本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的引物、試劑盒、檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著我國小麥產(chǎn)量的不斷提高，人們對優(yōu)質(zhì)小麥的需求日益增大，是攝取蛋白質(zhì)的主要來源，提高小麥蛋籽粒白質(zhì)含量(簡稱GPC)已成為近年來小麥品質(zhì)育種的主要目的，開發(fā)能夠檢測GPC高低的分子標(biāo)記，可為分子輔助選擇育種提供依據(jù)。

由于籽粒蛋白質(zhì)含量必須在收獲后才能進(jìn)行品質(zhì)測試，且易受環(huán)境條件影響，因此選擇效率較低，分子標(biāo)記輔助選擇可在DNA水平針對低蛋白質(zhì)含量基因或QTL對育種材料進(jìn)行選擇，因而可以在苗期進(jìn)行選擇，并且可以克服籽粒蛋白質(zhì)含量鑒定的不穩(wěn)定性，降低表型評價的成本，提高弱筋小麥品質(zhì)育種效率。Blanco等(2002)發(fā)現(xiàn)了7個控制籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL位點，分別位于4B、5A、6A、6B、7A和7B染色體上；Prasad等(1999)把控制籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL位點定位在2D染色體上；Huang(2006)等利用加倍單倍體群體，在4B和4D染色體上發(fā)現(xiàn)控制籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL；Li等(2007)利用含有229個和485個家系的兩個重組自交系群體分別檢測到3個和10個影響籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL，分別定位于2B、3A、4A、4D、5B、7A、7B和1A、1B、2A、2D、3A、4B、5A、5D、6B、7D染色體上，以目前公開的文獻(xiàn)資料來看，控制籽粒蛋白質(zhì)含量的基因或QTL較多，但單效應(yīng)值不高，且常規(guī)方法只能在雜交第4代之后才能對籽粒蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢查，因此增加了育種家對該性狀選擇的工作量，準(zhǔn)確性和育種效率低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的引物；

本發(fā)明的另一目的在于提供檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的試劑盒；

本發(fā)明的第三目的在于提供一種檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的檢測方法及應(yīng)用；

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的引物，所述引物的上游引物序列如SEQIDNO：Ⅰ所示，下游引物序列如SEQIDNO：Ⅱ所示。

一種檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的引物。

進(jìn)一步地，它還包括：10×PCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、Mg²⁺和電泳常規(guī)試劑。

一種檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的方法，它包括以下步驟：

S1.PCR擴(kuò)增：以待測小麥的基因組DNA為模板，以上述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；

S2.結(jié)果判斷：檢測步驟S1所得PCR產(chǎn)物的大小，按如下方法確定高籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥：

A.所述PCR產(chǎn)物中含有大小為1718bp的DNA片段，則所述待測小麥為高籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥；

B.所述PCR產(chǎn)物中不含有大小為1718bp的DNA片段，則所述待測小麥為非高籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥。

進(jìn)一步地，所述大小為1718bp的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：Ⅲ所示。

進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為54℃。

如上述的方法在篩選和培育高籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥新品種中的應(yīng)用。具體為篩選高含量小麥籽粒蛋白質(zhì)的小麥品種；培育高小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥品種。

在實際應(yīng)用中，判斷PCR產(chǎn)物中是否含有目的DNA片段時，可通過將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(凝膠濃度具體可為1％)，看電泳圖譜上是否含有目的條帶，電泳圖譜上含有目的條帶，則PCR產(chǎn)物中含有目的DNA片段。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的引物、檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的試劑盒、檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的檢測方法及應(yīng)用。通過對80份小麥品種的統(tǒng)計實驗結(jié)果表明，采用引物擴(kuò)增出1718bp目的條帶的42份小麥品種GPC變幅為15.0％-19.2％，均值為16.4％；不能擴(kuò)增出1718bp目的條帶的有38份，小麥品種GPC變幅為10.2％-15.2％，均值為12.6％，方差分析結(jié)果顯示，兩者達(dá)到極顯著水平?？梢?，本發(fā)明所提供的檢測小麥高GPC的方法可靠、簡便、實用，在小麥種質(zhì)資源評價和分子標(biāo)記輔助選擇育種中具有重要應(yīng)用前景，同時為培育小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥品種提供了參考依據(jù)。本發(fā)明在育種雜交第2代即可對籽粒高蛋白質(zhì)含量進(jìn)行篩選，克服了育種只能在雜交第4代之后才能對籽粒蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢查，因此減少了育種家對該性狀選擇的工作量，提高選擇的準(zhǔn)確性和育種效率，是一種高效、快速的育種新技術(shù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物對不同GPC含量的小麥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，各條帶由大到小依次為5000bp、3000bp、2000bp、1000bp；編號為1的泳道是使用本發(fā)明引物在高GPC品種ZM7186擴(kuò)增出1718bp的DNA片段；編號為2的泳道是使用本發(fā)明引物在非高GPC品種川育12中未擴(kuò)增出1718bp的DNA片段。

圖2為本發(fā)明引物分別對16個不同GPC含量的小麥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，各條帶由大到小依次為5000bp、3000bp、2000bp、1000bp；編號為泳道1-泳道16的品種分別為：ZM6352，ZM5723，ZM12064，ZM6333，藏春6號，加查幫達(dá)冬麥，白朗麥，ZM3489，W5293，川育12，綿45，綿28白，川育20，川麥51，綿20，川農(nóng)22。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。

實施例1：小麥籽粒GPC的測定

以表1中80份小麥品種作為實驗材料，采用GB 50095-2010中所示的方法測定小麥籽粒的GPC。該GPC數(shù)據(jù)為80份小麥品種種植在兩年三點間的均值，種植地力一致。

表1：小麥GPC的測定結(jié)果及PCR擴(kuò)增條帶

注：表中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一欄中“+”表示擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，“-”表示未擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶。

實施例2：小麥籽粒GPC相關(guān)分子標(biāo)記的合成及檢測方法

1、小麥GPC相關(guān)分子標(biāo)記的合成

合成由序列表中序列Ⅰ和序列Ⅱ組成的引物，標(biāo)記為：GPC-A

引物GPC-A的上下游引物如下：

GPC-A-F(序列Ⅰ)：5’-TTCACCTATGGTTTTTCCGTTC-3’(序列Ⅲ的第1-22位)；

GPC-A-R(序列Ⅱ)：5’-GCAACAAAAACAACAACT-3’(序列Ⅲ的第1701-1718位的反向互補(bǔ)序列)。

2、利用步驟1的分子標(biāo)記檢測小麥高GPC的方法

(1)PCR擴(kuò)增

以小麥基因組DNA為模板，采用引物GPC-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)體系(20μl)：2.0μL 10×PCRbuffer、50ng/μL DNA 1.0μL、2.5mmol/L總dNTPs 2.0μL、濃度為10μmol/L的上游引物(GPC-A-F)0.20μL、濃度為10μmol/L的下游引物(GPC-A-R)0.20μL、5U/μL高保真酶0.4μL、ddH₂O13.2μL。

采用引物GPC-A進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性35s；54℃退火35s，72℃延伸1min30s，共循環(huán)34次；最后72℃延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳分離，緩沖體系為1×TAE溶液，200V電壓電泳20min，EB染色顯影后照相統(tǒng)計并保存。

(2)目標(biāo)條帶的測序與分析

(3)根據(jù)結(jié)果判定待測小麥?zhǔn)欠駷楦逩PC

用引物GPC-A檢測否為高GPC：若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為1718bp的DNA片段(序列Ⅲ)，則所述待測小麥為高GPC的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中不含有大小為1718bp的DNA片段(序列Ⅲ)，則所述待測小麥為非高GPC小麥。

實施例3：引物GPC-A用于檢測小麥高GPC的有效性驗證

用引物GPC-A分別對表1中共80份小麥品種進(jìn)行了PCR分析，操作方法同實施例2中步驟二。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，參照實施例2步驟二2(3)中的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進(jìn)行判斷。

結(jié)果顯示，部分小麥品種的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果如圖2所示，從結(jié)果中可以看出：在這80份小麥品種中，利用引物GPC-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增時得到了大小為1718bp的目的條帶(序列Ⅲ)的小麥品種有42份。42份小麥品種的GPC變幅和均值如表1所示在(15.0％-19.2％)之間均值為16.4％；38份小麥品種的GPC變幅和均值如表1所示在(10.2％-15.2％)之間均值為12.6％，方差分析結(jié)果顯示，兩者達(dá)到極顯著水品(P<0.01)。

SEQUENCE LIST

<110> 中國科學(xué)院成都生物研究所

<120> 一種檢測小麥高籽粒蛋白質(zhì)含量的引物、試劑盒、檢測方法及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工 序列

<400> 1

ttcacctatg gtttttccgt tc 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaacaaaaa caacaact 18

<210> 3

<211> 1718

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcacctatg gtttttccgt tctcggttca gcgttccacc gtcgtcgtcc aaatacgtac 60

tagtaccaac agcgtccaaa tacaccgtac ggcaccgcca gaagaggagt ctgccggaaa 120

tttagctcgg cattcactcg tttccttggc gaagctggca agcagccgcc acttaccata 180

gatgatctgc tttgactcgc ggcggaaatg tttccccgaa acgatgaagg ggacggccgg 240

attcgtggga ttccgcgagg cagagtaatt gaccgatcgc cgcattaaaa gaatgaatgt 300

acagtggaag gccggtcagg tgcaaggccc ggcagccctt atatataccc gccgcccgcg 360

gctacgacag aatccatcaa atttcccgag agagagaccg acagcggtgc ccgagcggag 420

gaagaggcgg ggagagagag ggagagaggg agagagatgg acgtggagaa ggtgacggag 480

gtggcgccgg aggtggacga cgacggccgc gtaagaacag gtagcgcaca cgactccccc 540

ttgtagagag ctccgttgtt cgcggtttca gttcgttggt tccttcgctt gatgccttcc 600

gtctgagccg tgatgcgata ccggcaaacc cgctcgtcct tgtggcgagg aggcatggcc 660

ggatgcggtg ttttcaggtc cgtgcgtgag aaacggtagg aagctaggta gacgacagcg 720

gtagaacagt tcatgtctcg gttgcagagg ttttagaggg cgatgctggc gatcaaattg 780

gcactcaaaa tggattatat catactcttg ccgatttgcc tctcaagtct ttaggtactt 840

gaagtggcaa acttctcgtt ctgcaccgga atgtcaaaaa aagattggca cactgcaaac 900

tagtactagc ttggtatggg tagtatcaca aattcacaat catggagaaa agaaaaagaa 960

ttatcgcata tcctgaaact attgtcttat agaacattaa cacacattct tttttccgga 1020

aacaaacgtc catggttagg acttaggacc tggaactctg ctttgacaga ggaacatgtt 1080

gtagcagagc aattcaaaat tttgcccatc gcttgtgatc agcagcgtag cccaggatcc 1140

aggcagcgct gtcgctttta gatgtttgca tgcatgcagg ccgagctagt ttagtactcc 1200

ctccgtcaca aaattcttgt cttagatttg tttagatacg gatgtaccta atactaaaac 1260

gtgacttggc agtacctcca tatcttcccc atttctcttg acagttgaca catcacttgt 1320

ccaactccaa tccagatgac aaccctgaca tcgggacgaa atacatgcac cctgcatcta 1380

catgctctat ctgaaaatca gccatcccct gagaatgtgc catccatggt gtggcgcctc 1440

tgcgccattc cttttacaac gccccaaatg atgggaaccg ggttggtggc atggtattga 1500

tgcaggaatt aggtccaaat gccctgtgtc cccgatccgg tagagcaaaa taacttgctg 1560

cgagatccaa aattccggtg acttggcagg cactacccaa agcaagtggc ctcggcttgc 1620

aactcttatg cagcgtgagc accatagtgc ttcagaatta tacagaaaaa cttagtggtg 1680

tgtgagatca tggcatgcaa agttgttgtt tttgttgc 1718