專利名稱：檢測方法和試劑盒的制作方法
背景 本發(fā)明涉及與金屬鹽連接的抗原的檢測方法。
特別地，本發(fā)明涉及用于測定與鋁鹽連接的抗原的數(shù)量的方法，所述鋁鹽例如為氫氧化鋁或磷酸鋁或硫酸羥基磷酸鋁。
現(xiàn)有技術(shù)已知的方法可用于測定與金屬鹽連接的抗原，例如參見WO2004/038417和Abbott AuszymeTM試劑盒，上述二者都可以用于分析例如包含氫氧化鋁的乙型肝炎疫苗。
包含純化的重組體乙型肝炎表面抗原(HBsAg)顆粒的乙型肝炎疫苗在全世界廣泛地使用并且逐漸地用作常規(guī)兒科組合疫苗的組分。這些疫苗的質(zhì)量控制需要測定效力，并且目前多數(shù)使用測定HBsAg含量的體外效能試驗來測定。制造商已開發(fā)出產(chǎn)品特異性的測試，而這些測試都主要基于商品化的ELlSA試劑盒(來自Abbott實驗室的AuszymeTMEIA試劑盒)，并且被很多用于官方測定的國家控制實驗室所用。
AuszymeTM試劑盒基于使用珠子的夾層技術(shù)，所述珠子涂有小鼠單克隆IgM抗HBsAg和用過氧化物酶標記的小鼠單克隆IgG抗HBsAg，并且在HBsAg沒有事先從鋁佐劑解吸附的情況下AuszymeTM試劑盒也可在疫苗上使用。
古巴乙型肝炎疫苗的制造商已開發(fā)出用于乙型肝炎測定的間接方法，參見Cuervo和Huerta，Validation of an in vitro potency test for theCuban hepatitis B vaccine，Dev Biol(Basel).2002；111305-12以及Cuervo等人，Bioiogicals 32，2004，171-176。
仍然需要檢測與金屬或金屬鹽連接的抗原的方法，特別是在大量的抗原組合中檢測此類抗原。本發(fā)明解決了這一需要。
發(fā)明簡述 在第一方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的抗原的方法，所述方法包括 1.使所述抗原與該抗原的特異性抗體接觸； 2.在允許任何存在的抗體與固體載體上的抗原形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，使任何未結(jié)合的抗體與和固體載體連接的抗原接觸；和 3.檢測在固體載體上形成的抗體-抗原復(fù)合物。
在一個相關(guān)方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與鋁鹽連接的乙型肝炎抗原的方法，所述方法包括 1.使所述抗原與該抗原的特異性抗體接觸； 2.使任何未結(jié)合的抗體與和固體載體連接的抗原接觸，以允許任何存在的抗體與固體載體上的抗原形成抗體-抗原復(fù)合物；和 3.檢測在固體載體上形成的抗體-抗原復(fù)合物。
在另一個相關(guān)方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的第一種抗原的方法，所述抗原與至少一種其它(第二種)抗原結(jié)合，所述方法包括 1.使所述第一種抗原與該第一種抗原的特異性抗體接觸； 2.使任何未結(jié)合的抗體與和固體載體連接的抗原接觸，以允許任何抗體與固體載體上的抗原形成抗體-抗原復(fù)合物；和 3.檢測在固體載體上形成的抗體-抗原復(fù)合物。
在另一個相關(guān)方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的抗原的試劑盒，所述試劑盒包含進行本發(fā)明方法的說明書和至少一種選自以下的其它組分 1.對所要測定的抗原具有特異性的抗體(檢測抗體)； 2.任選地與固體載體連接的抗原； 3.用于檢測在固體載體上形成的任何抗體-抗原復(fù)合物的檢測試劑； 4.陽性對照；和 5.陰性對照。
詳細描述 本發(fā)明涉及一種間接地測定樣品中抗原含量的抑制試驗，其中所述抗原與金屬鹽連接。所述方法在ELISA型試驗中使用抗體(例如多克隆抗體)。概括地說，使與所研究的抗原特異性地相互作用的抗體與包含抗原-金屬鹽復(fù)合物的樣品接觸。在合適的時間(允許所述抗體與樣品中的抗原反應(yīng))之后，允許任何未結(jié)合的抗體與和固體載體(如ELISA板)結(jié)合的抗原反應(yīng)。與所述板上抗原結(jié)合的抗體的檢測指示由初始抗體-抗原樣品反應(yīng)所引起的未結(jié)合的抗體數(shù)量。因此，通過ELISA方法測定的抗體越多，在初始的抗體-抗原反應(yīng)之后存在的未結(jié)合的抗體越多以及初始樣品中抗原的數(shù)量越少。
由于ELISA板中金屬組分的存在，這種方法減少了任何干擾。
因此，在第一方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的抗原的方法，所述方法包括 1.使所述抗原與該抗原的特異性抗體接觸； 2.使任何未結(jié)合的抗體與和固體載體連接的抗原接觸，以允許任何抗體與固體載體上的抗原形成抗體-抗原復(fù)合物；和 3.檢測在固體載體上形成的抗體-抗原復(fù)合物。
所述抗原可以是任何合適的抗原。一方面，所述抗原是乙型肝炎表面抗原。雖然在本文中使用乙型肝炎抗原進行實驗，但是本發(fā)明適用于與金屬鹽(其可以是助劑)連接的其它抗原。因此，除非從上下文明顯地區(qū)分，否則，在本文對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的任何參考可當作是對任何合適的可與金屬鹽連接的抗原的參考，包括特異性的HBsAg。
本發(fā)明的金屬鹽包括鋁、鋅、鐵或鈣鹽，如氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣、氫氧化鋅或氫氧化鈣。
術(shù)語“抗體”在本文中可以涉及例如具有兩條重鏈和輕鏈的完整抗體，或者可以涉及抗體的任何子片段，如Fv區(qū)域，F(xiàn)v區(qū)域保持抗體的特異性抗原結(jié)合能力特征并且在本領(lǐng)域是公知的。
通過將抗原與金屬在使得抗原在金屬鹽上吸附的條件下混合，可以使抗原與金屬鹽連接。這樣的條件在本領(lǐng)域是公知的(參見，例如Vaccine.2004年3月29日；22(11-12)1475-9，“Mechanism of adsorptionof hepatitis B surface antigen by aluminium hydroxide adjuvant”)。
一方面，使用抗體來測定在固體載體上形成的抗體-抗原復(fù)合物，一方面使用標記的抗體來測定。一方面，對抗原-抗體復(fù)合物的抗體部份具有特異性的抗體，如抗體的Fc區(qū)域。
本發(fā)明適于評價在疫苗中發(fā)現(xiàn)的抗原的存在和數(shù)量，例如吸附氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸羥磷酸鋁的乙型肝炎表面抗原。
因此，在本文中使用的術(shù)語“磷酸鋁”和“氫氧化鋁”的含義包括適于輔助疫苗的所有形式的氫氧化鋁或磷酸鋁。
例如，磷酸鋁可以是不溶性磷酸鋁(無定形、半晶體或晶體)的沉淀，其可以任選地而不排他地通過混合可溶性鋁鹽和磷酸鹽來制備。“氫氧化鋁”可以是不溶性(無定形、半晶體或晶體)氫氧化鋁的沉淀，其可以任選地而不排他地通過中和鋁鹽溶液來制備。特別合適的是從商業(yè)來源可以得到的各種形式的氫氧化鋁和磷酸鋁凝膠，例如由Superfos(vedbaek，2950 Denmark)供應(yīng)的鋁水凝膠(氫氧化鋁，3％在水中的懸浮液)和Adju-fos(磷酸鋁，2％在鹽水中的懸浮液)。
因此，在一個相關(guān)的方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與鋁鹽連接的乙型肝炎抗原的方法，所述方法包括 1.使所述的抗原與該抗原的特異性抗體接觸； 2.使任何未結(jié)合的抗體與和固體載體連接的抗原接觸，以允許任何抗體與固體載體上的抗原形成抗體-抗原復(fù)合物；和 3.檢測在固體載體上形成的抗體-抗原復(fù)合物。
在一個方面中，本發(fā)明涉及在較大的抗原混合物(如多價疫苗組合物)中抗原的檢測。特別是本發(fā)明涉及乙型肝炎抗原與一種或多種選自白喉、破傷風(fēng)、百日咳、滅活的脊髓灰質(zhì)炎(IPV)、流感嗜血桿菌b(Hib)和甲型肝炎(HA)的抗原的組合中乙型肝炎抗原的檢測。
在一個方面中，本發(fā)明涉及在與例如以下物質(zhì)的組合中的乙型肝炎表面抗原的檢測 1.甲型肝炎抗原； 2.白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、絲狀凝血素、百日咳粘附素、1型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如，Mahoney)、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如，MEF-1)、3型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如，Saukett)； 3.白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、絲狀凝血素、百日咳粘附素； 4.白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、全細胞B百日咳抗原； 5.與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合的b型流感嗜血桿菌聚核糖基核糖醇磷酸酯。
在一個方面中，在包含多種抗原的組合疫苗中乙型肝炎被吸附到磷酸鋁上。參見，例如WO93/24148，在本文引入作為參考。
因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的第一種抗原的方法，所述抗原與至少一種其它(第二種)抗原結(jié)合，所述方法包括 1.使所述第一種抗原與該第一種抗原的特異性抗體接觸； 2.使任何未結(jié)合的抗體與和固體載體連接的抗原接觸，以允許任何抗體與固體載體上的抗原形成抗體-抗原復(fù)合物；和 3.檢測在固體載體上形成的抗體-抗原復(fù)合物。
在另一方面中，本發(fā)明涉及用于檢測和/或定量的方法，所述方法包括在上述方法的步驟1和2之間的附加方法步驟，其中在進行步驟2之前將步驟1的未結(jié)合抗體與結(jié)合的抗體分離。分離可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)(如離心)來進行，例如如本文的實施例中所述。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的抗原的試劑盒。
在一個方面中，所述試劑盒包含進行本發(fā)明方法的說明書和至少一種選自以下的其它組分 1.對所要測定的抗原具有特異性的抗體(檢測抗體)； 2.任選地與固體載體連接的抗原； 3.用于檢測在固體載體上形成的任何抗體-抗原復(fù)合物的檢測試劑； 4.陽性對照；和 5.陰性對照。
在一個方面中，所述試劑盒包含預(yù)先涂有抗原和抗體(優(yōu)選標記的)的板和用于特異性地結(jié)合檢測抗體。在一個方面中，所述板涂有乙型肝炎表面抗原。
在一個方面中，就乙型肝炎檢測而言，所使用的抗體是人多克隆抗體，如抗HBs抗體(Nabi-HBTM-Nabi Biopharmaceuticals，Boca Raton，F(xiàn)L.USA)。
本發(fā)明方法的概述被提供在

圖1中，以及所述方法通?？蓱?yīng)用于與金屬鹽連接的抗原的分析。
通過以下實施例舉例說明本發(fā)明，但實施例并不限制本發(fā)明。
實施例1 由制造商和國家控制實驗室使用的AuszymeTM試劑盒對測定乙型肝炎疫苗中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)含量的中止引導(dǎo)我們研制抑制ELISA方法的替代方案。
批準研究根據(jù)協(xié)調(diào)國際會議(The International Conference ofHarmonization)進行并在具有四個官方醫(yī)學(xué)控制實驗室(OMCLs)的可行性研究中評估再現(xiàn)性。
劑量-響應(yīng)曲線證明在60-360ng/ml HBsAg范圍內(nèi)的線性(R2>0.99)。再現(xiàn)性(CV<7％)、中間精密度(CV<10％)和準確度(91-113％回收率)與AuszymeTM方法相似。測定所用的商品化的抗體顯示與HBsAg的保護性表位結(jié)合并且證明了所述方法對HBsAg的特異性。雖然ELISA得到更高的結(jié)果(對于EngerixTM-B(n＝64)為25.3對24.4μg/ml，對于TwinrixTM(n＝69)為28.9對27.0μg/ml以及對于InfanrixTM penta(n＝62)為25.5vs.21.6μg/ml)，但是與Auszyme TM方法存在良好的一致性。所述方法被成功地轉(zhuǎn)移到四個OMCLs中。
我們已證明ELISA適于它的預(yù)定目的并且被認為是國家監(jiān)督實驗室和管理局在世界范圍所使用的普通方法。
1.介紹 包含純化的重組體乙型肝炎表面抗原(HBsAg)顆粒的乙型肝炎疫苗在全世界被廣泛地使用并且逐漸地用作常規(guī)兒科組合疫苗的組分。這些疫苗的質(zhì)量控制需要測定效力，并且目前多數(shù)使用測定HBsAg含量的體外效能試驗來測定。制造商已開發(fā)出產(chǎn)品特異性的試驗，而這些試驗都主要基于商品化的EL1SA試劑盒(來自Abbott實驗室的AuszymeTMEIA試劑盒)，其是由歐洲藥典[1]推薦的并且被很多用于官方測試的國家監(jiān)督實驗室所使用。然而，所述AuszymeTM試劑盒將被Abbott實驗室中止，因此我們已開始通過研制ELISA方法的替代方案來代替這種試劑盒。
所述AuszymeTM試劑盒基于使用涂有小鼠單克隆IgM抗HBsAg的珠子的夾層技術(shù)，并且在HBsAg沒有從鋁佐劑在先解吸附的情況下AuszymeTM試劑盒也可在疫苗上使用。在新的ELISA方法中還計劃避免樣品的預(yù)處理。初期研究將開發(fā)一種使用單克隆或多克隆抗體的夾層ELISA。然而，問題是與非特異性的結(jié)合沖突，這是由于疫苗助劑對微型板的固定。對于不同的包含乙型肝炎的組合疫苗(在助劑含量方面有差異)所得到的HBsAg值上還存在顯著性差異。排除這些問題的唯一方法是使用利用人多克隆抗體來間接測定HBsAg含量的抑制試驗，從而減少由于ELISA板中所存在的助劑的任何干擾。
我們已批準研究這種新的ELISA，以便提供一種替代的標準驗證方法，所述方法可由國家監(jiān)督實驗室所用以發(fā)布各種包含乙型肝炎表面抗原的疫苗并因此避免任何疫苗供應(yīng)的中斷，疫苗供應(yīng)中斷會由于AuszymeTM試劑盒的中止而出現(xiàn)。
2.參與者 大部分批準實驗由一個疫苗制造商進行，同時四個官方醫(yī)學(xué)控制實驗室(OMCLs)參與合作研究以評價再現(xiàn)性。這些OMCLs是比利時的公共衛(wèi)生科學(xué)學(xué)會(ISP)、法國的保健品的衛(wèi)生安全機構(gòu)(AFSSAP)、德國的Paul Ehrlich學(xué)會(PEI)和英國的生物標準和監(jiān)督的國家學(xué)會(NIBSC)。參與者的名單在本報告第8部分的結(jié)尾提供。
3.材料和方法 3.1.疫苗樣品 研究使用的所有疫苗(參見表1)由GlaxoSmithKline(GSK)Biologicals(Rixensart，比利時)制造。為了人為地降低效力，將一些疫苗樣品通過在60℃培養(yǎng)7天或15天或者通過在37℃用100ppm過氧化氫培養(yǎng)過夜來應(yīng)激，處理后，將樣品在4℃貯藏直到進行試驗。
3.2.參照疫苗 用于AuszymeTM方法和新的抑制ELISA的參照標準是歐洲藥典乙型肝炎疫苗(rDNA)BRP2b參照。該參照包含通過Lowry蛋白試驗測定的20μg/ml HBsAg。
3.3.人多克隆抗體 人多克隆抗HBs抗體(Nabi-HBTM-Nabi Biopharmaceuticals，BocaRaton，F(xiàn)L.USA)的商品化制劑用于新的抑制ELISA方法。為了證實該制品包含與HBsAg的保護性表位結(jié)合的抗體，將其在具有RF1HBs單克隆抗體的競爭性試驗中進行測試。RF1HBs抗體已顯示在易感的黑猩猩中能阻礙HBV的傳染[2，3]。
試驗樣品的兩倍稀釋在包含固定量(6.25ng/ml)的生物素化的RF1單克隆抗體(mAb)中完成并于37℃在HBsAg涂層板上培養(yǎng)1.5小時。在洗滌步驟之后，將在飽和緩沖液中稀釋的鏈霉菌素抗生物素蛋白(streptavidin)-HRP Amdex(Amersham，Uppsala，瑞典)復(fù)合物加入孔中并在37℃培養(yǎng)30分鐘。然后洗滌板并用四甲基聯(lián)苯胺底物溶液在22℃培養(yǎng)10分鐘。用H2SO4停止反應(yīng)。光密度(光密度)與類RF1抗體的抗體的數(shù)量成反比(競爭性試驗)，通過分光光度法(450nm)測定類RF1抗體的抗體的數(shù)量。
3.4.利用新的抑制ELISA測定HBsAg的含量 方法的概述被提供在圖1中。將標準品和疫苗樣品用含有0.1％ BSA和0.1％吐溫20的PBS稀釋。將100μl的各稀釋物在攪拌條件下于25℃，用100μl固定量的人多克隆抗HBs抗體(±170mIU抗HBs/ml)(Nabi-HB TM-Nabi Biopharmaceuticals，Boca Raton，F(xiàn)L.USA)在用于細胞培養(yǎng)Greiner Bio-One板(Greiner Bio-One，F(xiàn)rickenhausen，德國)中培養(yǎng)過夜。然后把板在2000rpm的條件下離心10分鐘并將上清液轉(zhuǎn)入ELISA板(來自NUNC，Roskilde，丹麥的Maxisorp免疫板)，用1μg/ml HBsAg(來自GSK)于4℃涂布所述ELISA板過夜，之后用含有1％BSA的PBS涂布。然后把板在攪拌條件下于37℃培養(yǎng)2小時。
洗滌之后，將100μl用過氧化物酶(Sigma-Aldrich，St-Louis，MO.USA)標記的山羊抗人IgG抗體的1/10000稀釋物加入到各個孔中。然后把板在攪拌條件下于37℃培養(yǎng)1小時，然后洗滌。通過加入作為底物的四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫溶液，用比色法測定結(jié)合抗體的數(shù)量。在室溫下在黑暗中培養(yǎng)20分鐘后，通過加入H2SO4來停止反應(yīng)，并在450nm讀取光密度。測定的光密度與未知樣品中HBsAg的數(shù)量成反比。
3.5.利用AuszymeTM EIA試劑盒測定HBsAg的含量 本方法使用Abbott Auszyme TM ELISA試劑盒(Abbott實驗室，Chicago，IL.USA)，并且是用于乙型肝炎疫苗(rDNA)測定的歐洲藥典方法B[1]。
簡單而言，將疫苗稀釋在含有0.2％ BSA的PBS中。將稀釋物與涂有單克隆抗HBs抗體的塑料珠一起培養(yǎng)。在40℃培養(yǎng)3小時之后，洗滌珠子并與過氧化物酶標記的單克隆抗HBs抗體一起培養(yǎng)。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，洗滌珠子。通過加入作為底物的鄰亞苯基二胺/過氧化氫，用比色法測定結(jié)合HBsAg的數(shù)量。在通過添加H2SO4停止反應(yīng)后，在490nm讀取光密度。測定的光密度與未知樣品中HBsAg的數(shù)量成比例。
3.6.體外效力的計算 對于兩種測定方法，使用平行線分析的統(tǒng)計方法計算試驗樣品中HBsAg的含量[4]。基于一系列的稀釋物，對各效力結(jié)果確定樣品稀釋物線性度和相對于標準曲線的響應(yīng)平行度的p值。如果線性度和平行度的p值均高于0.05，則認為結(jié)果是有效的。如果p值低于0.05，則認為結(jié)果是無效的并且要進行重復(fù)測定。
3.7.劑量-響應(yīng)范圍 在常規(guī)實踐中，對各測定確立含有360、300、240、180、120和60ng HBsAg/ml參照標準品的劑量-范圍曲線。于是將試驗樣品稀釋。
采用平行-線性分析所計算的效力值只用于曲線劑量/響應(yīng)的線性部分。為了顯示參照標準品的劑量響應(yīng)曲線和樣品的劑量響應(yīng)曲線是在常規(guī)測試所用的最高劑量和最低劑量之間的直線，通過逐漸稀釋參照制劑和一批EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTM penta疫苗(參見表1)來進行實驗。以兩倍連續(xù)的方式稀釋至1:1024，對于參照物對應(yīng)于19.5ng/ml的HBsAg濃度。以一式兩份對各樣品進行試驗。
3.8.定量限度(LOQ) 因為用于樣品計算的光密度值必須在參照標準品所得到的最高光密度值和最低光密度值之間，所以允許有效定量的最低抗原濃度是確定的定量范圍的下限值。
3.9.檢測限度(LOD) 分析本底響應(yīng)數(shù)值的測定是通過在六個獨立實驗中將空白試樣(PBS、0.1％吐溫、0.1％ BSA)分析六次并計算平均光密度值和標準偏差來進行的。計算試驗空白的平均光密度減去三個標準偏差。然后將該光密度值引入用參照物確立的標準曲線方程式，通過使用方程式y(tǒng)＝ax+b(y＝光密度，x＝log濃度，a＝校準曲線的斜率，b＝截距)的回歸分析來測定當量滴度。對稀釋度校正之后，計算LOD值以得到分析本底響應(yīng)。
3.10.線性度和平行度 將采用參照標準品確立的用以測定LOD的六條標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)用于測定線性度。而且，如前所示，在平行-線性分析過程中對各樣品計算線性度和平行度的p值。
3.11.精密度 為了評價再現(xiàn)性(試驗內(nèi)的精密度)，將三批EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTM penta疫苗以相同的實驗試驗六次。
為了評價中間精密度(試驗間的精密度)，三個技師在四個月里將三批EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTM penta疫苗在六個獨立實驗中進行試驗。用兩批不同的Nabi-HBTM進行檢驗以評價所述試劑在批次之間的變化性。兩批具有相同的抗HBsAg滴度，因此以相同的稀釋度使用。
為了評價再現(xiàn)性(實驗室間的精密度)，通過我們的實驗室和四個歐洲OMCLs對一批EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTM penta進行平行試驗向各實驗室供給涂有HBsAg和參照試劑的Nabi HB-TM，并在三個獨立期間中試驗各疫苗批次。
所有精密度結(jié)果用變異系數(shù)表示(標準偏差/平均值×100)。
3.12.準確度 在回收實驗中評價準確度，所述回收實驗通過向EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTM penta疫苗的樣品加入已知量的參照物來進行。將通過Lowry方法指定20μg HBsAg/ml數(shù)值的參照物分別用來摻合具有5μg、10μg和15μg HbsAg的試驗樣品(相當于250μl、500μl和750μl)。在平行實驗中，在加入作為對照物的250μl、500μl和750μl稀釋物后測試試驗樣品。按照下式計算回收百分比 [經(jīng)驗值摻合/(經(jīng)驗值未摻和+峰值的理論值)]×100。
3.13.特異性 通過測試安慰劑和沒有HBsAg的疫苗來評價特異性。通過測試EngerixTM-B和InfanrixTM penta的安慰劑，檢驗Nabi-HBTM試劑與鋁助劑(即Al(OH)3和AlPO4)的非特異性結(jié)合。測試的兩種安慰劑接近1:2、1:4和1:8。
為了證實Nabi-HB TM試劑以及其它疫苗抗原之間交叉反應(yīng)性的缺乏，測試的不包含HBsAg的各種疫苗(參見表1)接近1/10、1/20和1/83(用于試驗疫苗的最低稀釋度)。在該實驗中還加入兩種安慰劑。在平行實驗中，以1/83的稀釋度測試兩批EngerixTM-B疫苗。
3.14.用AuszymeTM方法橋連 通過新的ELISA和AuszymeTM方法對大量EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTM penta疫苗測定HBsAg的含量。結(jié)果通過配對的t-檢驗進行比較。
還評價兩種方法對于在正常商用范圍的下限和上限時測定效力值的能力。這包括通過應(yīng)激處理(參見2.1部分)誘導(dǎo)而具有降低效力的疫苗批次的測試，和由于去除硫柳汞而具有更高效力(研制大量候選的不含硫柳汞、含有10-20μg/ml HBsAg的疫苗)或增加抗原含量(FendrixTM，參見表1)的批次的測試。
4.結(jié)果 4.1.方法的穩(wěn)健性 在試驗期間，將以下參數(shù)確定為試驗可靠性的關(guān)鍵。首先，在過夜培養(yǎng)期間，稀釋緩沖液中BSA的存在對避免抗體與助劑的非特異性結(jié)合是重要的。第二，在過夜培養(yǎng)期間，微型板的攪拌對于在吸附的Ag和抗體之間提供合適的相互作用也是重要的。最后，在所述過夜培養(yǎng)之后的離心步驟對于避免ELISA板中助劑的存在是關(guān)鍵的。這種離心作用可以由在室溫下至少30分鐘的沉降來替代(同樣進行驗證，數(shù)據(jù)沒有顯示)。
4.2.表征人多克隆抗體(Nabi-HB TM) 圖2顯示與陽性對照(用EngerixTM接種的患者的血清池)和陰性對照(注射非相關(guān)疫苗的患者的血清池)相比，對抗Nabi-HBTM人多克隆抗體溶液的保護性RF1單克隆抗體的競爭性試驗的結(jié)果。在該試驗中，在試驗樣品中存在的抗HBs抗體與固定量的用于與HBsAg結(jié)合的生物素化的抗RF1mAbs競爭。因此光密度反比于與抗RF1mAbs相同的表位結(jié)合的抗體的數(shù)量。該結(jié)果表明Nabi-HB TM制品中類RF1的保護性抗體的水平與從EngerixTM-B疫苗接種者的血清池中發(fā)現(xiàn)的水平相似。
4.3.劑量-響應(yīng)范圍 在圖3中顯示的劑量-響應(yīng)曲線在以lin/log轉(zhuǎn)換的形式繪圖時顯示特征性的S形(在Y軸上的光密度和在對數(shù)標度X軸上的稀釋度倒數(shù))。所述圖形對于與常規(guī)操作所用的HBsAg濃度相應(yīng)的稀釋度是線形的(即對于標準制劑為360和60ng/ml和對于試驗制劑為240和60ng/ml)。
4.4.定量的限度 因為用于樣品計算的光密度值必須在參照標準品所得到的最高光密度值和最低光密度值之間(其對應(yīng)于60和360ng/ml)，所以所述提供有效定量的最低抗原濃度是60ng/ml。
4.5.檢測限度 表2顯示從六個獨立實驗估算的最低光密度值是35ng/ml。
4.6.線性度和平行度 如表2所示，對六條標準曲線線性回歸的相關(guān)系數(shù)值均在0.99以上，從而證明了對于60-360ng/ml的分析范圍的線性度。此外，如果線性度和平行度的p值均高于0.05，則僅認為效力值是有效的。具有該有效性標準的順應(yīng)性通常超過95％(未發(fā)表數(shù)據(jù))，在目前研究中得到的所有效力值是有效的。
4.7.再現(xiàn)性和中間精密度 六次測試的三批EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTM penta的再現(xiàn)性(試驗內(nèi)的精密度)顯示在表3中。用于再現(xiàn)性的CV值均低于7％。
表4顯示在六個獨立實驗中測試的三批EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTM penta的中間精密度(試驗間的精密度)。用于中間精密度的CV值均低于10％。
4.8.再現(xiàn)性 在我們實驗室和四個OMCL之間進行的再現(xiàn)性合作研究的結(jié)果顯示在表5中。一些結(jié)果特別是在一個實驗室中的結(jié)果是無效的，因為沒有遵守有效性標準(主要是線性度和平行度)。然而由所有有效結(jié)果計算的CV對于EngerixTM-B和TwinrixTM小于10％和對于InfanrixTM penta小于15％，表明所述方法對四個OMCLs的可轉(zhuǎn)移性。
4.9.準確度 準確性評價的結(jié)果在表6中給出。得到的回收百分比介于91％和113％之間。
4.10.特異性 初步實驗表明對于以1:2、1:4和1:8的稀釋度的EngerixTM-B和InfanrixTM penta的鋁安慰劑所觀察到的光密度值比空白試驗觀察到的光密度值低(標準曲線與[HBsAg]逆相關(guān))。然而，在測試疫苗所用的最低稀釋度(1:83)沒有觀察到非特異性結(jié)合(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這一結(jié)果通過在另一實驗中得到的安慰劑結(jié)果來證實(表7)，其中1:10的安慰劑稀釋物的光密度值顯示與空白相似。因此，雖然Nabi-HB試劑以高濃度非特異性地結(jié)合鋁，但是在測試疫苗樣品通常所用的稀釋度下沒有觀察到非特異性的結(jié)合。
表7同樣存在不包含HBsAg的疫苗的數(shù)據(jù)。正如所料，所有未稀釋的疫苗樣品(除了Hiberix TM，其是唯一沒有吸附在鋁鹽上的疫苗)具有高于空白的平均光密度值。然而當稀釋到至少1:10時，沒有非特異性結(jié)合和/或與非HBsAg疫苗組分交叉反應(yīng)的跡象。
4.11.用Auszyme TM方法橋連 對于不同商品批次的EngerixTM-B(64批)、TwinrixTM(69批)和InfanrixTM penta(62批)，使用兩種方法測定的效力結(jié)果在表8中顯示。總的來說，在用于全部三種疫苗的方法之間存在良好的一致性，但是平均起來新的ELISA方法得到更高的結(jié)果(對于三種疫苗有顯著的不同，如通過配對的t-檢驗確定，p<0.01)。圖4展示了對于所測試的不同類型的疫苗這兩種方法之間的相關(guān)性，不同類型的疫苗包括通過應(yīng)激處理誘導(dǎo)而具有降低效力的批次和由于去除硫柳汞或更高抗原含量而具有更高效力的批次(FendrixTM)。相關(guān)系數(shù)是0.76并且在低效力、正常范圍效力和高效力批次之間存在明顯區(qū)別。
5.討論 由制造商和國家控制實驗室使用的AuszymeTM試劑盒對測定乙型肝炎疫苗中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)含量的中止引導(dǎo)我們開發(fā)替代的抑制ELISA的方法。將所述ELISA設(shè)計成允許在抗原沒有事先從助劑解吸附的情況下測試疫苗，并且適于使用如以前所使用的同樣BRP參照物的不同疫苗組合。
這一研究的目的是證明所提出的ELISA適于它的預(yù)定目的。首先，重要的是表明通過試驗進行的HBsAg的定量是相關(guān)的疫苗效力的量度。我們通過證明用于試驗的人多克隆抗HBs抗體(Nabi-HB TM)的商品制劑包含與HBsAg的保護性表位相結(jié)合的抗體，而且保護性抗體的水平與從乙型肝炎疫苗接種者的血清中發(fā)現(xiàn)的抗體水平相似。
隨后，我們根據(jù)協(xié)調(diào)國際會議[5]對試驗進行確認研究。發(fā)現(xiàn)ELISA的性能特征適于所有被測試的包含乙型肝炎的疫苗。ELISA的再現(xiàn)性、中間精密度和準確度與在這之前基于AuszymeTM試劑盒的方法[1]相似。所提出的ELISA的敏感度較低(對于AuszymeTM方法，LOQ為60ng/ml比2.5ng/ml)，但是因為大多數(shù)疫苗包含10-20μg/ml HBsAg，所以這不會對預(yù)定的該試驗的用途有影響。實際上，較低的敏感度可給予這樣一種優(yōu)點通過減少所需要稀釋步驟的數(shù)目，從而將可能的誤差和可變性減到最少。
我們已顯示所提出的ELISA可以在其它疫苗抗原存在下特異性地測定HBsAg，這對于逐漸被用作組合疫苗組分的HBsAg是重要的。我們還證明雖然存在Nabi-HBTM試劑對鋁的非特異性結(jié)合，但是這不干涉試驗中所用的稀釋范圍。
用AuszymeTM方法對超過60批EngerixTM-B、TwinrixTM和InfanrixTMpenta進行的橋連研究顯示在這兩種方法之間良好的一致性，盡管平均起來所提出的ELISA方法得到更高的結(jié)果。對于一些疫苗，可通過釋放規(guī)格的修訂將這一差異考慮進來。這兩種方法之間的相關(guān)性還可以識別低效力批次和高效力批次(包括不含硫柳汞的批次，已經(jīng)觀察到(未發(fā)表數(shù)據(jù))從乙型肝炎疫苗制劑去除硫柳汞會導(dǎo)致效力增加)。
在四個官方醫(yī)學(xué)控制實驗室中的平行測試表明，所述方法可以容易地轉(zhuǎn)入其它實驗室。沒有向參與實驗室提供培訓(xùn)，僅僅供給測試方案加上Nabi-HBTM、涂層抗原和參照試劑。結(jié)果，存在稍微多的觀察到的無效結(jié)果，但是進一步的實驗和參數(shù)的細微調(diào)整會減少這些無效結(jié)果。通過一些參與實驗室對來自其它制造商的疫苗進行初步試驗是有希望的。結(jié)果(未發(fā)表數(shù)據(jù))表明通過使用相應(yīng)的參照物和通過改變定量范圍，所述測試可以潛在地適用于來自其它制造商的疫苗。
所提出的EL1SA可容易地采用可利用的試劑并且能潛在地用于來自其它制造商的疫苗，其成功的再現(xiàn)性表明它可以為由國家控制實驗室和管理局在世界范圍內(nèi)所使用的普通方法提供基礎(chǔ)。
6.結(jié)論 提出的ELISA適于測定不同乙型肝炎疫苗中的HBsAg含量并且對于使用中止的AuszymeTM試劑盒的方法提供了可靠的替代方案。
7.參考文獻Assay of hepatitis B vaccine(rDNA)，general chapter 2.7.15.Ph.Eur.第五版.Strasbourg FranceCouncil of Europe；2005.Iwarson S，Tabor E，Thomas HC等人，Neutralisation of hepatitisB virus infectivity by a murine monoclonal antibodyan experimental studyin the chimpanzee.J Med Virol 1985；1689-95.Waters JA，Brown SE，Steward MW等人，Analysis of the antigenicepitopes of hepatitis B surface antigen involved in the induction of aprotective antibody response.Virus research 1991；221-22.Finney DJ.Statistical Method in Biologicals Assay，chapter 4，第三版.LondonGriffin，1978.Validation of analytical proceduresmethodology.Ref Q2B ICH；1996.November[guideline]. 表1.研究中所用的疫苗組成的概要
*通過Lowry蛋白試驗測定 表2.檢測限度(LOD)
1空白樣品是稀釋緩沖液(PBS.吐溫0.1％，BSA0.1％)。
2通過分析六次空白試樣來進行分析本底響應(yīng)的數(shù)值和變化。
3校準曲線的斜率。
4R2是線性回歸擬合優(yōu)度的量度。
5LOD是通過考慮空白信號的平均光密度減去三個標準偏差來計算的。然后將該光密度值引入用參照物確立的標準曲線方程式，這允許通過使用方程式y(tǒng)＝ax+b(其中y＝光密度-(3*標準偏差)，x＝濃度，a＝校準曲線的斜率，b＝截距)的回歸分析來測定當量滴度。對稀釋度校正之后，計算LOD值以得到分析的本底響應(yīng)。
表3.再現(xiàn)性(試驗內(nèi)的精密度)
1對于不同疫苗的組成，參見表1。
2在同一天對各批次測定六次。
3變化系數(shù)＝(標準偏差/平均值)×100。
表4.中間精密度(試驗間的精密度)
1對于不同疫苗的組成，參見表1。
2在六個獨立實驗中測定各批次。
3變化系數(shù)＝(標準偏差/平均值)×100。
表5.在四個官方醫(yī)學(xué)控制實驗室中的再現(xiàn)性
1對于不同疫苗的組成，參見表1。
2無效的結(jié)果，由于沒有遵守有效性標準。
表6.準確度
1當通過Lowry方法測定時，給予參照物20μgHBsAg/ml的值(標記的值)。
2回收率(％)＝[經(jīng)驗值摻合/(經(jīng)驗值未摻合+峰值的理論值)]×100。
3對于不同疫苗的組成，參見表1。
表7.特異性
1安慰劑，代表Infanrix PentaTM 2安慰劑，代表EngerixTM-B 3對于不同疫苗的組成，參見表1 表8.用AuszymeTM方法橋連
CV變化系數(shù)＝(標準偏差/平均值)×100
權(quán)利要求
1.一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的抗原的方法，所述方法包括
1.使所述抗原與該抗原的特異性抗體接觸；
2.在允許任何存在的抗體與固體載體上的抗原形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，使任何未結(jié)合的抗體與和固體載體連接的抗原接觸；和
3.檢測在固體載體上形成的抗體-抗原復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原是與鋁鹽連接的乙型肝炎表面抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用于檢測和/或定量的方法，其中所述與金屬鹽連接的抗原與至少一種其它的第二種抗原組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述抗原是與以下抗原組中的一種抗原組合的乙型肝炎表面抗原
1.甲型肝炎抗原；
2.白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、絲狀凝血素、百日咳粘附素、1型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如，Mahoney)、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如，MEF-1)、3型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如，Saukett)；
3.白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、絲狀凝血素、百日咳粘附素；
4.白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、全細胞B百日咳抗原；和
5.與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合的b型流感嗜血桿菌聚核糖基核糖醇磷酸酯。
5.根據(jù)前述任何權(quán)利要求的方法，其中在步驟2之前，將在步驟1結(jié)束時存在的任何未結(jié)合的抗體從結(jié)合的抗體中純化掉。
6.一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的抗原的試劑盒，所述試劑盒包含進行本發(fā)明方法的說明書和至少一種選自以下的其它組分
1.對所要測定的抗原具有特異性的抗體(檢測抗體)；
2.任選地與固體載體連接的抗原；
3.用于檢測在固體載體上形成的任何抗體-抗原復(fù)合物的檢測試劑；
4.陽性對照；和
5.陰性對照。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測和/或定量與金屬鹽連接的抗原的方法。所述抗原可以存在于不同抗原的混合物中，例如存在于多價疫苗組合物中。本發(fā)明還提供一種在本發(fā)明方法中使用的試劑盒。
文檔編號G01N33/543GK101443662SQ200780017448
公開日2009年5月27日 申請日期2007年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月15日
發(fā)明者M·迪謝納, D·吉弗羅瓦, C·馬奇 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司