本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種PCR檢測方法，具體為基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法。

背景技術：

麗草蛉(Chrysopa formosa Brauer)，脈翅目，草蛉科，主要分布于我國的黑龍江、遼寧、吉林、北京、河北、山東、山西、河南、湖北、天津、甘肅、新疆、上海、四川、陜西等地區(qū)。成蟲和幼蟲的捕食能力都很強，主要捕食蚜蟲、介殼蟲、紅蜘蛛和多種昆蟲卵，也捕食蛾類幼蟲等。是田間生物防治的主要捕食性天敵。

集團內(nèi)捕食(Intraguild predation,簡稱IGP)作用是一種更為復雜的種間關系,廣泛存在于各種生態(tài)系中,充分認識IGP作用的內(nèi)在本質和作用機理,對發(fā)展和完善更有效的生物防治理論和策略、增強生物控害的功能、推進生物防治工程的建設有重大的意義。而常規(guī)的腸道解剖、行為觀察等傳統(tǒng)研究方法不能準確評價草蛉之間的捕食作用。目前，對麗草蛉的特異性檢測的方法尚未建立。

同時，傳統(tǒng)的草蛉鑒定是依據(jù)形態(tài)的差異，需具有一定的專業(yè)知識才能準確鑒定，而通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術進行鑒定只需常規(guī)分子生物學方面的知識就能解決，并且準確可靠、簡便快速。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法，具有檢測速度快的優(yōu)點。

本基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法包括以下步驟：

(1)制備特異性SS-COI引物：根據(jù)麗草蛉的線粒體DNA序列(genbank:KJ592501.1)，設計一對麗草蛉的特異性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’

反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’；

(2)提取樣品總DNA：在棉田采集麗草蛉，將單頭蟲體放入離心管中將其磨碎，用提取試劑盒提取單頭蟲體基因組溶液，將基因組溶液保存?zhèn)溆?，進行PCR擴增時吸取基因組溶液作為DNA模板；

(3)以步驟2)提取的總DNA為模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1進行PCR擴增反應；PCR反應體系以20μL計為：

(4)分析PCR產(chǎn)物：對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)大小為250bp的DNA擴增條帶，則表明樣品為麗草蛉。

在上述的基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法中，所述步驟(1)中，通過genbank的KJ592501.1，結合DNA條形碼技術中的通用引物：

LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

擴增出麗草蛉的COI產(chǎn)物，進行多條引物設計，從中篩選出特異性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。

在上述的基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法中，所述步驟(3)中PCR反應條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環(huán)次；最后，72℃10分鐘。

與現(xiàn)有的技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：采用SS-COI PCR技術檢測麗草蛉，該技術操作簡單、快速、高效，靈敏度較高，麗草蛉的DNA最低檢出濃度為0.143ng/μL。

附圖說明

圖1為本發(fā)明麗草蛉特異性引物CfF5/CfR1的PCR檢測結果圖。其中，M：100bp DNA ladder；1-64為表1中序號所對應昆蟲的擴增結果，-為陰性對照。

圖2為本發(fā)明麗草蛉特異性引物CfF5/CfR1的DNA濃度梯度檢測結果圖。其中，M：100bp DNA ladder；1-8為麗草蛉DNA原模板濃度89.54ng/μL依次4倍稀釋濃度梯度，-為陰性對照。

具體實施方式

如圖1、圖2所示，本方案包括以下步驟：

(1)制備特異性SS-COI引物：根據(jù)麗草蛉的線粒體DNA序列(genbank:KJ592501.1)，設計一對麗草蛉的特異性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’

反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’；

(2)提取樣品總DNA：在棉田采集麗草蛉，將單頭蟲體放入1.5mL離心管中將其磨碎，用OMEGA Insect Genomic DNA Kit提取試劑盒(OMEGA公司，美國)提取單頭蟲體基因組溶液。將基因組溶液保存于-20℃?zhèn)溆茫M行PCR擴增時吸取1μL溶液作為DNA模板；

(3)以步驟2)提取的總DNA為模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1進行PCR擴增反應；PCR反應體系以20μL計為：

(4)分析PCR產(chǎn)物：對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，取8μL PCR擴增產(chǎn)物，用1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成像系統(tǒng)中，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小來鑒定麗草蛉，如出現(xiàn)大小為250bp的DNA擴增條帶，則表明樣品為麗草蛉。

在上述的基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法中，所述步驟(1)中，通過genbank的KJ592501.1，結合DNA條形碼技術中的通用引物：

LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

擴增出麗草蛉的COI產(chǎn)物，進行多條引物設計，從中篩選出特異性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。

在上述的基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法中，所述步驟(3)中PCR反應條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環(huán)次；最后，72℃10分鐘。

利用引物CfF5/CfR1，以麗草蛉DNA為模板，以麗草蛉同域的44種其他昆蟲(見表1)為對照進行SS-COI PCR擴增，結果如圖1所示。1、2泳道對應的麗草蛉擴增出了250bp的目的條帶，表明根據(jù)麗草蛉線粒體DNA CO1基因設計的SS-COI引物的特異性強，其250bp序列如SEQ ID No.3所示。

表1引物特異性檢測中所涉及的昆蟲種類

第二部分，引物CfF5/CfR1對麗草蛉最低檢出量的測定

按第一部分中的方法提取單頭麗草蛉基因組DNA，然后原模板濃度89.54ng/μL以5倍進行遞減稀釋至檢測不出條帶，取1μL作為PCR檢測的模板，進行PCR反應，PCR反應條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環(huán)次；最后，72℃10分鐘。

利用引物CfF5/CfR1做最低檢出量的測定，麗草蛉的DNA最低檢出濃度為0.143ng/μL，結果如圖2所示。

本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。

序列表:

SEQ ID No.1

CfF5: 5'- TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG -3’

SEQ ID No.2

CfR1: 5’- TTGAAGATGCCAGTAATAAG -3’

SEQ ID No.3

1 TAGTTTAAGT TTATTAATTC GGGCTGAATT AGGTCAACCA GGATCTTTAATTGGTGATGA

61 TCAAATTTAT AATGTAATTG TAACAGCACA TGCTTTTATT ATAATTTTTTTTATAGTAAT

121 ACCAATTGTA ATTGGAGGTT TTGGTAATTG ATTAGTACCT TTAATACTTGCGGCTCCTGA

181 TATAGCTTTT CCACGTATAA ATAATATAAG TTTTTGAATA CTTCCTCCTTCATTAACCTT

241 ATTACTGGCA TCTTCAA

SEQ ID No.4

LepF1：5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’

SEQ ID No.5

LepR1：5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’