003)) 0己二酸在生理條件下是一種帶電分子，并且其被假設(shè)需要以基于質(zhì)子的同向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)形式的能量以被分泌出網(wǎng)絡(luò)。如果在中性或接近中性PH下進行發(fā)酵，則此轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在熱力學上是可行的。低PH己二酸形成將需要ATP-依賴性輸出機制，例如，與質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運相反的ABC系統(tǒng)。這些途徑中的反應(yīng)和實現(xiàn)這些途徑的方法描述在實施例1和2中。
[0038]如本文所使用來說明本發(fā)明的微生物生物體或微生物時，意在指微生物生物體具有至少一個在參照物種的天然存在株中正常情況下不存在的遺傳改變，所述天然存在株包括參照物種的野生株。遺傳改變包括，例如，引入可表達的編碼代謝多肽的核酸的修飾，其他核酸添加，核酸缺失和/或微生物遺傳材料的其他功能性破壞。此類修飾包括，例如，參照物種的異源多肽、同源多肽或異源多肽和同源多肽兩者的編碼區(qū)和其功能片段。其他的修飾包括，例如，非編碼調(diào)控區(qū)，其中所述修飾改變基因或操縱子的表達。示例性的代謝多肽包括己二酸生物合成途徑內(nèi)的酶。
[0039]如本文所使用，術(shù)語“CoA”或“輔酶A”意在指有機輔因子或輔基(酶的非蛋白部分)，其存在是許多酶(脫輔基酶)的活性形成活性酶體系所必需的。輔酶A在某些縮合酶中起作用，在乙酰基或其他?；D(zhuǎn)移和在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和在其他乙?；邪l(fā)揮作用。
[0040]本發(fā)明所采用的微生物生物體可以含有穩(wěn)定的遺傳改變，其指微生物可以培養(yǎng)5代以上而沒有丟失所述改變。通常，穩(wěn)定的遺傳改變包括持續(xù)10代以上的修飾，特別穩(wěn)定的修飾將持續(xù)約25代以上，并且更特別地，穩(wěn)定的遺傳修飾將為50代以上，包括無限期。
[0041]本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，遺傳改變，參照適當?shù)乃拗魃矬w諸如大腸桿菌和它們相應(yīng)的代謝反應(yīng)或適合于所需的遺傳物質(zhì)諸如所需代謝途徑的基因的來源生物體進行描述。然而，鑒于多種多樣的生物體的全基因組測序和基因組學領(lǐng)域中的高技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地將本文提供的教導和指導應(yīng)用于基本上所有其他生物體。例如，本文例舉的大腸桿菌代謝改變可以通過摻入來自參照物種以外的物種的相同的或類似的編碼核酸而容易地應(yīng)用于其他物種。此類遺傳改變包括，例如，物種同源物的遺傳改變，通常和特別地，直向同源物(ortholog)、旁系同源物(paralog)或非直向同源(nonortho1gous)基因置換。
[0042]直向同源物是通過垂直遺傳而相關(guān)并且在不同的生物體中負責基本上相同或同一功能的一種基因或多種基因。例如，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人環(huán)氧化物水解酶可以被認為是環(huán)氧化物水解的生物學功能的直向同源物。例如，當基因共享足以表明它們是同源的量的序列相似性時，它們是通過垂直遺傳而相關(guān)的，或由共同祖先進化而相關(guān)。如果基因共享足以表明它們已從共同祖先進化至一級序列相似性不可鑒定的程度的量的三維結(jié)構(gòu)但不必然具有這樣的量的序列相似性，它們也可被認為是直向同源物。直向同源的基因可以編碼具有約25% _ 100%氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白質(zhì)。如果其三維結(jié)構(gòu)也顯示相似性，則編碼共享小于25%的氨基酸相似性的蛋白質(zhì)的基因也可以被認為由垂直遺傳而產(chǎn)生。絲氨酸蛋白酶家族的成員，包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶，被認為從共同祖先通過垂直遺傳而產(chǎn)生。
[0043]直向同源物包括基因或它們編碼的基因產(chǎn)物，它們通過，例如，進化，已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上或總體活性上發(fā)生了趨異。例如，在一個物種編碼顯示兩種功能的基因產(chǎn)物的情況下以及在此類功能已經(jīng)在第二物種中分離入不同基因的情況下，這三種基因和它們相應(yīng)的產(chǎn)物被認為是直向同源物。對于生物化學產(chǎn)物的產(chǎn)生，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解具有待引入或待破壞的代謝活性的直向同源基因被選擇用于構(gòu)建非天然存在的微生物。顯示可分離的活性的直向同源物的實例是在兩個或多個物種之間或單個物種內(nèi)不同的活性已經(jīng)分離入不同的基因產(chǎn)物的情況。具體的實例是彈性蛋白酶蛋白水解和纖溶酶原蛋白水解(兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性)作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶分離入不同分子。第二個實例是支原體5’ -3’外切核酸酶和果蠅(Dr0Sophila)DNA聚合酶III活性的分離。來自第一物種的DNA聚合酶可以被認為是來自第二物種的外切核酸酶或聚合酶或兩者的直向同源物，且反之亦然。
[0044]相反，旁系同源物是通過例如，復制然后通過進化趨異而相關(guān)的同源物，并且具有相似的或共有的、但不相同的功能。旁系同源物可以源自或來自，例如，相同的物種或不同的物種。例如，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I I)可以被認為是旁系同源物，因為它們代表從共同祖先共同進化的兩種不同的酶，它們在相同的物種中催化不同的反應(yīng)并且具有不同的功能。旁系同源物是來自相同物種的彼此具有顯著的序列相似性的蛋白質(zhì)，表明它們是同源的，或通過從共同祖先共同進化而相關(guān)。旁系同源蛋白家族的組包括HipA同源物、螢光素酶基因、肽酶等。
[0045]非直向同源基因置換是來自一個物種的非直向同源基因可以替代不同物種中的參照基因功能。置換包括，例如，能夠在來源物種中執(zhí)行與不同物種中的參照功能相比基本上相同或相似的功能。盡管通常非直向同源置換將可被鑒定為與編碼參照功能的已知基因結(jié)構(gòu)上相關(guān)，然而結(jié)構(gòu)上不太相關(guān)但功能上相似的基因和它們相應(yīng)的基因產(chǎn)物將仍然落在該術(shù)語的范圍內(nèi)，如其在本文中所使用的那樣。與編碼尋求替代的功能的基因相比，功能相似性需要，例如，非直向同源基因產(chǎn)物的活性位點或結(jié)合區(qū)中的至少一些結(jié)構(gòu)相似性。因此，非直向同源基因包括，例如，旁系同源物或不相關(guān)基因。
[0046]因此，在鑒定和構(gòu)建本發(fā)明的具有己二酸生物合成能力的非天然存在的微生物生物體時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，將本文提供的教導和指導應(yīng)用于具體物種，使得代謝修飾的鑒定可以包括直系同源物的鑒定和包含或失活。就編碼催化相似或基本上相似的代謝反應(yīng)的酶的旁系同源物和/或非直向同源基因置換存在于參照微生物中這一程度而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以利用這些進化上相關(guān)的基因。
[0047]本發(fā)明所述的一種己二酸的全生物合成方法，包括對一株嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)進行代謝改造，通過生物信息學和轉(zhuǎn)錄組學的研究，確定己二酸的合成途徑，將合成途徑的6個基因分成兩個模塊導入大腸桿菌中表達，通過RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)和功能啟動子庫手段，調(diào)節(jié)異源基因的表達量和不同模塊的流量比，平衡異源代謝途徑的表達，防止代謝負擔，高效率積累己二酸，
[0048]以上所述的己二酸的全生物合成方法，第一步:在大腸桿菌中模塊化構(gòu)建3-氧代己二酰輔酶A途徑。
[0049]在之前的研究中，申請人通過菌種改造獲得了一株褐色嗜熱裂孢菌B6 (Thermobifida fusca B6)，該菌株能夠積累0.2g/L己二酸。通過生物信息學和轉(zhuǎn)錄組學的研究，申請人確定了己二酸的合成途徑為3-氧代己二酰輔酶A途徑(3-oxoadipyl-CoApathway) 0為了實現(xiàn)己二酸從頭合成，將3_氧代己二酰輔酶A途徑5個代謝步驟中的四個酶的基因:β -酮硫解酶基因(β -ketoth1lase)，3_羥?；?輔酶A脫氫酶基因(3-hydroxyacy1-CoA dehydrogenase), 3_ 輕基己二酰脫氫酶基因(3_hydroxyadipyl-CoAdehydrogenase)和 5_ 竣基-2-戊稀酰輔酶 A 還原酶基因(5-carboxy-2-pentenoyl_CoAreductase dehydrogenase)，經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，放入一個操縱子(Operon)內(nèi)，然后連接至pACY⑶uet?-l，形成上游模塊。該模塊催化的終產(chǎn)物是己二酰輔酶A(Adipyl-CoA)。由于琥珀酰輔酶A合成酶是該代謝途徑的限制性步驟，所以將此酶的基因Tfu_2577，2576經(jīng)過密碼子優(yōu)化后連接到pETDuetTM-l，形成下游模塊，該模