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一種己二酸的全生物合成方法

文檔序號(hào):9391905閱讀:3106來源:國知局
一種己二酸的全生物合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域,特別涉及一種己二酸的全生物合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]己二酸(adipic acid或者adipate)又稱肥酸,是一種重要的二元羧酸,它能夠發(fā)生成鹽反應(yīng)、酯化反應(yīng)、酰胺化反應(yīng)等,并能與二元胺或二元醇縮聚成高分子聚合物。當(dāng)前己二酸最重要的應(yīng)用領(lǐng)域是合成尼龍類纖維(比如尼龍6,6)。預(yù)計(jì)到2018年,己二酸全球的市場價(jià)值將達(dá)到63億美元,產(chǎn)量約為25.6億公斤,而且還在不斷增加,并且近兩年新增產(chǎn)能主要在中國。
[0003]工業(yè)上己二酸的生產(chǎn)路線主要通過硝酸對(duì)環(huán)己醇一環(huán)己酮的混合物(醇酮油,也稱KA油)進(jìn)行氧化制取。雖然己二酸化學(xué)合成方法已經(jīng)成熟,但是他們普遍有工藝流程長,副產(chǎn)物較多,工業(yè)“三廢”排放嚴(yán)重,產(chǎn)品收率不高等問題,特別是溫室氣體的排放量十分大。因此,研究開發(fā)新的清潔無害己二酸生產(chǎn)工藝越來越受到人們的重視。微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)己二酸有幾十年的研究經(jīng)歷,不動(dòng)桿菌、短桿菌、假單胞菌和黃色桿菌等屬微生物可以轉(zhuǎn)化苯甲酸、兒茶酚、環(huán)己醇、環(huán)己烷等化合物生產(chǎn)己二酸(Cheng Q,Thomas SM,Kostichka K,Valentine JR,Nagarajan V.Genet icanalys is of a gene cluster forcyclohexanol oxidat1n in Acinetobactersp.strain SE19by in vitro transos it1n.J Bacter1l.2000182(17):4744-4751.),這些生物轉(zhuǎn)化不需要化學(xué)催化劑、氧化劑以及溶劑,是潔凈無害的生產(chǎn)工藝。但是微生物的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)能力和效率有待進(jìn)一步提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本申請(qǐng)的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊,而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0005]鑒于上述和/或現(xiàn)有化工領(lǐng)域和生物工程領(lǐng)域中存在的問題,提出了本發(fā)明。
[0006]因此,本發(fā)明的目的是提供一種己二酸的全生物合成方法,以替代傳統(tǒng)化學(xué)合成己二酸的方法。
[0007]為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:一種己二酸的全生物合成方法,其包括,對(duì)褐色嗜熱裂孢菌進(jìn)行代謝改造,獲得能夠產(chǎn)己二酸的突變菌株B6 ;確認(rèn)己二酸的合成途徑,將該途徑的基因?qū)氪竽c桿菌中模塊化表達(dá),并且平衡異源代謝途徑的表達(dá);調(diào)節(jié)異源基因的表達(dá)量和不同模塊的流量比,提高己二酸的積累。
[0008]作為本發(fā)明所述己二酸的全生物合成方法的一種優(yōu)選方案,其中:所述己二酸的合成途徑為3-氧代己二酰輔酶A途徑。
[0009]作為本發(fā)明所述己二酸的全生物合成方法的一種優(yōu)選方案,其中:包括,
[0010]在大腸桿菌中模塊化構(gòu)建3-氧代己二酰輔酶A途徑;
[0011]平衡上游模塊中異源基因表達(dá),提高己二酸前體-己二酰輔酶A的供給;
[0012]基于啟動(dòng)子工程,最優(yōu)化上游模塊和下游模塊的表達(dá)量;以及,
[0013]基于代謝模型理性調(diào)節(jié)影響己二酸積累的代謝途徑。
[0014]作為本發(fā)明所述己二酸的全生物合成方法的一種優(yōu)選方案,其中:
[0015]所述3-氧代己二酰輔酶A途徑中共有5步反應(yīng),四個(gè)酶,四種酶分別對(duì)應(yīng)的基因?yàn)棣?-酮硫解酶基因,3-羥?;?輔酶A脫氫酶基因,3-羥基己二酰脫氫酶基因和5-羧基-2-戊烯酰輔酶A還原酶基因。
[0016]作為本發(fā)明所述己二酸的全生物合成方法的一種優(yōu)選方案,其中:將3-氧代己二酰輔酶A途徑的6個(gè)基因被分成兩個(gè)模塊導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá),其中5步代謝步驟中的四個(gè)酶的基因,經(jīng)過密碼子優(yōu)化后,放入一個(gè)操縱子內(nèi),然后連接至pACY⑶uet?-l,形成上游模塊,將該代謝步驟的限制性步驟的酶琥珀酰輔酶A合成酶的基因Tfu_2577,2576經(jīng)過密碼子優(yōu)化后連接到pETDuetTM-l,形成下游模塊。
[0017]作為本發(fā)明所述己二酸的全生物合成方法的一種優(yōu)選方案,其中:所述平衡上游模塊中異源基因表達(dá),提高己二酸前體-己二酰輔酶A的供給,包括,
[0018]I)通過代謝通量分析,預(yù)測己二酰輔酶A步驟中不同基因表達(dá)量配比;
[0019]2)通過增加RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu),構(gòu)建不同穩(wěn)定性的目的基因mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu),平衡異源基因的表達(dá)。
[0020]作為本發(fā)明所述己二酸的全生物合成方法的一種優(yōu)選方案,其中:所述基于啟動(dòng)子工程,最優(yōu)化上游模塊和下游模塊的表達(dá)量,包括,
[0021]使用來自噬菌體的組成型啟動(dòng)子Ι\-入;
[0022]以該啟動(dòng)子為模板進(jìn)行易錯(cuò)PCR,獲得突變序列;
[0023]將突變庫中的啟動(dòng)子替換連接到pGLO質(zhì)粒中的綠色熒光蛋白基因上游,并且將上述質(zhì)粒庫導(dǎo)入大腸桿菌中形成PGLO-P1" λ質(zhì)粒庫;
[0024]將大腸桿菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期,利用流式細(xì)胞儀,選擇熒光強(qiáng)度最弱,中等,最強(qiáng)的三種突變啟動(dòng)子;
[0025]分別將上述λ的三種突變啟動(dòng)子,取代上游模塊和下游模塊的啟動(dòng)子;
[0026]將不同組合的兩種質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá),選擇具有最佳己二酸生產(chǎn)性能的質(zhì)粒組合。
[0027]作為本發(fā)明所述己二酸的全生物合成方法的一種優(yōu)選方案,其中:所述基于代謝模型理性調(diào)節(jié)影響己二酸積累的代謝途徑,包括,
[0028]I)通過碳-13同位素標(biāo)記代謝流量分析方法,獲得己二酸積累的全局流量分布;
[0029]2)基于全基因組代謝模型理性調(diào)整影響己二酸積累的外圍代謝途徑。
[0030]本發(fā)明提供了實(shí)現(xiàn)己二酸及其前體物生物制造的核心技術(shù),即高性能生產(chǎn)菌株的選育改造,其涉及具有己二酸的生物合成性制備能力的細(xì)胞和生物體的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生。本發(fā)明研究結(jié)果表明代謝途徑可以被設(shè)計(jì)和重組改造,從而在大腸桿菌(Escherichia coli)和其他細(xì)胞或生物體中實(shí)現(xiàn)己二酸的生物合成。通過構(gòu)建具有設(shè)計(jì)的代謝基因型的菌株可以確認(rèn)己二酸的生物合成性制備。這些代謝改造的細(xì)胞或生物體還可以進(jìn)行適應(yīng)進(jìn)化以進(jìn)一步增加己二酸的生物合成,包括在接近理論最大生長的條件下。本發(fā)明己二酸及其前體物的生物制造具有污染少、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn),極具發(fā)展前景。
【附圖說明】
[0031 ] 圖1為具有RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的mRNA設(shè)計(jì)流程示意圖;
[0032]圖2為篩選功能啟動(dòng)子文庫流程示意圖;
[0033]圖3為碳-13同位素標(biāo)記流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂,下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說明。
[0035]在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明,但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實(shí)施,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣,因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
[0036]其次,此處所稱的“一個(gè)實(shí)施例”或“實(shí)施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個(gè)實(shí)施例中”并非均指同一個(gè)實(shí)施例,也不是單獨(dú)的或選擇性的與其他實(shí)施例互相排斥的實(shí)施例。
[0037]如本文所公開的,描述了使用葡萄糖/玉米芯粉作為碳底物的己二酸合成的不同的途徑。對(duì)于所有最大產(chǎn)率計(jì)算,在給定途徑中缺少的反應(yīng)加入至SimPheny中的大腸桿菌化學(xué)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中,其類似于以前所述的一種網(wǎng)絡(luò)(Reed等,Genome B1l.4:R54(2
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