本發(fā)明屬于生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定梯棱羊肚菌（Morchella importuna）交配型的方法和特異引物對(duì)。本發(fā)明技術(shù)適用于羊肚菌菌種選育、栽培、交配型基因和系統(tǒng)發(fā)育方面的研究。

背景技術(shù)：

子囊菌的有性生殖目前認(rèn)為由單一交配位點(diǎn)MAT1控制，這個(gè)交配位點(diǎn)包括以MAT1-1-1基因?yàn)樘卣鞯腗AT1-1交配型和以MAT1-2-1基因?yàn)樘卣鞯腗AT1-2 交配型。同宗交配的子囊菌自交可育，而異宗交配的子囊菌自交不育，必須由分別具有交配型MAT1-1和交配型MAT1-2的個(gè)體交配后才能完成有性生殖。

梯棱羊肚菌是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的美味食用菌，目前野生干品價(jià)格在2000元/公斤左右。近幾年，梯棱羊肚菌的人工栽培獲得成功并在全國興起熱潮，很多地方紛紛大面積商業(yè)化種植，但不出菇的情況經(jīng)常發(fā)生，有時(shí)甚至出現(xiàn)整個(gè)大棚或田塊1個(gè)羊肚菌都不出，究其原因除氣候環(huán)境因素外，最主要的就是菌種問題，確保菌種的可靠是首要的技術(shù)關(guān)鍵。

我們對(duì)梯棱羊肚菌基因組測序，獲得其MAT1-1-1和MAT1-2-1基因全長序列，通過單子囊孢子交配型比例分析并結(jié)合交配位點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析，證實(shí)梯棱羊肚菌是異宗交配型真菌，有性生殖過程（出菇）需要兩種配型個(gè)體結(jié)合才能完成。羊肚菌的孢子分離和組織分離都有可能只得到一種交配型的菌株，而菌種的繼代培養(yǎng)過程中也會(huì)出現(xiàn)一種交配型丟失的現(xiàn)象。因此，對(duì)菌株交配型的檢測是獲得有效栽培菌株的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒定梯棱羊肚菌交配型的方法和特異引物對(duì)，該方法是通過檢測兩對(duì)特異引物對(duì)PCR擴(kuò)增后條帶的有無，鑒定梯棱羊肚菌菌株的交配型，從而確定是否為有效栽培菌株，并為雜交育種提供可靠的待選菌株。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

鑒定梯棱羊肚菌交配型的方法，包括用于檢測交配型MAT1-1的特異引物對(duì)P8-4F/P8-4R，用于檢測交配型MAT1-2的特異引物對(duì)P6-1F/P6-1R，相應(yīng)的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序；

所述的P8-4F/P8-4R特異引物對(duì)中：

P8-4F的核苷酸序列為5’-GCTCTCTTGTGCCCCTTTTGACTAT-3’；（SEQ ID No.1）

P8-4R的核苷酸序列為5’-TCTACCAGCCATGTGAAACAAGCAA-3’ ；（SEQ ID No.2）

所述的P6-1F/P6-1R特異引物對(duì)中：

P6-1F的核苷酸序列為5’-GAGACTCAAATCTGACTGACTTCCT-3’（SEQ ID No.3）

P6-1R 的核苷酸序列為5’-GAAGAACCTCAGATAAGCGTAAAAT-3’。（SEQ ID No.4）

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，鑒定交配型MAT1-1和MAT1-2的PCR擴(kuò)增體系相同，均包括2×PCRmix 12.5 μL，10 μM/L 的正反向引物各1 μL，DNA模板10 ng， ddH₂O補(bǔ)足至25 μL。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，鑒定MAT1-1交配型的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；

鑒定MAT1-2交配型的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

檢測梯棱羊肚菌菌株的MAT1-1交配型時(shí)，可以獲得大小為1837bp唯一條帶，且該條帶包含了MAT1-1-1全長基因；檢測梯棱羊肚菌菌株的MAT1-2交配型時(shí)，可以獲得大小為1744bp唯一條帶，且該條帶包含了MAT1-2-1全長基因。

本發(fā)明提供鑒定梯棱羊肚菌交配型的PCR引物對(duì)，包括用于檢測交配型MAT1-1的特異引物對(duì)P8-4F/P8-4R和用于檢測交配型MAT1-2的特異引物對(duì)P6-1F/P6-1R。

本發(fā)明還要求保護(hù)上述PCR 引物對(duì)的鑒定梯棱羊肚菌交配型的試劑及試劑盒。

本發(fā)明還提供上述PCR 引物對(duì)、試劑或試劑盒在鑒定梯棱羊肚菌交配型中的應(yīng)用。

本發(fā)明同時(shí)提供上述PCR 引物對(duì)、試劑或試劑盒在鑒定梯棱羊肚菌育種的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，用引物對(duì)P8-4F/P8-4R 擴(kuò)增出1837bp左右唯一條帶，表明菌株含MAT1-1交配型；用引物對(duì)P6-1F/P6-1R 擴(kuò)增出1744bp左右唯一條帶，表明菌株含MAT1-2交配型；兩對(duì)引物對(duì)PCR擴(kuò)增都能檢測到預(yù)期條帶的菌株，含有兩種交配型，可以作為有效栽培菌株，而只具有單一交配型的菌株，不能用于栽培，可以作為雜交育種的備選菌株。

本發(fā)明基于基因組測序獲得的兩個(gè)交配基因序列的特征，設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異引物，分別用于梯棱羊肚菌菌株MAT1-1和MAT1-2交配型的檢測。擴(kuò)增條帶為單一條帶，條帶的有無即可確定菌株的交配型，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

本發(fā)明中所涉及的梯棱羊肚菌的交配基因序列和檢測方法目前國內(nèi)外均未報(bào)道。通過本發(fā)明的引物，可擴(kuò)增得到MAT1-1-1和MAT1-2-1 基因的全長序列，對(duì)于羊肚菌的有性生殖和系統(tǒng)進(jìn)化研究都有重要意義。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

梯棱羊肚菌MAT1-1-1和MAT1-2-1基因序列目前國內(nèi)外皆未見報(bào)道，利用本發(fā)明的兩對(duì)引物對(duì)，可以擴(kuò)增得到這兩個(gè)基因的全長序列，不僅可以通過擴(kuò)增條帶的有無鑒定梯棱羊肚菌菌株的交配型，而且可以用于進(jìn)一步有性生殖和系統(tǒng)進(jìn)化方面的研究。梯棱羊肚菌栽培中，由于菌種問題帶來每畝的直接經(jīng)濟(jì)損失在4000元以上。通過本技術(shù)的應(yīng)用，可以在4小時(shí)內(nèi)鑒定出是否為有效的栽培菌株，每個(gè)樣品的檢測成本只需50元左右,由此帶來的社會(huì)效益明顯。

附圖說明

圖1為梯棱羊肚菌YPL6單子囊孢子群體交配型MAT1-1檢測電泳圖：M代表Marker-DL2000（圖中從上到下的條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp）；1-24代表梯棱羊肚菌單子囊孢子菌株YPL6-1—YPL6-24。

圖2為梯棱羊肚菌YPL6單子囊孢子群體交配型MAT1-2檢測電泳圖：M代表Marker-DL2000（圖中從上到下的條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；1-24代表梯棱羊肚菌單子囊孢子菌株YPL6-1—YPL6-24。

圖3為梯棱羊肚菌有效栽培菌株檢測電泳圖：M代表Marker-DL2000（圖中從上到下的條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp）；1、2、3、4分別是菌株SP1、SP2、YPL6、YPL7檢測MAT1-1交配型；5、6、7、8分別是菌株SP1、SP2、YPL6、YPL7檢測MAT1-2交配型。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1梯棱羊肚菌YPL6單子囊孢子群體交配型鑒定

梯棱羊肚菌YPL6單子囊孢子群體菌株YPL6-1—YPL6-24接種在PDA培養(yǎng)基上，23℃培養(yǎng)10d，挑取適量菌絲體，CTAB法提取DNA，取3 μL在1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。

分別以YPL6-1—YPL6-24的DNA為模板，用引物對(duì)P8-4F/P8-4R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25μL擴(kuò)增體系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 μL，10 μM/L 的P8-4F、P8-4R引物各1 μL， DNA模板1μL，ddH₂O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30循環(huán)；72℃延伸10 min。

分別以YPL6-1—YPL6-24的DNA為模板，用P6-1F/P6-1R引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL擴(kuò)增體系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 μL，10 μM/L 的P6-1F、P6-1R引物各1 μL， DNA模板1 μL，ddH₂O 9.5μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30循環(huán)；72℃延伸10 min。

所有擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖1和圖2，菌株YPL6-2、YPL6-3、YPL6-5、YPL6-7、YPL6-9、 YPL6-10、YPL6-11、YPL6-17 、YPL6-20、YPL6-21、YPL6-23在引物對(duì)P8-4F/P8-4R擴(kuò)增時(shí)有1.8kb左右唯一條帶，而用P6-1F/P6-1R引物對(duì)擴(kuò)增時(shí)無條帶，鑒定為交配型MAT1-1菌株。菌株YPL6-1、YPL6-4、YPL6-6、YPL6-8、YPL6-12、 YPL6-13、YPL6-14、YPL6-15 、YPL6-16、YPL6-18、YPL6-19、YPL6-22、YPL6-24在引物對(duì)P8-4F/P8-4R擴(kuò)增時(shí)無條帶，而引物對(duì)P6-1F/P6-1R擴(kuò)增時(shí)有1.7kb左右唯一條帶，鑒定為交配型MAT1-2菌株。

實(shí)施例2 梯棱羊肚菌有效栽培菌株的鑒定

待測菌株為梯棱羊肚菌菌株SP1、SP2、YPL6、YPL7，菌株培養(yǎng)、DNA提取、PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序同實(shí)施例1。

擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果見圖3，SP2、YPL6、YPL7菌株用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R引物對(duì)PCR擴(kuò)增都有條帶，說明具有兩種交配型，是有效栽培菌株。而SP1菌株用P8-4F/P8-4R引物對(duì)擴(kuò)增時(shí)無條帶，P6-1F/P6-1R引物對(duì)擴(kuò)增有條帶，為MAT1-2交配型菌株，不能作為栽培菌株。菌株YPL6、YPL7栽培后已出菇。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。

序列表

SEQ ID No.1

GCTCTCTTGT GCCCCTTTTG ACTAT 25

SEQ ID No.2

TCTACCAGCC ATGTGAAACA AGCAA 25

SEQ ID No.3

GAGACTCAAA TCTGACTGAC TTCCT 25

SEQ ID No.4

GAAGAACCTC AGATAAGCGT AAAAT 25

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 鑒定梯棱羊肚菌交配型的方法和特異引物對(duì)

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCTCTCTTGT GCCCCTTTTG ACTAT 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TCTACCAGCC ATGTGAAACA AGCAA 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

GAGACTCAAA TCTGACTGAC TTCCT 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GAAGAACCTC AGATAAGCGT AAAAT 25