本發(fā)明屬于食品檢測(cè)和動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種qPCR鑒定牛肉的方法，適用于鑒定未知樣品是否是牛肉或是否含有牛肉成份。

背景技術(shù)：

隨著我國(guó)居民生活水平的提高，僅國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的肉類遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，需要從國(guó)外進(jìn)口一部分肉類。這些因素為國(guó)內(nèi)外不法商販乘虛而入創(chuàng)造了條件。為保障消費(fèi)者合法權(quán)益，確立有效的肉源性成份鑒定方法十分必要。

PCR (polymerase chain reaction)，即DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是20世紀(jì)80年代發(fā)明的集高度特異性、靈敏性、高效性為一體的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于涉及生物的諸多領(lǐng)域，包括物種鑒定、法學(xué)鑒定、藥品/食品/飼料等諸多樣品中源自生物的成份及其含量的分析。PCR分為傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)。

與傳統(tǒng)PCR耗時(shí)長(zhǎng)的特點(diǎn)相比,，qPCR雖然成本高，但因靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短，所以倍受青睞，所以亟需一種qPCR鑒定牛肉的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種qPCR鑒定牛肉的方法。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題：一種qPCR鑒定牛肉的方法，包括以下步驟：

步驟1：設(shè)計(jì)特異性識(shí)別牛細(xì)胞色素b基因片段的1對(duì)引物；

步驟2：將牛肉總DNA的濃度調(diào)至2 ng/μL作為樣品PCR檢測(cè)的模板；

步驟3：使用步驟1的引物和步驟2的模板，借助qPCR擴(kuò)增牛細(xì)胞色素b基因特定片段；

步驟4：根據(jù)qPCR的Ct值判斷樣品是否為牛肉或是否含有牛肉或牛的其他組織成份。

所述qPCR反應(yīng)體系為10μL，其中2×qPCR Master mix：5μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。

所述qPCR的程序?yàn)椋?5℃變性/3 s，63℃退火/30 s，72℃延伸反應(yīng)/25 s，40次循環(huán)。

所述qPCR的Ct值判斷樣品是否是或含有牛肉或牛的其他組織成份，若Ct值在16～29時(shí)出現(xiàn)特異性SYBR熒光信號(hào)，則表明檢測(cè)樣品是牛肉或含有牛肉的成分或牛的其他組織成份；反之不是或不含有牛肉成份或牛的其他組織成份。

本發(fā)明的有益效果：采用上述技術(shù)方案，能夠快速鑒定牛肉成份，該發(fā)明可直接用于生產(chǎn)鑒定牛肉成份的試劑盒。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中牛肉引物與豬肉、豬肝和羊肉特異性實(shí)驗(yàn)比較結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中的qPCR程序（上）和將2 ng/μL的羊肉總DNA連續(xù)稀釋10倍的樣品qPCR檢測(cè)結(jié)果（下）。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明使用本發(fā)明的引物結(jié)合qPCR鑒定牛肉的優(yōu)異效果。本發(fā)明使用KAPA Biosystems公司試劑盒——KAPA SYBR Fast qPCR Kit Master Mix (2×) Universal 和Agilent StrataGene Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，但并不限制本發(fā)明使用其他公司的qPCR試劑與儀器設(shè)備。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

制備完全相同的3組，每組4個(gè)樣品，分別以牛肉、豬肉、豬肝和羊肉總DNA為模板，其他條件相同，共計(jì)12管10μL qPCR反應(yīng)體系：2×KAPA SYBR Fast qPCR Master mix：5μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。然后按qPCR程序：95℃變性/3s，63℃退火/30 s，72℃延伸反應(yīng)/25s，40次循環(huán)，實(shí)施qPCR。圖1示出僅在以牛肉總DNA為模板的PCR樣品中檢測(cè)到特異性信號(hào)，Ct值為16，而以豬肉、豬肝和羊肉總DNA為模板進(jìn)行qPCR樣品中，Ct值大于30，表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物優(yōu)良特異性。

實(shí)施例2

制備完全相同的3組，每組5個(gè)樣品，分別以0.2 ng/μL、0.02 ng/μL、2 pg/μL、0..2 pg/μL和0.02 pg/μL的牛肉總DNA為模板，其他條件相同，共計(jì)15管10μqL PCR反應(yīng)體系：2×KAPA SYBR Fast qPCR Master mix：5μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。然后按qPCR程序：95℃變性/3s，63℃退火/30 s，72℃延伸反應(yīng)/25s，40次循環(huán)實(shí)施qPCR。圖2示出當(dāng)牛肉總DNA濃度稀釋至0.2 pg/μL時(shí)，Ct值為29，qPCR仍能夠很好地鑒定出檢測(cè)樣品是牛肉。