專利名稱：一種利用磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶的固定化領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種利用磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶的方法。
背景技術(shù)：
酶作為一種高效專一的生物催化劑，在21世紀(jì)工業(yè)化學(xué)的發(fā)展中占有重要的地位。這歸因于酶具有專一性、反應(yīng)條件溫和、低污染、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。酶在醫(yī)學(xué)、能源、食品、有機(jī)合成等與人類生活息息相關(guān)的領(lǐng)域中起著舉足輕重的作用。傳統(tǒng)的游離酶在應(yīng)用中存在易失活、分散性差、回收難以及難以連續(xù)使用等問(wèn)題。酶的固定化技術(shù)是解決這些問(wèn)題的有效措施之一，固定化酶不僅保留了酶的催化特性，可以提高酶的分散性和操作穩(wěn)定性，還可以實(shí)現(xiàn)酶的回收和連續(xù)利用，從而降低了生產(chǎn)中酶的投入成本。近年來(lái)，離子液體中酶催化反應(yīng)的研究逐漸受到重視。許多種酶在離子液體中的穩(wěn)定性、活性、選擇性都比在傳統(tǒng)有機(jī)溶劑中高；離子液體獨(dú)特的溶解性能使原來(lái)在傳統(tǒng)有機(jī)溶劑中無(wú)法溶解而不能反應(yīng)的過(guò)程能得以進(jìn)行；通過(guò)改變離子液體結(jié)構(gòu)能夠控制催化條件；同時(shí)離子液體無(wú)蒸汽壓，產(chǎn)物分離較傳統(tǒng)有機(jī)溶劑更容易，過(guò)程更綠色化。磁性納米材料不僅具有高比表面積及良好的分散性，而且具有超順磁。磁性納米材料作為固定化酶的載體能夠有效提高催化劑的分散性，同時(shí)易于酶催化反應(yīng)后催化劑、 底物、產(chǎn)物的分離。將離子液體負(fù)載于磁性納米載體，形成磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶體系，不僅引入了離子液體微環(huán)境，提高酶活性及穩(wěn)定性，同時(shí)能夠解決離子液體與酶的回收再生問(wèn)題。此外，磁性離子液體復(fù)合材料中離子液體結(jié)構(gòu)可調(diào)的特性為酶催化提供結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)的載體。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種利用磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶的方法。根據(jù)本發(fā)明的利用磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶的方法包括以下步驟1)制備磁性納米顆粒；2)將離子液體負(fù)載至磁性納米顆粒，得到磁性離子液體復(fù)合材料；3)使用所述磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選所述納米顆粒為!^e3O4納米顆粒，可以采用共沉淀法合成磁性狗304納米顆粒。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選所述離子液體為咪唑類離子液體，該類離子液體具有以下特性不可燃性；幾乎無(wú)蒸氣壓，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，不會(huì)造成環(huán)境污染且可用于低壓條件，因此被稱為“綠色溶劑”；溶解能力強(qiáng)，能溶解許多有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物；它的極性及親水、憎水性等可通過(guò)選擇陰、陽(yáng)離子而加以調(diào)控，因而又被稱為“可設(shè)計(jì)性”溶劑。另外該類離子液體有兩個(gè)取代基位置，可以通過(guò)修飾功能團(tuán)，使其中的一個(gè)取代基與磁性顆粒相連，另一個(gè)取代基與酶相連。此時(shí)，優(yōu)選所述納米顆粒與所述咪唑類離子液體的質(zhì)量比為 1 10 20。根據(jù)本發(fā)明的方法，磁性離子液體復(fù)合材料的制備分為兩類，一類是用于通過(guò)吸附來(lái)固定化酶，另一類通過(guò)共價(jià)結(jié)合固定化酶。例如，通過(guò)吸附固定化酶磁性離子液體復(fù)合材料的制備過(guò)程具體如下將60mmol 烷基咪唑與60mmol氯丙基三乙氧基硅烷在90°C攪拌反應(yīng)Mh。反應(yīng)結(jié)束后用乙醚反復(fù)洗滌并于室溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚得到產(chǎn)物1-烷基-3-丙基乙氧基硅烷基-咪唑氯鹽([CnC (S) Lu]Cl，S表示硅烷基團(tuán)，η表示咪唑環(huán)Cl取代基團(tuán)C數(shù))，產(chǎn)率為96%。將6Ommol 1-烷基-3-丙基乙氧基硅烷基-咪唑氯鹽溶解于300mL乙腈，向混合體系中加入60mmol KPF6 (或 NaBF4)，30°C下攪拌反應(yīng)三天。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾除去沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈。向體系中加入200mL 二氯甲烷并過(guò)濾后經(jīng)水洗滌至水相用AgNO3檢測(cè)不到Cl_存在。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到所需要的離子液體([CnC⑶Im] PF6 (或[CnC⑶Im] BF4))。將IOOmg磁性納米!^e3O4顆粒在甲苯中超聲分散后，向體系中加入Ig硅烷離子液體([CnC(S) Im]Cl, [CnC(S) ImjPF6, [CnC(S) LiJBF4)，90°C下攪拌反應(yīng)Mh。反應(yīng)結(jié)束后磁分離，分別用IOOmL乙腈和甲醇萃取洗滌兩次，并真空干燥得到固體粉末并稱重，得到磁性離子液體[CnC (S) Im] Cl，[CnC (S) Im] PF6 (或 [CnC (S)Im] BF4)復(fù)合材料，該復(fù)合材料通過(guò)靜電相互作用吸附固定化酶。又如，通過(guò)共價(jià)結(jié)合固定化酶磁性離子液體復(fù)合納米材料的制備過(guò)程具體如下 將IOOmg磁性納米Fe3O4顆粒在IOOmL乙醇中超聲分散30min后，向其中加入Ig溴辛酸或溴丁酸。體系在氮?dú)獗Ｗo(hù)下超聲反應(yīng)15min。反應(yīng)結(jié)束后，磁分離得到的固體顆粒用IOOmL 乙腈洗滌兩次，IOOmL甲醇洗滌兩次，并真空干燥得到固體粉末。將得到的固體粉末在THF 中超聲分散后加入2g 丁醛取代的咪唑在60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后用THF洗滌固體顆粒若干次得到磁性納米顆粒負(fù)載的陰離子為Cl—的離子液體。將得到的顆粒分散于乙腈，向混合體系中加入50mmolKPF6或NaBF4, 30°C條件下攪拌反應(yīng)三天。產(chǎn)物經(jīng)去離子水洗滌若干次直至水相用AgNO3檢測(cè)不到Cl-存在。將顆粒真空干燥除水得到磁性離子液體復(fù)合納米材料(離子液體為[Cn(A)C4(D) Im]X，l-丁醛-3-羧酸-咪唑鹽，其中A表示羧基基團(tuán)，η表示其中的C數(shù)，D表示醛基基團(tuán)，X表示Cl_，BF4-, PF6O。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選所述酶為脂肪酶、纖維素酶、漆酶或淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的方法，將離子液體負(fù)載于磁性納米載體，形成磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶體系，不僅引入了離子液體微環(huán)境，離子液體幾乎沒(méi)有蒸汽壓，具有綠色環(huán)保特性和可設(shè)計(jì)性，能提高酶活性及穩(wěn)定性；同時(shí)，磁性納米材料作為固定化酶的載體能夠有效提高催化劑的分散性，同時(shí)易于酶催化反應(yīng)后催化劑、底物、產(chǎn)物的分離，從而提高了酶的利用率，降低成本，有望在催化領(lǐng)域等綠色化學(xué)過(guò)程得到廣泛應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、磁性納米顆粒的制備采用共沉淀法合成磁性!^e3O4納米顆粒。在通氮?dú)夂涂焖贆C(jī)械攪拌條件下，將 4. 66g FeCl3 ·6Η20及 1. 72g FeCl2 ·4Η20溶解在 IOOmL去離子水中，加入 2OmL 25% NH3 ·Η20, 反應(yīng)體系變黑色。將體系于80°C下反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后磁分離，用去離子水反復(fù)洗滌至上清呈中性。
2、通過(guò)吸附固定化酶磁性離子液體復(fù)合材料的制備將60mmol烷基咪唑與60mmol氯丙基三乙氧基硅烷在90°C攪拌反應(yīng)Mh。反應(yīng)結(jié)束后用乙醚反復(fù)洗滌并于室溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚得到產(chǎn)物1-烷基-3-丙基乙氧基硅烷基-咪唑氯鹽([C1C (S) Im] Cl，S表示硅烷基團(tuán))，產(chǎn)率為96 %。3、磁性離子液體[C1C(S) ImJCl復(fù)合材料吸附固定化脂肪酶150mg脂肪酶與IOOmg磁性離子液體[C1C(S) Im] Cl復(fù)合材料加入到50mL IOmmol/ L磷酸鹽緩沖液中(pH 7.0)。混合體系置于25°C的恒溫水浴搖床中，轉(zhuǎn)速150r/min保持 20 180min。體系經(jīng)去離子水清洗，記錄去離子水的用量。固定化前后溶液中脂肪酶的濃度用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，該固定化酶的量為580mg/g。4、脂肪酶催化活性固定化酶的活性及穩(wěn)定性通過(guò)無(wú)溶劑條件下脂肪酶催化的油酸與正丁醇的酯化反應(yīng)來(lái)考察。通過(guò)分子篩移除反應(yīng)體系中的水。將含有30mg脂肪酶的固定化酶加入到2mL 由油酸與正丁醇以摩爾濃度為1 2比例組成的底物中。將反應(yīng)體系置于30°C的恒溫水浴搖床中，轉(zhuǎn)速為150r/min，每隔30min取樣。將反應(yīng)后的體系用磁鐵分離，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò) 0. 05mol/L KOH乙醇溶液滴定法測(cè)量剩余的油酸量來(lái)測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其酶活性為游離酶的1. 1 1. 2倍，提高離子液體疏水性能夠增大固定化酶對(duì)疏水性底物的催化活性，重復(fù)使用5次后仍能保持92%的活性。實(shí)施例21、磁性納米顆粒的制備同實(shí)施例1。2、通過(guò)共價(jià)結(jié)合固定化酶磁性離子液體復(fù)合材料的制備將IOOmg磁性納米!^e3O4顆粒在IOOmL乙醇中超聲分散30min后，向其中加入Ig 溴辛酸或溴丁酸。體系在氮?dú)獗Ｗo(hù)下超聲反應(yīng)15min。反應(yīng)結(jié)束后，磁分離得到的固體顆粒用IOOmL乙腈洗滌兩次，IOOmL甲醇洗滌兩次，并真空干燥得到固體粉末。將得到的固體粉末在THF中超聲分散后加入2g 丁醛取代的咪唑在60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后用THF洗滌固體顆粒若干次得到磁性納米顆粒負(fù)載的陰離子為Cl—的離子液體。將得到的顆粒分散于乙腈，向混合體系中加入50mmolKPF6或NaBF4, 30°C條件下攪拌反應(yīng)三天。產(chǎn)物經(jīng)去離子水洗滌若干次直至水相用AgNO3檢測(cè)不到Cl—存在。將顆粒真空干燥除水得到磁性離子液體復(fù)合納米材料(離子液體為K0V)CjDnm]PF6-，其中A表示羧基基團(tuán)，D表示醛基基團(tuán))。3、磁性離子液體[C4(A)C4(D) ImJPF6復(fù)合材料共價(jià)結(jié)合固定化脂肪酶20mg 脂肪酶與 50mg 磁性[C4 (A) C4 (D) Im] PF6 復(fù)合材料加入 15mL 1 OOmmo 1/L 磷酸鹽緩沖液中(pH 7. 0)?；旌象w系置于25°C的恒溫水浴搖床中，轉(zhuǎn)速150r/min保持6h。體系經(jīng)磁分離、0.8mol/L NaCl溶液及去離子水清洗。在通過(guò)⑶I (1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)連接固定脂肪酶的過(guò)程中，將ImL 20mg/mL脂肪酶的pH 6. 3的磷酸緩沖溶液加入到ImL 20mg/mL OTlWpH 6. 3的磷酸緩沖溶液中。將3mL 20mg/mL磁性離子液體復(fù)合材料加入混合體系中并在室溫下攪拌反應(yīng)Mh。得到的固定化顆粒經(jīng)磁分離并用 lOOmmol/L磷酸鹽緩沖液中(pH 7.0)洗滌及去離子水清洗，記錄緩沖液用量。固定化前后溶液中脂肪酶的濃度用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，該固定化酶的量為56mg/g。
4、脂肪酶催化活性固定化酶的活性及穩(wěn)定性通過(guò)無(wú)溶劑條件下脂肪酶催化的油酸與正丁醇的酯化反應(yīng)來(lái)考察。通過(guò)加入分子篩移除反應(yīng)體系中的水。將含有30mg脂肪酶的固定化酶加入到2mL由油酸與正丁醇以摩爾濃度為1 2比例組成的底物中。將反應(yīng)體系置于30°C的恒溫水浴搖床中，轉(zhuǎn)速為150r/min，每隔30min取樣。將反應(yīng)后的體系用磁鐵分離，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)0. 05mol/L KOH乙醇溶液滴定法測(cè)量剩余的油酸量來(lái)測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種固定化酶與反應(yīng)底物的親和力是游離酶體系的2 3倍重復(fù)使用5次后仍能保持80%的活性。固定化后脂肪酶的穩(wěn)定性提高，疏水離子液體連接脂肪酶的穩(wěn)定性更好。
權(quán)利要求
1.一種利用磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)制備磁性納米顆粒；2)將離子液體負(fù)載至磁性納米顆粒，得到磁性離子液體復(fù)合材料；3)使用所述磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米顆粒為!^e3O4納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述離子液體為咪唑類離子液體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述納米顆粒與所述咪唑類離子液體的質(zhì)量比為1 10 20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)吸附固定化和共價(jià)固定化固定酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶為脂肪酶、纖維素酶、漆酶或淀粉
全文摘要
本發(fā)明涉及酶的固定化領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種利用磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟1)制備磁性納米顆粒；2)將離子液體負(fù)載至磁性納米顆粒，得到磁性離子液體復(fù)合材料；3)使用所述磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶。根據(jù)本發(fā)明的方法，將離子液體負(fù)載于磁性納米載體，形成磁性離子液體復(fù)合材料固定化酶體系，不僅引入了離子液體微環(huán)境，離子液體幾乎沒(méi)有蒸汽壓，具有綠色環(huán)保特性和可設(shè)計(jì)性，能提高酶活性及穩(wěn)定性；而且磁性納米材料作為固定化酶的載體能夠有效提高催化劑的分散性。
文檔編號(hào)C12N11/02GK102250868SQ20101018666
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者劉會(huì)州, 劉春朝, 江洋洋, 郭晨, 高紅帥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所