本發(fā)明屬于生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定梯棱羊肚菌（Morchella importuna）、六妹羊肚菌（Morchella sextelata）、七妹羊肚菌(Morchella septimelata)和高羊肚菌(Morchella elata)交配型的分子檢測方法和通用特異引物對。本發(fā)明技術(shù)適用于羊肚菌菌種選育、栽培、交配型基因和系統(tǒng)發(fā)育方面的研究。

背景技術(shù)：

O’Donnell等利用多基因譜系一致性系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種識別法（GCPSR），基于LSU、ef1‐a、rpb1 和rpb2 這4個(gè)基因的核苷酸序列，把羊肚菌屬真菌劃分為黃色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）和變紅羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade）。梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和高羊肚菌均屬于黑色羊肚菌支系。

子囊菌的有性生殖目前認(rèn)為由單一交配位點(diǎn)MAT1控制，這個(gè)交配位點(diǎn)包括以MAT1-1-1基因?yàn)樘卣鞯腗AT1-1交配型和以MAT1-2-1基因?yàn)樘卣鞯腗AT1-2交配型。同宗交配的子囊菌自交可育，而異宗交配的子囊菌自交不育，必須由分別具有交配型MAT1-1和交配型MAT1-2的個(gè)體交配后才能完成有性生殖。

近幾年，梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌的人工栽培獲得成功并在全國興起熱潮，很多地方紛紛大面積商業(yè)化種植，但不出菇的情況經(jīng)常發(fā)生，有時(shí)甚至出現(xiàn)整個(gè)大棚或田塊1個(gè)羊肚菌都不出，究其原因除氣候環(huán)境因素外，最主要的就是菌種問題，確保菌種的可靠是首要的技術(shù)關(guān)鍵。

我們通過前期的研究工作，分別獲得了梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和高羊肚菌的MAT1-1-1和MAT1-2-1基因全長序列。通過單子囊孢子交配型比例分析并結(jié)合交配位點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析，證實(shí)這四種羊肚菌都是異宗交配型真菌，有性生殖過程（出菇）需要兩種配型個(gè)體結(jié)合才能完成。羊肚菌的孢子分離和組織分離都有可能只得到一種交配型的菌株，而菌種的繼代培養(yǎng)過程中也會出現(xiàn)一種交配型丟失的現(xiàn)象。因此，對菌株交配型的檢測是獲得有效栽培菌株的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒定黑色羊肚菌類群中四個(gè)種的交配型方法和通用特異引物對，通過特異引物對PCR擴(kuò)增后條帶的有無，鑒定梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和高羊肚菌菌株的交配型，從而確定是否為有效栽培菌株。引物對可以通用于四種羊肚菌菌株，方法簡便而結(jié)果穩(wěn)定可靠。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

鑒定黑色羊肚菌類群中四個(gè)種的交配型方法，包括用于檢測交配型MAT1-1的特異引物對P7-2F/P7-2R或P8-5F/P8-5R，用于檢測交配型MAT1-2的特異引物對P10-1F/P10-2R或P10-2F/P10-3R，相應(yīng)的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序；

所述的P7-2F/P7-2R特異引物對：

P7-2F的核苷酸序列為5’-CCGGTTTATCTTACTGGACTGGTTC-3’ ；（SEQ ID No.1）

P7-2R 的核苷酸序列為5’-GCTTTCCTCTTCTCTCGTTGCCATA -3’ ；（SEQ ID No.2）

所述的P8-5F/P8-5R特異引物對：

P8-5F的核苷酸序列為5’-ATGTCACTCCGTCCGGTTTACCTTA -3’，（SEQ ID No.3）

P8-5R 的核苷酸序列為5’-TGGAATGTCTGTGATTGAGGCTGTG -3’ ；（SEQ ID No.4）

所述的P10-1F/P10-2R特異引物對：

P10-1F的核苷酸序列為5’-GGCCAGAACAGATGCTCGAAGAAGC -3’，（SEQ ID No.5）

P10-2R 的核苷酸序列為5’-CTCCCAAAGCATGATCAAATCCCTC -3’ ；（SEQ ID No.6）

所述的P10-2F/P10-3R特異引物對：

P10-2F的核苷酸序列為5’-AGACCGCTTTAGATAGATTGGCAGG -3’，（SEQ ID No.7）

P10-3R 的核苷酸序列為5’-GATCAAATCCCTCCATTAAGGCATC -3’。（SEQ ID No.8）

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，鑒定交配型MAT1-1和MAT1-2的PCR擴(kuò)增體系相同，均包括2×PCRmix 12.5μL，10μM/L的正反向引物各1μL， DNA模板10ng， ddH₂O補(bǔ)足至25μL。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，特異引物對P7-2F/P7-2R鑒定菌株的MAT1-1交配型的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，62℃退火30 sec，72℃延伸40 sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；

特異引物對P8-5F/P8-5R鑒定菌株的MAT1-1交配型的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，65℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

特異引物對P7-2F/P7-2R檢測菌株的MAT1-1交配型時(shí)，可以獲得大小約為0.6kb的唯一條帶；特異引物對P8-5F/P8-5R檢測菌株MAT1-1交配型時(shí)，可以獲得大小約為1.7kb的唯一條帶。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，特異引物對P10-1F/P10-2R和P10-2F/P10-3R鑒定菌株的MAT1-2交配型的PCR擴(kuò)增程序相同，均為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，64℃退火30 sec，72℃延伸60 sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

特異引物對P10-1F/P10-2R，檢測菌株MAT1-2交配型時(shí)，可以獲得大小約為1.1kb的唯一條帶；特異引物對P10-2F/P10-3R檢測菌株MAT1-2交配型時(shí)，可以獲得大小約為1.0kb的唯一條帶。

本發(fā)明提供鑒定黑色羊肚菌類群中四個(gè)種的交配型的PCR引物對：包括用于檢測交配型MAT1-1的特異引物對為P7-2F/P7-2R或P8-5F/P8-5R，以及用于檢測交配型MAT1-2的特異引物對為P10-1F/P10-2R或P10-2F/P10-3R。

本發(fā)明還要求保護(hù)上述PCR 引物對的鑒定黑色羊肚菌類群中四個(gè)種的交配型的試劑及試劑盒。

本發(fā)明還提供上述PCR 引物對、試劑或試劑盒在鑒定黑色羊肚菌類群中四個(gè)種的交配型中或黑色羊肚菌育種的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，利用P7-2F/P7-2R引物對PCR擴(kuò)增出0.6kb左右唯一條帶，或者P8-5F/P8-5R引物對PCR擴(kuò)增出1.7kb左右唯一條帶，表明菌株含MAT1-1交配型；利用P10-1F/P10-2R引物對PCR擴(kuò)增出1.1kb左右唯一條帶，或者P10-2F/P10-3R引物對PCR擴(kuò)增出1.0kb左右唯一條帶，表明菌株含MAT1-2交配型；檢測菌株若能檢測到兩條預(yù)期的條帶，說明該菌株為含有兩種交配型的菌株，可以作為有效栽培菌株，而只檢測到其中一條預(yù)期的條帶，說明該菌株為只具有一種交配型的菌株，不能用于栽培，可以作為雜交育種的備選菌株。

本發(fā)明基于前期研究工作獲得的梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和高羊肚菌兩個(gè)交配基因序列的特征，設(shè)計(jì)了四對特異引物，可以通用于這四種羊肚菌菌株MAT1-1和MAT1-2交配型的檢測。擴(kuò)增條帶為單一條帶，條帶的有無即可確定菌株的交配型，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

本發(fā)明中所涉及的四種羊肚菌交配基因序列和檢測方法目前國內(nèi)外均未報(bào)道。本發(fā)明中的四對特異引物對，均可以通用于四種羊肚菌交配型的檢測，對于羊肚菌的有性生殖和系統(tǒng)進(jìn)化研究都有重要意義。

引物對P7-2F/P7-2R或P8-5F/P8-5R可以通用于上述四種羊肚菌的MAT1-1交配型檢測。

引物對P10-1F/P10-2R或P10-2F/P10-3R可以通用于上述四種羊肚菌的MAT1-2交配型檢測。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、高羊肚菌MAT1-1-1和MAT1-2-1基因序列目前國內(nèi)外皆未見報(bào)道，本發(fā)明的四對特異引物對，可以通用于這四種羊肚菌交配基因保守區(qū)段的擴(kuò)增，通過擴(kuò)增條帶的有無即可鑒定出菌株的交配型，方法簡便而結(jié)果穩(wěn)定可靠。在4小時(shí)內(nèi)可以完成全套檢測流程，每個(gè)樣品的檢測成本只需50元左右。此方法還可以進(jìn)一步用于羊肚菌有性生殖和系統(tǒng)進(jìn)化方面的研究。

附圖說明

圖1為梯棱羊肚菌YPL2單子囊孢子菌株交配型檢測電泳圖。A:P8-5F/P8-5R引物對擴(kuò)增交配基因MAT1-1-1；B：P10-1F/P10-2R引物對擴(kuò)增交配基因MAT1-2-1。M代表Marker-DL2000（圖中從上到下的條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；1~24代表梯棱羊肚菌單子囊孢子菌株YPL2-1~YPL2-24。

圖2為六妹羊肚菌HL1單子囊孢子菌株交配型檢測電泳圖。M代表Marker-DL2000（圖中從上到下的條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp）；1~12代表菌株HL1-1~HL1-12用引物對P7-2F/P7-2R擴(kuò)增交配基因MAT1-1-1；13-24代表菌株HL1-1~HL1-12用引物對P10-2F/P10-3R擴(kuò)增交配基因MAT1-2-1。

圖3為高羊肚菌2688單子囊孢子菌株交配型檢測電泳圖。M代表Marker-DL2000（圖中從上到下的條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp）；1~12代表菌株23-S1~23-S12用引物對P7-2F/P7-2R擴(kuò)增交配基因MAT1-1-1；13~24代表菌株23-S1~23-S12用引物對P10-2F/P10-3R擴(kuò)增交配基因MAT1-2-1。

圖4為羊肚菌有效栽培菌株檢測電泳圖。M代表Marker-DL2000（圖中從上到下的條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp）；1、2、、3、4分別代表菌株YPL2、YPL6、HL1、HL2用引物對P7-2F/P7-2R擴(kuò)增交配基因MAT1-1-1；5、6、7、8分別代表菌株YPL2、YPL6、HL1、HL2用引物對P10-2F/P10-3R擴(kuò)增交配基因MAT1-2-1；CK代表沒加模板的負(fù)對照。

圖5為七妹羊肚菌3712單子囊孢子菌株交配型檢測電泳圖。M代表Marker-DL2000（圖中從上到下的條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；1~12代表菌株3712-10~3712-21用引物對P8-5F/P8-5R擴(kuò)增交配基因MAT1-1-1；13~24代表菌株3712-10~3712-21用引物對P10-1F/P10-2R擴(kuò)增交配基因MAT1-2-1。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1梯棱羊肚菌YPL2單子囊孢子菌株交配型鑒定

梯棱羊肚菌單子囊孢子菌株YPL2-1—YPL2-24接種在PDA培養(yǎng)基上，23℃培養(yǎng)10d，挑取適量菌絲體，CTAB法提取DNA，取3 μL在1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。

分別以YPL2-1—YPL2-24的DNA為模板，用引物對P8-5F/P8-5R進(jìn)行PCR擴(kuò)增：25μL擴(kuò)增體系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 μL，10 μM/L 的P8-5F、P8-5R引物各1 μL，DNA模板1μL，ddH₂O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，65℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30循環(huán)；72℃延伸10 min。

分別以YPL2-1—YPL2-24的DNA為模板，用引物對P10-1F/P10-2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL擴(kuò)增體系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 μL，10 μM/L 的P10-1F、P10-2R引物各1 μL， DNA模板1 μL，ddH₂O 9.5μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，64℃退火30 sec，72℃延伸60 sec，30循環(huán)；72℃延伸10 min。

所有擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖1的A和B，菌株YP2-2、YPL2-8、YPL2-10、YPL2-12、YPL2-13、YP2-14、YPL2-16、YPL2-17、YPL2-18、YPL2-21、YPL2-22、YPL2-23、YPL2-24在引物對P8-5F/P8-5R擴(kuò)增時(shí)有1.7kb左右唯一條帶，而用引物對P10-1F/P10-2R擴(kuò)增時(shí)無條帶，鑒定為交配型MAT1-1菌株。而菌株YP2-1、YPL2-3、YPL2-4、YPL2-5、YPL2-6、YP2-7、YPL2-9、YPL2-11、YPL2-15、YPL2-19、YPL2-20在引物對P8-5F/P8-5R擴(kuò)增時(shí)無條帶，而引物對P10-1F/P10-2R擴(kuò)增時(shí)有1.1kb左右唯一條帶，鑒定為交配型MAT1-2菌株。

實(shí)施例2 六妹羊肚菌HL1單子囊孢子菌株交配型鑒定

六妹羊肚菌單子囊孢子菌株HL1-1—HL1-12接種在PDA培養(yǎng)基上，23℃培養(yǎng)10d，挑取適量菌絲體，CTAB法提取DNA，取3 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。

分別以HL1-1—HL1-12的DNA為模板，用引物對P7-2F/P7-2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25μL擴(kuò)增體系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 μL，10 μM/L 的P7-2F、P7-2R引物各1 μL， DNA模板1μL，ddH₂O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，62℃退火30 sec，72℃延伸40 sec，30循環(huán)；72℃延伸10 min。

分別以HL1-1—HL1-12的DNA為模板，用引物對P10-2F/P10-3R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL擴(kuò)增體系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 μL，10 μM/L 的P10-2F、P10-3R引物各1 μL， DNA模板1 μL，ddH₂O 9.5μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，64℃退火30 sec，72℃延伸60 sec，30循環(huán)；72℃延伸10 min。

所有擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖2，菌株HL1-1、HL1-5、HL1-6、HL1-7、HL1-9、HL1-10只有引物對P7-2F/P7-2R擴(kuò)增出0.6kb左右條帶，為MAT1-1交配型；菌株 HL1-3、HL1-8、HL1-11、HL1-12只有引物對P10-2F/P10-3R擴(kuò)增出1.0kb左右條帶，為MAT1-2 交配型；而菌株HL1-2、HL1-4兩個(gè)引物對都擴(kuò)增出條帶，包含兩種交配型。

實(shí)施例3 高羊肚菌2688單子囊孢子菌株交配型鑒定

高羊肚菌單子囊孢子菌株23-S1—23-S12接種在PDA培養(yǎng)基上，23℃培養(yǎng)10d，挑取適量菌絲體，CTAB法提取DNA，取3 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。

用引物對P7-2F/P7-2R和P10-2F/P10-3R進(jìn)行交配型檢測，操作步驟同實(shí)施例2。

所有擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖3，菌株 23-S3、23-S7、23-S9、23-S10、23-S11只有引物對P7-2F/P7-2R擴(kuò)增出0.6kb左右條帶，為MAT1-1交配型；菌株 23-S1、23-S2、23-S4、23-S15、23-S6、23-S8、23-S12只有引物對P10-2F/P10-3R擴(kuò)增出1.0kb左右條帶，為MAT1-2交配型。

實(shí)施例4 梯棱菌株和六妹羊肚菌有效栽培菌株鑒定

梯棱羊肚菌菌株YPL2、YPL6和六妹羊肚菌菌株HL1、HL2接種在PDA培養(yǎng)基上，23℃培養(yǎng)10d，挑取適量菌絲體，CTAB法提取DNA，取3 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。

用引物對P7-2F/P7-2R和P10-2F/P10-3R進(jìn)行交配型檢測，操作步驟同實(shí)施例2。

所有擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖4，菌株YPL6、YPL2、HL1、HL2用兩個(gè)引物對都擴(kuò)增出預(yù)期條帶，表明包含兩種交配型，可作為有效栽培菌株。通過鑒定的有效栽培菌株菌株YPL6、和HL1栽種后，均已出菇，而只含一種交配型的4個(gè)菌株均未出菇。

實(shí)施例5 七妹羊肚菌3712單子囊孢子菌株交配型鑒定

七妹羊肚菌3712單子囊孢子菌株3712-10—3712-21接種在PDA培養(yǎng)基上，23℃培養(yǎng)10d，挑取適量菌絲體，CTAB法提取DNA，取3 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。

用引物對P8-5F/P8-5R和P10-1F/P10-2R進(jìn)行交配型檢測，操作步驟同實(shí)施例1。

所有擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖5，菌株 3712-1、3712-5、3712-8、3712-9只有引物對P8-5F/P8-5R擴(kuò)增出1.7kb左右條帶，為MAT1-1交配型；菌株 3712-2、3712-3、3712-4、3712-6、3712-7、3712-10、3712-11、3712-12只有引物對P10-1F/P10-2R擴(kuò)增出1.1kb左右條帶，為MAT1-2交配型。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。

序列表

SEQ ID No.1

CCGGTTTATC TTACTGGACT GGTTC 25

SEQ ID No.2

GCTTTCCTCT TCTCTCGTTG CCATA 25

SEQ ID No.3

ATGTCACTCC GTCCGGTTTA CCTTA 25

SEQ ID No.4

TGGAATGTCT GTGATTGAGG CTGTG 25

SEQ ID No.5

GGCCAGAACA GATGCTCGAA GAAGC 25

SEQ ID No.6

CTCCCAAAGC ATGATCAAAT CCCTC 25

SEQ ID No.7

AGACCGCTTT AGATAGATTG GCAGG 25

SEQ ID No.8

GATCAAATCC CTCCATTAAG GCATC 25

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 鑒定黑色羊肚菌類群中四個(gè)種的交配型方法和引物對

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCGGTTTATC TTACTGGACT GGTTC 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GCTTTCCTCT TCTCTCGTTG CCATA 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ATGTCACTCC GTCCGGTTTA CCTTA 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

TGGAATGTCT GTGATTGAGG CTGTG 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

GGCCAGAACA GATGCTCGAA GAAGC 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

CTCCCAAAGC ATGATCAAAT CCCTC 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

AGACCGCTTT AGATAGATTG GCAGG 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

GATCAAATCC CTCCATTAAG GCATC 25