專利名稱：獼猴成體肝臟前體細胞的分離及培養(yǎng)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于動物前體細胞分離及培養(yǎng)液，特別是獼猴成體肝臟前體細胞的分離及
培養(yǎng)液。
背景技術(shù)：
我國現(xiàn)有慢性肝炎病人3000萬，其中一部分逐步發(fā)展成為肝纖維化，肝纖維化如 果進一步惡化將導致肝硬化、肝衰竭、門靜脈高壓等。一般說來，早期肝纖維化是可逆的，而 晚期肝纖維化即肝硬化則是不可逆的，器官移植是目前治療晚期肝臟疾病唯一可行方案， 然而，供體器官嚴重缺乏限制了其應用。越來越多的研究表明以肝干(前體)細胞為基礎的細胞替代治療已成為治療肝 臟疾病新的希望。成體肝臟前體細胞Ofepatic Progenitor cells,HPCs)具有較強的細胞 增殖及分化為特定細胞類型的能力，較低的畸胎瘤生成率，而沒有胎兒來源的HPCs和胚胎 干細胞存在的倫理問題，因此被認為是細胞替代治療晚期肝臟疾病的理想種源細胞。目前已分離到多種類型的成體HPCs。來源于人、小鼠和大鼠病理肝臟中的卵圓細 胞(oval cells)是最早被鑒定具有HPCs功能的細胞，卵圓細胞在體內(nèi)外具有很強的增殖 能力，并能分化為肝細胞或膽管上皮細胞(biliary印ithelial cells, BECs)的能力。但 由于細胞分離是一種甚為復雜的技術(shù)，要做到最大限度的富集所需的細胞，同時減少其他 細胞的百分比，要求細胞分離培養(yǎng)的每一個環(huán)節(jié)都要經(jīng)過比較分析，才能得到一個簡單、高 效、穩(wěn)定的體系。目前還沒有從正常的成體肝臟中得到與卵圓細胞相同表型一致細胞的報 道。成熟的肝細胞由于在體外可以分化為膽管上皮細胞或表達膽管上皮細胞的相關(guān)蛋白， 并可參與再生膽管的重塑，因此也被認為是成體HPCs細胞中的一種，遺憾的是成熟的肝細 胞在體外很難擴增培養(yǎng)。除了卵圓細胞和肝細胞外，來源于小鼠、大鼠和豬健康的成體肝上皮細胞(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)具有HPC的特性，這些上皮細胞呈現(xiàn)干細胞特有的 擴增能力、并能分化為肝臟特定的細胞類型，移植后可恢復受損肝臟的肝功能水平，所有這 些特性表明肝臟上皮前體細胞是潛在的細胞替代治療理想的供體細胞。同樣，從嚙齒類， 人以及SV40T轉(zhuǎn)染的食蟹猴的胎兒肝臟也可分離到類似的肝臟上皮細胞。許多研究進行了從人的成體肝臟中分離HPCs的嘗試。利用特定的培養(yǎng)條件可從正 在進行肝切除的病人的肝內(nèi)分離到一種能在體外長期增殖的肝干細胞(human hepatic stem Cells，HHSC)。然而，該細胞群的表達模式以及分化潛力都表明它們更加類似于間充質(zhì)干細胞 (mensenchymal stem cells,MSCs)而不是傳統(tǒng)意義上的HPCs。最近，從人健康的成體或肝切 除的肝臟中得到了呈現(xiàn)肝膽表達模式的肝上皮細胞，提示它們可能是潛在的前體細胞。但目 前報道并沒有完全證實肝臟前體細胞的特性，如細胞的雙向(肝和膽)分化能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可應用于獼猴成體肝臟前體細胞的分離培養(yǎng)方法，所分離得到的細胞能夠為靈長類各個物種的成體肝臟前體細胞的分離 培養(yǎng)和細胞分化機制的研究，尤其是作為替代治療晚期肝臟疾病的理想種源細胞奠定基 石出。本發(fā)明目的通過以下步驟實現(xiàn)(1)取5-10克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，用含5mg/ml 的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30 60分鐘；(2)收集上清液中的細胞，用DMEM洗三次后以1200轉(zhuǎn)/分速度離心5分鐘；(3)將收集到的細胞置于10%胎牛血清DMEM的密封離心管中懸浮培養(yǎng)，以形成細 胞團塊；(4)挑出單個的細胞團塊，接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板；(5)細胞培養(yǎng)液含有 10mmol/L nicotinamide, lx ITS, lOOU/mlpenicillin, 100 u g/ml str印tomycin 的 DMEM/F12(3 1)，加入 10% FBS，50ng/mL 表皮生長因子 EGF， lOng/ml肝細胞生長因子HGF ；(6)待細胞在培養(yǎng)板上長滿后，用trypsin-EDTA在37°C消化10 30分鐘，用流 式細胞術(shù)分選E-cad+細胞，收集獼猴成體肝臟前體細胞。所述的細胞培養(yǎng)條件為37°C，5%的C02，每兩天換一次培養(yǎng)液。所述步驟(1)在37°C的搖床中，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊 30分鐘。所述步驟(3)中密封的離心管中細胞懸浮液在37°C的搖床中懸浮培養(yǎng)，所述的獼猴成體肝臟前體細胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培 養(yǎng)板上進行培養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。本發(fā)明具有的積極意義及進步是經(jīng)過反復比較，我們成功地在本發(fā)明中建立了一個合適的體系，用來分離培養(yǎng) 來自于正常成年獼猴的肝臟前體細胞(monkey liver epithelialprogenitor cells, mLEPCs)，包括分離過程中的肝臟組織小塊消化時間的長度，消化酶的濃度，培養(yǎng)板的大鼠 鼠尾膠原鋪板，細胞團塊的制備和單個細胞團塊的挑選，培養(yǎng)液中各種成分的組合，以及 E-cad+細胞的流式細胞術(shù)分選等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明能夠為靈長類各個物種的成體肝臟前體 細胞的分離培養(yǎng)和細胞分化機制的研究提供條件，更重要的是，由于獼猴和人的高度相似 性，利用同樣的技術(shù)，將可能分離得到類似于獼猴的人肝臟前體細胞，從而使細胞替代治療 晚期肝臟疾病成為可能。本發(fā)明方法簡單，所需設備都是細胞培養(yǎng)實驗室必備的設備，易于推廣。實驗研究 結(jié)果表明，本發(fā)明的方法能夠有效地分離得到獼猴成體肝臟前體細胞，該前體細胞能在體 外分化為包括肝細胞和膽管細胞在內(nèi)的多種細胞。該前體細胞移植到肝損傷小鼠，能參與 肝損傷小鼠的肝組織再生，并能分化為功能性的肝細胞。
具體實施例方式實施例1 取5克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，用含5mg/ml的IV 型膠原酶的DMEM消化組織塊30分鐘，收集上清液中的細胞，用DMEM洗三次并以1200轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘。將收集到的細胞懸浮于10%胎牛血清的DMEM中，再置于密封的離心 管中懸浮培養(yǎng)，以形成細胞團塊。在顯微鏡下，將單個的細胞團塊挑出，并接種于大鼠鼠尾 膠原鋪板的培養(yǎng)板。待細胞在培養(yǎng)板上長滿后，用trypsin-EDTA在37°C消化10-30分鐘， 消化得到的細胞用流式細胞術(shù)分選E-cad+細胞，得到獼猴成體肝臟前體細胞。上述方法中，大鼠鼠尾膠原制備方法見(Malhi，2002)。
細胞培養(yǎng)液含有IOmmol/L nicotinamide, Ix ITS, 100U/ml penicillin, 100 μ g/ ml streptomycin 的 DMEM/F12(3 1)，加入 10% FBS,50ng/mL 表皮生長因子，10ng/ml 肝 細胞生長因子。實施例2 取大約8克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，在37°C的搖床 中，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊50分鐘，收集上清液中的細胞，用DMEM 洗三次并以1200轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘。將收集到的細胞懸浮于10%胎牛血清的DMEM 中，再置于密封的離心管中在37°C的搖床中懸浮培養(yǎng)，以形成細胞團塊。在顯微鏡下，將單 個的細胞團塊挑出，并接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板。細胞培養(yǎng)條件為37°C，5%的 CO2，每兩天換一次培養(yǎng)液。待細胞在培養(yǎng)板上長滿后，用trypsin-EDTA在37°C消化10-30 分鐘，消化得到的細胞用流式細胞術(shù)分選E-cad+細胞，得到獼猴成體肝臟前體細胞。大鼠鼠尾膠原制備方法、細胞培養(yǎng)液同實施例1。實施例3 將分離獲得的獼猴成體肝臟前體細胞用實施例1的細胞培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原 鋪板的培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代，生長擴增。
權(quán)利要求
一種獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)取5-10克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30～60分鐘；(2)收集上清液中的細胞，用DMEM洗三次后以1200轉(zhuǎn)/分速度離心5分鐘；(3)將收集到的細胞置于10％胎牛血清DMEM的密封離心管中懸浮培養(yǎng)，以形成細胞團塊；(4)挑出單個的細胞團塊，接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板；(5)細胞培養(yǎng)液含有10mmol/L nicotinami de，1x I TS，100U/mlpenicillin，100μg/ml streptomycin的DMEM/F12(3∶1)，加入10％FBS，50ng/mL表皮生長因子EGF，10ng/ml肝細胞生長因子HGF；(6)待細胞在培養(yǎng)板上長滿后，用t ryps in-EDTA在37℃消化10～30分鐘，用流式細胞術(shù)分選E-cad+細胞，收集獼猴成體肝臟前體細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是細胞培 養(yǎng)條件為37°C，5%的C02，每兩天換一次培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步 驟(1)在37°C的搖床中，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步 驟(3)中密封的離心管中細胞懸浮液在37°C的搖床中懸浮培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步驟 (3)中密封的離心管中細胞懸浮液在37°C的搖床中懸浮培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
全文摘要
獼猴成體肝臟前體細胞的分離和培養(yǎng)方法，屬于動物前體細胞分離及培養(yǎng)液，特別是獼猴成體肝臟前體細胞的分離及培養(yǎng)液。本發(fā)明將獼猴肝臟切除手術(shù)或其他途徑得到的少量肝臟組織，用IV型膠原酶將組織塊消化，收集細胞懸浮于10％胎牛血清DMEM中培養(yǎng)、挑出單個細胞團塊接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板，培養(yǎng)液為專用的培養(yǎng)液，經(jīng)培養(yǎng)的細胞用流式細胞術(shù)分選E-cad+細胞獲得目的細胞。本方法分離得到的細胞可用于細胞分化機制研究，并可能成為細胞替代治療晚期肝臟疾病的理想種源細胞。
文檔編號C12N5/071GK101864394SQ20101019877
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者季維智, 紀少琿, 金立方 申請人:昆明亞靈生物科技有限公司