專利名稱：某些酰胺化合物作為探針測定抗微管蛋白活性和抗性檢測的應(yīng)用的制作方法
微管是存在于所有真核細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)絲狀結(jié)構(gòu)。作為各種細(xì)胞器如有絲分裂的紡錘體、中心粒、基粒、纖毛、鞭毛、軸偽足和細(xì)胞骨架的組分，在很多細(xì)胞功能中涉及微管，這些功能包括有絲分裂期間染色體的移動(dòng)、細(xì)胞游動(dòng)性、細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞板形成、細(xì)胞形狀的保持和發(fā)育植物細(xì)胞壁中細(xì)胞微原纖維沉積的取向。微管的主要組成是微管蛋白，是由稱為α和β的兩種亞單元組成的蛋白質(zhì)。細(xì)胞中的微管蛋白的重要性質(zhì)是其經(jīng)過聚合形成微管或在適當(dāng)條件下降解的能力，此過程在離體的分離微管蛋白中也會(huì)出現(xiàn)。
作為有絲分裂的紡錘體的組分，微管在細(xì)胞分裂中起著關(guān)鍵的作用，在細(xì)胞準(zhǔn)確分裂成為兩個(gè)子核時(shí)染色體的分配涉及到細(xì)胞器。各種藥物和農(nóng)藥通過與微管蛋白或微管的結(jié)合阻止細(xì)胞分裂。有此作用機(jī)制的抗癌藥包括生物堿長春新堿和長春花堿，以及紫杉烷基化合物paclitaxel和docetaxel[例如，參見E.K.Rowinsky和R.C.Donehower,Pharmacologyand Therapeutics,52,35-84(1991)]。其它對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有活性的抗微管蛋白化合物包括苯并咪唑類化合物如諾考達(dá)唑(nocodazole)和天然產(chǎn)物如秋水仙堿、鬼臼素和combretastatins。與微管蛋白結(jié)合的苯并咪唑類化合物也廣泛用于抗蠕蟲[McKELLAR,Q.A.和Scott,E.W.,J.Vet.Pharmacol.Ther.,13,223-247(1990)]?？刮⒐艿鞍椎某輨┰贘.R.Corbett,K.Wright和A.C.Baillie的“TheBiochemical Mode of Action of Pesticides”,pp202-223已有描述，這包括二硝基苯胺類，如氟樂靈，N-苯基氨基甲酸酯類如氯苯胺靈、甲基-胺草磷和戊炔草胺。通過與微管蛋白結(jié)合而作用的殺真菌劑包括zarilamide[Young,D.H.和Reitz,E.M.,Proceedings of the 10thInternational Symposium on Systemic Fungicides and AntifungalCompounds,Reinhardsbrunn,由H.Lyr和C.Polter編輯，381-385，(1993)]，苯并咪唑類苯菌靈和多菌靈，和N-苯基氨基甲酸酯類乙霉威[Davidse,L.C.和Ishi,H.,“Modern Selective Fungicides”,H.Lyr編輯，305-322(1995)]。
由于微管蛋白成功地作為藥物和農(nóng)藥的生化靶，人們對(duì)發(fā)現(xiàn)與微管蛋白結(jié)合的新化合物有很大的興趣。通常的方法包括測量在離體試驗(yàn)中試驗(yàn)化合物抑制分離的微管蛋白聚合成微管的能力[例如，參見E.Hamel,Medicinal Research Reviews,16,207-231(1996)]。在第二種試驗(yàn)中，通過測定試驗(yàn)化合物影響作為探針的第二微管蛋白結(jié)合配體結(jié)合的能力，可以測定結(jié)合試驗(yàn)中試驗(yàn)化合物與分離的微管蛋白的相互作用。典型地是，將該探針進(jìn)行放射性標(biāo)記，以測量結(jié)合的探針。試驗(yàn)化合物通過作為探針結(jié)合于微管蛋白的蛋白質(zhì)的相同位點(diǎn)，可以影響與探針的結(jié)合，因此，結(jié)合的探針量減少。另外，此結(jié)合還會(huì)受到“別構(gòu)”作用的影響，在此作用中試驗(yàn)化合物和探針結(jié)合于不同的位置，并減少微管蛋白蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，此變化會(huì)影響探針的結(jié)合位置。此別構(gòu)作用還可以增加或減少探針的結(jié)合。第三種方法包括測定試驗(yàn)化合物對(duì)微管蛋白相關(guān)的鳥嘌呤核苷三硫酸酶的活性[Duanmu,C.,Shahrik,L.K.,Ho,H.H.和Hamel,E.,CancerResearch,49,1344-1348(1989)]。
目前，采用上述任何一種方法，只有用由哺乳動(dòng)物的腦組織得到的微管蛋白篩選大量化合物才是可行的，因?yàn)橛善渌鼇碓床豢赡芊蛛x出足夠大量的純微管蛋白。這就限制了這些方法的應(yīng)用，因?yàn)楹芏嗫刮⒐艿鞍谆衔飳?duì)不同來源的微管會(huì)顯示出顯著的特異性。例如，除草劑安磺靈和甲基胺草靈能抑制植物微管蛋白，而不是抑制腦微管蛋白的聚合作用，而秋水仙堿作為抑制劑，對(duì)腦微管蛋白聚合作用比對(duì)植物微管蛋白的聚合作用的抑制高100倍[Morejohn,L.C.和Fosket,D.E.,‘Tubulin fromPlant,Fungi,and Protists’,Cell and Molecular Biology of theCytoskeleton,J.W.Shay編輯，257-329(1986)]。
本發(fā)明涉及某些已知能抑制真核細(xì)胞的生長的酰胺衍生物的應(yīng)用，所說的真核細(xì)胞包括真菌和植物細(xì)胞[例如參見US 3,661,991、4,863,940和5,254,584]，該酰胺衍生物在篩選抗微管蛋白活性的化合物的結(jié)合試驗(yàn)中可作為探針。而放射性標(biāo)記的探針如秋水仙堿[例如參見M.H.Zweig和C.F.Chignell,Biochemical Pharmacology,22,2141-2150(1973)]和長春花堿[例如參見R.Bai Journal of BiologicalChemistry,265,17141(1990)]已經(jīng)廣泛用于使用分離微管蛋白的結(jié)合試驗(yàn)這些化合物以非共價(jià)鍵與微管蛋白結(jié)合。與已有的抗微管蛋白化合物相比，在競爭結(jié)合試驗(yàn)中本發(fā)明的酰胺化合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是特有的以高特異性的方式以共價(jià)鍵結(jié)合于微管蛋白，特別是β-亞單元的微管蛋白的能力。在結(jié)合試驗(yàn)中，必須要測定和微管蛋白結(jié)合的探針的量，通常要求把結(jié)合了微管蛋白的探針與未結(jié)合的探針分離。在本發(fā)明酰胺的情況下，由于是以共價(jià)鍵結(jié)合，與微管蛋白結(jié)合的探針具有化學(xué)穩(wěn)定性，從而可采用過濾或離心的方法使之容易地與未結(jié)合的探針分離。這使它們不僅可以用于使用分離微管蛋白的試驗(yàn)，而且可以用于使用全細(xì)胞、粗制的細(xì)胞萃取物和和部分純化的微管蛋白制劑的試驗(yàn)，這就免得要求分離微管蛋白，以及使微管蛋白的結(jié)合試驗(yàn)?zāi)苡煤芏嗖煌愋偷募?xì)胞或細(xì)胞萃取物來進(jìn)行。例如，在使用植物或真菌或細(xì)萃取物和酰胺探針的試驗(yàn)中可以檢測出結(jié)合于植物或真菌微管蛋白的試驗(yàn)化合物，以提供適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)篩選大量的化合物。酰胺探針也可以用于檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞中結(jié)合于微管蛋白的化合物，從而提供了研究試驗(yàn)化合物對(duì)非腦源哺乳動(dòng)物微管蛋白的作用的方法。具體地說，可測定試驗(yàn)化合物對(duì)酰胺探針結(jié)合的初始速度的影響。與用分離微管蛋白的非細(xì)胞試驗(yàn)相比，全細(xì)胞試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是有利于細(xì)胞中試驗(yàn)化合物的積累，和其可能的代謝活化或失活，這是影響生物活性的重要因素。
本發(fā)明的第二方面涉及酰胺探針在評(píng)價(jià)真核細(xì)胞對(duì)農(nóng)藥或藥物的靈敏度的結(jié)合試驗(yàn)中的應(yīng)用，所述農(nóng)藥或藥物是通過結(jié)合于微管蛋白而起作用的。在使用抗微管蛋白的農(nóng)藥或藥物期間可能導(dǎo)致細(xì)胞的發(fā)育，這說明對(duì)抗微管蛋白化合物減少了靈敏度(抗性)。抗性可能回是由于微管蛋白的變更，或可能涉及其它機(jī)制，例如抗微管蛋白化合物的吸收或代謝的變化。由于微管蛋白的變更而引起的對(duì)抗微管蛋白化合物的抗性已經(jīng)出現(xiàn)在真菌病原體[Davidse,L.C.和Ishi,H.,“Modern SelectiveFungicides”,H.Lyr編輯，305-322(1995)]，藻類[James,S.W.等人，Journal of Cell Science,106,209-218(1993)]和蠕蟲[Beech,R.N.等人，Genetics,138,103-110(1994)]。在對(duì)酰胺類化合物的結(jié)合親和力上含有變更后的微管蛋白的抗性細(xì)胞可能顯示出差別，可使酰胺探針應(yīng)用于檢測這些突變體的結(jié)合試驗(yàn)。通過把酰胺探針與接觸抗微管蛋白農(nóng)藥或藥物之前的細(xì)胞或細(xì)胞萃取物的結(jié)合速率和與未處理的對(duì)照細(xì)胞或細(xì)胞萃取物的結(jié)合速率進(jìn)行比較而完成此試驗(yàn)。
例如，苯并咪唑和硫菌靈類殺真菌劑如苯菌靈(1-(丁基氨基甲酰基)苯并咪唑-2-基氨基甲酸甲酯)、麥穗寧(2-(2-呋喃基)苯并咪唑)、噻菌靈(2-(4-噻唑基)苯并咪唑)、多菌靈(苯并咪唑-2-基氨基甲酸甲酯)、甲基-硫菌靈(1,2-雙(3-甲氧羰基2-硫脲基)苯)和硫菌靈(1,2-雙(3-乙氧羰基-2-硫脲基)苯)在本領(lǐng)域用于抗植物病原體真菌是已知的。但是，在使用苯并咪唑和硫菌靈類殺真菌劑期間可能會(huì)導(dǎo)致能減少這些殺真菌劑靈敏度的真菌菌株生長，從而在控制特點(diǎn)的真菌內(nèi)疾病時(shí)，使殺真菌劑效果大大降低。典型地，在作為純培養(yǎng)物分離時(shí)，這些“抗性的”真菌對(duì)苯并咪唑和硫菌靈類的靈敏度比沒有接觸這些殺真菌劑的地區(qū)的真菌小10倍到＞1000倍。而且，其生長會(huì)減少對(duì)一種苯并咪唑和硫菌靈類殺真菌劑的靈敏度的真菌常常也會(huì)減少對(duì)其它苯并咪唑和硫菌靈類殺真菌劑的靈敏度。N-苯基氨基甲酸酯殺真菌劑乙霉威通常被用來控制對(duì)苯并咪唑有抗性的真菌，如灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)。它的使用對(duì)苯并咪唑和乙霉威兩種殺真菌劑有抗性真菌菌株的生長。檢測真菌菌株對(duì)苯并咪唑類、硫菌靈或乙霉威有抗性的真菌菌株的通用方法是費(fèi)力費(fèi)時(shí)的(labor-intensive and time-consuming)。一些方法中包括了分離純的試驗(yàn)培養(yǎng)物，接著用殺真菌劑改良的瓊脂板進(jìn)行菌絲體生長的離體試驗(yàn)，或者用殺真菌劑處理的葉子進(jìn)行活體試驗(yàn)。另外，在殺真菌劑的存在下，可以進(jìn)行孢子的玻片發(fā)芽試驗(yàn)。對(duì)乙霉威和/或苯并咪唑和硫菌靈有抗性的真菌菌株典型地含有變更后的微管蛋白蛋白質(zhì)[例如參見Koenraadt,H.,Phytopathology,82,1348-1354(1992)以及Yarden,O.和Katan,T.,Phytopathology,83,1478-1483(1993)]。苯并咪唑-抗性、乙霉威-敏感的真菌菌株特別顯示出增加本發(fā)明的酰胺衍生物靈敏度的作用，而苯并咪唑-抗性、乙霉威-抗性的真菌菌株特別顯示出減少靈敏度的作用。雖然從理論上不希望被結(jié)合，但是，可以確信酰胺探針可用于結(jié)合試驗(yàn)以便將苯并咪唑-抗性、乙霉威-敏感的真菌菌株，或苯并咪唑-抗性、乙霉威-抗性的真菌菌株與沒有抗性的菌株區(qū)分開，苯并咪唑-抗性、乙霉威-敏感的真菌菌株在用全細(xì)胞或細(xì)胞萃取物進(jìn)行的試驗(yàn)中顯示出增加結(jié)合酰胺探針的能力，苯并咪唑-抗性、乙霉威-抗性的真菌菌株顯示出減少結(jié)合酰胺探針的能力。此試驗(yàn)可以減少勞動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間消耗，并且還可以提供關(guān)于與微管蛋白變化有關(guān)的抗性機(jī)制的資料。關(guān)于抗性機(jī)制的資料可以用來設(shè)計(jì)抗性控制對(duì)策。
本發(fā)明的第三方面涉及酰胺探針在結(jié)合試驗(yàn)中用于定性和定量測定細(xì)胞或細(xì)胞萃取物中的微管蛋白。由于微管蛋白成功地作為藥物和農(nóng)藥的靶位以及它們重要的細(xì)胞功能，因此成為重點(diǎn)研究的課題。在這些研究中常常需要定性和定量測定細(xì)胞或細(xì)胞萃取物中的微管蛋白。目前，此測定是通過下述方法來完成的各種免疫試驗(yàn)[D.Thrower等人，Methods in CellBiology,vol.37,p129-145(1993)]，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳[B.M.Spiegelman等，Cell,vol.12,pp.587-600(1977)]，與DEAE-纖維素的結(jié)合[J,C.Bulinski等，Analytical Biochemistry,vol.104,432-439(1980)]，或測定秋水仙堿結(jié)合活性[Wilson,L.,Biochemistry,vol.9,pp.4999-5007(1970)]。酰胺探針提供了另外一種以測量酰胺結(jié)合活性為基礎(chǔ)的定性和定量測定微管蛋白的方法。使用酰胺探針避免了對(duì)抗微管蛋白的抗體的需求，提供了一種比十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳或與DEAE-纖維素的結(jié)合更簡單、更快速的方法，并且適合于測量各種細(xì)胞，如對(duì)秋水仙堿不敏感的事物或真菌細(xì)胞之中的微管蛋白水平。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的各種方法都可以用來測定用全細(xì)胞、粗制的細(xì)胞萃取物、部分純化的微管蛋白制劑或分離的微管蛋白進(jìn)行的試驗(yàn)中酰胺探針和微管蛋白的結(jié)合。這可能涉及例如放射性標(biāo)記或熒光的酰胺探針。具體地，該探針是用細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或微管蛋白孩子基培育的，在用各種分離技術(shù)或這些技術(shù)的結(jié)合將它們與未結(jié)合的探針分離之后，測定結(jié)合探針的量。分離技術(shù)包括，但不限于離心、色譜、相分離、沉淀結(jié)合或未結(jié)合探針中的一種，或結(jié)合或未結(jié)合探針中的一種粘合于固體基質(zhì)。閃爍接近試驗(yàn)技術(shù)(scintillation proximity assay technology)(U.S.4,568,649)提供了另外一種測定探針與微管蛋白結(jié)合的有效方法。另一種方法還涉及用質(zhì)譜技術(shù)鑒定結(jié)合了酰胺的微管蛋白或結(jié)合了酰胺的蛋白質(zhì)，它們是由化學(xué)或酶處理后釋放出來的。
本發(fā)明提供了用某些抑制真核細(xì)胞生長的酰胺進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)的方法，該方法可用于篩選抗微管蛋白活性的化合物、抗性檢測和測定在真核細(xì)胞、細(xì)胞萃取物和微管蛋白制劑中微管蛋白的含量，所說的酰胺是具有以下結(jié)構(gòu)的酰胺或其光學(xué)對(duì)映體
其中A是(C3-C7)環(huán)烷基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、鹵代(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、鹵代(C2-C6)炔基、苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噁唑基、吡咯基、異噻唑基、噻唑基、吡唑基、咪唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、萘基、噠嗪基、吡嗪基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并呋喃基或芐基；或是由各自獨(dú)立地選自下述基團(tuán)的4個(gè)或少于4個(gè)取代基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噁唑基、吡咯基、異噻唑基、噻唑基、吡唑基、咪唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、萘基、噠嗪基、吡嗪基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并呋喃基或芐基鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、鹵代(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、鹵代(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、鹵代(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷硫基、硝基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12和-COOR13；或者當(dāng)A是不飽和環(huán)并被2個(gè)或多個(gè)相鄰的取代基取代時(shí)，所說的取代基中的兩個(gè)取代基可形成含有至多兩個(gè)選自氧、氮、硫和磷的雜原子的稠合5、6、7元環(huán)；R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、鹵代(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基或鹵代(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R6和R7各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基羰基；
R8是氫原子、(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基；R9是氫原子、(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基或(C1-C4)烷基羰基；R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基；和X、Y和Z各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X、Y和Z中至少有一個(gè)不是氫原子。
這里所說的“鹵素”包括氟、溴、氯或碘。
“烷基”包括在每個(gè)基團(tuán)中具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烴基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基。
“鏈烯基”包括在每個(gè)基團(tuán)中至少有一個(gè)雙鍵和有2-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基，例如乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基和2-甲基-2-丙烯基。
“炔基”包括在每個(gè)基團(tuán)中至少有一個(gè)三鍵和有2-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基，例如乙炔基、2-丙炔基和2-丁炔基。
“烷氧基”包括在每個(gè)基團(tuán)中具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷氧基，例如甲氧基、丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。
“烷硫基”包括在每個(gè)基團(tuán)中具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷硫基，例如甲硫基和丙硫基。
“鹵代烷基”、“鹵代鏈烯基”、“鹵代炔基”、“鹵代烷氧基”和“鹵代烷硫基”基團(tuán)是各自有1-5個(gè)鹵素取代的“烷基”、“鏈烯基”、“炔基”、“烷氧基”和“烷硫基”基團(tuán)。
“環(huán)烷基”包括有3-7個(gè)碳原子的環(huán)狀環(huán)，例如環(huán)丙基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
“烷基羰基”包括每個(gè)基團(tuán)具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，該烷基連接于羰基上，例如甲基羰基和丁基羰基。
“烷基磺酰氧基”包括每個(gè)基團(tuán)具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，該烷基連接于磺酰氧基上，例如甲基磺酰氧基和丙基磺酰氧基。
本發(fā)明的優(yōu)選方法是使用具有下式結(jié)構(gòu)的酰胺或其光學(xué)對(duì)映體
其中R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；或者R4和R5一起形成稠合的5、6或7元環(huán)，其中最多含有兩個(gè)選自O(shè)、S、N和P的雜原子；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
本發(fā)明更優(yōu)選的方法是使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是甲基或乙基；R3和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、甲基、硝基、氰基、-NR6R7、-CR8=NOR9或-NHCOOR10；條件是R3和R5不能同時(shí)為氫原子；R4是氫原子、鹵素、-NR6R7、、氰基、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-COOR13或(C1-C4)烷基；R6、R7、R8、R9、R10和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；X是氯；和Y是氫原子。
在用哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或微管蛋白的試驗(yàn)中，本發(fā)明更優(yōu)選的方法是使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是乙基；R3是鹵素或氰基；R4和R5是氨基或-CH=NOCH3，條件是R4和R5不同；X是氯；或Y是氫原子。
在用真菌細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或其中的真菌屬于Ascomycete、Deutermycete或Basidiomycete類真菌的微管蛋白的試驗(yàn)中，本發(fā)明更優(yōu)選的方法是使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是甲基或乙基；R3是-CH=NOCH3，鹵素或氰基；R4是氫原子、鹵素、氨基、氰基或甲基；R5是鹵素、甲基、硝基或氰基；X是氯；和Y是氫原子。
在用真菌細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或其中的真菌屬于Oomycete類真菌的微管蛋白的試驗(yàn)中，本發(fā)明更優(yōu)選的方法是使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是乙基；R3和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、甲基、硝基、氰基、-NR6R7、-CR8=NOR9或-NHCOOR10，條件是R3和R5不能同時(shí)為氫原子；R4是氫原子、鹵素、-NR6R7、、氰基、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-COOR13或(C1-C4)烷基；R6、R7、R8、R9、R10和R13各自獨(dú)立地是氫原子或甲基；X是氯；和Y是氫原子。
在用植物細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或微管蛋白的試驗(yàn)中，本發(fā)明更優(yōu)選的方法是使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是甲基或乙基；R3和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、甲基、硝基或氰基，條件是R3和R5不能同時(shí)為氫原子；R4是氫原子；X是氯；和Y是氫原子。
本發(fā)明其它更優(yōu)選的方法是使用具有下式結(jié)構(gòu)的吡啶甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體
其中R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、羧基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
本發(fā)明其它更優(yōu)選的方法是使用具有下式結(jié)構(gòu)的吡啶甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體
其中R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3和R4各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、羧基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；或者R3和R4一起形成稠合的5、6或7元環(huán)，其中最多含有兩個(gè)選自O(shè)、S、N和P的雜原子；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
本發(fā)明另一更優(yōu)選的方法是使用具有式(Ⅳ)結(jié)構(gòu)的吡啶甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是甲基或乙基；R3和R4各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、甲基、硝基、氰基、-NR6R7、-CR8=NOR9或-NHCOOR10；條件是R3和R4不能同時(shí)為氫原子；R6、R7、R8、R9、R10和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；X是氯；和Y是氫原子。
本發(fā)明還有另一更優(yōu)選的方法是使用具有下式結(jié)構(gòu)的呋喃甲酰胺、噻吩甲酰胺或它們的光學(xué)對(duì)映體
其中D是O或S；R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、羧基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；或者R3和R4一起形成稠合的5、6或7元環(huán)，其中最多含有兩個(gè)選自O(shè)、S、N和P的雜原子；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
本發(fā)明還有另一更優(yōu)選的方法是使用具有下式結(jié)構(gòu)的呋喃甲酰胺、噻吩甲酰胺或它們的光學(xué)對(duì)映體
其中D是O或S；R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、羧基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
當(dāng)R1和R2不同時(shí)，由于存在連接R1和R2的不對(duì)稱碳原子，就可能有本發(fā)明化合物的光學(xué)對(duì)映體。在這種情況下，兩種對(duì)映體均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。已知很多生物活性化合物具有光學(xué)對(duì)映體，其中之一與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合比另一個(gè)更有效。與此類似，對(duì)于本發(fā)明方法的化合物而言，在與微管蛋白的結(jié)合中一種對(duì)映體可能比另一種對(duì)映體更有效。例如，化合物1、2和3的“S對(duì)映體”在與微管蛋白結(jié)合時(shí)比相應(yīng)的“R對(duì)映體”更為有效。術(shù)語“S對(duì)映體”是指連接R1和R2的碳原子上的四個(gè)基團(tuán)如果是按照Cahn-Ingold-Prelog體系[Angew.Chem.Int.Ed.Engl.5,385-415(1966)]的一組序列規(guī)則排列時(shí)，則大意該碳原子為S構(gòu)型。術(shù)語“R對(duì)映體”是指四個(gè)基團(tuán)形成R構(gòu)型。
已經(jīng)制得的并且預(yù)計(jì)可以用于本發(fā)明的方法制得的的具體化合物包括，但不限于表1-6所列出的化合物。
在本發(fā)明的附圖中

圖1表示辣椒疫霉用14C-標(biāo)記化合物3處理后，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝脈電泳和自動(dòng)放射線照像分析放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)；圖2表示煙草細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液經(jīng)14C-標(biāo)記處理后，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝脈電泳和自動(dòng)放射線照像分析放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)；圖3表示分離的牛微管蛋白用14C-標(biāo)記傾倒物處理后，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝脈電泳和自動(dòng)放射線照像分析放射標(biāo)記蛋白質(zhì)表1 式(Ⅱ)的苯甲酰胺
表2 式(Ⅲ)的吡啶甲酰胺
<p>表3 式(Ⅳ)的吡啶甲酰胺
表4 式(Ⅴ)的噻吩甲酰胺和呋喃甲酰胺
表5 式(Ⅵ)的噻吩甲酰胺
表6 式(Ⅱ)的稠合環(huán)苯甲酰胺
*左端的原子連接于苯甲酸酰胺環(huán)的4-位，右端原子連接于苯甲酸酰胺環(huán)的5-位。
下面的方法和實(shí)施例進(jìn)一步說明了本發(fā)明的應(yīng)用。制備表1-6所列化合物使用的方法表1中的化合物1、6、8、9、10、11、13、15、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28和29表1中的化合物1、6、8、9、10、11、13、15、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28和29按照USP 4,822,902,第5-8列，第11-17行所述的合成方法制備。表1中的化合物7和16表1中的化合物7和16按照USP 5,254,584，第7和8列(化合物16)，和10-14列(化合物7)所述的合成方法制備。表1中的化合物3、14和21表1中的化合物3、14和21按照USP 5,304,572，第4-8列所述的合成方法制備。表1中的化合物5和12表1中的化合物5和12按照USP 4,863,940，第5-7列所述的常規(guī)技術(shù)，由適當(dāng)?shù)谋郊姿峄虮郊柞Ｂ戎苽?。即化合?和12分別由4-氨基-3,5-二氯苯甲酰氯和4-氨基-3,5-二溴苯甲酰氯制備。表1中的化合物2表1中的化合物2是使R3是Cl,R4是NH2和R5是-CH=NOCH3，的式Ⅶ的苯甲酰氯與R1是甲基和R2是乙基的式Ⅷ的(α-氨基-α-氯代酮衍生物反應(yīng)而制得的，如反應(yīng)流程說明
反應(yīng)流程A用于制備化合物2的原料苯甲酰氯用下面的反應(yīng)流程B所示的方法制備。
反應(yīng)流程B化合物Ⅷ用下述方法制備在溶劑如二氯甲烷、氯仿、乙醚或水中，在有堿如三乙胺、碳酸鈉、碳酸氫鈉或氫氧化鈉存在下，用三氟乙酸酐處理乙炔胺(Ⅹ)，得到乙炔酰胺Ⅺ
在-78℃-0℃，于溶劑如二氯甲烷或氯仿中，用氯或氯源處理乙炔酰胺Ⅺ，得到中間體噁唑啉(Ⅻ)。于40℃-60℃，以甲醇或四氫呋喃為溶劑，在酸性條件下，用酸，如鹽酸或硫酸很容易使噁唑啉Ⅻ水解，得到α-氨基-α,α-二氯代酮(ⅩⅢ)。
使ⅩⅢ選擇催化脫鹵素，得到相應(yīng)的α-氨基-α-氯代酮衍生物Ⅷ
a)制備3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯在配備有回流冷凝管、塔頂攪拌器和進(jìn)氣管的5升三頸圓底燒瓶中放入300g 3-甲基-4-硝基苯甲酸和3升甲醇，在所得到的充分?jǐn)嚢璧娜芤褐泄呐菁尤?0.8g氯化氫，并把得到的混合物攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，使之靜置過夜，沉淀出預(yù)期的3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯，為淺黃色結(jié)晶，抽濾得到該結(jié)晶，干燥后為259.3g，該固體即可用于下一步驟。b)制備3-溴甲基-4-硝基苯甲酸甲酯在配備有回流冷凝管、塔頂攪拌器、加料漏斗和氮?dú)膺M(jìn)氣管的5升三頸圓底燒瓶中放入220g 3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯、2升無水四氯化碳和4g過氧化苯甲酰。把得到的溶液用275瓦UV燈照射，一邊回流一邊用2小時(shí)時(shí)間滴加198g溴，加完后，將反應(yīng)混合物再回流60小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，抽濾分離得到的固體，該固體(159.1g)由預(yù)期的3-溴甲基-4-硝基苯甲酸甲酯和少量的原料組成。將母液與另外220g 3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯和4g過氧化苯甲酰一起加回到燒瓶中，并如上文所述用198g溴處理。加完后將反應(yīng)混合物攪拌96小時(shí)，冷卻至室溫和過濾分離得到的另外一份252g 3-溴甲基-4-硝基苯甲酸甲酯。將得到的固體合并，共得到411.1g 3-溴甲基-4-硝基苯甲酸甲酯，其中帶有少量原料3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯和3-二溴甲基-4-硝基苯甲酸甲酯，該固體即可用于下一步驟。c)制備3-乙酰氧基甲基-4-硝基苯甲酸甲酯在配備有回流冷凝管、塔頂攪拌器和氮?dú)膺M(jìn)氣管的5升三頸圓底燒瓶中放入411g前面制得的3-溴甲基-4-硝基苯甲酸甲酯、441g無水乙酸鉀和2升冰乙酸。把得到的混合物攪拌4小時(shí)，冷卻至室溫和攪拌過夜。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去溶劑，得到的淺黃色固體用2升乙酸乙酯和1升水的混合物處理，分離有機(jī)相，用水(3×400ml)和鹽水(1×400ml)洗滌，無水硫酸鎂干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑。粗制的反應(yīng)各個(gè)外用己烷研磨，過濾，得到318g預(yù)期的3-乙酰氧基甲基-4-硝基苯甲酸甲酯，此混合物即可用于下一步驟。d)制備3-羥甲基-4-硝基苯甲酸甲酯在配備有回流冷凝管、塔頂攪拌器和氮?dú)膺M(jìn)氣管的5升三頸圓底燒瓶中放入318g前面得到的3-乙酰氧基甲基-4-硝基苯甲酸和3.2升無水甲醇，在所得到的溶液中鼓泡加入40g氯化氫，并把得到的混合物回流3小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻至室溫后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，得到273g 3-羥甲基-4-硝基苯甲酸甲酯，為黃色結(jié)晶，含有痕量的甲醇，該固體即可用于下一步驟。e)制備3-甲?；?4-硝基苯甲酸甲酯在5升三頸圓底燒瓶中把1.5升二氯甲烷冷卻至-78℃，緩慢加入草酰氯(164g,1.29mol)，接著再滴加202g(2.59mol)干燥二甲亞砜的125ml二氯甲烷溶液，使溫度保持在低于-70℃。加完后于-78℃攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后滴加前面制得的，溶于250ml二氯甲烷的273g(1.29mol)3-羥甲基-4-硝基苯甲酸甲酯，將反應(yīng)混合物再攪拌30分鐘。滴加三乙胺(392g,3.88mol)的125ml二氯甲烷溶液，使溫度保持在低于-65℃。使反應(yīng)混合物緩慢溫?zé)嶂潦覝睾蛿嚢柽^夜。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，得到的固體用2升乙酸乙酯和1升水的混合物處理。分離有機(jī)相，通過硅藻土過濾，并順序用稀鹽酸水溶液(2×250ml)、水(2×250ml)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×250ml)、水(2×200ml)和鹽水(1×200ml)洗滌，用無水硫酸鎂干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，粗制的反應(yīng)混合物用己烷研磨，過濾后得到234.1g預(yù)期的3-甲酰基-4-硝基苯甲酸甲酯黃色固體，此固體即可用于下一步驟。f)制備3-甲氧基亞氨基甲基-4-硝基苯甲酸甲酯在充分?jǐn)嚢璧?95g 3-甲?；?4-硝基苯甲酸甲酯、1升二氯甲烷和370ml水的混合物中依次加入77.6g甲氧基胺鹽酸鹽、76.2g乙酸鈉和6.8g四正丁基銨硫酸氫鹽，將得到的混合物于室溫?cái)嚢柽^夜，然后用2升乙醚稀釋。分離有機(jī)相和依次用水(1×500ml)、2％鹽酸水溶液(2×500ml)、水(2×250ml)和鹽水(1×250ml)洗滌，用無水硫酸鎂干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，得到218.6g預(yù)期的3-甲氧基亞氨基甲基-4-硝基苯甲酸甲酯，為帶紅色的油，使其靜置固化，此固體即可用于下一步驟。g)制備4-氨基-3-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸甲酯在5升三頸圓底燒瓶中放入0.9升5％乙酸水溶液和157g(2.8mol)鐵，在得到的充分?jǐn)嚢柚幕旌衔镏屑尤?66.6g(0.7mol)前面所制得的，溶于0.9升乙酸乙酯的3-甲氧基亞氨基甲基-4-硝基苯甲酸甲酯，接著滴加0.9升乙酸，同時(shí)保持35℃。得到的混合物于35℃攪拌30分鐘并通過硅藻土過濾。把濾液傾入5升水中，分離水相并用乙醚(2×500ml)洗滌。合并的有機(jī)相依次用水(4×500ml)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×500ml)、水(2×500ml)和鹽水(1×400ml)洗滌，有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，得到130g預(yù)期的4-氨基-3-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸甲酯。h)制備4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸甲酯在2升三頸圓底燒瓶中放入106g(0.51mol)前面制備的4-氨基-3-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸甲酯和500ml乙腈，得到的混合物于70℃加熱并滴加75.2g(0.56mol)的N-氯琥珀酰亞胺，同時(shí)保持溫度低于80℃。加入完成后，回流反應(yīng)混合物1小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去溶劑。將粗制的產(chǎn)品溶于5升乙酸乙酯，有機(jī)溶液用水(3×500ml)和鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中把反應(yīng)混合物濃縮成漿液，用己烷研磨和過濾得到130g預(yù)期的4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸甲酯，為黃色固體。用相同用量重復(fù)此反應(yīng)，得到總量為210.5g4-氨基-3-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸甲酯，此化合物即可用于下一步驟。ⅰ)制備4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸在5升三頸圓底燒瓶中放入210g(0.86mol)前面制備的4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸甲酯、1.7升甲醇和462g(1.73mol)15％氫氧化鈉水溶液，將得到的混合物回流3小時(shí)，之后于室溫下將反應(yīng)混合物攪拌過夜。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮反應(yīng)混合物。把粗制的反應(yīng)混合物溶于2升水，得到的水溶液用500ml乙酸乙酯洗滌一次，用冰浴冷卻，和用濃鹽酸酸化至pH=2。預(yù)期的4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸以淺黃色固體的形式沉淀出來，抽濾分離固體。濾餅用乙酸乙酯和己烷的1∶2混合物洗滌，干燥后得到185.2g產(chǎn)品(產(chǎn)率94％)。ⅰ)制備4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酰氨在5升三頸圓底燒瓶中放入180g前面制備的4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酸、2升甲苯、3ml二甲基甲酰胺和104g(64ml)亞硫酰氯。得到的混合物在70℃加熱2小時(shí)，熱過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑得到178.1g 4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酰氯。k)制備3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然?化合物Ⅷ，其中R1甲基和R2是乙基)(ⅰ)制備N-[3-(3-甲基-1-戊炔基)三氟乙酰胺在配備有機(jī)械攪拌、氮?dú)膺M(jìn)氣管和溫度計(jì)的3升三頸圓底燒瓶中放入234g(1.75mol)3-氨基-3-甲基-1-戊炔氫氯化物和1000ml二氯甲烷，在得到的充分?jǐn)嚢璧幕旌衔镏芯徛渭?54g(3.51mol)三乙胺(TEA)，并保持溫度低于30℃。加完后，攪拌反應(yīng)混合物120分鐘，接著滴加溶于500ml二氯甲烷的334.5g(1.59mol)三氟乙酸酐，加入速度是保持反應(yīng)溫度為0℃。加完后，反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢柽^夜并真空濃縮。得到的漿液用乙醚洗滌，乙醚層依次用水、飽和碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，用活性炭處理，通過CeliteTM過濾。減壓除去溶劑，得到的粗制的產(chǎn)品用冷的戊烷處理，過濾和干燥得到255.5g(83％)預(yù)期的N-[3-(3-甲基-1-戊炔基)三氟乙酰胺。
(ⅱ)制備5-氯-5-(二氯甲基)-4-乙基-4-甲基-2-三氟甲基噁唑啉氫氯化物在配備有機(jī)械攪拌、溫度計(jì)和進(jìn)氣管的5升四頸圓底燒瓶將255.5g(1.32mol)N-[3-(3-甲基-1-戊炔基)三氟乙酰胺溶于4000ml二氯甲烷，把得到的混合物冷卻至-30℃，用2小時(shí)時(shí)間鼓泡加入235g氯。加入完成后反應(yīng)混合物于-30℃攪拌0分鐘并溫?zé)嶂潦覝?。粗制的反?yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)得到預(yù)期的5-氯-5-(二氯甲基)-4-乙基-4-甲基-2-三氟甲基噁唑啉氫氯化物，此化合物即可用于下一步驟。
(ⅲ )制備3-氨基-1,1-二氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然锇亚耙徊襟E中制得的5-氯-5-(二氯甲基)-4-乙基-4-甲基-2-三氟甲基噁唑啉氫氯化物溶于1800ml甲醇、72ml水和190ml濃鹽酸，溫?zé)嶂?0℃，于室溫?cái)嚢柽^夜。把粗制的反應(yīng)混合物冷卻并傾入冰/水/乙醚混合物中，相分離，乙醚層用水萃取一次，留存此乙醚(有機(jī)相Ⅰ)。合并的含水層用乙醚洗滌一次，此有機(jī)層與有機(jī)相Ⅰ合并(有機(jī)相Ⅱ)。水層用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，和用乙醚萃取二次。合并的醚層用水和鹽水洗滌。用無水硫酸鎂干燥，用活性炭處理和通過CeliteTM過濾。在得到的無色溶液中用無水氯化氫氣體鼓泡，并使溫度保持在低于20℃。過濾得到的白色固體并干燥，得到124.8g預(yù)期的3-氨基-1,1-二氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然?，為白色固體。將乙醚濾液與有機(jī)相Ⅱ合并，濃縮，把得到的殘余物(150g)溶于甲醇/水/濃鹽酸的混合物，在50℃加熱過周末按前面描述的方法精制得到另外的51g 3-氨基-1,1-二氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然?，所得總量?75.8g(產(chǎn)率61％)。
ⅳ)制備3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然镌?L ParrTM瓶中加入41g 3-氨基-1,1-二氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然铩?.8g 10％鈀-碳和400ml乙醇，將得到的混合物在ParrTM儀上，于50psi震蕩3小時(shí)。用CeliteTM過濾粗制的反應(yīng)混合物，真空蒸發(fā)得到粘稠的油，將其溶于300-400ml乙酸乙酯，于室溫下攪拌數(shù)小時(shí)。結(jié)晶出預(yù)期的3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然?，為白色固體。在得到的懸浮液中加入300ml己烷，過濾得到34g(98％)3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然铩?br> 用41g、41g和51g 3-氨基-1,1-二氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然镒髟现貜?fù)上述反應(yīng)，得到總量132.1g(總產(chǎn)率90％)的3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然铩?)制備4-氨基-3-氯-甲氧基亞氨基甲基-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)苯甲酰胺(化合物2)在5升四頸圓底燒瓶中加入93g 3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然锖?85ml水，在得到的溶液中加入138.6g碳酸氫鈉溶液，接著加入500ml乙酸乙酯。室溫下，有50分鐘時(shí)間在所得到的充分?jǐn)嚢璧幕旌衔镏屑尤?23.5g 4-氨基-3-氯-5-甲氧基亞氨基甲基苯甲酰氯的1000ml乙酸乙酯溶液。加入完成以后，反應(yīng)緩和于室溫?cái)嚢?小時(shí)。分離兩相，有機(jī)層用水(2×500ml)和鹽水(1×500ml)洗滌，用無水硫酸鎂干燥和在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去溶劑，得到棕色油狀的粗制產(chǎn)物。使此油通過一短的硅膠柱，以二氯甲烷為洗脫溶劑。蒸發(fā)溶劑后得到133.3g預(yù)期的4-氨基-3-氯-甲氧基亞氨基甲基-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)苯甲酰胺，為灰白色固體，mp140-141℃。表1的化合物4和化合物30化合物30按下述方法制備。
按照上文反應(yīng)流程A的方法，通過3-硝基苯甲酰氯與Ⅷ反應(yīng)制備3-硝基-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)苯甲酰胺，然后，以鈀為催化劑催化氫化得到3-氨基-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)苯甲酰胺。
在配備有機(jī)械攪拌、溫度計(jì)和加料漏斗的300ml四頸圓底燒瓶中將3.5g3-氨基-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)苯甲酰胺懸浮于100ml二氯甲烷，鈀該混合物在冰浴中冷卻至0-5℃，然后加入1.8ml三乙胺，將該混合物攪拌數(shù)分鐘。緩慢加入氯甲酸甲酯(1.1ml)，滴加時(shí)保持溫度低于5℃，將混合物攪拌20分鐘。撤去冰浴，使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝亍Ｓ?0ml水將反應(yīng)混合物洗滌二次，和用無水硫酸鎂干燥。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，得到粗制的產(chǎn)物，用硅膠色譜純化該粗制產(chǎn)品得到230g化合物30。
化合物4按照和化合物30相同的方法制備，只是使用4-硝基苯甲酰氯為原料。表2、3、4和5的化合物表2、3、4和5的化合物按照USP4,863,940所述的合成方法制備。表6的化合物40、41、42、43和44化合物40、41、43和44可按上文反應(yīng)流程A所述通過其中R4和R5一起形成稠合環(huán)的相應(yīng)芳族衍生物(Ⅶ)與3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮(化合物Ⅷ，其中R1是甲基和R2是乙基)反應(yīng)制備。
要制備化合物42，首先用亞硫酰氯處理6-羰基-1,3-苯并噻唑(購自Maybrige Chemical Company Ltd.)得到酰氯。在三乙胺存在下將該酰氯用3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然锾幚淼玫交衔?2。
為制備化合物41的芳基部分，由相應(yīng)的2-氨基酚衍生物，采用本領(lǐng)域已知的方法制備5-羧基苯并噁唑衍生物ⅩⅣ，該方法如E.C.Taylor編輯，The Chemistry of Heterocyclic Compounds,vol.47,John Wiley &amp;Sons,1987,“Synthesis of Fused Heterocycles”,G.P.Ellis編輯，p.50,patr Ⅰ，和p.713-714,part Ⅱ中所述。
此方法如下式所述
然后在三乙胺存在下將ⅩⅣ用3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然锾幚淼玫交衔?1。
為了制備化合物40、43和44的芳基部分，由相應(yīng)的2-氨基酚衍生物通過下述方法制備6-羧基苯并噁唑衍生物(ⅩⅤ)
ⅩⅤ其中R14是H或甲基。
為了制備化合物40，可以4-氨基-3-羥基苯甲酸為原料，用原甲酸三甲酯處理而制備6-羧基-1,3-苯并噁唑。首先將6-羧基-1,3-苯并噁唑用亞硫酰氯處理得到酰氯，再在三乙胺存在下將該酰氯用3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然锾幚?，得到化合?0。
為了制備化合物43，以4-氨基-5-氯-3-羥基苯甲酸為原料，用原甲酸三甲酯處理而制備6-羧基-4-氯-1,3-苯并噁唑。首先將6-羧基-4-氯-1,3-苯并噁唑用亞硫酰氯處理得到酰氯，再在三乙胺存在下將該酰氯用3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然锾幚?，得到化合?3。
為了制備化合物44，以4-氨基-5-氯-3-羥基苯甲酸為原料，用原甲酸三甲酯處理而制備6-羧基-2-甲基-4-氯-1,3-苯并噁唑。首先將6-羧基-2-甲基-4-氯-1,3-苯并噁唑用亞硫酰氯處理得到酰氯。再在三乙胺存在下將該酰氯用3-氨基-1-氯-3-甲基-2-戊酮?dú)渎然锾幚?，得到化合?4。
為了說明本發(fā)明的方法給出了下面的實(shí)施例。實(shí)施例1此實(shí)施例說明化合物3用于卵菌綱真菌(Oomycete fungus)辣椒疫霉(Phytophthora capsici)時(shí)與β-微管蛋白共價(jià)鍵結(jié)合的能力P.capsici(ATCC15399)保持于V-8瓊脂，pH7.0，每升中含有200ml V-8汁液，4g碳酸鈣和20g瓊脂。在含有20ml Rrwin,D.C.和Katznel son,K.,1971,Canada Journal of Microbiology,vol.7,p.15-25(1971)中所描述的天冬酰胺-蔗糖介質(zhì)的錐形瓶(容量125ml)中孵化由在V-8瓊脂上生長的P.capsici培養(yǎng)物的生長邊緣切下來的菌絲體孢塞(直徑7mm)。在旋轉(zhuǎn)震蕩器上以120rpm震蕩的條件下于26℃孵化72小時(shí)，然后加入50μl 0.8mM14C-標(biāo)記的化合物3。在進(jìn)一步孵化1小時(shí)后，規(guī)律收集真菌菌絲體并用100ml水洗滌。將菌絲體在液氮中冷凍和研磨成細(xì)粉，在變性條件下(于100℃，在62mM含有3％十二烷基硫酸鈉、5％巰基乙醇、和10％甘油的Tris-HCl,pH6.8，緩沖溶液中加熱5分鐘)萃取蛋白質(zhì)，期望能引起任一非共價(jià)鍵結(jié)合的配位體的解離。按照Laemmli,U.K.,Nature(London),o1.277,pp.680-685,1970所述的方法，在雙重7.5％聚丙烯酰胺凝膠上將各等份的萃取蛋白質(zhì)經(jīng)過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)。在一種凝膠上將蛋白質(zhì)用Coomassie亮蘭色R250染色。第二凝膠上的蛋白質(zhì)用電泳法轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上，該膜用EN3HANCETM噴霧劑(Dupont NEN ResearchProducts)噴，使用柯達(dá)X-OMAT AR膠片，采用自動(dòng)放射照相的方法，曝光3周測定放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)位置。β-微管蛋白在硝基纖維素上的位置用抗微管蛋白的單克隆抗體按照免疫標(biāo)記的方法測定。結(jié)果用圖1表示。虛線表示Coomassie染色凝膠的密度掃描，說明了蛋白質(zhì)的分布，實(shí)線表示自動(dòng)照相的密度掃描，以及說明了單個(gè)的14C-標(biāo)記鍵。用免疫標(biāo)記法測定的β-微管蛋白的位置用箭頭指明，并和14C-標(biāo)記蛋白質(zhì)帶重合。實(shí)施例2此實(shí)施例說明化合物1用于煙草細(xì)胞的培養(yǎng)懸浮液時(shí)與β-微管蛋白共價(jià)鍵結(jié)合的能力在按照Naagata,K.等人，Molecular and GeneralGenetics,vol.184,pp.161-165(1981)制備的生長介質(zhì)中，在旋轉(zhuǎn)震蕩器上，200rpm的條件下于27℃使煙草細(xì)胞的培養(yǎng)懸浮液生長。細(xì)胞用濃度為10μm的14C-標(biāo)記的化合物1處理1小時(shí)，然后過濾收集。在液氮中冷凍該細(xì)胞并磨成細(xì)粉，之后在實(shí)施例1描述的雙重凝膠上，用SDS-PAGE方法萃取和分離蛋白質(zhì)。用實(shí)施例1描述的方法在一種凝膠上將蛋白質(zhì)染色，和用自動(dòng)放射照相和免疫標(biāo)記的方法分析第二凝膠。結(jié)果用圖2表示。虛線表示Coomassie染色凝膠的密度掃描，說明了蛋白質(zhì)的分布，實(shí)線表示自動(dòng)照相的密度掃描，以及說明了單個(gè)的14C-標(biāo)記鍵。用免疫標(biāo)記法測定的β-微管蛋白的位置用箭頭指明，并和14C-標(biāo)記蛋白質(zhì)帶重合。實(shí)施例3此實(shí)施例說明化合物1與分離的牛微管蛋白的β-亞單元以共價(jià)鍵結(jié)合的能力用Vallee,R.B.在Methods in Enzymology,vol.134,pp.89-104(1986)中描述的方法從牛腦中分離微管蛋白。在含有1mM氯化鎂的1.0M谷氨酸鈉，pH6.6的溶液中的微管蛋白(10μM)于37℃和2μM的14C-標(biāo)記化合物1一起孵化4小時(shí)。樣品轉(zhuǎn)移至冰浴中3分鐘，假如20％的三氯乙酸使微管蛋白沉淀，并在冰中繼續(xù)孵化20分鐘。在12000g離心5分鐘后用80％冰冷的丙酮洗滌微管蛋白小球，室溫下溶解于62mM含有3％十二烷基硫酸鈉、5％巰基乙醇、和10％甘油的Tris-HCl,pH6.8，緩沖溶液。樣品于100℃加熱2分鐘，然后各等份如實(shí)施例所述在雙重凝膠上，用SDS-PAGE方法處理。在一種凝膠上將蛋白質(zhì)染色，以及用自動(dòng)放射照相和免疫標(biāo)記的方法分析第二凝膠，免疫標(biāo)記法用抗α-和β-兩種微管蛋白的單克隆抗體進(jìn)行。結(jié)果用圖3表示。用免疫標(biāo)記法測定的α-微管蛋白和β-微管蛋白的位置用箭頭指明。虛線表示Coomassie染色凝膠的密度掃描，說明了蛋白質(zhì)的分布，實(shí)線表示自動(dòng)照相的密度掃描，說明了β-微管蛋白亞單元的主要的標(biāo)記物。實(shí)施例4此實(shí)施例說明不同化學(xué)類別的各種抗微管蛋白化合物對(duì)化合物1與煙草細(xì)胞的培養(yǎng)懸浮液的微管蛋白結(jié)合的影響將如實(shí)施例2所述培養(yǎng)的多份(2ml)煙草細(xì)胞的培養(yǎng)懸浮液加入容量為25ml的玻璃管形瓶，然后在每個(gè)管形瓶中加入5μl DMSO(對(duì)照)或5μl溶于DMSO的抗微管蛋白化合物。一邊震蕩一邊把這些管形瓶于27℃孵化2小時(shí)，然后加入5μl 100μM的氚標(biāo)記化合物1的DMSO溶液，一邊震蕩一邊把這些管形瓶于27℃孵化20分鐘，然后通過加入5μl未標(biāo)記的40mM化合物1使放射性配位體的結(jié)合停止。一邊震蕩一邊將樣品于27℃再孵化20分鐘，再轉(zhuǎn)移至放置于冰浴中的、容量為15ml的聚丙烯離心管中。每個(gè)管形瓶用2ml冰冷卻的生長介質(zhì)(如實(shí)施例2所述)洗滌，把洗滌液加入其余樣品中。在4℃,2500rpm離心3分鐘后，棄去上清液，把沉淀的細(xì)胞再懸浮于4ml冰冷卻的10％三氯乙酸。樣品在冰浴中放置1小時(shí)，再次離心，將細(xì)胞再懸浮于4ml冰冷卻的乙醇。將帶有洗滌細(xì)胞的過濾器轉(zhuǎn)移至閃爍管形瓶中在每個(gè)瓶中加入10ml HydrofluorTM閃爍液(NationalDiagnostics,Manyille，新澤西州)，樣品在閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以測定結(jié)合的放射活性。不同的抗微管蛋白化合物對(duì)放射性配體結(jié)合的影響在表7中用存在各種抗微管蛋白化合物時(shí)結(jié)合的放射性配體的量表示，該量表示為是DMSO對(duì)照組結(jié)合放射性配體量的百分?jǐn)?shù)。paclitaxel和抗微管蛋白的除草劑戊炔草胺和氯苯胺磷減少放射性配體的結(jié)合，而抗微管蛋白除草劑氟樂靈增加放射性配體的結(jié)合。表7各種抗微管蛋白化合物對(duì)氚化的化合物1在用煙草細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液進(jìn)行的全細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)中與微管蛋白結(jié)合的影響
實(shí)施例5此實(shí)施例說明paclitaxel對(duì)化合物1與辣椒疫霉的微管蛋白結(jié)合的影響用天冬酰胺-蔗糖介質(zhì)中的P.capsici的菌絲體震蕩培養(yǎng)物液體制備用于結(jié)合試驗(yàn)的真菌物質(zhì)的均勻懸浮液。天冬酰胺-蔗糖介質(zhì)(100ml)與由V-8瓊脂上生長的培養(yǎng)物的生長邊緣切下來的菌絲體孢塞一起孵化，在旋轉(zhuǎn)震蕩器上于26℃孵化48小時(shí)，培養(yǎng)物在攪拌器中均化，將30ml傳代培養(yǎng)的均化物加入100ml新鮮的介質(zhì)，在旋轉(zhuǎn)震蕩器上于26℃再孵化17小時(shí)。由介質(zhì)中離心回收得到的菌絲體并再懸浮于1170ml新鮮的介質(zhì)。把等份(2ml)的此懸浮液加入容量為25ml的玻璃管形瓶，每個(gè)管形瓶中加入5μl DMSO(對(duì)照)或5μl溶于DMSO的paclitaxel。一邊震蕩一邊把這些管形瓶于26℃孵化1小時(shí)，然后加入5μl 100μM的氚標(biāo)記化合物1的DMSO溶液，一邊震蕩一邊把這些管形瓶于26℃孵化20分鐘，然后通過加入5μl未標(biāo)記的40mM化合物1使放射性配位體的結(jié)合停止。一邊震蕩一邊將樣品于27℃再孵化20分鐘，再轉(zhuǎn)移至放置于冰浴中的、容量為15ml的聚丙烯離心管中。每個(gè)管形瓶用2ml冰冷卻的介質(zhì)洗滌，把洗滌液加入其余樣品中。在4℃,3400rpm離心3分鐘后，棄去上清液，把沉淀的細(xì)胞再懸浮于4ml冰冷卻的10％三氯乙酸。樣品在冰浴中放置1小時(shí)，再次離心，將細(xì)胞再懸浮于4ml冰冷卻的乙醇。在冰浴中再孵化2小時(shí)之后，用玻璃纖維過濾器過濾收集細(xì)胞，用10ml冰冷卻的乙醇洗滌二次。將帶有洗滌細(xì)胞的過濾器轉(zhuǎn)移至閃爍管形瓶中，加入10ml HydrofluorTM閃爍液，樣品在閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以測定結(jié)合的放射活性。paclitaxel對(duì)放射性配體結(jié)合的影響在表8中說明，其影響用存在paclitaxel時(shí)結(jié)合的放射性配體的量表示，該量表示為是DMSO對(duì)照組結(jié)合放射性配體量的百分?jǐn)?shù)。表8:paclitaxel對(duì)氚化的化合物1在用辣椒疫霉菌絲體進(jìn)行的全細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)中與微管蛋白結(jié)合的影響
實(shí)施例6此實(shí)施例說明zarilamide和表1所述化合物7、8、16、19、23和27對(duì)化合物1與辣椒疫霉的微管蛋白結(jié)合的影響按下述方法制備P.capsici的游動(dòng)孢子在9cm直徑和含有15mlV-8瓊脂的培氏(Petri)板上培育辣椒疫霉的菌絲體塞，在25℃，黑暗中培育4天，然后，放置于連續(xù)的熒光下3天以誘導(dǎo)孢子形成。為誘導(dǎo)游動(dòng)孢子的釋放，在每個(gè)板上加入15ml無菌水。此板在室溫孵化10分鐘，接著在4℃孵化20分鐘，最后，再回到室溫孵化15分鐘。然后，從每個(gè)板上取出含有游動(dòng)孢子的液體，調(diào)節(jié)其密度為每毫升含有5×105個(gè)游動(dòng)孢子。按下述方法制備含有萌芽的游動(dòng)孢子孢囊的試驗(yàn)管在16×1.25cm的聚丙烯管中，于400μl天冬酰胺-蔗糖介質(zhì)中加入100μl游動(dòng)孢子懸浮液，然后將其松松地覆蓋并于26℃下，在120rpm的旋轉(zhuǎn)震蕩器上孵化24小時(shí)。
然后在含有萌芽的游動(dòng)孢子孢囊的試驗(yàn)管中加入2.5μl DMSO(對(duì)照)或2.5μl試驗(yàn)化合物的DMSO溶液。每種化合物以一系列的濃度進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)管于26℃震蕩孵化1小時(shí)，然后加入2.5μl 40μM的氚標(biāo)記化合物1的DMSO溶液，管形瓶于26℃震蕩孵化20分鐘，然后通過加入1.5ml冰冷卻的133mM未標(biāo)記的化合物1使放射性配位體的結(jié)合停止，把管形瓶轉(zhuǎn)移至冰浴中。接著以3400rpm的速度離心3分鐘，棄去上清液，把沉淀的細(xì)胞再懸浮于2ml冰冷卻的10％三氯乙酸。樣品在冰浴中放置1小時(shí)，再次離心，將細(xì)胞再懸浮于2ml冰冷卻的乙醇。在冰浴中再孵化1小時(shí)之后，在每個(gè)管中再加入4ml冰冷卻的乙醇，在Brandell細(xì)胞收集器(BrandelBiomedical Research and Development Laboratories,Inc.,Gaithersburg，馬里蘭州)中用玻璃纖維過濾器過濾收集細(xì)胞，用4ml冰冷卻的乙醇洗滌二次。將帶有洗滌細(xì)胞的過濾器轉(zhuǎn)移至閃爍管形瓶中，加入0.1ml水，接著再加入1ml ProtosolTM(Dupont NEN ResearchProducts)。將此瓶于60℃孵化30分鐘并冷卻至室溫。向其中加入10mlEconofluorTM閃爍液(Dupont NEN Research Products)，樣品在閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以測定結(jié)合的放射活性。每個(gè)化合物的IC50值(定義為與沒有試驗(yàn)化合物的對(duì)照組相比，抑制50％的放射性配體結(jié)合所需的濃度)由劑量-響應(yīng)曲線確定并列于表9。
表9
實(shí)施例7此實(shí)施例說明化合物1作為探針檢測抗微管蛋白化合物對(duì)分離的牛微管蛋白的作用方面的應(yīng)用在0.5ml的聚乙烯管中，試驗(yàn)混合物是在含有1mM氯化鎂的1.0M谷氨酸鈉，pH6.6的溶液中含有10μM分離的微管蛋白，和2.5μl DMSO(對(duì)照)或2.5μl溶于DMSO的試驗(yàn)化合物?；旌衔镉?7℃孵化30分鐘，然后加入2.5μl 640μM的氚標(biāo)記化合物1的DMSO溶液。于37℃孵化120分鐘后，把等份(80μl)試驗(yàn)混合物用于2.3cm直徑的Whatman 3MM過濾器紙盤，將其在熱氣流中干燥15分鐘，浸入3ml冰冷的10％三氯乙酸，并于4℃放置過夜。將盤轉(zhuǎn)移至5％三氯乙酸30分鐘，用另外的5％三氯乙酸洗滌二次，在37℃于乙醇/乙醚(1∶1,v/v)中洗滌30分鐘，然后在室溫下于乙醇/乙醚(1∶1,v/v)中洗滌30分鐘，最后于室溫進(jìn)行二次連續(xù)的洗滌，每次15分鐘。將該盤干燥，并轉(zhuǎn)移至含有10ml HydrofluorTM的管形瓶和在閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。最后濃度為100μM的抗微管蛋白化合物對(duì)放射性配體結(jié)合的影響見表10，此影響用有各種抗微管蛋白化合物存在時(shí)結(jié)合的放射性配體的量表示，該量表示為是DMSO對(duì)照組結(jié)合放射性配體量的百分?jǐn)?shù)。
表10
應(yīng)該理解的是本說明書只是用于說明而不是限制，并且，在不脫離由附后的權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)可以做各種改進(jìn)和變化。
權(quán)利要求
1．進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)的方法，該方法用于篩選抗微管活性的化合物、抗性監(jiān)測和測定真核細(xì)胞、細(xì)胞萃取物和微管制劑中微管蛋白含量，該方法是用某些酰胺化合物抑制真核細(xì)胞的生長，所說的酰胺是具有下式結(jié)構(gòu)的酰胺或其光學(xué)對(duì)映體
其中A是(C3-C7)環(huán)烷基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、鹵代(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、鹵代(C2-C6)炔基、苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噁唑基、吡咯基、異噻唑基、噻唑基、吡唑基、咪唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、萘基、噠嗪基、吡嗪基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并呋喃基或芐基；或是由各自獨(dú)立地選自下述基團(tuán)的4個(gè)或少于4個(gè)取代基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噁唑基、吡咯基、異噻唑基、噻唑基、吡唑基、咪唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、萘基、噠嗪基、吡嗪基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并呋喃基或芐基鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、鹵代(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、鹵代(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、鹵代(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷硫基、硝基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12和-COOR13；或者當(dāng)A是不飽和環(huán)并被2個(gè)或多個(gè)相鄰的取代基取代時(shí)，所說的取代基中的兩個(gè)取代基可形成含有至多兩個(gè)選自氧、氮、硫和磷的雜原子的稠合5、6、7元環(huán)；R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、鹵代(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基或鹵代(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R6和R7各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基羰基；R8是氫原子、(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基；R9是氫原子、(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基或(C1-C4)烷基羰基；R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基；和X、Y和Z各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X、Y和Z中至少有一個(gè)不是氫原子。
2．權(quán)利要求1的方法，使用具有下式結(jié)構(gòu)的酰胺或其光學(xué)對(duì)映體
其中R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基，(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；或者R4和R5一起形成稠合的5、6或7元環(huán)，其中最多含有兩個(gè)選自O(shè)、S、N和P的雜原子；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
3．權(quán)利要求2的方法，使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是甲基或乙基；R3和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、甲基、硝基、氰基、-NR6R7、-CR8=NOR9或-NHCOOR10；條件是R3和R5不能同時(shí)為氫原子；R4是氫原子、鹵素、-NR6R7、氰基、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-COOR13或(C1-C4)烷基；R6、R7、R8、R9、R10和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；X是氯；和Y是氫原子。
4．權(quán)利要求3的方法，在用哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或微管蛋白的試驗(yàn)中，使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是乙基；R3是鹵素或氰基；R4和R5是氨基或-CH=NOCH3，條件是R4和R5不同；X是氯；或Y是氫原子。
5．權(quán)利要求3的方法，在用真菌細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或其中的真菌屬于Ascomycete、Deutermycete或Basidiomycete類真菌的微管蛋白的試驗(yàn)中，使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是甲基或乙基；R3是-CH=NOCH3，鹵素或氰基；R4是氫原子、鹵素、氨基、氰基或甲基；R5是鹵素、甲基、硝基或氰基；X是氯；和Y是氫原子。
6．權(quán)利要求3的方法，在用真菌細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或其中的真菌屬于Oomycete類真菌的微管蛋白的試驗(yàn)中，使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是乙基；R3和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、甲基、硝基、氰基、-NR6R7、-CR8=NOR9或-NHCOOR10，條件是R3和R5不能同時(shí)為氫原子；R4是氫原子、鹵素、-NR6R7、氰基、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-COOR13或(C1-C4)烷基；R6、R7、R8、R9、R10和R13各自獨(dú)立地是氫原子或甲基；X是氯；和Y是氫原子。
7．權(quán)利要求3的方法，在用植物細(xì)胞、細(xì)胞萃取物或微管蛋白的試驗(yàn)中，使用具有式(Ⅱ)結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是甲基或乙基；R3和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、甲基、硝基或氰基、條件是R3和R5不能同時(shí)為氫原子；R4是氫原子；X是氯；和Y是氫原子。
8．權(quán)利要求1的方法，使用具有下式結(jié)構(gòu)的吡啶甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體
其中R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、羧基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
9．權(quán)利要求1的方法，使用具有下式結(jié)構(gòu)的吡啶甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體
其中R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3和R4各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、羧基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；或者R3和R4一起形成稠合的5、6或7元環(huán)，其中最多含有兩個(gè)選自O(shè)、S、N和P的雜原子；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
10．權(quán)利要求9的方法，使用具有式(Ⅳ)結(jié)構(gòu)的吡啶甲酰胺或其光學(xué)對(duì)映體，其中R1是甲基；R2是甲基或乙基；R3和R4各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、甲基、硝基、氰基、-NR6R7、-CR8=NOR9或-NHCOOR10；條件是R3和R4不能同時(shí)為氫原子；R6、R7、R8、R9、R10和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；X是氯；和Y是氫原子。
11．權(quán)利要求1的方法，使用具有下式結(jié)構(gòu)的呋喃甲酰胺、噻吩甲酰胺或它們的光學(xué)對(duì)映體
其中D是O或S；R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、羧基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；或者R3和R4一起形成稠合的5、6或7元環(huán)，其中最多含有兩個(gè)選自O(shè)、S、N和P的雜原子；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
12．權(quán)利要求1的方法，使用具有下式結(jié)構(gòu)的呋喃甲酰胺、噻吩甲酰胺或它們的光學(xué)對(duì)映體
其中D是O或S；R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基或(C2-C6)炔基，條件是R1和R2不能同時(shí)為氫；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、(C1-C6)烷基、鹵代(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷硫基、鹵代(C1-C6)烷氧基、硝基、羧基、-NR6R7、-CR8=NOR9、-NHCOOR10、-CONR11R12或-COOR13；R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子或(C1-C6)烷基；和X和Y各自獨(dú)立地是氫原子、鹵素、氰基、硫氰酸基、異硫氰酸基或(C1-C6)烷基磺酰氧基，條件是X和Y不能同時(shí)為氫原子。
全文摘要
本發(fā)明涉及用某些酰胺類化合物篩選抗微管蛋白活性、抗性監(jiān)測和定量測定微管蛋白含量的化合物的方法,所述酰胺在結(jié)合試驗(yàn)中可作為探針抑制真核細(xì)胞的生長,所說的酰胺是具有右式結(jié)構(gòu)的酰胺或其光學(xué)對(duì)映體,其中各取代基具有說明書中所述含義。
文檔編號(hào)C07C233/30GK1211736SQ9712269
公開日1999年3月24日 申請(qǐng)日期1997年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月14日
發(fā)明者D·H·揚(yáng) 申請(qǐng)人:羅姆和哈斯公司