一種蜂巢小甲蟲(chóng)的pcr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜂巢小甲蟲(chóng)(Aethina tumida)屬于銷(xiāo)翅目(Coleoptera)露尾甲科(Nitidulidae)，是蜜蜂的六大重要病原體之一。蜂巢小甲蟲(chóng)有四個(gè)發(fā)育時(shí)期，卵主要產(chǎn)在蜂箱內(nèi)護(hù)脾工蜂不多的幼蟲(chóng)脾和粉蜜脾以及巢脾縫隙間，和蜜蜂卵相似但稍小；幼蟲(chóng)為乳白色，以蜂蜜和花粉為食，取食后巢房和封蓋被其破壞，蜂蜜呈水態(tài)發(fā)酵，甚至起泡溢出巢房，散發(fā)異味。有時(shí)幼蟲(chóng)會(huì)產(chǎn)生帶臭味的粘液，可迫使蜂群飛逃;成熟的幼蟲(chóng)離開(kāi)蜂巢進(jìn)入土壤化蛹，由白色逐漸變?yōu)樽厣?，羽化后的成蟲(chóng)由棕色變成褐色或黑色，飛行能力很強(qiáng)，主要以粉蜜和蜜蜂的卵及幼蟲(chóng)為食，可有效引起蜜蜂蜂群的大規(guī)模損失。
[0003]蜂巢小甲蟲(chóng)最早起源于南非，1998年確認(rèn)傳入美國(guó)，隨后傳播到埃及、加拿大和澳大利亞等國(guó)。蜂巢小甲蟲(chóng)傳播途徑極其廣泛，雖然蜜蜂是其主要寄主，但小甲蟲(chóng)成蟲(chóng)可以在沒(méi)有食物和水的情況下存活5天，因此它還可以通過(guò)轉(zhuǎn)移的蜂群、蜂箱、蜂膠、蜂蠟和運(yùn)輸工具，以及進(jìn)出口的養(yǎng)蜂設(shè)備甚至附著的土壤等傳播，蜂巢小甲蟲(chóng)是兼性寄生蟲(chóng)，可以在水果中繁殖，因此它還可以通過(guò)果蔬產(chǎn)品的流通而傳播。隨著熊蜂、蜜蜂等進(jìn)出口貿(mào)易的日益增多，由此帶來(lái)的生物入侵等安全風(fēng)險(xiǎn)日益受到關(guān)注，因此，建立一種快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于防止蜂巢小甲蟲(chóng)的入侵具有重要意義。
[0004]蜂巢小甲蟲(chóng)的檢測(cè)方法主要是解剖鏡下觀察其幼蟲(chóng)，其外形雖和其他巢蟲(chóng)類(lèi)似，但其背部有荊狀突刺，其明確的頭殼和發(fā)育完全的胸足以及產(chǎn)生黏液的特點(diǎn)，因此可與其他巢蟲(chóng)區(qū)分開(kāi)來(lái)，此外小甲蟲(chóng)的卵太小不易觀測(cè)，易與熊蜂及蜜蜂卵混淆，蛹則易與大蠟螟蛹相混淆，成蟲(chóng)在外形上也與其他甲蟲(chóng)極為相似，難以檢出。PCR檢測(cè)方法可迅速檢出各個(gè)發(fā)育時(shí)期的小甲蟲(chóng)，甚至可以對(duì)蜂巢碎片及土壤等進(jìn)行檢測(cè)，杜絕其攜帶蟲(chóng)卵等，可廣泛應(yīng)用于進(jìn)境樣品的檢測(cè)。本發(fā)明在全基因合成的蜂巢小甲蟲(chóng)線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I基因的基礎(chǔ)上，通過(guò)特異性引物的設(shè)計(jì)，建立了一種蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的主要內(nèi)容是提供一種蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法，以便準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)進(jìn)出口蜂群中的蜂巢小甲蟲(chóng)。
[0006]本發(fā)明提供的蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法，具體步驟如下:
利用特異性引物對(duì)，對(duì)待檢測(cè)的疑似蜂巢小甲蟲(chóng)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增出205 bp的蜂巢小甲蟲(chóng)COI基因片段，則標(biāo)志著待檢測(cè)樣品為蜂巢小甲蟲(chóng)。
[0007]其中，所述特異性引物對(duì)為:
上游引物Aet-F: 5 ’ -GCGACCCTCAGGCATAAC-3 ’ ；
下游引物Aet-R: 5 ’ -ACCGAAGAATCAAAATAAGT-3 ’。
[0008]其中，所述PCR的反應(yīng)體系如下:
GoTaq ? DNA聚合酶 0.5yL dNTPs(200 μΜ)2yL
MgCh(25 mM)1.5yL
5 XGoTaq Buffer4yL
引物Aet-F(10 μΜ)IyL
引物Aet-R(10 μΜ)IyL
模板DNA2yL
CldH2O補(bǔ)足 20yL
反應(yīng)體系總體積為20 yLo
[0009]其中，所述PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)，95°C變性30 s，52°C退火30 s，72°C延伸45 s，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0010]其中，所述凝膠電泳為1.5%瓊脂糖凝膠電泳。
[0011]本發(fā)明還提供用于蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法的特異性引物對(duì)，上游引物為Aet-F: 5 ’ -GCGACCCTCAGGCATAAC-3 ’ ；下游引物為Aet-R: 5，-ACCGAAGAATCAAAATAAGT-3，。
[0012]本發(fā)明還提供所述蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法在進(jìn)境蜜蜂或熊蜂檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明所提供的蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法能快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)出進(jìn)出口蜜蜂或熊蜂中攜帶的蜂巢小甲蟲(chóng)。所述PCR反應(yīng)體系中有一對(duì)特異性引物Aet-F和Aet-R，上述引物能夠從蜂巢小甲蟲(chóng)線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I基因序列(GenBankID:AF522358)中特異性擴(kuò)增一段205 bp的片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)。本發(fā)明的蜂巢小甲蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法，對(duì)全基因合成的蜂巢小甲蟲(chóng)DNA的檢測(cè)靈敏度為0.77 fg /uL,具有特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于進(jìn)境蜂類(lèi)病蟲(chóng)害檢測(cè)，為防止蜂巢小甲蟲(chóng)的生物入侵提供可靠的理論和技術(shù)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1常見(jiàn)蜂類(lèi)敵害DNA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。其中M:DNA Marker I；N:陰性對(duì)照(ddH20) ; 1:蜂巢小甲蟲(chóng)；2:花金龜;3:大蠟螟，4:小蠟螟，5:胡蜂。
[0015]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2全基因合成的蜂巢小甲蟲(chóng)DNA不同稀釋倍數(shù)下的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中M:DNA Marker I;N:陰性對(duì)照(ddH20) ; 1:陽(yáng)性對(duì)照;2:10°；3:101 ；4:102；5:103；6:104；7:105；8:106 ；9:107；10:108；11:109；12:1010；13:1u ；14:1012；15:1013；16:1014；17: 1150
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0017]實(shí)施例1蜂巢小甲蟲(chóng)的特異性檢驗(yàn)
采用本發(fā)明方法，對(duì)蜂巢小甲蟲(chóng)和花金龜、大蠟螟、小蠟螟、胡蜂進(jìn)行蜂巢小甲蟲(chóng)的檢驗(yàn)。
[0018]特異性引物對(duì)為:
Aet-F:5，-GCGACCCTCAGGCATAAC-3，；
Aet-R:5，-ACCGAAGAATCAAAATAAGT-3，。
[0019]PCR 反應(yīng)體系中包括 4 yL 的 5 XGoTaq Buffer ^ 1.5 yL 的 MgCl2 (25mM)( Promega公司)，2 yL的dNTPs(200μΜ)(TaKaRa 公司)，引物Aet_F、引物Aet-R 各I yL(10yM)，0.5 yL的GoTaq ? DNA聚合酶，2 yL的模板DNA，ddH20補(bǔ)足至20 yL:
反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)，95°C變性30 s，52°C退火30 s，72°C延伸45s，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0020]取6yL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶。全基因合成的蜂巢小甲蟲(chóng)0嫩用引物六社4/^的-財(cái)廣增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明擴(kuò)增出了205 bp的蜂巢小甲蟲(chóng)基因片段，花金龜、大蠟螟、小蠟螟、胡蜂0嫩用引物4的4/^的-財(cái)廣增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳未檢測(cè)出電泳條帶，使用本發(fā)明的方法可用于蜂箱中蜂巢小甲蟲(chóng)卵及幼蟲(chóng)的檢驗(yàn)。
[0021 ]實(shí)施例2蜂巢小甲蟲(chóng)的靈敏性檢驗(yàn)
采用本發(fā)明方法，對(duì)全基因合成的蜂巢小甲蟲(chóng)DNA不同稀釋倍數(shù)進(jìn)行靈敏度檢驗(yàn)。
[0022]PCR反應(yīng)方法、體系與條件均同實(shí)例I，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，圖2為全基因合成的蜂巢小甲蟲(chóng)DNA 1t3-1O15倍稀釋后PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)18稀釋的77 ng/此模板DNA擴(kuò)增出了條帶，本發(fā)明中的特異性引物對(duì)4社4/^的-1?的靈敏度為0.77 fg / yLo
[0023]本發(fā)明并不局限于上述【具體實(shí)施方式】，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，所做出的多種變化和改進(jìn)也應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法的引物，其特征在于:所述的特異性引物對(duì)為: 上游引物Aet-F: 5 ’ -GCGACCCTCAGGCATAAC-3 ’ ； 下游引物Aet-R: 5 ’ -ACCGAAGAATCAAAATAAGT-3 ’。2.—種蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:利用特異性引物對(duì)Aet-F和Aet-R，對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增出205 bp的特異性條帶，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有蜂巢小甲蟲(chóng)，反之則未檢出。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 yL，包括GoTaq ? DNA聚合酶0.5 yL；200 μΜ的dNTPs 2 yL；25 mM的MgCl21.5 yL； 5 XGoTaq Buffer 4 “1^;濃度為10 μΜ的上游引物Aet-F I “1^;濃度為10 μΜ的下游引物Aet-R I yL; DNA模板2 yL；ddH20 8 yL。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性4 min，之后95°C變性30 s，52°C退火30 s，72°C延伸45 S，循環(huán)40次后，72°C延伸 10 min。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法，其特征在于:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)與分析步驟:取6 yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在加入0.01% GelRed核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，所述PCR反應(yīng)體系中有一對(duì)特異性引物Aet-F和Aet-R，上述引物能夠從蜂巢小甲蟲(chóng)線粒體細(xì)胞色素c氧化酶Ⅰ基因序列（GenBank？ID：AF522358）中特異性擴(kuò)增一段205bp的片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂巢小甲蟲(chóng)的PCR檢測(cè)。本發(fā)明的蜂巢小甲蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法，對(duì)全基因合成的蜂巢小甲蟲(chóng)DNA的檢測(cè)靈敏度為0.77fg/μL，具有特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于進(jìn)境蜂類(lèi)病蟲(chóng)害檢測(cè)，為防止蜂巢小甲蟲(chóng)的生物入侵提供可靠的理論和技術(shù)依據(jù)。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105543405
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610133954
【發(fā)明人】張?bào)w銀, 劉蓓, 鄭騰, 白泉陽(yáng), 王武軍, 張志燈, 于師宇, 林素潔
【申請(qǐng)人】福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年3月10日