七種不同種屬來(lái)源細(xì)胞的pcr檢測(cè)引物和檢測(cè)方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的七種不同種屬來(lái)源的細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)的PCR檢測(cè)引物和檢測(cè)方法與應(yīng)用。本發(fā)明的檢測(cè)引物包括7對(duì)引物，且各引物僅對(duì)各自種屬細(xì)胞的細(xì)胞色素b(Cytb)基因片段有特異性擴(kuò)增，因此，用本發(fā)明的引物可以一次性對(duì)7種種屬來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的特異性，不僅可以對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用細(xì)胞的種屬來(lái)源(即細(xì)胞來(lái)源的可靠性)進(jìn)行鑒定，還可以對(duì)培養(yǎng)過程中是否存在不同種屬間細(xì)胞的交叉污染進(jìn)行判定，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
-t種不同種屬來(lái)源細(xì)胞的PCR檢測(cè)引物和檢測(cè)方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域，特別是設(shè)及實(shí)驗(yàn)室常用的屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞 (MD服、10邸、8服21、51\5?20、293、￥61?0)的？0?檢測(cè)引物和檢測(cè)方法，適用于細(xì)胞來(lái)源的鑒 定及細(xì)胞間交叉污染的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞是目前醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛、最重要的實(shí)驗(yàn)工 具之一，確定細(xì)胞來(lái)源的可靠性W及培養(yǎng)過程中是否存在不同種屬間細(xì)胞的交叉污染，對(duì) 于實(shí)驗(yàn)成功至關(guān)重要。目前，實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法主要有染色體分析、STR分析、同工酶圖 譜分析法，運(yùn)些方法成本較高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且可鑒定的種屬范圍較窄。針對(duì)運(yùn)些情況，后續(xù) 又開發(fā)出了 PCR檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)方法比較，PCR檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢測(cè)范 圍寬等特點(diǎn)，并且細(xì)胞使用量小，利于在實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用。
[0003] 在PCR檢測(cè)方法中，常選用線粒體DNA(mtDNA)作為目的基因。線粒體DNA是動(dòng)物體 內(nèi)唯一存在的核內(nèi)遺傳信息載體，為共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀分子，大多數(shù)脊椎動(dòng)物的線粒體 DNA約為16化，包括由37個(gè)基因組成的編碼區(qū)和一段長(zhǎng)度可變的非編碼序列（又稱控制區(qū)或 D-1 OOP)，37個(gè)基因中包括2個(gè)rRNA基因（12SrRNA和16SrRNA)，22個(gè)tRNA基因和13個(gè)蛋白質(zhì) 基因。線粒體基因分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，并且種屬間特異性高、進(jìn)化速度快、嚴(yán)格遵守母性遺 傳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MD服、MDCK、B皿21、ST、 SP20、293、VER0)的切tb基因設(shè)計(jì)特異性引物并建立PCR檢測(cè)方法，用W檢測(cè)細(xì)胞來(lái)源是否 可靠，W及鑒別培養(yǎng)過程中細(xì)胞是否存在交叉污染。
[0005] 本發(fā)明所提供的用于對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VER0)進(jìn)行PCR檢測(cè)的引物，其序列如下(見表1):
[0006] 1)用于檢測(cè)來(lái)源于牛的MDBK細(xì)胞(牛腎細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序列 1所示，其下游引物如序列表中序列2所示；
[0007] 2)用于檢測(cè)來(lái)源于狗的MDCK細(xì)胞(狗腎細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序列 3所示，其下游引物如序列表中序列4所示；
[000引3)用于檢測(cè)來(lái)源于倉(cāng)鼠的B皿21細(xì)胞(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表 中序列5所示，其下游引物如序列表中序列6所示；
[0009] 4)用于檢測(cè)來(lái)源于豬的ST細(xì)胞(豬睪丸細(xì)胞)的引物，其上游引物如序列表中序列 7所示，其下游引物如序列表中序列8所示；
[0010] 5)用于檢測(cè)來(lái)源于鼠的SP20細(xì)胞(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)的引物，其上游引物如序列表 中序列9所示，其下游引物如序列表中序列10所示；
[0011] 6)用于檢測(cè)來(lái)源于人的293細(xì)胞(人腎上皮細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中 序列11所示，其下游引物如序列表中序列12所示;和/或
[0012] 7)用于檢測(cè)來(lái)源于非洲綠猴的VERO細(xì)胞(猴腎細(xì)胞)的引物，其上游引物如序列表 中序列13所示，其下游引物如序列表中序列14所示。
[0013] 本發(fā)明所提供的用上述引物對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、 SP20、293、VERO)進(jìn)行PCR檢測(cè)的方法，可包括W下步驟：
[0014] 1)提取待測(cè)細(xì)胞的基因組DNA;
[001引2似待測(cè)細(xì)胞的基因組DNA為模板，用上述7對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體 系為（2扣L):2XDream Taq? Green PCR Master Mix^hermo公司）12.扣L，DNA模板（lOng/ 化)化L，上游引物0.化L，下游引物0 .扣L，此0 9.5化;PCR反應(yīng)程序?yàn)椋合?5 °C預(yù)變性5min; 然后95°C變形30s，退火(退火溫度見表l)30s，72°C延伸Imin，共35個(gè)循環(huán);最后72°C完全延 伸lOmin;
[0016] 3)PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量均為10化， 若出現(xiàn)93化p(序列表中序列15)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于牛的MD服細(xì)胞;若出 現(xiàn)439bp(序列表中序列16)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于狗的MDCK細(xì)胞;若出現(xiàn) 198bp(序列表中序列17)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于倉(cāng)鼠的B皿21細(xì)胞;若出現(xiàn) 780bp(序列表中序列18)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于豬的ST細(xì)胞;若出現(xiàn)839bp (序列表中序列19)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于鼠的SP20細(xì)胞;若出現(xiàn)689bp(序 列表中序列20)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于人的293細(xì)胞;若出現(xiàn)39化p(序列表 中序列21)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于非洲綠猴的VER0細(xì)胞。
[0017]在上述檢測(cè)方法中，所述步驟2)中用于檢測(cè)牛源MDBK細(xì)胞的退火溫度為55。用 于檢測(cè)狗源MDCK的退火溫度為60°C ;用于檢測(cè)倉(cāng)鼠源BHK21細(xì)胞的退火溫度為60°C ;用于檢 測(cè)豬源ST細(xì)胞的退火溫度為65°C ;用于檢測(cè)鼠源SP20細(xì)胞的退火溫度為55°C ;用于檢測(cè)人 源293細(xì)胞的退火溫度為58°C ;用于檢測(cè)非洲綠猴源VER0細(xì)胞的退火溫度為60°C。
[0018] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供鑒別細(xì)胞污染與否的方法，用前述方法對(duì)待測(cè)細(xì)胞分別進(jìn)行 針對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0 )DNA的PCR檢測(cè)，依據(jù)所 出現(xiàn)的目的條帶進(jìn)行W下鑒別：
[0019] 僅出現(xiàn)用待測(cè)細(xì)胞檢測(cè)引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的目的條帶，不出現(xiàn)用其它細(xì)胞檢測(cè)引物 擴(kuò)增的目的條帶，判定待測(cè)物細(xì)胞無(wú)污染;和
[0020] 出現(xiàn)用待測(cè)細(xì)胞檢測(cè)引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的目的條帶，同時(shí)出現(xiàn)用其它細(xì)胞檢測(cè)引物 擴(kuò)增的目的條帶，判定待測(cè)物細(xì)胞被其它細(xì)胞污染，且出現(xiàn)目的條帶的對(duì)應(yīng)細(xì)胞為污染細(xì) 胞?；?br>[0021] 出現(xiàn)用待測(cè)細(xì)胞檢測(cè)引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的目的條帶，同時(shí)微弱出現(xiàn)用其它細(xì)胞檢測(cè) 引物擴(kuò)增的目的條帶，判定待測(cè)物細(xì)胞可能被其它細(xì)胞污染，且出現(xiàn)微弱目的條帶的對(duì)應(yīng) 細(xì)胞為可疑細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明還提供一種用于對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、SP20、 293、VERO)進(jìn)行PCR檢測(cè)的試劑盒。
[0023] 本發(fā)明所提供的試劑盒包括上述用于對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞（MDBK、MDCK、 B服21、ST、SP20、293、VERO)進(jìn)行 PCR檢測(cè)的引物。
[0024] 本發(fā)明所提供的試劑盒還包括用于25化PCR反應(yīng)體系的試劑，包括：2 X化earn Taq? Green PCR Master ]?1又（化6^11〇公司）12.化L，上游引物0.扣L，下游引物0.化L，此0 9.如L。
[0025] 本發(fā)明針對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的屯種不同種屬來(lái)源的細(xì)胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、 293、VER0)提供了 PCR檢測(cè)引物和檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)引物包括7對(duì)引物，且各引物僅對(duì) 各自種屬細(xì)胞的細(xì)胞色素 b(切tb)基因片段有特異性擴(kuò)增，因此，用本發(fā)明的引物可W-次 性對(duì)巧巾種屬來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的特異性，不僅可W對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用細(xì)胞的種屬 來(lái)源（即細(xì)胞來(lái)源的可靠性)進(jìn)行鑒定，還可W對(duì)培養(yǎng)過程中是否存在不同種屬間細(xì)胞的交 叉污染進(jìn)行判定，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)W及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明具有特異性 強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為巧中引物對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳圖；
[002引圖2為牛源引物對(duì)(C-F和C-R)對(duì)牛源MD服細(xì)胞的特異性檢測(cè)結(jié)果；
[0029] 圖3為狗源引物對(duì)(D-F和D-R)對(duì)狗源MDCK細(xì)胞的特異性檢測(cè)結(jié)果；
[0030] 圖4為倉(cāng)鼠源引物對(duì)(M-F和M-R)對(duì)倉(cāng)鼠源B服21細(xì)的特異性檢測(cè)結(jié)果；
[0031] 圖5為豬源引物對(duì)(P-F和P-R)對(duì)豬源ST細(xì)胞的特異性檢測(cè)結(jié)果；
[0032] 圖6為鼠源引物對(duì)(R-F和R-R)對(duì)鼠源SP20細(xì)胞的特異性檢測(cè)結(jié)果；
[0033] 圖7為人源引物對(duì)化-F和H-R)對(duì)人源293細(xì)胞的特異性檢測(cè)結(jié)果；
[0034] 圖8為非洲綠猴源引物對(duì)(GM-F和GM-R)對(duì)非洲綠猴源VER0細(xì)胞的特異性檢測(cè)結(jié) 果；
[0035] 圖9為牛源引物對(duì)(C-F和C-R)對(duì)牛源MDBK細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；
[0036] 圖10為狗源引物對(duì)(D-F和D-R)對(duì)狗源MDCK細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；
[0037] 圖11為倉(cāng)鼠源引物對(duì)(M-F和M-R)對(duì)倉(cāng)鼠源B服21細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；
[0038] 圖12為豬源引物對(duì)(P-F和P-R)對(duì)豬源ST細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；
[0039] 圖13為鼠源引物對(duì)(R-F和R-R)對(duì)鼠源SP20細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；
[0040] 圖14為人源引物對(duì)化-F和H-R)對(duì)人源293細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；
[0041 ] 圖15為非洲綠猴源(GM-F和GM-R)對(duì)非洲綠猴源VER0細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；
[0042 ]圖16為倉(cāng)鼠源B服21細(xì)胞樣品的檢測(cè)結(jié)果；
[0043] 圖17為豬源ST細(xì)胞樣品的檢測(cè)結(jié)果；
[0044] 圖18為牛源MD服細(xì)胞樣品的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russel1，David W.， Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
[0046] 所述百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/質(zhì)量(W/W，單位g/lOOg)百分比濃度、質(zhì) 量/體積(W/V，單位g/lOOmU百分比濃度或體積/體積(V/V，單位mL/lOOmU百分比濃度。
[0047] 實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑W達(dá) 到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的 來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可W按照實(shí)施例中的提 示替換使用。
[0048] 所用引物由華大基因公司合成。
[0049] 實(shí)施例在W本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的 操作過程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[(K)加]實(shí)施例1、設(shè)計(jì)用于對(duì)屯種不同種屬來(lái)源的細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VER0)進(jìn)行PCR檢測(cè)的引物
[0051 ] PCR檢測(cè)中常選用線粒體DNA(mtDNA)作為目的基因，發(fā)明人分析確認(rèn)線粒體DNA中 的細(xì)胞色素 b(切tb)基因作為種屬鑒定的目的基因較為適宜。運(yùn)是因?yàn)榍衪b基因全長(zhǎng)約為 1100-1200bp，在物種間序列長(zhǎng)度沒有明顯差異，但在核巧酸組成上具有偏好，并且具有種 間的差異。Cytb基因的編碼序列區(qū)進(jìn)化緩慢、相對(duì)保守，在所有哺乳動(dòng)物中都存在。
[0化2] 基于W上構(gòu)思，發(fā)明人檢索Genbank上屯種不同種屬來(lái)源的細(xì)胞（MDBK、MDCK、 6服21、51\5?20、293、￥61?0)的細(xì)胞色素6化7計(jì))基因的核巧酸序列，用生物信息學(xué)的方法對(duì) 細(xì)胞色素 b基因的核巧酸序列進(jìn)行比對(duì)，選取各種細(xì)胞的細(xì)胞色素 b基因高度保守且具有特 異性的序列(保守區(qū)）為PCR檢測(cè)的各祀目標(biāo)(發(fā)明人分析細(xì)胞色素 b基因長(zhǎng)度較小，可W將 其全長(zhǎng)當(dāng)做保守序列設(shè)計(jì)引物），用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerE邱ress6.0分別設(shè)計(jì)用于PCR檢測(cè) 的特異性引物。
[0053] 屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MD服、]\?)〇(、8服21、51'、5口20、293、￥61?0)細(xì)胞色素6基因保 守區(qū)核巧酸序列參見表1:
[0054] 表1引物設(shè)計(jì)參考序列
[0化5]
[0056]獲得的各引物序列如表2所不：
[0057] 表2用于對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(]\?)61(、]\?)〇(、8服21、51'、5?20、293、￥邸0)進(jìn)行 PCR檢測(cè)的引物
[0化引 [0化9]
[0060] 實(shí)施例2、建立屯種不同種屬來(lái)源的細(xì)胞(MD服、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、VER0) 的PCR檢測(cè)方法
[0061 ] 本發(fā)明用實(shí)施例1中的引物對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、 SP20、293、VER0)進(jìn)行PCR檢測(cè)，包括W下步驟：
[0062] 1)提取待測(cè)細(xì)胞的基因組DNA
[0063] 選取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293和VER0 7種細(xì)胞，提取基因組 DNA，具體步驟如下：
[0064] (1)取凍存的MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293和VER0 7種細(xì)胞各兩支，將凍存管置 于37 °C溫水中快速解凍，收集細(xì)胞于1.5mL離屯、管中，800化mp離屯、lOmin，棄上清，分別用 ImL PBS重懸細(xì)胞；
[00化](2)取重懸后的細(xì)胞20化L至新的1.5mL離屯、管中，加入ImL DNAzol裂解液振蕩混 勻，靜置10分鐘裂解；
[0066] (3)12000rpm離屯、10分鐘，取上清約800化至新的1.5mL離屯、管中，加入500化無(wú)水 乙醇，輕輕混勻靜置5分鐘，使DNA析出；
[0067] (4) 1200化pm離屯、10分鐘，棄上清，加入80化L 75%乙醇洗涂DNA沉淀，輕輕混勻后 12000巧m離屯、5分鐘；
[0068] (5)重復(fù)上一步驟；
[0069] (6)棄上清，待離屯、管中殘留液體驚干后，加入20化無(wú)酶水溶解DNA沉淀，-20°C凍 存?zhèn)溆谩?br>[0070] 2) W待測(cè)細(xì)胞的基因組DNA為模板，用化no化op對(duì)各細(xì)胞的基因組DNA測(cè)定濃度， 分別稀釋至lOng/化，用上述7對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為（2化L): 2 X化earn Taq? Green PCR Master Mix^hermo公司）12.5化，0臟模板（10雌/化）2化，上游引物0.5^ L，下游引物0.扣L，此0 9.5化;PCR反應(yīng)程序?yàn)?先95°C預(yù)變性5min;然后95°C變形30s，退火 (退火溫度見表l)30s，72°C延伸Imin，共35個(gè)循環(huán);最后72°C完全延伸lOmin。
[0071] 3)PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量均為10化， 如圖巧日表1所示，若出現(xiàn)93化p(序列表中序列15)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于牛 的MDBK細(xì)胞;若出現(xiàn)439bp(序列表中序列16)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于狗的 MDCK細(xì)胞;若出現(xiàn)198bp (序列表中序列17)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于倉(cāng)鼠的 BHK21細(xì)胞;若出現(xiàn)780bp(序列表中序列18)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于豬的ST 細(xì)胞;若出現(xiàn)839bp(序列表中序列19)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于鼠的SP20細(xì) 胞;若出現(xiàn)689bp(序列表中序列20)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于人的293細(xì)胞;若 出現(xiàn)39化p(序列表中序列21)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于非洲綠猴的VER0細(xì)胞。
[0072] 實(shí)施例3、本發(fā)明引物及檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)
[0073] W濃度為lOng/化的屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、 V邸0)的基因組DNA為模板，分別用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的屯對(duì)引物對(duì)屯種模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè) 各對(duì)引物的特異性。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序與實(shí)施例2相同，PCR反應(yīng)完成后對(duì)PCR產(chǎn)物 進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量均為10化。
[0074] 結(jié)果如圖2-圖8所示：
[0075] 圖2為牛源引物對(duì)(C-F和C-R)對(duì)巧巾細(xì)胞基因組DNA模板的特異性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果 顯示牛源特異性引物僅對(duì)牛源MDBK細(xì)胞的DNA模板擴(kuò)增出932bp片段，對(duì)其它種屬細(xì)胞的 DNA模板無(wú)擴(kuò)增條帶;說(shuō)明牛源引物對(duì)(C-F和C-R)對(duì)牛源MD服細(xì)胞DNA有特異性。
[0076] 圖3為狗源引物對(duì)(D-F和D-R)對(duì)巧巾細(xì)胞基因組DNA模板的特異性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果 顯示狗源特異性引物僅對(duì)狗源MDCK細(xì)胞DNA模板擴(kuò)增出439bp片段，對(duì)其它種屬細(xì)胞的DNA 模板無(wú)擴(kuò)增條帶;說(shuō)明狗源引物對(duì)(D-F和D-R)對(duì)狗源MDCK細(xì)胞DNA有特異性。
[0077] 圖4為倉(cāng)鼠源引物對(duì)(M-F和M-R)對(duì)巧中細(xì)胞基因組DNA模板的特異性檢測(cè)結(jié)果，結(jié) 果顯示倉(cāng)鼠源特異性引物僅對(duì)倉(cāng)鼠源B皿21細(xì)胞DNA模板擴(kuò)增出198bp片段，對(duì)其它種屬細(xì) 胞的DNA模板無(wú)擴(kuò)增條帶;說(shuō)明倉(cāng)鼠源引物對(duì)(M-F和M-R)對(duì)倉(cāng)鼠源BHK21細(xì)胞DNA有特異性。 [007引圖5為豬源引物對(duì)(P-F和P-R)對(duì)巧中細(xì)胞基因組DNA模板的特異性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果 顯示豬源特異性引物僅對(duì)豬源ST細(xì)胞的DNA模板擴(kuò)增出780bp片段，對(duì)其它種屬細(xì)胞的DNA 模板無(wú)擴(kuò)增條帶;說(shuō)明豬源引物對(duì)(P-F和P-R)對(duì)豬源ST細(xì)胞的DNA有特異性。
[0079] 圖6為鼠源引物對(duì)(R-F和R-R)對(duì)巧中細(xì)胞基因組DNA模板的特異性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果 顯示鼠源特異性引物僅對(duì)鼠源SP20細(xì)胞的DNA模板擴(kuò)增出839bp片段，雖然對(duì)其它種屬細(xì)胞 的DNA模板有擴(kuò)增條帶，但位置與目的片段不符;說(shuō)明鼠源引物對(duì)(R-F和R-R)對(duì)鼠源SP20細(xì) 胞的DNA有特異性。
[0080] 圖7為人源引物對(duì)化-F和H-R)對(duì)巧巾細(xì)胞基因組DNA模板的特異性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果 顯示人源特異性引物僅對(duì)人源293細(xì)胞的DNA模板擴(kuò)增出689bp片段，雖然對(duì)其它種屬細(xì)胞 的DNA模板有擴(kuò)增條帶，但位置與目的片段不符;說(shuō)明人源引物對(duì)化-F和H-R)對(duì)人源293細(xì) 胞的DNA有特異性。
[0081 ]圖8為非洲綠猴源引物對(duì)(GM-F和GM-R)對(duì)巧巾細(xì)胞基因組DNA模板的特異性檢測(cè)結(jié) 果，結(jié)果顯示非洲綠猴源特異性引物僅對(duì)非洲綠猴源VER0細(xì)胞的DNA模板擴(kuò)增出390bp片 段，雖然對(duì)其它種屬細(xì)胞的DM模板有擴(kuò)增條帶，但位置與目的片段不符。說(shuō)明洲綠猴源引 物對(duì)(GM-F和GM-R)對(duì)對(duì)非洲綠猴源VERO細(xì)胞的DNA有特異性。
[0082] 實(shí)施例4、本發(fā)明引物及檢測(cè)方法的靈敏性檢測(cè)
[0083] 將巧中不同種屬來(lái)源細(xì)胞（MDBK、MDCK、B服21、51\5口20、293、￥61?0)的基因組0麻 (lOng/化)按照10倍梯度稀釋后作為模板，濃度分別為10ngAiL、lngAiL、0.1ngAiL、0.01ng/ 化，分別用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的7對(duì)引物對(duì)7種不同濃度的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)各對(duì)引物的靈 敏性。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序與實(shí)施例2相同，PCR反應(yīng)完成后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量均為lOyL。
[0084] 結(jié)果如圖9-圖15所示：
[0085] 圖9為牛源引物對(duì)(C-F和C-R)對(duì)牛源MDBK細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示模板 濃度為0.0 lng/iiL時(shí)仍能檢測(cè)到明亮條帶；
[0086] 圖10為狗源引物對(duì)化-F和D-R)對(duì)狗源MDCK細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示模板 濃度為0.0 lng/iiL時(shí)仍能檢測(cè)到明亮條帶；
[0087] 圖11為倉(cāng)鼠源引物對(duì)(M-F和M-R)對(duì)倉(cāng)鼠源B皿21細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯 示模板濃度為0.0 lng/iiL時(shí)仍能檢測(cè)到明亮條帶；
[0088] 圖12為豬源引物對(duì)(P-F和P-R)對(duì)豬源ST細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示模板濃 度為0.0 lng/iiL時(shí)仍能檢測(cè)到明亮條帶；
[0089] 圖13為鼠源引物對(duì)(R-F和R-R)對(duì)鼠源SP20細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示模板 濃度為0.1 ng/iiL時(shí)仍能檢測(cè)到明亮條帶；
[0090] 圖14為人源引物對(duì)化-F和H-R)對(duì)人源293細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示模板 濃度為0.0 lng/iiL時(shí)仍能檢測(cè)到明亮條帶；
[0091] 圖15為非洲綠猴源(GM-F和GM-R)對(duì)非洲綠猴源VER0細(xì)胞的靈敏性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果 顯示模板濃度為0.1 ng/iiL時(shí)仍能檢測(cè)到明亮條帶。
[0092] 實(shí)施例5、用本發(fā)明的引物及檢測(cè)方法對(duì)倉(cāng)鼠源BHK21細(xì)胞、豬源ST細(xì)胞、牛源MD服 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)
[0093] 將倉(cāng)鼠源B皿21細(xì)胞、豬源ST細(xì)胞、牛源MDBK細(xì)胞的基因組DNA(lOngAiL)作為模 板，分別用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的7對(duì)引物對(duì)S種不同的模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng) 程序與實(shí)施例2相同，PCR反應(yīng)完成后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量均 為10化。
[0094] 結(jié)果如圖16-圖18所示，倉(cāng)鼠源B皿21細(xì)胞僅在用倉(cāng)鼠源引物對(duì)(M-F和M-R)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)198bp的目的條帶，用其它引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)雖有擴(kuò)增條帶，但不屬于目的條 帶，說(shuō)明細(xì)胞無(wú)污染；
[0095] 豬源ST細(xì)胞除在用豬源引物對(duì)(P-F和P-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)780bp的目的條帶 夕h在用非洲綠猴源引物對(duì)（GM-F和GM-R)和倉(cāng)鼠源引物對(duì)(M-F和M-R)擴(kuò)增時(shí)分別出現(xiàn) 390bp和198bp的條帶，判定該豬源ST細(xì)胞可能有非洲綠猴源和倉(cāng)鼠源細(xì)胞的污染；
[0096] 牛源MD服細(xì)胞除在用牛源引物對(duì)(C-F和C-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)932bp的目的條 帶外，在用倉(cāng)鼠源引物對(duì)(M-F和M-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)中也出現(xiàn)較淺的198bp的條帶，可能有 倉(cāng)鼠源細(xì)胞的污染，判定為可疑。
[0097] 實(shí)施例6、制備用于對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、 VERO)進(jìn)行PCR檢測(cè)的試劑盒
[009引本發(fā)明的試劑盒包括實(shí)施例1中用于對(duì)屯種不同種屬來(lái)源細(xì)胞（MDBK、MDCK、 B服21、ST、SP20、293、VERO)進(jìn)行 PCR檢測(cè)的引物；
[0099] 本發(fā)明的試劑盒還包括用于25化PCR反應(yīng)體系的試劑，包括：2X化earn Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司）12.^iL，上游引物O.^iL，下游引物O.^iL，出0 9.扣L。
[0100] 本發(fā)明試劑盒的使用方法參見實(shí)施例2。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于對(duì)七種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)進(jìn)行PCR檢測(cè) 的引物，其序列如下： 1) 用于檢測(cè)來(lái)源于牛的MDBK細(xì)胞（牛腎細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序列1所 示，其下游引物如序列表中序列2所示； 2) 用于檢測(cè)來(lái)源于狗的MDCK細(xì)胞(狗腎細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序列3所 示，其下游引物如序列表中序列4所示； 3) 用于檢測(cè)來(lái)源于倉(cāng)鼠的BHK21細(xì)胞(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序 列5所示，其下游引物如序列表中序列6所示； 4) 用于檢測(cè)來(lái)源于豬的ST細(xì)胞(豬睪丸細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序列7所 示，其下游引物如序列表中序列8所示； 5) 用于檢測(cè)來(lái)源于鼠的SP20細(xì)胞(小鼠骨髓瘤細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序 列9所示，其下游引物如序列表中序列10所示； 6) 用于檢測(cè)來(lái)源于人的293細(xì)胞（人腎上皮細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序列 11所示，其下游引物如序列表中序列12所示;和/或 7) 用于檢測(cè)來(lái)源于非洲綠猴的VERO細(xì)胞(猴腎細(xì)胞）的引物，其上游引物如序列表中序 列13所示，其下游引物如序列表中序列14所示。2. 對(duì)七種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)進(jìn)行PCR檢測(cè)的方 法，包括以下步驟： 1) 提取待測(cè)細(xì)胞的基因組DNA; 2) 以待測(cè)細(xì)胞的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的七對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR反應(yīng)體系為（25yL):2XDream Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司）12.5yL，DNA 模板（1 〇ng/yL) 2yL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，H20 9.5yL; PCR反應(yīng)程序?yàn)?先95 °C預(yù) 變性5min;然后95°C變形30s，退火(退火溫度見表l)30s，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán);最后 72°C完全延伸lOmin; 3 )PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量均為10yL，若出 現(xiàn)932bp(序列表中序列15)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于牛的MDBK細(xì)胞;若出現(xiàn) 439bp(序列表中序列16)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于狗的MDCK細(xì)胞；若出現(xiàn) 198bp(序列表中序列17)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于倉(cāng)鼠的BHK21細(xì)胞;若出現(xiàn) 780bp(序列表中序列18)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于豬的ST細(xì)胞;若出現(xiàn)839bp (序列表中序列19)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于鼠的SP20細(xì)胞;若出現(xiàn)689bp(序 列表中序列20)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于人的293細(xì)胞;若出現(xiàn)390bp(序列表 中序列21)的目的條帶，則待測(cè)細(xì)胞中含有來(lái)源于非洲綠猴的VER0細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟2)中的退火溫度為： 用于檢測(cè)牛源MDBK細(xì)胞的退火溫度為55°C ; 用于檢測(cè)狗源MDCK的退火溫度為60°C ; 用于檢測(cè)倉(cāng)鼠源BHK21細(xì)胞的退火溫度為60°C ; 用于檢測(cè)豬源ST細(xì)胞的退火溫度為65°C ; 用于檢測(cè)鼠源SP20細(xì)胞的退火溫度為55°C ; 用于檢測(cè)人源293細(xì)胞的退火溫度為58°C ; 用于檢測(cè)非洲綠猴源VERO細(xì)胞的退火溫度為60°C。4. 鑒別細(xì)胞污染與否的方法，用權(quán)利要求2或3所述方法對(duì)待測(cè)細(xì)胞分別進(jìn)行針對(duì)七種 不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)DNA的PCR檢測(cè)，依據(jù)所出現(xiàn)的目 的條帶進(jìn)行以下鑒別： 僅出現(xiàn)用待測(cè)細(xì)胞檢測(cè)引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的目的條帶，不出現(xiàn)用其它細(xì)胞檢測(cè)引物擴(kuò)增 的目的條帶，判定待測(cè)物細(xì)胞無(wú)污染;和出現(xiàn)用待測(cè)細(xì)胞檢測(cè)引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的目的條帶， 同時(shí)出現(xiàn)用其它細(xì)胞檢測(cè)引物擴(kuò)增的目的條帶，判定待測(cè)物細(xì)胞被其它細(xì)胞污染，且出現(xiàn) 目的條帶的對(duì)應(yīng)細(xì)胞為污染細(xì)胞。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述鑒別細(xì)胞污染與否的方法，還包括以下鑒別： 出現(xiàn)用待測(cè)細(xì)胞檢測(cè)引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的目的條帶，同時(shí)微弱出現(xiàn)用其它細(xì)胞檢測(cè)引物 擴(kuò)增的目的條帶，判定待測(cè)物細(xì)胞可能被其它細(xì)胞污染，且出現(xiàn)微弱目的條帶的對(duì)應(yīng)細(xì)胞 為可疑細(xì)胞。6. -種用于對(duì)七種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)進(jìn)行PCR 檢測(cè)的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的用于對(duì)七種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、 ST、SP20、293、VERO)進(jìn)行PCR檢測(cè)的引物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括用于25yL PCR反應(yīng)體 系的試劑，包括：2XDream Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司）12.5yL，上游引物 〇.5yL，下游引物0.5yL，H20 9.5yL。8. 權(quán)利要求1所述的用于對(duì)七種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VERO)進(jìn)行PCR檢測(cè)的引物在對(duì)細(xì)胞來(lái)源的可靠性以及培養(yǎng)過程中是否存在不同種屬間細(xì) 胞的交叉污染進(jìn)行判定中的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求6或7所述的用于對(duì)七種不同種屬來(lái)源細(xì)胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、 293、VER0)進(jìn)行PCR檢測(cè)的試劑盒在對(duì)細(xì)胞來(lái)源的可靠性以及培養(yǎng)過程中是否存在不同種 屬間細(xì)胞的交叉污染進(jìn)行判定中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK106048054SQ201610634844
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月3日 公開號(hào)201610634844.0, CN 106048054 A, CN 106048054A, CN 201610634844, CN-A-106048054, CN106048054 A, CN106048054A, CN201610634844, CN201610634844.0
【發(fā)明人】韓志玲, 郝鵬, 陳光達(dá), 商曉桂, 閆聰, 陳君彥, 張貴剛, 范秀麗, 劉國(guó)英, 魏學(xué)峰
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