(fā)明的具體實施方案中，用于診斷冠屯、 病的SPEG基因及其表達產(chǎn)物的來源是血液。
[0019]在本發(fā)明的上下文中，"SPEG基因"包括SPEG基因 w及SPEG基因的任何功能等同物 的多核巧酸。SPEG基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中SPEG基因（NC_ 000002.12)DNA序列具有70% W上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DM序列；
[0020] 優(yōu)選地，SPEG基因的編碼序列包括W下任一一種DNA分子：
[0021] (1)序列表中沈Q ID N0.1所示的DNA序列；
[0022] (2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0023] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90% W上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0024] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述SPEG基因的編碼序列是SEQ ID N0.1所示的DNA 序列。
[0025] 在本發(fā)明的上下文中，SPEG基因表達產(chǎn)物包括SPEG蛋白W及SPEG蛋白的部分膚。 所述SPEG蛋白的部分膚含有與冠屯、病相關(guān)的功能域。
[0026] "SPEG蛋白"包括SPEG蛋白W及SPEG蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 SPEG蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘 導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊條件下能與SPEG的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0027] 優(yōu)選地，SPEG蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[00%] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0029] (2)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30 個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
[0030] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0031] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述SPEG蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0032] 通常，已知的是，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0033] 通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是SPEG蛋白的融合 蛋白。對于與SPEG蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留SPEG蛋白 的生物學活性即可。
[0034] 本發(fā)明的SPEG蛋白也包括對SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留SPEG蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變的 氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
[0035] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷冠屯、病"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有冠屯、病、也 包括判斷受試者是否存在患有冠屯、病的風險。
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