專利名稱：一種鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的試劑，特別是一種鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(俗稱豬藍(lán)耳病，Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的，以成年母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為主要癥狀的豬傳染病。分為美洲型和歐洲型兩個(gè)基因型。我國自1996年以來流行的是美洲型PRRSV。變異型豬繁殖與呼吸綜合征是2006年以來流行于中國，由美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性高致死性疫病，主要表現(xiàn)為豬高熱(41°C以上)、高發(fā)病率、高死亡率、低治愈率，對任何日齡的豬都敏感。現(xiàn)有免疫學(xué)快速診斷方法不能區(qū)分傳統(tǒng)PRRSV和變異型PRRSV ；只有RT-PCR試劑盒和熒光定量PCR試劑盒可用于傳統(tǒng)PRRSV 和變異型PRRSV的鑒別診斷，但操作繁瑣、試驗(yàn)條件要求高，不適合獸醫(yī)臨床和基層對PRRS 的快速診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不同之處而提供一種快速、簡便、易于基層推廣應(yīng)用的鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
一種鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法， 將一種僅能識別傳統(tǒng)美洲型PRRSV的雜交瘤細(xì)胞Mab-B47株，保藏在CCTCC(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏編號CCTCC C201122，和一株能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株，分別進(jìn)行復(fù)蘇、擴(kuò)大培養(yǎng)，并制備相應(yīng)的腹水，將腹水進(jìn)行分離，取上清液為腹水單克隆抗體，測定其IFA效價(jià)，腹水單抗的IFA效價(jià)在IXlO3以上，分裝后一 40°C保存，備用；
將兩種腹水單克隆抗體測定測定蛋白濃度后，蛋白濃度應(yīng)大于10 mg^mL-1,分別以 pH9. 2-PH9. 5碳酸鹽緩沖液稀釋成稀釋成10 mg · mL—1后，各自裝入透析袋中，根據(jù)待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量，取需要量的熒光素，熒光素的用量相當(dāng)與蛋白質(zhì)含量的1/20(其計(jì)量單位是重量計(jì))，用PH9. 2-PH9. 5碳酸鹽緩沖液溶解，其量為待標(biāo)記蛋白液體積的10倍，溶解時(shí)輕輕攪拌，避免氣泡，而后將透析袋置于熒光素溶解液中，攪拌器上4°C閉光攪拌標(biāo)記M h。將上述兩種已經(jīng)標(biāo)記的熒光單抗分別加入kphadex G50柱，用滅菌PBS洗脫，收集有熒光的第一峰，測定第一峰各收集液的熒光效價(jià)，將陽性管合并，即為鑒別傳統(tǒng)美洲型 PRRS和變異型PRRS的免疫熒光診斷試劑，-40°C保存。
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采用本方法制備的試制具有特異性好、敏感性高、操作簡便、快速等特點(diǎn)，能對疑似PRRS的病豬進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。所述的免疫熒光診斷試劑的特性為
(1) Mab-B47、和能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株熒光抗體的效價(jià)應(yīng)
≥1 :32ο(2) Mab_B47熒光抗體僅與傳統(tǒng)美洲型PRRSV反應(yīng)，與正常Marc-145細(xì)胞、豬2型圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)。能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株熒光抗體能夠與所有的美洲型PRRSV反應(yīng)，與正常Marc-145細(xì)胞、豬2型圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)。(3)熒光抗體在-20°C條件下保存期為6個(gè)月。(4)熒光抗體DFA與IFA檢測的符合率在95%以上。(5) DFA與VI總符合率在90%以上，DFA與RT-PCR之間的總符合率在90%以上。(6)診斷試劑的檢測時(shí)間為30_60min。兩種腹水單克隆抗體的制備方法具體為取雜交瘤細(xì)胞Mab_B47、和一株能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株，分別復(fù)蘇后經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，腹腔注射10 12周齡 Balb/c小鼠，預(yù)先用滅菌液體石蠟誘導(dǎo)，每只小鼠IXlO6個(gè)細(xì)胞，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)， 引流收集腹水，于10 000r/min離心15 min，取上清液即為腹水單克隆抗體，測定其IFA效價(jià)，分裝后一 40°C保存，備用。所述的攪拌器為磁力攪拌器。本發(fā)明的鑒別傳統(tǒng)美洲型PRRS和變異型PRRS的免疫熒光診斷試劑可應(yīng)用于檢測染毒細(xì)胞以及臨床鑒別診斷。所述的能夠識別包括傳統(tǒng)美洲型和變異型在內(nèi)的所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株為Mab-C65、Mab_D4。本發(fā)明免疫熒光診斷試劑在臨床鑒別診斷中的最佳應(yīng)用為組織冷凍切片厚度為 0. 1-0. 3mm,采用甲醇/丙酮固定法(即先經(jīng)100%冷凍甲醇作用5min后，再經(jīng)100%冰凍丙酮作用5min ；或者先用冰丙酮固定再用冰甲醇固定的固定方法)，抗體稀釋液為1%BSA-PBS， 熒光抗體經(jīng)1:32倍稀釋為最佳反應(yīng)條件。綜上所述，本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)
采用僅能識別傳統(tǒng)美洲型PRRSV毒株的單抗Mab-B47，以及能夠識別包括傳統(tǒng)美洲型和變異型在內(nèi)的所有美洲型PRRSV毒株的單抗；應(yīng)用單抗能識別不同類型PRRSV毒株的特性，分別標(biāo)記FITC，挑選不同的熒光單抗建立能區(qū)分傳統(tǒng)美洲型PRRS和變異型TORS的免疫熒光診斷方法，該方法的檢測時(shí)間為40min，與病毒分離符合率達(dá)92. 5%，與RT-PCR檢測試劑盒的符合率達(dá)92. 1。應(yīng)用該診斷方法對87份臨床疑似病例和12份人工感染病例進(jìn)行檢測，表明該方法試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于傳統(tǒng)美洲型和變異型PRRS的鑒別診斷，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。為了更好的說明本發(fā)明效果，申請人還對熒光單抗在鑒別人工感染病例及臨床病例中進(jìn)行初步應(yīng)用，以下是應(yīng)用情況
1 人工感染豬及病料的采集
28日齡、PRRSV抗體陰性健康仔豬12頭，隨機(jī)分成3組，4頭/組。第一組用變異株
5PRRSV-FJ0605第7代病毒培養(yǎng)物(104_°TCID5(1/mL)經(jīng)滴鼻、肌注途徑接種，劑量為2mL/頭； 第二組用傳統(tǒng)美洲株P(guān)RRSV-FZ (IO4 5TCID5ciAiL)經(jīng)滴鼻、肌注途徑接種，劑量為2mL/頭；第三組為未攻毒健康對照豬。三組隔離飼養(yǎng)，每日觀察臨床反應(yīng)，于病毒接種后8 d每組迫殺 2頭，14d剖殺2頭，采集肺、肺門淋巴結(jié)，制作冰凍切片和組織勻漿，用于病毒分離、免疫熒光檢測、RT-PCR檢測的符合率比較。2人工感染豬組織樣品的DFA檢測結(jié)果
變異株攻毒組中，肺門淋巴結(jié)和肺臟檢出率為100%，且熒光信號很強(qiáng)；傳統(tǒng)美洲豬攻毒組在肺臟和肺門淋巴結(jié)中檢測到陽性抗原，但熒光信號比變異株攻毒組弱；健康對照豬各組織樣品檢測結(jié)果均為陰性。3人工感染豬DFA、RT-PCR、VI三種檢測方法的符合率比較
分別采集每頭攻毒豬的肺臟、淋巴結(jié)、腎臟等組織，制成勻漿在Marcl45細(xì)胞中進(jìn)行病毒分離，待出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，用PRRSV單抗進(jìn)行免疫熒光驗(yàn)證；取攻毒豬內(nèi)臟勻漿，提取核酸，按照PRRSV RT-PCR鑒別診斷試劑盒進(jìn)行檢測。結(jié)果，變異株攻毒組4頭豬病毒分離和 RT-PCR均為陽性，DFA、RT-PCR、VI三者之間的符合率為100%。傳統(tǒng)美洲株攻毒組4頭豬 RT-PCR均為陽性，而只有3頭攻毒豬VI及DFA檢測均是陽性。DFA與RT-PCR之間的符合率為75%, DFA與VI的符合率為100%ο4人工感染和確診病料DFA檢測與VI及RT-PCR檢測的總符合率比較
本研究共對12份人工感染病料及15份臨床確診病料進(jìn)行了 VI和DFA符合率統(tǒng)計(jì)。變異型PRRS 9份，病毒分離、RT-PCR和DFA檢測均為陽性。傳統(tǒng)型PRRS 9份，病毒分離陽性數(shù)7份，陰性2份；DFA檢測陽性數(shù)8份，陰性1份；RT-PCR檢測都是陽性。9份陰性病料三種方法檢測都是陰性。DFA與VI的陽性符合率為94%( 16/17)，陰性符合率為91%( 10/11)， DFA與VI的總符合率為92. 5%。DFA與RT-PCR之間的陽性符合率為94% (17/18)，陰性符合率為90% (9/10)，DFA與RT-PCR之間的總符合率為92. 2%。臨床應(yīng)用效果評價(jià)應(yīng)用試劑盒對87份臨床疑似病例和12份人工感染病例進(jìn)行檢測，結(jié)果該試劑盒與VI或RT-PCR的符合率在均在90%以上，檢測時(shí)間為30-60min。顯示該試劑盒試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于傳統(tǒng)美洲型和變異型PRRS的鑒別診斷，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值?？姑乐扌蚉RRSV雜交瘤細(xì)胞Mab_B47株，保藏在CCTCC (中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué))，保藏日2011年4月15日，保藏編號CCTCC C201122。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
抗PRRSV的雜交瘤細(xì)胞Mab-B47株，具有如下特性該細(xì)胞株特異性單克隆抗體僅傳統(tǒng)美洲型PRRSV反應(yīng)，與Marc-145細(xì)胞、豬2型圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)，雜交瘤細(xì)胞上清液和腹水的抗體的IFA效價(jià)分別在24和IO3以上。Mab-B47保藏在 CCTCC (中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏編號CCTCC C201122。本發(fā)明所述的上述抗PRRSV的雜交瘤細(xì)胞Mab_B47株、Mab_C65聯(lián)合應(yīng)用于傳統(tǒng)美洲型PRRS和變異型PRRS的免疫熒光診斷的制備方法
(1)從液氮中取出雜交瘤細(xì)胞Mab-B47株、Mab-C65株，復(fù)蘇后經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，腹腔注射 10 12周齡Balb/c小鼠(預(yù)先用滅菌液體石蠟誘導(dǎo))，每只小鼠1 X IO6個(gè)細(xì)胞，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，用12號針頭引流收集腹水，于10 000r/min離心15 min，取上清液即為腹水單克隆抗體，分別測定其ELISA和IFA效價(jià)，分裝后一 40°C保存，備用。(2)單抗的熒光標(biāo)記
將Mab-B47、Mab-C65腹水單克隆抗體測定蛋白濃度后，以pH9. 2-PH9. 5碳酸鹽緩沖液稀釋成一定濃度后，裝入透析袋中。根據(jù)待標(biāo)記IgG的總量，取需要量的熒光素(相當(dāng)與蛋白質(zhì)含量的1/20)，用pH9. 2-PH9. 5碳酸鹽緩沖液溶解在燒杯中，其量為待標(biāo)記蛋白液體積的10倍，溶解時(shí)輕輕攪拌，避免氣泡。將透析袋置于燒杯中，磁力攪拌器上4°C閉光攪拌標(biāo)記24 h ；將透析袋取出于0. 01 Mol -T1 pH7. 2 PBS中4°C透析4 h 5 h，中間換液數(shù)次， 充分除鹽。(3)熒光抗體純化
應(yīng)用kphadex G50柱除去游離FITC。將上述已透析除鹽的FITC標(biāo)記抗體加入 Sephadex G50柱，用滅菌PBS洗脫，收集有熒光的第一峰，測定第一峰各收集液的熒光效價(jià)，將陽性管合并，即為標(biāo)記抗體，保存于-40°C備用。所述的免疫熒光診斷試劑的特性為
(1) Mab-B47、和能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株熒光抗體的效價(jià)應(yīng)
^ 1 :32ο(2) Mab_B47熒光抗體僅與傳統(tǒng)美洲型PRRSV反應(yīng)，與正常Marc-145細(xì)胞、豬2型圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)。能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株熒光抗體能夠與所有的美洲型PRRSV反應(yīng)，與正常Marc-145細(xì)胞、豬2型圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)。(3)熒光抗體在_20°C條件下保存期為6個(gè)月。(4)熒光抗體DFA與IFA檢測的符合率在95%以上。(5) DFA與VI總符合率在90%以上，DFA與RT-PCR之間的總符合率在90%以上。(6)診斷試劑的檢測時(shí)間為30_60min。下面說明免疫熒光診斷試劑在檢測染毒細(xì)胞的操作程序。(1): PRRSV感染細(xì)胞的制備
將Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)于96孔細(xì)胞板，37°C 5%C02條件下培養(yǎng)至細(xì)胞單層后，分別接種傳統(tǒng)美洲型及變異型PRRSV毒株，接種量為100個(gè)TCID5tl。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)30 %左右時(shí)，棄上清液，PBS洗滌1次，每孔加入冷甲醇100 yL,4 V固定30 min，甩干，PBS洗滌1次，-40 °C凍存?zhèn)溆?。同時(shí)設(shè)正常Marc-145細(xì)胞為陰性對照。(2 ) DFA 檢測
取染毒細(xì)胞板，用PBS孔浸洗后，每孔加入一定量用1%BSA-PBS稀釋的熒光標(biāo)記抗體工作液，置于濕盒內(nèi)，37°C感作30min后取出。輕輕倒掉熒光抗體染液并用濾紙吸干，用PBS 200 μ L/孔洗幾次，最后每孔加抗熒光衰減封片劑(50%甘油-PBS)，于熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，拍照。同設(shè)未接種病毒的正常Marc-145細(xì)胞孔作為陰性對照。(3)熒光抗體效價(jià)測定將熒光抗體用含1%BSA的PBS進(jìn)行2倍比梯度稀釋后，分別加入PRRSV毒株感染的 Marcl45細(xì)胞進(jìn)行熒光抗體染色，同時(shí)設(shè)未染毒的陰性細(xì)胞對照。以出現(xiàn)清晰明亮的特異性熒光(++)的最大稀釋度，即為該熒光抗體的效價(jià)。結(jié)果，熒光抗體的效價(jià)為1:64 1:128。 為保證熒光抗體的特異性強(qiáng)度，并且能夠消除正常組織細(xì)胞的非特異性熒光反應(yīng)，實(shí)際工作濃度為1 :32。(4)熒光抗體特異性測定
在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。將熒光抗體適當(dāng)稀釋后，分別與PRRSV、PRV、PPV、CSFV、 TGEV, PCV2、MPV、NDRV等感染細(xì)胞及正常細(xì)胞作用30min后，以生理鹽水洗滌3次，每孔加 50%甘油-PBS 50ul，倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示PRRS熒光抗體與PRRSV感染細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，在胞漿中呈現(xiàn)特異的亮綠色熒光，DFA的熒光特性與IFA相同；而其它病毒感染細(xì)胞及正常Marcl45細(xì)胞均無交叉反應(yīng)。初步表明制備的熒光抗體與其它多種豬病毒抗原無特異性交叉，有較好的特異性，可用于PRRSV感染細(xì)胞的鑒定。(5) DFA與IFA檢測染毒細(xì)胞的符合率比較
分別取B47和C65熒光抗體在PRRSV感染細(xì)胞和正常對照細(xì)胞中進(jìn)行直接免疫熒光試驗(yàn)(DFA)，同時(shí)用相同的單抗進(jìn)行相應(yīng)的IFA試驗(yàn)，并進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果，DFA檢測特性與 IFA相符，在Marc 145染毒細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，兩中方法的符合率為100%，表明熒光標(biāo)記抗體的聯(lián)合應(yīng)用，可用于各類PRRSV感染細(xì)胞的鑒定。(6)熒光抗體的保存期測定
取-20°C條件下保存熒光抗體，每個(gè)月進(jìn)行一次DFA試驗(yàn)，觀察抗體效價(jià)變化，測定熒光抗體在-20°C條件下保存期為6個(gè)月。下面說明免疫熒光診斷試劑在臨床診斷中的操作程序。一 PRRSV DFA反應(yīng)條件的優(yōu)化 (1)冰凍切片的制備
制作病料切片，采取疑似PRRS病料，切取黃豆大小肺臟和肺門淋巴結(jié)組織塊，放置于組織固著器上并冷凍，待組織塊冷凍后將其裝到切片機(jī)上，調(diào)整好位置后，切取0. Γ0. 3mm 的組織薄片，粘附在載玻片上。(2)固定劑和固定方法的選擇
制備健康豬及PRRS感染豬的肺門淋巴節(jié)切片，分別用冰甲醇和冰丙酮采用以下4種固定方法進(jìn)行固定(1) 100%冰凍甲醇，作用IOmin ； (2) 50%冰凍甲醇/50%冰凍丙酮混合液，作用IOmin ； (3) 100%冰凍甲醇，作用5min，移出后，冰凍丙酮，作用5min ；或者先用冰丙酮作用5min再冰甲醇作用5min (4) 100%冰凍丙酮，作用lOmin。固定好的切片加入用 P/oBSA-PBS稀釋的熒光單抗，37°C作用30min后，用PBS充分洗滌，加入甘油-PBS進(jìn)行封片后熒光顯微鏡觀察。比較不同固定劑和固定方法染色效果及非特異染色情況，從而確定出最佳固定條件。結(jié)果，采用(2)方法即100%冰凍甲醇，作用5min，移出后，100%冰凍丙酮， 作用5min或者先用冰丙酮固定后再用冰甲醇作用的固定方法，切片DFA檢測背景好、無非特異熒光染色，組織細(xì)胞形態(tài)完整、陽性熒光病灶視野清晰。而其它三組固定方法有一定的非特異熒光染色，容易造成假陽性的判定。(3)熒光抗體最佳稀釋液的選擇
組織切片中除了目的抗原以外，還可能存在類屬抗原，可與組織中特異性抗原以外的相應(yīng)抗體結(jié)合，這就需要在試驗(yàn)時(shí)用稀釋液來封閉能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)。分別采用PBS、0. 5%BSA-PBS、1%BSA-PBS、2%BSA-PBS將熒光抗體稀釋成最佳工作濃度，分別對健康豬及PRRS感染豬的肺門淋巴節(jié)切片進(jìn)行DFA熒光染色，確定熒光抗體的最佳稀釋液。結(jié)果，熒光抗體用PBS稀釋，切片的非特異性假陽性熒光染色較多，不易與陽性病灶的陽性區(qū)分；用含不同濃度牛血清白蛋白(BSA)的PBS稀釋后，非特異性熒光隨著BSA濃度的提高而減少，但熒光抗體的敏感度隨著BSA濃度的提高而略有下降，所以實(shí)際工作時(shí)，選擇 P/oBSA-PBS作為熒光抗體的稀釋液。通過反復(fù)試驗(yàn)，最終確定組織冷凍切片采用甲醇/丙酮固定法，抗體稀釋液為 P/oBSA-PBS,熒光抗體經(jīng)1 32倍稀釋為最佳反應(yīng)條件。實(shí)施例2
實(shí)施例2與實(shí)施例1大致相同，就是將能夠識別包括傳統(tǒng)美洲型和變異型在內(nèi)的所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株Mab-D4替換Mab_C65。
權(quán)利要求
1.一種鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法，其特征在于將一種僅能識別傳統(tǒng)美洲型PRRSV的雜交瘤細(xì)胞Mab-B47株，和一株能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株，分別進(jìn)行復(fù)蘇、擴(kuò)大培養(yǎng)，并制備相應(yīng)的腹水，將腹水進(jìn)行分離，取上清液為腹水單克隆抗體，測定其IFA效價(jià)腹水單抗IFA效價(jià)在 1X IO3以上，分裝后一 40°C保存，備用；將兩種腹水單克隆抗體測定測定蛋白濃度后，蛋白含量應(yīng)大于10 mg^mL-1,分別以 pH9. 2-PH9. 5碳酸鹽緩沖液稀釋成稀釋成10 mg · mL—1后，各自裝入透析袋中，根據(jù)待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量，取需要量的熒光素，熒光素的用量相當(dāng)與蛋白質(zhì)含量的1/20，其計(jì)量單位是重量計(jì)，用pH9. 2-PH9. 5碳酸鹽緩沖液溶解，其量為待標(biāo)記蛋白液體積的10倍，溶解時(shí)輕輕攪拌，避免氣泡，而后將透析袋置于熒光素溶解液中，攪拌器上4°C閉光攪拌標(biāo)記M h;將上述兩種已標(biāo)記好的熒光單抗分別加入kphadex G50柱，用滅菌PBS洗脫，收集有熒光的第一峰，測定第一峰各收集液的熒光效價(jià)，將陽性管合并，即為鑒別傳統(tǒng)美洲型PRRS 和變異型PRRS的免疫熒光診斷試劑，-40°C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法，其特征在于所述的免疫熒光診斷試劑的技術(shù)指標(biāo)為(1) Mab-B47、和能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株熒光抗體的效價(jià)應(yīng)> 1 32;(2)Mab-B47熒光抗體僅與傳統(tǒng)美洲型PRRSV反應(yīng)，與正常Marc_145細(xì)胞、豬2型圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)，能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株熒光抗體能夠與所有的美洲型PRRSV反應(yīng)，與正常Marc-145細(xì)胞、豬2型圓環(huán)病毒、 豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)；(3)熒光抗體在-20°C條件下保存期為6個(gè)月；(4)熒光抗體DFA與IFA檢測的符合率在95%以上；(5)DFA與VI總符合率在90%以上，DFA與RT-PCR之間的總符合率在90%以上；(6)診斷試劑的檢測時(shí)間為30-60min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法，其特征在于兩種腹水單克隆抗體的制備方法具體為取雜交瘤細(xì)胞Mab-B47、和一株能夠識別所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株，分別復(fù)蘇后經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，腹腔注射10 12周齡Balb/c小鼠，預(yù)先用滅菌液體石蠟誘導(dǎo)，每只小鼠IXlO6個(gè)細(xì)胞，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，引流收集腹水，于10 000r/min離心15 min，取上清液即為腹水單克隆抗體，測定其IFA效價(jià)，分裝后一 40°C保存，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法，其特征在于所述的攪拌器為磁力攪拌器。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任何一項(xiàng)所述的鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法，其特征在于所述的能夠識別包括傳統(tǒng)美洲型和變異型在內(nèi)的所有美洲型PRRSV毒株的雜交瘤細(xì)胞株為Mab-C65、Mab-D4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法，其特征在于所述的免疫熒光診斷試劑在臨床鑒別診斷中的最佳應(yīng)用為組織冷凍切片厚度為0. 1-0. 3mm，采用甲醇/丙酮固定法(即先經(jīng)100%冷凍甲醇作用 5min后，再經(jīng)100%冰凍丙酮作用5min ；或者先用冰丙酮固定再用冰甲醇固定的固定方法)，抗體稀釋液為1%BSA-PBS，熒光抗體經(jīng)1:32倍稀釋為最佳反應(yīng)條件。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別診斷傳統(tǒng)美洲型和變異型豬繁殖與呼吸綜合征的免疫熒光試劑的制備方法，采用僅能識別傳統(tǒng)美洲型PRRSV毒株的單抗Mab-B47，以及能夠識別包括傳統(tǒng)美洲型和變異型在內(nèi)的所有美洲型PRRSV毒株的單抗；應(yīng)用單抗能識別不同類型PRRSV毒株的特性，分別標(biāo)記FITC，挑選不同的熒光單抗建立能區(qū)分傳統(tǒng)美洲型PRRS和變異型PRRS的免疫熒光診斷方法，該方法的檢測時(shí)間為40min，與病毒分離符合率達(dá)92.5%，與RT-PCR檢測試劑盒的符合率達(dá)92.2%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于表明該方法試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于傳統(tǒng)美洲型和變異型PRRS的鑒別診斷，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C07K16/10GK102297969SQ20111013575
公開日2011年12月28日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者朱小麗, 李兆龍, 林鋒強(qiáng), 王劭, 程曉霞, 陳仕龍, 陳少鶯 申請人:朱小麗, 李兆龍, 林鋒強(qiáng), 王劭, 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 程曉霞, 陳仕龍, 陳少鶯