檢測乳腺癌her2基因的納米量子點(diǎn)標(biāo)記分子探針及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種檢測乳腺癌皿R2基因的納米量子 點(diǎn)標(biāo)記分子探針及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中屯、統(tǒng) 計(jì)，2012年全球女性乳腺癌新發(fā)病例達(dá)167萬，占全部女性腫瘤發(fā)病的25.2% ;52萬女性因 乳腺癌死亡，占所有女性惡性腫瘤死亡的14.7 %。在我國，乳腺癌占據(jù)女性惡性腫瘤發(fā)病的 首位，2009年調(diào)查結(jié)果顯示其標(biāo)化發(fā)病率為23.16/100,000,顯著高于其它癌癥的發(fā)病率， 并W每年2-3%的增長速率遞增。同時(shí)，我國女性乳腺癌的死亡率呈連續(xù)上升趨勢，達(dá)4.94/ 100，000，是女性第五位最常見的惡性腫瘤死亡原因。
[0003] 人類表皮生長因子受體化uman 邱idermal growth factor receptor,肥R/IirbB) 家族屬酪氨酸激酶受體，包括4種同源跨膜蛋白：肥RUEG-FR或化bBl)、皿R2(Neu或化bB2)、 肥R3化rbB3)和肥R4化rbB4)。每種受體蛋白酪氨酸激酶活性域高度保守，使其結(jié)構(gòu)和功能 具有很高的同源性并成為受體間相互作用及交叉激活的分子基礎(chǔ)。皿R1、皿R3或肥R4與配 體結(jié)合后，通過與肥R2形成異二聚體而激活其細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)含有酪氨酸殘基的蛋白片段，使C 末端的酪氨酸激酶發(fā)生憐酸化，信號通路被激活，進(jìn)而參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，如生長、 增殖和調(diào)亡等。人類肥R2基因是定位于17號染色體的原癌基因，皿R2蛋白膜內(nèi)段的各酪氨 酸殘基發(fā)生憐酸化后均能作用于特定的信號蛋白，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。運(yùn)些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 包括Ras/促分裂原活化蛋白激酶通路、PI3K/AKT/mT0R通路、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn) 錄激活因子通路及化C-丫通路。轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常和各種腫瘤，尤其是乳腺癌的生長及增殖 密切相關(guān)。臨床上約20 %的乳腺癌患者存在肥R2基因擴(kuò)增或過表達(dá)。有數(shù)據(jù)顯示，皿R2的過 表達(dá)預(yù)示著疾病復(fù)發(fā)及患者存活率的降低。
[0004] 作為21世紀(jì)最重要的高新技術(shù)之一，納米技術(shù)在癌癥診療方面已展示出廣闊的應(yīng) 用前景。特別是納米巧光量子點(diǎn)（Quantum dots,Cff)s)，作為一種半徑小于或接近于激子玻 爾半徑的新型半導(dǎo)體納米晶粒，表現(xiàn)出獨(dú)特的量子尺寸和表面效應(yīng)，使其具有W下多方面 優(yōu)越的光學(xué)特性:巧光發(fā)射波長可控、發(fā)射峰狹窄對稱，激發(fā)譜寬而連續(xù)，消光系數(shù)大、巧光 強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性好。經(jīng)過表面修飾及功能化后，量子點(diǎn)易與生物功能分子禪聯(lián)，成為量子 點(diǎn)標(biāo)記探針，在分子成像中與傳統(tǒng)的免疫巧光標(biāo)記探針相比具有顯著應(yīng)用優(yōu)勢，主要表現(xiàn) 在：1)實(shí)現(xiàn)分子信息的高準(zhǔn)確性及靈敏性定量檢測:量子點(diǎn)的巧光強(qiáng)度高、耐光漂性強(qiáng)，能 克服生物組織自發(fā)巧光的影響，獲得準(zhǔn)確的成像信息并進(jìn)行量化;2)長時(shí)間、實(shí)時(shí)成像:巧 光強(qiáng)度高、抗光漂白能力強(qiáng)，及經(jīng)過適當(dāng)修飾后具有良好的生物相容性，能夠耐受復(fù)雜的生 物醫(yī)學(xué)應(yīng)用環(huán)境，可用于長時(shí)間、實(shí)時(shí)分子成像研究；3)多分子共成像與相互作用研究：不 同材料或大小的量子點(diǎn)可具有不同的發(fā)射光譜，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)分子的原位、實(shí)時(shí)、同時(shí)成像； 4)深組織成像:巧光發(fā)射波長可控使其可發(fā)射近紅外波長的光譜，具有較好的組織穿透性， 對體內(nèi)成像監(jiān)測十分理想。
[0005] 近年來，基于量子點(diǎn)標(biāo)記探針技術(shù)的分子成像、細(xì)胞成像和在體成像取得了重要 進(jìn)展。目前，量子點(diǎn)標(biāo)記探針技術(shù)的研究重點(diǎn)已從基礎(chǔ)研究向轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究轉(zhuǎn)變，將量子點(diǎn) 標(biāo)記探針技術(shù)用于腫瘤學(xué)研究，通過對腫瘤演變進(jìn)展過程的關(guān)鍵分子事件、關(guān)鍵細(xì)胞事件 進(jìn)行實(shí)時(shí)、高靈敏、長時(shí)間標(biāo)記成像，有望對腫瘤發(fā)病機(jī)制研究、早期診斷、祀向治療、預(yù)后 復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面產(chǎn)生重要影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測乳腺癌皿R2基因的納米量子點(diǎn)標(biāo)記分子探針及其 制備方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的用于檢測乳腺癌皿R2基因的納米量子點(diǎn)標(biāo)記分子 探針，所述分子探針包含:識別單元、連接單元和信號報(bào)告單元；
[000引所述識別單元為經(jīng)過表面修飾的水溶性化S包被的CdSe量子點(diǎn)與生物素標(biāo)記的高 特異性核巧酸序列；
[0009] 所述連接單元為利用量子點(diǎn)表面的元素如Zn、Cd等與琉基之間強(qiáng)的絡(luò)合作用力， 使量子點(diǎn)與琉基酸絡(luò)合帶上簇基，琉基酸可W是琉基乙酸、琉基丙酸、琉基下二酸、6,8-二 琉基辛酸等；
[0010] 所述信號報(bào)告單元為:biotin與STV/avidin/ExtrAvidin連接形成的；
[0011] 所述分子探針的通式如下：
[0012] QDs-高特異性核巧酸序列-biotin-STV/avidin/ExtrAvidin;
[0013] 其中，QDs為水溶性化S包被的CdSe量子點(diǎn)，其巧光發(fā)射波長在520皿-620nm;所述 生物分子是指可與乳腺癌肥R2基因相互作用的核酸、多膚、抗體或小分子抑制劑。
[0014] 所述經(jīng)過表面修飾的水溶性ZnS包被的CdSe量子點(diǎn)是指在水溶性ZnS包被的CdSe 量子點(diǎn)表面修飾可與生物分子連接的官能團(tuán)。例如，表面帶-C00H或-NH2的量子點(diǎn)很容易進(jìn) 行PEG、NTA、Biotin或化late等功能化，所得產(chǎn)物具有更好的生物相容性和更廣泛的適應(yīng) 性。
[0015] 優(yōu)選地，所述生物分子是指可與SEQ ID NO: 1所示序列雜交的DNA片段。
[0016] 更優(yōu)選地，所述分子探針為QDs-DNA-biotin-STV。
[0017] 本發(fā)明還提供一種用于檢測乳腺癌的試劑盒，所述試劑盒中含有上述分子探針。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步提供分子探針QDs-DNA-biotin-STV的制備方法，包括W下步驟：
[0019] 1)水溶性ZnS包被的CdSe量子點(diǎn)的制備；
[0020] 2)水溶性aiS包被的CdSe量子點(diǎn)與biotin標(biāo)記的DNA連接，制備QDs-DNA-biotin;
[0021] 3)STV 與 QDs-DNA-biotin 結(jié)合，制備 QDs-DNA-biotin-STV。
[0022] 步驟1)具體為：
[0023] 取12.5g Τ0Ρ0(Ξ辛基氧化麟)置于反應(yīng)瓶中，于200°C真空環(huán)境下干燥并脫氣約 20min;然后升溫到350°C接近一個(gè)大氣壓，待溫度穩(wěn)定后，將0.7ml儲(chǔ)存液A加入反應(yīng)瓶中并 停止加熱；待反應(yīng)混合液冷卻至310°C，析出少量的CdSe納米晶體；當(dāng)溫度降至300°C，將儲(chǔ) 存液B按每次0.55ml的量加入反應(yīng)瓶中，間隔20s加入一次，共加入5次(儲(chǔ)存液A、儲(chǔ)存液B的 摩爾比約為1:4)，待溫度降至100°C，恒溫?cái)埌璺磻?yīng)化，然后，將無水甲醇加入到上述反應(yīng)液 中，離屯、收集沉淀，向沉淀中加入無水甲醇清洗，然后離屯、收集沉淀，沉淀用無水甲醇重復(fù) 清洗2次，W去除殘余的TOPO;將收集的納米晶體懸浮于10ml氯仿中，離屯、去除殘余碎片和 尚未反應(yīng)的試劑;通過吸收光譜峰、X射線或測量直徑等方法篩選出巧光發(fā)射波長在520nm- 62化m且粒徑均一，單分散性好的化S包被的CdSe納米粒子;然后將其完全溶于氯仿中，超聲 30min，向其中逐滴加入蒸饋水至50ml。滴加完畢，將混合液旋蒸除去氯仿，使用.022um濾膜 過濾水溶液，得到透明的水溶性化S包被的CdSe量子點(diǎn)。
[0024]其中，儲(chǔ)存液A的制備方法如下:取0.2g Se溶于4.5ml TOP溶液（lOOuM)，向其中加 入0.25ml MesCd溶液（lOOuM)，再加入19.5ml TOP溶液混勻即得儲(chǔ)存液A，保存于充滿化的干 燥盒中；
[002引儲(chǔ)存液B的制備方法如下：取0.52ml(TMS)2S加入4.5ml TOP溶液中，向其中加入 3.5ml MesZn溶液（lOOuM)，再加入16ml TOP溶液混勻即得儲(chǔ)存液B，保存于充滿化的干燥盒 中。
[0026] 步驟2)具體為：（備注:該部分包含表面修飾）
[0027] 將1.2nmol Q化與12皿〇1經(jīng)琉基、biotin雙修飾的DNA混合，加入化is緩沖液，最終 形成1 X Tris緩沖液，在25°C恒溫振蕩器上震蕩后，避光放置過夜，使琉基修飾的DNA分子與