專利名稱：乙型肝炎病毒前表面抗原蛋白導(dǎo)向藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程表達的融合蛋白，即將乙型肝炎病毒表面抗原(Pres1-65)與毒素蛋白相連接的融合蛋白。毒素蛋白應(yīng)選用對患病細胞有針對性作用的，例如人腫瘤壞死因子或其突變體，特別是第二位由Arg突變?yōu)長ys的人腫瘤壞死因子突變體。
眾所周知，乙肝表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白，由HBV基因組的S開放閱讀框架(S-ORF)所編碼，HBsAg含有大、中、小3種分子形式蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)C端具有相同的序列1、2。其中小分子蛋白(SHBs)即主要蛋白由226個氨基酸組成，中蛋白是在主要蛋白N端加上由55個氨基酸組成的preS2區(qū)，大分子蛋白(LHBs)則根據(jù)病毒亞型的不同在中蛋白的N端前面再加上由108或119個氨基酸組成的preS1區(qū)，這三種蛋白都存在糖基化和非糖基化的形式。Lin和Pontisso等實驗表明，LHBs的preS1區(qū)參與病毒與肝細胞膜的結(jié)合，Petit等指出preS1(21-47)肽段是病毒與含有肝細胞受體的肝腫瘤細胞HepG2的結(jié)合位點，但也可能還有preS1(11-14)肽段。Rhyum等認為，HBVadr亞型preS1(1-56)肽含有B細胞和T細胞抗原決定簇，preS1蛋白含有許多免疫原性比S蛋白更強的T細胞和B細胞表位，preS1特異性的細胞免疫可以幫助克服某些個體對S蛋白的免疫無反應(yīng)狀態(tài)或同時對S蛋白和preS2蛋白的雙重?zé)o反應(yīng)狀態(tài)9。實驗還證明，化學(xué)合成的preS1(12-47)肽段接種黑猩猩后，能使黑猩猩對HBV攻擊獲得良好保護，因而有人提出基因工程疫苗也應(yīng)帶有preS1蛋自，以期獲得對HBV比較全面均衡的免疫效果。還有人報道，preS1抗原的出現(xiàn)與病毒的復(fù)制水平密切相關(guān)，而且乙肝病毒表面抗原上的preS1表位只有在病毒完全消除之后才會消失，從而可以用作指示病毒復(fù)制劑量以及預(yù)后和評價治療效果的檢驗指標(biāo)。為此，汪垣等人采用化學(xué)合成preS1(20-47)肽段以及核心抗原與preS1(20-47)融合表達蛋白，Sidorkieovicz14等則采用與β半乳糖苷酶(450aa)融合表達得到的preS1(20-4退)四串聯(lián)肽段建立了preS1的抗原-抗體檢測試劑盒。
本發(fā)明利用乙肝病毒表面抗原preS1對肝細胞具有專一親和性和人腫瘤壞死因子具有抗腫瘤活性這兩方面的特點，將含有β細胞和T細胞抗原決定簇和肝細胞結(jié)合的全部位點在內(nèi)的preS1(1-65)肽段(或相關(guān)肽段)同人腫瘤壞死因子或其突變體的羧末端進行融合并構(gòu)建成功同時具有HBV-preS1抗原活性和抗腫瘤活性的融合蛋白，它將有可能發(fā)展成為治療肝癌的導(dǎo)向藥物。
本發(fā)明的創(chuàng)新點和意義在于1、它為今后在人腫瘤壞死因子及其突變體的羧末端接上一個具有與腫瘤細胞特異抗原有高親和性的肽段進行融合，構(gòu)建成功對某種腫瘤細胞具有高效的新的抗腫瘤藥物提示了可能性。
2、它開創(chuàng)了乙肝病毒表面抗原PreS1與其它毒素或殺傷蛋白以融合的方式來構(gòu)建對肝區(qū)疾病有特異性療效的導(dǎo)向藥物的方向。
3、提供了一條制備乙肝病毒preS1抗原肽段的新方法。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、避免了毒素蛋白可能引起的臟器中毒或全身性副反應(yīng)。
2、排除了其他臟器對藥物的反應(yīng)，在劑量設(shè)置時只需單純考慮藥物對肝細胞的作用，有利于準(zhǔn)確給藥。
3、減少用藥量下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作一步說明

圖1是P1、P2、P3、P4引物順序表圖2是preS1(1-65)肽基因序列3是腫瘤壞死因子(h-TNFα)基因序列4是hTNFα-PreS1融合基因序列圖1、preS1(1-65)肽基因的合成根據(jù)HBVadr亞型的基因核苷酸順序，設(shè)計并合成兩個PCR引物，其中P1位于PreS1(1-65)基因的5’端并帶有XhoⅠ酶切位點，P2互補于preS1(1-65)肽段末端氨基酸相應(yīng)的基因序列，并含有終止密碼子及BamHⅠ酶切位點，PCR反應(yīng)以含HBVADRⅠ基因的質(zhì)粒FNA為模板，反應(yīng)體積為100μl，含有100pmol的引物P1和P2,10μl10×Taq聚合酶緩沖液，200pmoldNTP，反應(yīng)于PCR自動反應(yīng)儀(ThermOlyne公司產(chǎn)品)，按反應(yīng)程序自動反應(yīng)30個循環(huán)，94℃30秒，50℃40秒，72℃40秒，最后于72℃保溫10分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)氯仿抽提，乙醇沉淀、備用，P1,P2引物順序見圖1。
2、PCR法改造腫瘤壞死因子(hTNFα)基因TNF基因5’端和3’端分別為EcoRⅠ和BamHⅠ識別位點，并有自己的終止密碼子TAA，為了使preS1(1-65)肽正確融合在hTNFα基因之后，必須消除hTNFα基因的終止密碼子及改變hTNFα3’端的BamHⅠ識別位點，以便和preS1(1-65)肽的5’端XhoⅠ位點相符，為此，我們設(shè)計合成了PCR突變引物P4改造hTNFα的3’端，該引物引進了XhoⅠ識別序列，同時消除了hTNFα基因3’端的BamHⅠ酶切位點和終止密碼子TAA，5’端設(shè)計的引物P3含有EcoRⅠ識別位點，在上述PCR儀上按以下程序反應(yīng)30個循環(huán)，94℃40秒，52℃50秒，72℃70秒，最后于72℃保溫10分鐘，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)氯仿抽提，乙醇沉淀、備用。P3,P4引物順序見圖1。
3、改造后的hTNFα基因和preS1(1-65)肽融合基因(簡稱TpreSⅠ)表達載體(PSB-TpreSⅠ)的構(gòu)建分別用EcoR1/Xhol酶和XhoⅠ/BamHⅠ酶處理TNF基因和preSI(1-65)肽基因的PCR產(chǎn)物，同時用EcoRⅠ/BamHⅠ酶消化表達載體PSB-92，酶切回收后，一起在4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌YK537，酶切鑒定轉(zhuǎn)化子，將含融合基因的轉(zhuǎn)化子用于表達。
4、外源基因在大腸桿菌中的表達含有重組質(zhì)粒(PSB-TpreS1)的大腸桿菌YK537于30℃活化過夜后，按1∶100轉(zhuǎn)接入2YT培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，迅速轉(zhuǎn)入42℃誘導(dǎo)4-6小時，5000rpm3分鐘，收集菌體備用。融合蛋白在菌體中以包涵體形式存在，經(jīng)細胞破碎并分離出包涵體，將純化的100毫克包涵體溶解于5毫升含8M尿素的Tris-Hcl(PH8.0)buffer溶液中，加入等體積的50mM Tris-Hcl(PH8.0)溶液，使尿素濃度為4M，用50mM Tris-Hcl(PH8.0)稀釋10倍，透析復(fù)性，經(jīng)活性測定粗純化的融合蛋白的TNF細胞毒比活性為2×104。
權(quán)利要求
1.一種對肝細胞具有專一親和性的融合蛋白，其特征在于是將乙型肝炎病毒表面抗原蛋白與人腫瘤壞死因子(hTNFα)或其突變體相融合的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所說的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白是preS1區(qū)的1-65肽段或相關(guān)肽段。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所說的人腫瘤壞死因子突變體是指其第二位由Arg突變?yōu)長ys。
4.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于為合成preS1(1-65)肽段設(shè)計了兩個PCR引物P1和P2。
5.如權(quán)利要求4所述的PCR引物，其特征在于P1位于5′端并帶XhoⅠ酶切位點，P2互補于preS1(1-65)肽段末端氨基酸相應(yīng)的基因序列。
6.如權(quán)利要求4和5所述的PCR引物，其特征在于P1的序列為5’AATCTCGAGATGGGAGGTTGGTCTTCCAAAC3’，P2的序列為CTCGGATCCTCATTATGGCCCGAATGCTCCCGCT3’。
7.如權(quán)利要求1所述的融合蛋自，在于所述的人腫瘤壞死因子(hTNFα)基因是經(jīng)過改造的，消除了(hTNFα)基因的終止密碼子及改變了hTNFα3′端的BamHⅠ識別位點，使其與preS1(1-65)肽的5′端XhoⅠ位點相符。
8.如權(quán)利要求7所述的人腫瘤壞死因子基因，其特征在于基因的改造是通過PCR方法實現(xiàn)的，為此設(shè)計了5′端引物P3和3′端突變引物P4。P3的序列為5’AGGAATTCATGGTAAAATCTAGCTCTCGC3’，P4的序列為5’AATCTCGAGCAGAGCGATAATACCGAA3’。
全文摘要
乙型肝炎病毒表面抗原PrdS1蛋白參與乙肝病毒與肝細胞受體的結(jié)合,同時也含有B細胞和T細胞的抗原決定簇,我們用PCR法合成了HBsAg preS1(1—65)肽段基因,將該基因融合在毒素蛋白基因(腫瘤壞死因子)之后,插入表達載體中,使融合基因的5’端直接置于大腸肝菌P1啟動子下游,經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo),獲得了毒素蛋白與preSl(1—65)融合蛋白的表達產(chǎn)物,以人腫瘤壞死因子(hTNFa)為例,SDS－PAGE電泳顯示表達產(chǎn)物為25KD,約占細菌總蛋白的35%。表達產(chǎn)物經(jīng)Wertern－blot驗證,能分別特異地與hTNFa抗體與preSI抗體結(jié)合,稀釋復(fù)性后,該融合蛋白還具有TNF的生理功能(對L－929細胞的細胞毒活性)經(jīng)DNA序列測定,preSl(1—65)肽基因正確地融合在hTBFa基因之后。
文檔編號C07K19/00GK1221753SQ9712521
公開日1999年7月7日 申請日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者陳常慶, 陳波 申請人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心