專利名稱：：防治肝臟損傷的細(xì)胞疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種防治肝臟損傷的細(xì)胞群，其制備方法、用途，以及用所述細(xì)胞群所制備的疫苗。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)以來(lái)，肝炎發(fā)病率的逐漸攀升成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。從病因?qū)W角度來(lái)講，肝炎主要包括病毒性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎等。在中國(guó)，各型肝炎患者正在呈上升趨勢(shì)，每年有近40萬(wàn)人死于肝臟疾病。肝炎的感染者全球均有分布，從世界人口來(lái)講，60億人口，當(dāng)中20億曾經(jīng)感染過(guò)乙型肝炎(服V)，占全球人口的三分之一，20億感染過(guò)HBV的人中慢性HBV感染病人有3.5到4億，占全球人口大概6%，亞洲占三分之二，中國(guó)占三分之一。如此驚人的數(shù)據(jù)報(bào)道，使得本領(lǐng)域研究人員必須采取有效措施控制疾病的蔓延。刀豆素A誘導(dǎo)的肝炎模型(ConAInducedHepatitis,CIH)是一種模擬急性爆發(fā)型肝炎的動(dòng)物模型。到目前為止，很多的研究都集中于對(duì)其發(fā)病機(jī)制的探討及尋找對(duì)CIH的治療和預(yù)防的方法，主要集中于尋找一些藥物。然而本領(lǐng)域目前還沒(méi)有采用刀豆素A誘導(dǎo)的肝炎模型本身來(lái)制備疫苗的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可用于防治肝臟損傷的細(xì)胞群，其制備方法、用途，以及用所述細(xì)胞群所制備的疫苗。在本發(fā)明的第一方面，提供一種細(xì)胞群，所述細(xì)胞群來(lái)源于經(jīng)刀豆素A誘導(dǎo)的模式動(dòng)物，且其中90%以上為單個(gè)核細(xì)胞，所述細(xì)胞群在注射到哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，能夠顯著降低哺乳動(dòng)物患肝損傷后體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平(使體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平降低5倍；更優(yōu)選的，降低6倍；最優(yōu)選的，降低8倍或8倍以上)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞群在注射到哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，還能夠抑制哺乳動(dòng)物患肝損傷后的體內(nèi)TNF-a、IFN-y或IL-4的水平、抑制哺乳動(dòng)物患肝損傷后的肝臟組織MIP-la、MCP-l和IP-10的表達(dá)、或促進(jìn)哺乳動(dòng)物患肝損傷后的脾臟組織顆粒酶B(GranzymeB)的表達(dá)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的模式動(dòng)物為鼠。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞群來(lái)源于經(jīng)刀豆素A誘導(dǎo)的模式動(dòng)物的脾臟或外周血。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞群通過(guò)以下方法制備獲得(a)給予模式動(dòng)物有效量的刀豆素A，誘導(dǎo)肝損傷的模式動(dòng)物；(b)取出(a)制備的肝損傷模式動(dòng)物的脾臟或外周血，從中分離出單個(gè)核細(xì)胞;和(c)將(b)獲得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行滅活，獲得所述的細(xì)胞群。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，刀豆素的用量為15±5mg/kg體重。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在給予模式動(dòng)物刀豆素A后17土3小時(shí)，取出模式動(dòng)物的脾臟或外周血。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，采用輻照處理進(jìn)行滅活。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述輻照處理的強(qiáng)度為4000±300rad。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞群可用于非人哺乳動(dòng)物肝損傷的預(yù)防。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物選自嚙齒類動(dòng)物。在本發(fā)明的第二方面，提供所述的細(xì)胞群的用途，用于制備預(yù)防哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞群用于降低體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平；抑制體內(nèi)TNF-a、IFN-y或IL-4的水平；抑制肝臟組織MIP-1a、MCP-l和IP-10的表達(dá)；或促進(jìn)脾臟組織顆粒酶B的表達(dá)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的肝損傷為肝炎。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物包括(但不限于)小鼠、大鼠、牛、羊、狗。在本發(fā)明的第三方面，提供一種組合物，所述的組合物含有有效量的所述的細(xì)胞群(細(xì)胞群中含有如lxio、ixi(T個(gè)細(xì)胞；更優(yōu)選的為lxioMxi(^個(gè)細(xì)胞；最優(yōu)選的，1X106-1X1()8個(gè)細(xì)胞；如2xl()6個(gè)細(xì)胞、lxl()7個(gè)細(xì)胞)，以及與所述細(xì)胞群相容的載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物為疫苗。在本發(fā)明的第四方面，提供一種制備所述的細(xì)胞群的方法，所述方法包括步驟(a)給予模式動(dòng)物有效量的刀豆素A，誘導(dǎo)肝損傷的模式動(dòng)物；(b)取出(a)制備的模式動(dòng)物的脾臟或外周血，從中分離出單個(gè)核細(xì)胞；和(C)將(b)獲得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行滅活，獲得所述的細(xì)胞群。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，當(dāng)從模式動(dòng)物的脾臟分離單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，將模式動(dòng)物的脾臟置于PBS中，研磨獲得細(xì)胞懸液，除去細(xì)胞懸液中的紅細(xì)胞，獲得單個(gè)核細(xì)胞懸液。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，當(dāng)從模式動(dòng)物的外周血分離單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，將外周血用肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。在本發(fā)明的第五方面，提供一種刀豆素A誘導(dǎo)的肝炎模型的用途，用于制備所述的細(xì)胞群。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的刀豆素A誘導(dǎo)的肝炎模型用于制備防治哺乳動(dòng)物肝損傷的物質(zhì)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖l顯示了3個(gè)處理組(分別是對(duì)照組，CV組和na'iveCV組)的小鼠血漿ALT的水平，與對(duì)照組相比，***P<0.001。圖2顯示了3個(gè)處理組(分別是對(duì)照組，CV組和na'iveCV組)的肝臟組織切片的服E染色和TUNEL染色結(jié)果。圖3A顯示了分別給予低劑量(CV(L))和高劑量(CV(H))的CV后，小鼠血漿ALT水平，與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P〈0.01;圖3B顯示了分別給予單次(CV-1)和2次(CV-II)CV注射后，小鼠血漿ALT水平。圖4顯示了CV對(duì)于血漿中TNF-a、IFN-y和IL-4的水平的影響，與對(duì)照組相比，***P〈0.001。圖5顯示了CV對(duì)于肝臟組織中MIP-la、MCP-1和IP-10的表達(dá)的影響。圖6顯示了Cv對(duì)于脾臟中GranzymeB的表達(dá)的影響。圖7A顯示了3個(gè)處理組(分別是對(duì)照組，PBLCV組和na'ivePBLCV組)的小鼠血漿ALT的水平；圖7B顯示了2個(gè)處理組(分別是對(duì)照組，PBLCV組)的肝臟組織切片的服E染色和TUNEL染色結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期而廣泛的研究，首次采用刀豆素A誘導(dǎo)的肝炎模型(ConAInducedH印atitis，CIH)制備出一種可用于防治肝損傷的細(xì)胞群(減弱的致病性淋巴細(xì)胞)，所述的細(xì)胞群可用于免疫哺乳動(dòng)物(如制備成疫苗)，達(dá)到防治肝損傷的目的。并且，采用本發(fā)明的方法，無(wú)需進(jìn)行免疫細(xì)胞的體外擴(kuò)增，即可獲得足夠量的細(xì)胞疫苗?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。如本發(fā)明所用，所述的"細(xì)胞群"或"淋巴細(xì)胞群"是指從肝損傷小鼠的脾臟或外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)滅活后獲得可用于預(yù)防肝損傷的細(xì)胞群體。如本發(fā)明所用，所述的"細(xì)胞疫苗"或"淋巴細(xì)胞疫苗"是指從肝損傷小鼠的脾臟或外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)滅活后，與與其相容的載體(如PBS等)混合后獲得的可用于預(yù)防肝損傷的疫苗。本發(fā)明人致力于應(yīng)用CIH疾病來(lái)源的致病性淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)滅活制成疫苗以研究疫苗對(duì)于肝損傷的保護(hù)作用。CIH是一種模擬急性爆發(fā)性肝炎的動(dòng)物模型。通過(guò)一定劑量刀豆素A的注射，異常激活淋巴細(xì)胞，在短時(shí)間內(nèi)引起血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性急劇增加，肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞和大量肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡，同時(shí)淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TNF-ci和IFN-Y對(duì)肝臟病變過(guò)程起到了重要的作用。這種動(dòng)物模型與急性爆發(fā)性肝炎有較多相似的地方，成為研究預(yù)防和治療免疫介導(dǎo)的肝損傷非常有用的動(dòng)物模型。根據(jù)本發(fā)明人的研究證明，自體淋巴細(xì)胞的應(yīng)答與CIH的致病機(jī)理相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在CIH和急性肝炎發(fā)生時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)異常活化，大量淋巴細(xì)胞擴(kuò)增，迅速攻擊肝臟正常組織結(jié)構(gòu)和實(shí)質(zhì)細(xì)胞。這些參與致病性的多種淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生促炎性因子，促進(jìn)肝臟組織的病理?yè)p傷，并且急性肝炎還可以反復(fù)發(fā)作慢性遷延為慢性肝炎。本發(fā)明人利用CIH動(dòng)物模型，通過(guò)將發(fā)病小鼠中分離出來(lái)的致病性淋巴細(xì)胞，經(jīng)體外滅活后，回輸至健康小鼠，證實(shí)了本發(fā)明的細(xì)胞群(即減弱的致病性淋巴細(xì)胞)對(duì)于免疫介導(dǎo)的肝損傷有顯著的保護(hù)作用。因此，本發(fā)明提供一種細(xì)胞群，所述細(xì)胞群來(lái)源于經(jīng)刀豆素A誘導(dǎo)的模式動(dòng)物，且其中90%以上為單個(gè)核細(xì)胞，所述細(xì)胞群在注射到哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，能夠顯著降低哺乳動(dòng)物患肝損傷后體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平。更特別的，所述細(xì)胞群在注射到哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，還能夠抑制哺乳動(dòng)物患肝損傷后的TNF-a、IFN-Y或IL-4的水平；抑制哺乳動(dòng)物患肝損傷后的肝臟組織MIP-la、MCP-1或IP-10的表達(dá)；或促進(jìn)哺乳動(dòng)物患肝損傷后的脾臟組織顆粒酶B的表達(dá)。適用于制備所述細(xì)胞群的模式動(dòng)物為嚙齒類動(dòng)物，更優(yōu)選的，所述的模式動(dòng)物為鼠。作為本發(fā)明的一種方式，應(yīng)用經(jīng)刀豆素A誘導(dǎo)的模式動(dòng)物的疾病起源部位(肝臟)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行滅活，作為疫苗，來(lái)防治肝損傷。作為本發(fā)明的另一種方式，應(yīng)用經(jīng)刀豆素A誘導(dǎo)的模式動(dòng)物的外周血中淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)滅活處理，作為疫苗，來(lái)防治肝損傷。上述兩種方式得到了基本相同的效果。并且，基于達(dá)到基本相同的效果，后一種方式所用細(xì)胞量比前一種方式所用細(xì)胞量明顯減少(減少約2-10倍)。因此，從發(fā)病小鼠的外周血中獲取致病性淋巴細(xì)胞作為疫苗來(lái)預(yù)防C]:H的發(fā)生，對(duì)于臨床上應(yīng)用此法預(yù)防肝炎更為方便、安全、實(shí)用。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞群通過(guò)以下方法制備獲得(a)給予模式動(dòng)物有效量的刀豆素A，誘導(dǎo)肝損傷的模式動(dòng)物；(b)取出(a)制備的肝損傷模式動(dòng)物的脾臟或外周血，從中分離出單個(gè)核細(xì)胞;禾口(c)將(b)獲得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行滅活，獲得所述的細(xì)胞群。本發(fā)明還提供了所述的細(xì)胞群的用途，用于制備預(yù)防哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物。本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如1X10、1X10^個(gè)細(xì)胞；更優(yōu)選的為1X105-1X1()9個(gè)細(xì)胞；最優(yōu)選的，1X106-1X1()8個(gè)細(xì)胞；如2xl()6個(gè)細(xì)胞、1"07個(gè)細(xì)胞)的所述的細(xì)胞群，以及與所述的細(xì)胞群相容的載體。更優(yōu)選的，所述的組合物為疫苗。本發(fā)明的組合物可直接用于肝損傷的預(yù)防或治療。此外，還可同時(shí)與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。通常，可將本發(fā)明的細(xì)胞群配制于無(wú)毒的、惰性的和與所述的細(xì)胞群相容的介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"含有"表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"有效量"或"有效劑量"是指可對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被哺乳動(dòng)物所接受的量。如本文所用，"與所述細(xì)胞群相容的"的成分是適用于哺乳哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"與所述細(xì)胞群相容的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑，也即屬于一種藥學(xué)上可接受的載體。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,N.J.1991)中可找到關(guān)于與所述細(xì)胞群相容的載體的充分說(shuō)明。在組合物中與所述細(xì)胞群相容的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。本發(fā)明的組合物含有安全有效量的所述的細(xì)胞群以及與所述細(xì)胞群相容的載體。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效在使用本發(fā)明的組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明的細(xì)胞群施用于哺乳動(dòng)物，其中所述的安全有效量通常每次約lxl06-lxl(T個(gè)細(xì)胞/千克體重，優(yōu)選的每次約1"07-1><109個(gè)細(xì)胞/千克體重。適合的接種次數(shù)通常為1-4次，優(yōu)選的為2-3次。當(dāng)然，具體的接種劑量和接種次數(shù)還應(yīng)考慮所施與的哺乳動(dòng)物的種類、體重、年齡、健康狀況等因素，這些都是本領(lǐng)域熟練人員既能范圍內(nèi)的。作為本發(fā)明的實(shí)例，經(jīng)過(guò)含本發(fā)明的細(xì)胞群的疫苗預(yù)處理的小鼠，在誘導(dǎo)CIH后其小鼠血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性降低到500U/L以下(正常小鼠ALT值約為50U/L，CIH小鼠ALT平均值在5000U/L以上)，比藥物(比如EGCG、LLDT-8等，這些藥物約可使ALT值降至800-2000U/L)預(yù)防和治療的效果更為有效，毒副作用更低。肝臟的病理分析也顯示，在采用本發(fā)明的細(xì)胞疫苗處理后的小鼠幾乎看不到明顯的肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡，說(shuō)明本發(fā)明的疫苗效果極其優(yōu)異。此外，本發(fā)明人的研究證明了采用所述的疫苗處理后的小鼠，血漿中TNF-ct、IFN-y和IL-4的分泌和肝臟中淋巴細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，與對(duì)照組相比，也顯著降低。此外，本發(fā)明也顯示了疫苗接種次數(shù)以及接種劑量對(duì)于預(yù)防疾病發(fā)生的影響，疫苗接種2次的效果明顯優(yōu)于接種1次。因此，較佳地，本發(fā)明的細(xì)胞疫苗適合的接種次數(shù)為1-4次，更佳的為2-3次。雖然本發(fā)明的疫苗經(jīng)驗(yàn)證可用于非人哺乳動(dòng)物，但是其對(duì)于非人哺乳動(dòng)物極好的預(yù)防效果和實(shí)用性提示進(jìn)一步的針對(duì)人的臨床研究。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明所獲得的細(xì)胞群的預(yù)防肝損傷的效果大大優(yōu)于其它藥物，且毒副作用低。(2)采用刀豆素A誘導(dǎo)的肝炎模型(CIH)來(lái)制備疫苗，制備條件簡(jiǎn)單、成本低廉，無(wú)需進(jìn)行免疫細(xì)胞的體外擴(kuò)增，具有獲取方法簡(jiǎn)便、快速、獲取量大的特點(diǎn)，避免了從患病的哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得單個(gè)核細(xì)胞存在的種種局限(比如無(wú)法獲得足夠量的細(xì)胞等)。(3)采用本發(fā)明的方法，可獲得大量的單個(gè)核細(xì)胞，從而用于制備成細(xì)胞疫苗，克服了本領(lǐng)域通常難以從致病個(gè)體獲得足夠量免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)且難以獲得針對(duì)性的細(xì)胞的缺陷。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1淋巴細(xì)胞疫苗的制備制備CIH模型刀豆素A(15mg/kg體重，購(gòu)自Sigma公司)或PBS尾靜脈注射C57BL/6小鼠(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，以誘導(dǎo)CIH模型。疫苗1的制備在誘導(dǎo)CIH模型17小時(shí)后，取出小鼠的脾臟，置于PBS中，通過(guò)尼龍的篩網(wǎng)研磨脾臟獲得細(xì)胞懸液，加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，獲得單個(gè)核細(xì)胞懸液，將細(xì)胞的濃度調(diào)為5X107200yl禾卩IX107200u1，輻照4000rad后作為脾臟來(lái)源的淋巴細(xì)胞疫苗(CV)。疫苗2的制備在誘導(dǎo)CIH模型17小時(shí)后，取出小鼠脾臟之前，通過(guò)心臟采血的方式，獲取小鼠的外周血，用肝素進(jìn)行抗凝，之后采用Ficoll密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞，從分離層中獲取外周血中的淋巴細(xì)胞調(diào)至濃度為2X107200ul，4000rad輻照后作為外周血來(lái)源的淋巴細(xì)胞疫苗(PBLCV)。實(shí)施例2細(xì)胞疫苗可以降低血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平細(xì)胞疫苗按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，將C57BL/6小鼠分為三組，每組四只對(duì)照組注射PBS;致病性淋巴細(xì)胞處理組注射CV;未致敏的淋巴細(xì)胞處理組注射采用如前述疫苗1的制備方法，但從未誘導(dǎo)CIH的小鼠脾臟中分離出來(lái)的淋巴細(xì)胞(na'iveCV)。小鼠在第0天和第7天通過(guò)尾靜脈注射分別接受PBS、na'iveCV、以及CV。也即對(duì)照組的小鼠僅接受了PBS的注射；na'iveCV組的小鼠接受了來(lái)自于健康小鼠的輻照脾臟淋巴細(xì)胞(1X107細(xì)胞/小鼠)；CV組的小鼠接受來(lái)自CIH的小鼠的輻照脾臟淋巴細(xì)胞(1X107細(xì)胞/小鼠)。在第14天，所有的小鼠均給予15mg/kg體重刀豆素A的尾靜脈注射。17-20小時(shí)后，取出小鼠的血漿測(cè)量ALT的水平(ALT的測(cè)量采用丙酮酸氧化酶法，參照上海伊華科技有限公司的ALT測(cè)量試劑盒的說(shuō)明書)。結(jié)果顯示，通過(guò)給健康小鼠預(yù)先接種細(xì)胞疫苗，與對(duì)照組和接受na'ive細(xì)胞疫苗的小鼠相比，可以顯著降低CIH誘導(dǎo)后血漿中的ALT的水平，結(jié)果如圖1，與對(duì)照相比，***P〈0.001。實(shí)施例3細(xì)胞疫苗可以減少肝臟的損傷細(xì)胞疫苗按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，將C57BL/6小鼠分為三組，每組四只對(duì)照組注射PBS;致病性淋巴細(xì)胞處理組注射CV;未致敏的淋巴細(xì)胞處理組注射na'iveCV。小鼠在第0天和第7天通過(guò)尾靜脈注射分別接受PBS、na'iveCV、以及CV。也即對(duì)照組的小鼠僅接受了PBS的注射；na'iveCV組的小鼠接受了來(lái)自于健康小鼠的輻照脾臟淋巴細(xì)胞(1X107細(xì)胞/小鼠)；CV組的小鼠接受了來(lái)自CIH的小鼠的輻照脾臟淋巴細(xì)胞。在第14天，所有的小鼠均給予15mg/kg刀豆素A的尾靜脈注射。17-20小時(shí)后，取出小鼠的肝臟，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定。對(duì)肝臟的組織切片進(jìn)行常規(guī)的服E染色和TU腦EL染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)其進(jìn)行檢查。結(jié)果如圖2所示，在對(duì)照組小鼠和接受na'ive細(xì)胞疫苗處理的小鼠，CIH誘導(dǎo)后其肝臟出現(xiàn)大量的炎性浸潤(rùn)和肝細(xì)胞凋亡，然而接受了細(xì)胞疫苗預(yù)處理的小鼠，其肝臟部位少見炎性浸潤(rùn)和肝細(xì)胞凋亡。實(shí)施例4細(xì)胞疫苗的保護(hù)作用呈劑量和頻率依賴性1.劑量依賴測(cè)試細(xì)胞疫苗按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，將C57BL/6小鼠分為三組，每組四只-對(duì)照組注射PBS;致病性淋巴細(xì)胞處理組l:注射低劑量(5XlCf細(xì)胞/小鼠)CV，即CV(L);致病性淋巴細(xì)胞處理組2:注射高劑量(為1X10'細(xì)胞/小鼠)CV，即CV(H)。各組小鼠在第0天和第7天通過(guò)尾靜脈注射分別給予不同劑量的CV，其中CV(L)的為5Xl(T細(xì)胞/小鼠，CV(H)的為1X107細(xì)胞/小鼠。在第14天，所有的小鼠均給予尾靜脈注射的15mg/kg刀豆素A。17-20小時(shí)后，取出小鼠的血漿測(cè)量ALT的水平。結(jié)果如圖3A，可以看到，健康小鼠經(jīng)過(guò)高劑量CV(lXl(T細(xì)胞/小鼠)預(yù)先處理后，CIH誘導(dǎo)后血漿中ALT的水平與接受低劑量CV(5X106細(xì)胞/小鼠)的小鼠相比明顯降低。因此，本發(fā)明的細(xì)胞疫苗對(duì)于CIH的保護(hù)作用顯示了明顯的劑量依賴性。2.注射頻率依賴測(cè)試細(xì)胞疫苗按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，將C57BL/6小鼠分為三組，每組四只對(duì)照組注射PBS;致病性淋巴細(xì)胞處理組l:1次注射CV(CV-1);致病性淋巴細(xì)胞處理組2:2次注射CV(CV-I1)。對(duì)照組的小鼠僅接受PBS的注射，其它兩組小鼠分別接受不同次數(shù)的疫苗接種。CV-I組小鼠僅在第0天接受一次CIH的小鼠的輻照脾臟淋巴細(xì)胞(1X107細(xì)胞/小鼠)；CV-II組小鼠分別在第0天和第7天接受兩次CIH的小鼠的輻照脾臟淋巴細(xì)胞(1X107細(xì)胞/小鼠)，間隔7天。第14天，所有的小鼠均給予15mg/kg刀豆素A的尾靜脈注射。17-20小時(shí)后，取出小鼠的血漿測(cè)量ALT的水平。結(jié)果見圖3B，從圖中可以看到，在第0天和第7天給小鼠預(yù)先接種細(xì)胞疫苗，對(duì)于CIH的保護(hù)作用明顯好于給小鼠單次接種細(xì)胞疫苗的效果，ALT的水平降低的更為顯著。圖中，與對(duì)照相比，*p〈0.05，**p〈0.01。實(shí)施例5細(xì)胞疫苗可以抑制血漿中TNF-a、IFN-y和IL-4的水平細(xì)胞疫苗按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，將c57bl/6小鼠分為兩組，每組四只-對(duì)照組注射PBS;致病性淋巴細(xì)胞處理組注射CV。小鼠在第0天和第7天通過(guò)尾靜脈注射分別接受PBS以及CV。在第14天，所有的小鼠均給予15mg/kg刀豆素A的尾靜脈注射。在注射刀豆素A2小時(shí)后，取出小鼠血漿，通過(guò)ELISA方法分別檢測(cè)TNF-a和IL-4，以一抗(TNF-a和IL-4的一抗均購(gòu)自R&D公司)包板室溫過(guò)夜，洗板后以1%BSA，5%蔗糖封閉，洗板后加標(biāo)本孵育2小時(shí)，洗板后加生物素標(biāo)記的二抗(均購(gòu)自R&D公司)孵育2小時(shí)，洗板后以鏈霉素親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶45分鐘，最后加底物顯色。本檢測(cè)方法采用R&D的ELISA試劑盒，完全按照說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果如圖4A和4B所示。在注射刀豆素A8小時(shí)后，取出小鼠的血漿，通過(guò)ELISA方法分別檢測(cè)IFN-y的分泌水平，以一抗(IFN-y的一抗購(gòu)自R&D公司)包板室溫過(guò)夜，洗板后以1%BSA、5%蔗糖封閉，洗板后加標(biāo)本孵育2小時(shí)，洗板后加生物素標(biāo)記的二抗(購(gòu)自R&D公司)孵育2小時(shí)，洗板后以鏈霉素親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)45分鐘，最后加底物顯色。本檢測(cè)方法采用R&D的ELISA試劑盒，完全按照說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果如圖4C所示。由圖4A-4C所示，在誘導(dǎo)CIH之前給予小鼠接種細(xì)胞疫苗可以顯著抑制TNF-a、IFN-Y和IL-4在血漿中的水平，與對(duì)照組相比，可以分別抑制80%、80%和60%，顯示了細(xì)胞疫苗可以通過(guò)抑制炎性因子的分泌發(fā)揮對(duì)于CIH的保護(hù)作用。與對(duì)照相比，***P<0.001。實(shí)施例6細(xì)胞疫苗可抑制肝臟組織中MIP-1a、MCP-1和IP-10的表達(dá)細(xì)胞疫苗按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，將C57BL/6小鼠分為兩組，每組四只對(duì)照組注射PBS;致病性淋巴細(xì)胞處理組注射CV。小鼠在第0天和第7天通過(guò)尾靜脈注射分別接受PBS以及CV。第14天，所有的小鼠均給予15mg/kg刀豆素A的尾靜脈注射。17-20小時(shí)后，麻醉小鼠，灌注后取出肝臟組織，提取RNA。通過(guò)Real-timePCR的方法檢測(cè)A)MIP-1a,B)MCP-l和C)IP-IO的表達(dá)水平。腿抽提采用Qiagen公司的試劑盒(RNeasyMiniKit)進(jìn)行RNA的抽提，主要步驟如下(1)取包含>5乂106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞的脾臟細(xì)胞于E卯endorf管中，2000轉(zhuǎn)/min，離心3min，離心后去上清；(2)加入350ul裂解液(RLT)，吹打幾次，充分裂解；(3)裂解后加入350^1的70%酒精，反復(fù)吹打，充分混勻；(4)將700ti1的總液體轉(zhuǎn)移到柱子上，12000轉(zhuǎn)/min，室溫下離心15sec，去液體；(5)加入RW1溶液350ul，12000轉(zhuǎn)/min，室溫下離心15sec，離心后去液體；(6)加入RNase-freeDNase(盡量直接加到膜上)，室溫放置15min;(7)加入RW1溶液350ul，12000轉(zhuǎn)/min，室溫下離心15sec，離心后去液體(8)換套管，加入RPE溶液50012000轉(zhuǎn)/min，室溫下離心15sec，離心后去液體；(9)加入RPE溶液500ul，12000轉(zhuǎn)/min，室溫下離心2min，離心后去液體；(10)換Eppendorf管，加入無(wú)RNase的水30u1，12000轉(zhuǎn)/min，室溫下離心lmin;(11)加入無(wú)RNase的水30u1，12000轉(zhuǎn)/min，室溫下離心lmin;(12)收集得到60ul含有RNA的溶液；(13)分光光度儀上測(cè)定RNA濃度；(14)-80。C凍存。逆轉(zhuǎn)錄1采用Qiagen公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(SensiscriptRTKit)，體系為20pd，具體如1表l:表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>混勻后離心，進(jìn)行如下反應(yīng):37°Clh，93°C5min，4°C。Real-timePCR(1)將上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA，用高壓水按l:4比例稀釋。(2)將熒光染料SYBRGreen和目的基因IP-IO和內(nèi)參actin的引物按5HiSYBRGreen+0.15ii1引物混勻，短暫離心。(3)加樣在RealTimePCR檢測(cè)板(384孔)中每孔4.85"1cDNA+5.15SYBRGreen和引物混合物，加好后離心，在384孔板上蓋上膜，盡量密封。(4)封膜后，將384孔板放入RealTimePCR儀(ABI7900)進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體程序如下①50°C2min，②95°ClOmin，③95°C15sec，60°C60sec，回到步驟3，共40個(gè)循環(huán)。采用的引物如表2:表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，接受細(xì)胞疫苗CV的小鼠在誘導(dǎo)CIH后，MIP-la、MCP-1和IP-10mRNA在肝臟中的表達(dá)顯著降低。因此，細(xì)胞疫苗可以通過(guò)抑制趨化因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)CIH的保護(hù)作用。實(shí)施例7細(xì)胞疫苗可以使脾臟中顆粒酶BmRNA的表達(dá)上調(diào)細(xì)胞疫苗按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，將C57BL/6小鼠分為兩組，每組四只對(duì)照組注射PBS;致病性淋巴細(xì)胞處理組注射CV。小鼠在第0天和第7天通過(guò)尾靜脈注射分別接受PBS以及CV。第14天，所有的小鼠均給予15mg/kg刀豆素A的尾靜脈注射。17-20小時(shí)后，處死小鼠，取出脾臟，采用常規(guī)的RNA提取方法提取脾臟淋巴細(xì)胞的RNA。通過(guò)ReaHimePCR的方法檢測(cè)granzymeB的表達(dá)7夂平(Real-timePCR的方法同上)。結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組相比，接受細(xì)胞疫苗CV的小鼠在誘導(dǎo)CIH后，脾臟淋巴細(xì)胞中g(shù)ranzymeB的表達(dá)水平明顯升高，顯示了細(xì)胞疫苗可能通過(guò)誘導(dǎo)了細(xì)胞毒作用發(fā)揮其對(duì)CIH的保護(hù)作用。實(shí)施例8外周血淋巴細(xì)胞疫苗可以保護(hù)小鼠，抑制CIH的發(fā)生細(xì)胞疫苗按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，將C57BL/6小鼠分為三組，每組四只對(duì)照組注射PBS;致病性淋巴細(xì)胞處理組注射外周血來(lái)源的淋巴細(xì)胞疫苗(PBLCV)。未致敏的淋巴細(xì)胞處理組注射采用如前述疫苗2的制備方法，但從未誘導(dǎo)CIH的小鼠外周血中分離出來(lái)的淋巴細(xì)胞(na'ivePBLCV)。小鼠分為三組，每組四只。小鼠在第0天和第7天通過(guò)尾靜脈注射分別接受PBS、na'ivePBLCV以及從PBLCV。也即對(duì)照組的小鼠僅接受PBS的注射；na'ivePBLCV組的小鼠接受來(lái)自于健康小鼠的輻照外周血淋巴細(xì)胞(2X106細(xì)胞/小鼠)；PBLCV組的小鼠接受來(lái)自CIH的小鼠的輻照外周血淋巴細(xì)胞(2X106細(xì)胞/小鼠)。第14天，所有的小鼠均給予15mg/kg刀豆素A的尾靜脈注射。17-20小時(shí)后，取出小鼠的血漿測(cè)量ALT的水平。結(jié)果如圖7A所示，與對(duì)照相比，**P<0.01。取出肝臟組織，對(duì)肝臟的組織切片進(jìn)行服E染色和TUNEL染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)其進(jìn)行檢査，結(jié)果如圖7B所示。如圖所示，本發(fā)明人可以看到外周血來(lái)源的細(xì)胞疫苗同樣也可以保護(hù)小鼠免受CIH的破壞作用，主要表現(xiàn)在血漿中ALT水平的明顯降低，以及肝臟組織中炎性浸潤(rùn)和細(xì)胞凋亡的明顯抑制，顯示了與脾臟細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞疫苗的相似作用。而且，這種外周血來(lái)源的細(xì)胞疫苗只需要極低的細(xì)胞量即可以發(fā)揮保護(hù)作用，且未發(fā)現(xiàn)對(duì)受試動(dòng)物本身可見的毒副作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>巾國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120〉防治肝臟損傷的細(xì)胞疫苗<130〉066572<160〉10<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物〈400〉1tgtccaccttccagcagatgt21<210〉2<211〉23<212〉隨<213〉人T.序列<220><221〉raise—feature<223>引物<柳〉2agctcagtaacagtccgcctaga23<210>3<211>21<212>靈<213〉人T.序列<220>〈221〉misc—feature<223〉引物<400>3aaaaacctggatcggaaccaa<210>4<211〉22〈212〉DNA<213>人丁序列<220><221〉raise—feature<223〉引物<400>4egggtcaacttcacattcaaag<210>5<211>21〈212>DNA〈213>人工序列<220><221>misc—feature〈223〉引物<400>5caccctctgtcacctgctcaa<210>6<211〉21<212>廳<213>人丁序列<220><221〉tnisc一feature<223>引物<400>6atggcgctgagaagacttggt<210>7<211>20<212〉DNA〈213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400〉7gccgtcattttctgcctcat<210〉8<211〉18<212〉靈<213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature<223>引物<400〉8ggcccgtcatcgatatgg18<210>9<211>21<212〉廳<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物〈400〉9acagaaggatcgggagtgtga21<210>10<211〉19<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400〉10cccgaaaggaagcacgttt19權(quán)利要求1.一種細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞群來(lái)源于經(jīng)刀豆素A誘導(dǎo)的模式動(dòng)物，且其中90％以上為單個(gè)核細(xì)胞，所述細(xì)胞群在注射到哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，能夠顯著降低哺乳動(dòng)物患肝損傷后體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平。2.如權(quán)利要求l所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞群在注射到哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，還能夠抑制哺乳動(dòng)物患肝損傷后的TNF-a、IFN-Y或IL-4的水平；抑制哺乳動(dòng)物患肝損傷后的肝臟組織MIP-1a、MCP-1或IP-10的表達(dá)；或促進(jìn)哺乳動(dòng)物患肝損傷后的脾臟組織顆粒酶B的表達(dá)。3.如權(quán)利要求l所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述的模式動(dòng)物為鼠。4.如權(quán)利要求l所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述的細(xì)胞群來(lái)源于經(jīng)刀豆素A誘導(dǎo)的模式動(dòng)物的脾臟或外周血。5.如權(quán)利要求l所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述的細(xì)胞群通過(guò)以下方法制備獲得(a)給予模式動(dòng)物有效量的刀豆素A，誘導(dǎo)肝損傷的模式動(dòng)物；(b)取出(a)制備的肝損傷模式動(dòng)物的脾臟或外周血，從中分離出單個(gè)核細(xì)胞；和(c)將(b)獲得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行滅活，獲得所述的細(xì)胞群。6.權(quán)利要求l所述的細(xì)胞群的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物。7.—種組合物，其特征在于，所述的組合物含有有效量的權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群，以及與所述細(xì)胞群相容的載體。8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述的組合物為疫苗。9.一種制備權(quán)利要求l所述的細(xì)胞群的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(a)給予模式動(dòng)物有效量的刀豆素A，誘導(dǎo)肝損傷的模式動(dòng)物；(b)取出(a)制備的模式動(dòng)物的脾臟或外周血，從中分離出單個(gè)核細(xì)胞；和(c)將(b)獲得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行滅活，獲得所述的細(xì)胞群。10.—種刀豆素A誘導(dǎo)的肝炎模型的用途，其特征在于，用于制備權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群。全文摘要本發(fā)明公開了一種細(xì)胞群，所述細(xì)胞群來(lái)源于經(jīng)刀豆素A誘導(dǎo)的模式動(dòng)物，且其中90％以上為單個(gè)核細(xì)胞，所述細(xì)胞群在注射到哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，能夠顯著降低體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平。本發(fā)明還公開了所述細(xì)胞群的制備方法以及含有所述細(xì)胞群的組合物。本發(fā)明所獲得的細(xì)胞群的預(yù)防肝損傷的效果大大優(yōu)于其它藥物；并且，采用本發(fā)明的方法可獲得大量的單個(gè)核細(xì)胞且制備簡(jiǎn)便、獲得量大、無(wú)需體外培養(yǎng)，從而可用于制備成細(xì)胞疫苗，克服了本領(lǐng)域通常難以從致病個(gè)體獲得足夠量免疫細(xì)胞且難以獲得針對(duì)性的細(xì)胞的缺陷。文檔編號(hào)C12N5/06GK101195814SQ20061011932公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2006年12月8日優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日發(fā)明者徐凌云,梅云華,瑩王申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院;中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院