一種黃芪指紋圖譜的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥指紋圖譜領域，特別涉及一種黃茂指紋圖譜的測定方法。
【背景技術】
[0002] 黃茂的基源植物為豆科植物蒙古黃茂Astragalus membranaceus (Fisch. )Bge. var. mongholicus 炬ge. )hsiao 或膜芙黃茂 A. membranaceus (Fisch. )Bge.的根。黃茂中 含有多種化學成分，如黃麗、皂巧類及多糖類等成分.黃麗類成分W異黃麗類成分為主如 芒柄花黃素、3' -輕基芒柄花黃素（毛蕊異黃麗）及其葡萄糖式、2'，3' -二輕基-7, 4' -二 甲氧基異黃麗、7, 2'-二輕基-3'，4'-二甲氧基異黃茂黃焼及其葡萄糖式、7, 3'-二輕 基-4'，5' -二甲氧基異黃焼、3-輕基-9, 10-二甲氧基紫檀焼及其葡萄糖巧等.其中有些成 分具較強的抗氧化活性.皂巧類成分有黃茂皂巧I?理及大豆皂巧I ;黃茂甲巧（即黃茂 皂式IV)與黃茂己巧是其中的主要成分。
[0003] 黃茂具有補氣固表，利尿巧毒，排賊，斂瘡生肌的功效。用于氣虛乏力，食少便搪， 中氣下陷，久瀉脫化，便血崩漏，表虛自汗，痛痘難潰，久潰不斂，血虛萎黃，內熱消渴?，F(xiàn)代 研究表明黃茂具有增強非特異性免疫功能，黃茂能顯著增加血液中的白細胞總數(shù)，促進中 性粒細胞及巨瞻細胞的吞瞻功能和殺菌能力。增強特異性免疫功能黃茂能明顯增強細胞免 疫，促進PHA、C0nA、PWM(美洲商陸）引起的淋己細胞轉化。增強抗疲勞的作用，黃茂能增強 大鼠和小鼠的肌力。大鼠灌胃黃茂水煎液6天或14天，能增強大鼠游泳耐疲勞的作用，并 使游泳應激大鼠血漿皮質醇含量明顯增加，超過空白應激組和正常對照組的水平。減緩自 然衰老的作用，黃茂能延長家蠶和果禍的平均壽命，減緩人胎肺二倍體細胞體外培養(yǎng)的自 然衰老過程，使細胞壽命延長達98代，對照組僅為61-66代，使壽命延長1/3。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種黃茂指紋圖譜的測定方法，該方法所得黃 茂指紋圖譜的峰多，峰形好，峰分離效果好，易于鑒別，相似性高，準確可靠，確定26個色譜 峰為共有色譜峰，經(jīng)過參比對照品溶液色譜峰確定了 7個成分。
[0005] 本發(fā)明的一種黃茂指紋圖譜的測定方法，包括：
[0006] (1)取黃茂中粉，精密稱定，加入甲醇，35KHZ超聲提取60min，過濾，濾液揮干，殘 渣加甲醇溶解、定容并用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；
[0007] (2)取毛蕊異黃麗葡萄糖巧對照品、芒柄花巧對照品、9, 10-二甲氧基紫檀 焼-3-0-目-D葡萄化喃糖巧對照品、毛蕊異黃麗對照品、黃茂甲巧對照品、黃茂皂巧III對照 品、芒柄花素對照品、黃茂皂巧I對照品，精密稱定，分別加入甲醇制成對照品溶液；
[0008] (3)分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀測定，即得黃 茂指紋圖譜；其中，色譜條件為：色譜柱:Athena C18-WP色譜柱；柱溫；3(TC ;檢測波長： 208nm ;進樣體積；lOy 1 ;流速；1ml ? mirTV流動相；流動相A為水，流動相B為己膳；梯度 洗脫程序；〇 ?20min ;5% B - 20% B，20 ?70min ;20% B - 40% B，70 ?85min ;40% B - 60% B。
[000引所述步驟（1)中的黃茂中粉與甲醇的比例為lg:20ml。
[0010] 所述步驟（1)中的微孔濾膜的孔徑為0. 22 y m。
[0011] 所述步驟（2)中的對照品與甲醇的比例為0. 05?1. 5mg: 1ml。
[0012] 所述步驟（2)中的對照品溶液具體為：每1ml各含毛蕊異黃麗巧0. 2mg、芒柄花巧 0. 05mg、9, 10-二甲氧基紫檀焼-3-0-目-D葡萄化喃糖巧0. 08mg、毛蕊異黃麗0. 2mg、黃茂甲 巧1. 4mg、黃茂皂巧III 1. 2mg、芒柄花素0. 05mg、黃茂皂巧I 1. 2mg的混合溶液。
[0013] 所述步驟（3)中的黃茂指紋圖譜中26個色譜峰被確定為共有色譜峰，通過與對照 品保留時間的比較，確定峰10為毛蕊異黃麗葡萄糖巧；峰12為芒柄花巧；峰13為9, 10-二 甲氧基紫檀焼-3-0-目-D葡萄化喃糖巧；峰16為毛蕊異黃麗；峰20為黃茂甲巧；峰21為 黃茂皂巧III ;峰22為芒柄花素；峰26為黃茂皂巧I。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明所得黃茂指紋圖譜的峰多，峰形好，峰分離效果好，易于鑒別，相似性高，準 確可靠，確定26個色譜峰為共有色譜峰，經(jīng)過參比對照品溶液色譜峰確定了 7個成分；本發(fā) 明方法簡便、快捷、準確、穩(wěn)定、可靠，可用于黃茂樣品的質量控制，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為黃茂中存在的7種成分對照品在紫外區(qū)間內全波長掃描結果W及最大吸收 波長；其中，a為毛蕊異黃麗葡萄糖巧，b為芒柄花巧，C為毛蕊異黃麗，d為黃茂甲巧，e為 黃茂皂巧III，f為芒柄花素，g為黃茂皂巧I ;
[0017] 圖2為不同波長條件下黃茂指紋圖譜；
[001引圖3為Kromasil 100-5C18色譜柱的黃茂指紋色譜圖；其中，a-c為不同的洗脫梯 度程序；
[0019] 圖4為Athena C18色譜柱的黃茂指紋色譜圖；其中，a-b為不同的洗脫梯度程序；
[0020] 圖5為Waters XSelect CSH C18色譜柱的黃茂指紋色譜圖；
[0021] 圖6為Athena C18-WP色譜柱黃茂指紋色譜圖；其中，a-c為不同的洗脫梯度程 序；
[0022] 圖7為不同柱溫下黃茂HPLC色譜圖；
[0023] 圖8為不同提取方式供試品溶液HPLC色譜圖；
[0024] 圖9為不同提取溶劑供試品溶液HPLC色譜圖；
[00巧]圖10為不同提取條件供試品溶液HPLC色譜圖；
[002引圖11為不同濃度供試品溶液、不同進樣體積HPLC色譜圖；
[0027] 圖12為混合化學對照品指紋圖譜；
[0028] 圖13為不同產(chǎn)地批次黃茂指紋圖譜；
[0029] 圖14為黃茂標準指紋圖譜；
[0030] 圖15為兩個批次黃茂與蒙古黃茂和膜芙黃茂指紋圖譜比較。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，該些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人 員可W對本發(fā)明作各種改動或修改，該些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0032] 實施例1
[0033] 1.儀器參數(shù)的選擇
[0034] (1)檢測波長的選擇
[00巧]對黃茂中存在的7種成分對照品在紫外區(qū)間內全波長掃描結果W及最大吸收波 長如圖la-g所示?？蒞看出，毛蕊異黃麗葡萄糖巧最大吸收波長為220nm、258nm，芒柄花巧 和芒柄花素最大吸收波長為250nm，毛蕊異黃麗最大吸收波長為220nm、258nm，黃茂甲巧、 黃茂皂巧m和黃茂皂巧I末端吸收強度最大。所W，綜合比較各個對照品的紫外全波長吸 收掃描圖，黃茂指紋圖譜檢測波長應該在末端吸收處選擇，下面考察黃茂制得的樣品分別 在五個波長（203皿，208皿，265皿，250皿，280nm)下檢測得到的指紋圖譜W期選擇最佳吸 收波長。
[0036] 樣品制備方法：取2.0g黃茂中粉，精密稱定，加入甲醇40ml超聲巧3KHz，280W)提 取60min，過濾，濾液揮干，殘渣用適量甲醇溶解并定容至10ml。
[0037] 色譜條件；體積流量；1. 0ml ? min-i;進樣體積；lOiil ;柱溫；3(TC ;流動相：水 (A) -己膳炬），梯度洗脫；0 ?5min ;5% B，5 ?12min ;5% B - 10% B，12 ?60min ;10% B - 30% B，60 ?90min ;30% B - 55% B，90 ?95min ;55% B - 100% B。指紋圖譜結果 如圖2所示。可W看出，208nm下檢測的指紋圖譜峰高較高，且基線漂移較小，故選擇208nm 作為黃茂指紋圖譜的檢測波長。（2)色譜柱的選擇和流動相洗脫程序的優(yōu)化
[0038] ① Kromasil 100-5C18 色譜柱
[0039] 選擇適當溶劑，爭取盡可能多的成分被檢測出，本實驗初步選擇甲醇作為提取溶 齊U，對藥材中粉進行超聲提取，并進行高效液相色譜分析。
[0040] 供試品溶液的制備；取黃茂中粉2. Og，精密稱定，加甲醇30ml超聲巧3KHz，280W) 提取60min，放冷，補足減失的溶劑重量，過0. 22 y m微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。
[00川色譜條件；柱溫為30。流動相為水（A)-己膳炬），流速為0. 8ml ? min-i，進樣體 積為lOy 1，梯度洗脫程序；0?70min ;5% B - 100% B。檢測波長為190-400皿全波長掃 描。測得HPLC色譜圖見圖3a所示?？蒞看出，在40min炬相達到55%左右）之后，只有1 個特征峰出現(xiàn)。繼續(xù)優(yōu)化色譜條件。
[0042] 上述液相條件只改變洗脫梯度程序如下；0?lOmin ;5% B，10?15min ;