鼻咽癌游離ebv-dna熒光pcr檢測(cè)試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及核酸巧光PCR檢測(cè)試劑盒，尤其設(shè)及鼻咽癌游離邸V-DNA巧光PCR檢測(cè) 試劑盒及其使用方法，屬于鼻咽癌體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼻咽癌是華南和東南亞的高發(fā)腫瘤，具有種族和地域特性，我國(guó)主要集中在廣東、 廣西、湖南、福建等華南省份，其發(fā)病率高達(dá)25/10萬(wàn)/年(25人每10萬(wàn)人每年），平均死亡率 達(dá)2.88/10萬(wàn)/年，在頭頸部腫瘤中高居首位，嚴(yán)重危害人民生命健康。研究表明EB病毒感染 與鼻咽癌密切相關(guān)。
[0003] EBV是一種瘤疹類病毒，在人群的攜帶率高達(dá)90%，人一旦感染后，就可能終身攜 帶，EBV主要感染人上皮細(xì)胞和B淋己細(xì)胞。EBV可W通過(guò)唾沫傳播，其感染途徑一般為:首先 在口咽部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，然后感染B淋己細(xì)胞。運(yùn)些被感染的B淋己細(xì)胞大量進(jìn)入血液循 環(huán)而造成全身性感染，并可長(zhǎng)期潛伏在人體淋己組織中，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，潛伏的 EBV活化形成復(fù)發(fā)感染。
[0004] 目前，針對(duì)鼻咽癌的臨床診斷主要依靠體格檢查、纖維鼻咽鏡、鼻咽部CT或MRI，遠(yuǎn) 處轉(zhuǎn)移主要依靠 PET/CT、胸腹部CT或胸片、腹部B超、骨掃描等檢查手段，但其項(xiàng)目繁多而費(fèi) 用昂貴，普適性較差，在此背景下，實(shí)驗(yàn)室診斷成為鼻咽癌診斷重要的組成部分。根據(jù)EBV與 鼻咽癌的密切關(guān)系，檢測(cè)人體中EBV的存在對(duì)鼻咽癌的早期診斷有很大的價(jià)值。由于EBV分 離培養(yǎng)困難，目前臨床一般用免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)兩種方法來(lái)輔助診斷，采用酶聯(lián)免 疫吸附試驗(yàn)巧LISA)或免疫組化法檢測(cè)血漿中特異性邸V抗體，用PCR技術(shù)對(duì)樣本中邸V-DNA 載量進(jìn)行檢測(cè)，W確定EBV的感染。
[0005] 血漿中游離的細(xì)胞外DNA(Cell-打ee DNA，cfDNA)最早發(fā)現(xiàn)于1948年，Mandel等人 在健康人和患病個(gè)體中均發(fā)現(xiàn)了運(yùn)些游離物質(zhì)的存在，從而推翻了 W往認(rèn)為只有細(xì)胞中才 含有遺傳物質(zhì)的觀點(diǎn)。1977年，Leon首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清游離DNA顯著高于正常人，由此 開(kāi)辟了游離DNA與惡性腫瘤關(guān)系研究的新領(lǐng)域。基于W上認(rèn)識(shí)，結(jié)合邸病毒在鼻咽癌病因和 發(fā)病中的特殊地位，Mutirangura運(yùn)用巢式PCR技術(shù)在既往邸病毒感染的健康患者和確診鼻 咽癌患者的血漿中進(jìn)行游離邸V-DNA化BV-C巧NA)檢測(cè)，前者均呈陰性，而后者血漿中則發(fā) 現(xiàn)31 %的檢出率，統(tǒng)計(jì)顯示，治療前血漿邸VDNA的濃度與腫瘤細(xì)胞調(diào)亡呈統(tǒng)計(jì)學(xué)正相關(guān)，提 示血漿EBVDNA主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，該研究首次掲示了外周血游離EBV-DNA和鼻咽癌 的關(guān)系。chan進(jìn)一步證實(shí)外周血邸V-DNA的10%-90% W82-18化P的小分子片段形式存在， 并且運(yùn)種小片段邸V-DNA占總邸V-DNA的比例與鼻咽癌癌體的大小W及是否復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)， 從而認(rèn)為其成因是腫瘤細(xì)胞崩解后基因組DNA發(fā)生碎裂，并釋放入血?？傊?，目前的觀點(diǎn)認(rèn) 為治療前外周血游離EBVDNA被認(rèn)為和腫瘤的壞死、調(diào)亡和增殖均相關(guān)，可W間接反映體內(nèi) 腫瘤的負(fù)荷;治療后外周血游離邸VDNA與病灶殘留、復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。
[0006] 隨著研究的進(jìn)步，2013版《頭頸部鱗癌綜合治療：中國(guó)專家共識(shí)》將血漿邸V-DNA載 量檢測(cè)作為鼻咽癌診斷和分期的指標(biāo)之一。研究表明，鼻咽癌患者血漿邸V-DNA主要W細(xì)胞 游離DM化BV-rfDNA)的形式存在，并且邸V-cf DM已成為鼻咽癌特異性腫瘤標(biāo)志物。
[0007]國(guó)內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)邸VDNA的試劑盒，但是都是檢 測(cè)的EBV病毒粒子DNA，而不是EBV-cfDNA，并且運(yùn)些試劑盒所提供的DNA提取方法主要是煮 沸裂解法、酪-氯仿法和膜親和層析，有很多不足之處:煮沸裂解法要反復(fù)加熱、容易爆管產(chǎn) 生污染;酪-氯仿法是操作繁瑣，對(duì)于設(shè)備和人員操作要求高，低病毒載量的標(biāo)本檢出率低， 且所用試劑具有一定的毒性;膜親和層析法需高速離屯、，還需要頻繁更換離屯、管，用時(shí)長(zhǎng)， 特異性較差;并且，運(yùn)種方法對(duì)于片段大小在82-18化P的小分子片段，抽提效果不好。擴(kuò)增 區(qū)域和探針類型也有差別，運(yùn)導(dǎo)致現(xiàn)有方法檢測(cè)靈敏度和特異性欠佳。
[000引雖然巧光實(shí)時(shí)定量PCR(FQ-PCR)是目前最適合也最常用的檢測(cè)游離邸V-DNA的手 段。然而，該技術(shù)定量結(jié)果的影響因素眾多，包括游離DNA的抽提、目的基因的選取、引物和 探針的設(shè)計(jì)，PCR設(shè)備、預(yù)混酶試劑的成分、循環(huán)數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品的選擇等多個(gè)方面，需要將各個(gè) 影響因素進(jìn)行優(yōu)化，W達(dá)到最佳的檢測(cè)效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有EBV巧光定量PCR檢測(cè)試劑盒的缺陷，提供一種操作快 速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高的EBV-cfDNA巧光定量PCR檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用該試劑盒，可W對(duì) 血清和/或血漿樣品中的EBV-cfDNA進(jìn)行快速檢測(cè)，為鼻咽癌的診斷和治療療效觀察提供參 考依據(jù)。
[0010] 本發(fā)明實(shí)施例中提供了一種鼻咽癌游離EBV-DNA化BV-C巧NA)巧光PCR檢測(cè)試劑 盒，包括W下各組分:核酸釋放劑，標(biāo)準(zhǔn)品，PCR反應(yīng)液，EBV陽(yáng)性對(duì)照W及EBV陰性對(duì)照，其 中，所述核酸釋放劑為T(mén)ri S-HC1和/或抓TA，其中Tri S-HC1濃度為0.8mo 1/L~1.2mo 1/L， 邸ΤΑ濃度為0.1mol/L~1. Omol/L;
[0011] 所述標(biāo)準(zhǔn)品為包含EBV-EBER區(qū)域?yàn)閿U(kuò)增區(qū)域的質(zhì)粒，其中，所述質(zhì)粒的濃度為 5.00E；+07copies/mL~5.00E；+04copies/mL。
[0012] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述PCR反應(yīng)液包括用于擴(kuò)增祀多核巧酸的上 下游引物，W及用于祀多核巧酸檢測(cè)的探針，其中，所述用于祀多核巧酸擴(kuò)增的上下游引物 及用于祀多核巧酸檢測(cè)的探針的堿基對(duì)序列分別為：
[0013] 上游引物：5 '-GAGAGGCTTCCCGCCTAGA-3 ' ；
[0014] 下游引物:5 ' -AAATAGCGGACAAGCCGAATA-3 ' ；
[0015] 探針：5 'FM-TCTCCCAGAGGGATTAGA-B冊(cè)13 '。
[0016] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述用于祀多核巧酸擴(kuò)增的上下游引物W及用 于祀多核巧酸檢測(cè)的探針的濃度分別為0.2ymol/L~0.4ymol/L和0.2ymol/L~0.4ymol/L。
[0017] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述PCR反應(yīng)液還包括5XPCR反應(yīng)緩沖液， 0.8mmol/L脫氧核糖核巧Ξ憐酸，511/化~洲/μL Tth DNA聚合酶和lU/yL~7υ/μΙ H-Taq DNA聚合酶。
[001引優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為5.00E+04copies/mL， 5.00E；+05copies/mL，5.00E；+06copies/mL和/或 5.00E；+07copies/mL。
[0019]優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述邸V陽(yáng)性對(duì)照為陰性血清稀釋的B958細(xì)胞 的培養(yǎng)上清，其濃度為1.00~5.00化05copies/mL。
[0020] 優(yōu)選的，上述的檢測(cè)試劑盒，其中，所述邸V陰性對(duì)照為陰性血清。
[0021] 本發(fā)明實(shí)施例中還提供了使用上述的檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)樣本中游離邸V-DNA的 方法，其包括如下步驟：
[0022] (1)制備待測(cè)樣本
[0023] 制備血漿樣本:選用抓TA抗凝全血，于抽血后1.5~2.5小時(shí)內(nèi)在1800~2200巧m/ min的條件下離屯、2~4分鐘，吸取上清，并移至干凈EP管中，在18000~22000巧m/min條件下 高速離屯、8~12分鐘去除細(xì)胞碎片，隨后將上清轉(zhuǎn)移于一新的EP管中備用;和/或
[0024] 制備血清樣本:選用新抽取的靜脈血，常溫放置25~35分鐘后，于1800~2000巧m/ min條件下離屯、2~4分鐘，吸取上清，并移至干凈EP管中備用；
[0025] (2)處理樣本和配置PCR反應(yīng)體系
[00%] (a)取化L~如L核酸釋放劑和祉L~12化步驟（1)中制備的待測(cè)樣本，充分混合均 勻，于室溫放置3~5分鐘，備用；
[0027] (b)分別取化L~祉L核酸釋放劑和化L~lOul陰性對(duì)照，6化~祉L核酸釋放劑和化 L~10化陽(yáng)性對(duì)照W及化L~10化核酸釋放劑和化L~10化標(biāo)準(zhǔn)品，充分混合均勻，于室溫放 置3~5分鐘，備用；
[002引（C)根據(jù)待測(cè)樣本，陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量，配置PCR反應(yīng)液，其中， PCR反應(yīng)液包括5 X PCR反應(yīng)緩沖液，0.8mmol/L脫氧核糖核巧Ξ憐酸，5UAiL~洲AiL Tth DM聚合酶，lU/yL~7υ/μΙ H-Taq DM聚合酶，0.2ymol/L~0.4ymol/L用于擴(kuò)增祀多核巧酸 的上游引物W及下游引物，0.2皿ol/L~0.4ymol/L用于祀多核巧酸檢測(cè)的探針，其中PCR反 應(yīng)緩沖液包括Tris-HCl，其濃度為lOOmmol/L，抑8，KC1，其濃度為15mmol/L，W及MgCl2,其