專利名稱：用于核酸檢測的新型熒光染料組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域。具體而言，本發(fā)明涉及例如擴增反應如聚合酶鏈反應(PCR)中的核酸檢測。本發(fā)明可特別用于基因分型、定量PCR、實時PCR和多重PCR。本發(fā)明具體涉及PCR中使用的染料。
背景技術：
熒光染料在分析化學、生物化學和分子生物學中有廣泛的應用，如在DNA測序和核酸的檢測和擴增中。熒光染料吸收特定波長光譜(“激發(fā)譜”)的光并在不同的特定波長光譜(“發(fā)射譜”)再發(fā)射能量。熒光染料通常用作分子標記與DNA和蛋白質探針或其它生物分子連接。多重聚合酶鏈反應(多重PCR)是一種能夠在單個反應管中平行擴增兩種或兩種以上產(chǎn)物的PCR技術。它廣泛應用于基因分型應用和分子生物學的其它方面，例如研究、法醫(yī)學或診斷應用，包括人的鑒定和親子鑒定以及傳染病的診斷或同種異體骨髓移植后的嵌合狀態(tài)分析。利用cDNA作為起始模板或結合以mRNA為起始材料的逆轉錄，多重PCR還可用于定性和半定量的基因表達分析。例如，被分析的核酸可來自各種真核(人、動物或植物) 與原核(細菌)或病毒來源。例如，多重PCR被用來同時檢測多個標記基因和/或它們的多態(tài)性，例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)、短串聯(lián)重復(STR)或缺失-插入多態(tài)性(DIP或hdel)。擴增產(chǎn)物及其基因分型的檢測通常在DNA測序儀中電泳分離(如毛細管凝膠電泳)后通過多色熒光檢測進行。在實時定量多重PCR中，可通過同時檢測不同熒光染料來同時監(jiān)測多個目標序列的擴
+曰O用于多色熒光檢測的儀器通常設計并校準為針對非常特定的熒光染料的組合，即按照激發(fā)和檢測光譜和濾光片組。許多DNA序列分析儀采用毛細管電泳裝置結合特殊的多波長熒光檢測系統(tǒng)。此類儀器的基本設置見 Karger 等(1991)所述(Karger A, Harris JM, Gesteland RF. “采用毛細管電泳的DNA測序多波長熒光檢測(Multiwavelength fluorescence detection for DNA sequencing using capillary electrophoresis)，，· Nucleic Acids Res 18, 4955-4962，1991)，并通過應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)(美國加利福尼亞州福斯特城(Foster City, CA, USA))的 ABI Prism 系列遺傳分析儀(310、3100、3130 等) 進入商業(yè)應用。這些儀器可用于DNA序列分析、遺傳多態(tài)性(SNP、DIP、STR)的多重基因分型、mRNA表達分析，或更一般地用于擴增DNA片段的長度分析。后者還是法醫(yī)學和親子鑒定領域中多重PCR STR基因分型的當前標準。在該情況中，在多重擴增中使用的各引物對中的至少一個引物在其5' -OH端或內部堿基上標記有共價連接的熒光染料。這些儀器的光學檢測單元使用可調至IOmW的多線氬離子激光器，其可以在488nm(主波長)和514nm 激發(fā)多個熒光團(Wenz H, Robertson JM, Menchen S, Oaks F, Demorest DM, Scheibler D, Rosenblum BB, Wike C, Gilbert DA, Efcavitch JW. “通過變性毛細管電泳進行高精度基因分型(High-precision genotyping by denaturing capillary electrophoresis)". Genome Res 8，69-80頁，1998)。記錄525到680nm之間的熒光發(fā)射。分離出發(fā)射光以便通過攝譜儀(棱鏡)進行多色熒光的同時檢測并成像在冷卻的CCD(電荷耦合器件(charge coupled device))相機上。在現(xiàn)有構造中，可通過約IOnm重量的數(shù)字帶通濾波器在C⑶芯片上設定最多5個波長帶。這些數(shù)字帶通濾波器的相對位置由生產(chǎn)商針對有限數(shù)量的染料組合進行專有設定(見表1)。所述裝置的這些設定也稱為虛擬濾光片組。數(shù)字帶通濾波器的確切位置和范圍未見公開。新一代的多毛細管DNA測序儀如ABI Prism 3130遺傳分析儀另外還具有兩個可變虛擬濾光片組，稱為“any4dyes”或“any5dyeS”，使客戶能針對其它染料組合調整預設的數(shù)字帶通濾波器。因此，所謂的條件限定數(shù)可有一定程度的改變。然而仍然沒有關于這些數(shù)字帶通濾波器的相對位置和波長范圍的信息。表1:用于ABI Prism 遺傳分析儀的已知熒光染料組合以及虛擬濾光片組。5， 6-FAM:5-和6-羧基熒光素；6-FAM:6-羧基熒光素JOE :6-羧基-4' ,5' -二氯， 7' -二甲氧基熒光素；HEX:4，7，2' ,4' ,5' ,7'-六氯 _6_ 羧基熒光素；TET :4，7，2‘， 7'-四氯-6-羧基熒光素；TAMRA :6-羧基四甲基-羅丹明；VIC :2'-氯-7'-苯基-1， 4-二氯-6-羧基熒光素；NED :2'-氯-5'-氟_7 ‘，8'-苯_1，4-二氯-6-羧基熒光素；ROX :5-和6-羧基-X-羅丹明；PET和LIZ為未公開的應用生物系統(tǒng)公司(美國加利福尼亞州)的專有染料。
熒光染料的組合以及色道推薦的虛擬濾光片組 τ^綠黃 (遠紅外)6-FAMJOETAMRAROX-F或A6-FAMTETHEXTAMRA-C5,6-FAMJOETAMRAROX-F或A6-FAMJOENEDROX-F6-FAMHEXNEDROX-F或D6-FAMVICNEDPETLIZG5此外，必須針對為了同時檢測4或5個不同色而選定的多色濾光片組進行光譜校準，以產(chǎn)生數(shù)學矩陣來校正染料重疊的熒光發(fā)射譜。這一計算所運用的數(shù)學算法尚未公開。還需要著重注意的是，由單個氬離子激光器、攝譜儀、與CCD相機聯(lián)用的虛擬濾光片組和光譜校準算法組成的用于同時檢測不同熒光染料的ABIPrism 遺傳分析儀的光學設置與其它測序儀或實時PCR熱循環(huán)儀所用的設置具有本質不同。后者具有來通過不同的濾光器組合和短時補償(時間分辨)分析不同染料的多組激發(fā)和發(fā)射濾光器。此外，ABI Prism 遺傳分析儀的具體光學設置也限制了多熒光檢測中不同染料的兼容性。如表1所列，只有幾組熒光染料可用于DNA寡核苷酸的標記和通過應用生物系統(tǒng)公司的DNA自動測序設備進行的同時檢測。由于所使用的單個氬激光器在488nm的激發(fā)最強，這些染料在藍色道到紅色道之間的相對靈敏度顯著降低。此外，各顏色的相對靈敏度和適當?shù)姆治龇蛛x受到光譜重疊的影響。這些染料中有很多(如VIC、HEX、NED、PET、LIZ)是應用生物系統(tǒng)公司專有的，這一事實造成了進一步的限制。用VIC、NED和PET染料標記的定制PCR引物只能通過該公司的合成實驗室獲得，而LIZ只能作為應用生物系統(tǒng)公司的市售產(chǎn)品和帶標記DNA長度標準一起得到。此外，PET和LIZ的化學結構是未知的。因此，出于技術和經(jīng)濟方面的原因，需要新的顏色組合物。

發(fā)明內容
本發(fā)明特別致力于用于DNA序列分析儀的染料組合物，該分析儀使用與特殊的多波長熒光檢測系統(tǒng)聯(lián)用的毛細管電泳裝置。如上所述，這些儀器可用于DNA序列分析、遺傳多態(tài)性(SNP、DIP、STR)的多重基因分型、mRNA表達分析，或更一般地用于擴增DNA片段的長度分析等。本發(fā)明涉及用于檢測熒光標記核酸的熒光染料的替代組合。出乎意料地，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些組合物與現(xiàn)有技術的組合物相比具有優(yōu)異的性能，例如在靈敏度方面。 本發(fā)明的熒光染料組合物克服了已知組合物的許多局限和缺點。染料的相對靈敏度提高， 光譜重疊減少。如本發(fā)明的發(fā)明人在所附實施例中所示，本發(fā)明的染料組合物的積極效果不能從各單個染料的光譜性質檢測得到。具體而言，本發(fā)明涉及對樣品中至少4種用共價連接染料標記的核酸進行同時檢測的方法，包括檢測所述熒光染料激發(fā)后的熒光發(fā)射的步驟，其中一種選自5-FAM或6-FAM 或其混合物的熒光染料與第一核酸共價連接，一種選自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的熒光染料與第二核酸共價連接，一種選自ATTO 550或DY-556的熒光染料與第三核酸共價連接，和一種選自ROX、DY-510XL或ATTO 565的熒光染料與第四核酸共價連接，以及任選地，一種選自DY-632或DY-520XL的熒光染料與第五核酸共價連接。本發(fā)明還涉及用于多重PCR的試劑盒和組合物，包含(i)與選自5-FAM或6-FAM或其混合物的熒光染料共價連接的第一核酸；(ii)與選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532 的熒光染料共價連接的第二核酸；(iii)與選自ATTO 550、DY-555或DY-556的熒光染料共價連接的第三核酸；(iv)與選自R0X、DY_510XL或ATTO 565的熒光染料共價連接的第四核酸。本發(fā)明的范圍還包括至少4種熒光染料的組合物在多重聚合酶鏈反應中的應用， 其中各染料與和側接待擴增基因座的序列基本互補的寡核苷酸引物或和待擴增基因座上的序列基本互補的寡核苷酸探針共價連接，其中 (i)第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，(ii)第二染料選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATT0532，(iii)第三染料選自 ATTO 550 或 DY-556，(iv)第四染料選自 R0X、DY-510XL 或 ATTO 565，以及選自 DY-632 或 DY-520XL，(ν)任選地，第五染料選自DY-632或DY-520XL。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于檢測熒光標記核酸的熒光染料的特定組合物。
具體而言，本發(fā)明涉及對樣品中至少4種用共價連接染料標記的核酸進行同時檢測的方法，包括檢測所述熒光染料激發(fā)后的熒光發(fā)射的步驟，其中一種選自5-FAM或6-FAM 或其混合物的熒光染料與第一核酸共價連接，一種選自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的熒光染料與第二核酸共價連接，一種選自ATTO 550、DY-555或DY-556 的熒光染料與第三核酸共價連接，和一種選自ROX、DY-510XL或ATTO 565的熒光染料與第四核酸共價連接，以及任選地，一種選自DY-632或DY-520XL的熒光染料與第五核酸共價連接。本發(fā)明的一個方面涉及同時檢測擴增反應的擴增產(chǎn)物的方法，包括以下步驟(i)采用和側接基因座的序列基本互補的引物或引物對擴增核酸模板上的三個或三個以上基因座；和(ii)通過熒光檢測熒光標記的擴增產(chǎn)物或通過熒光檢測與所述擴增產(chǎn)物的所述基因座上的序列互補的熒光標記寡核苷酸探針來檢測所述擴增產(chǎn)物，其中熒光染料與所述擴增產(chǎn)物和/或所述寡核苷酸探針和/或所述引物和/或所述引物對中至少一個引物共價連接，并任選地與大小標記共價連接，且其中使用至少4 種不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、DY_555 或 DY-556，第四染料選自 ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或DY-520XL。本發(fā)明還涉及同時檢測核酸擴增反應的擴增產(chǎn)物的方法，包括以下步驟(i)用與側接待擴增序列的引物或引物對擴增三個或三個以上核酸序列；和(ii)直接檢測或利用與所述擴增產(chǎn)物互補的熒光標記寡核苷酸探針間接檢測熒光標記的擴增產(chǎn)物，(iii)任選地，檢測熒光標記的大小標記，其中，各待測序列有不同的熒光染料與所述擴增產(chǎn)物和/或所述寡核苷酸探針和 /或所述引物和/或所述引物對中至少一個引物共價連接，并任選地與大小標記共價連接，且其中使用至少4種不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、 DY-555或DY-556，第四染料選自R0X、DY_510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自 DY-632 或 DY-520XL。在本發(fā)明所述方法的一種具體實施方式
中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自DY-530或ATTO 532，第三染料選自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或DY-520XL。如上所述，本發(fā)明涉及至少4種不同熒光染料的組合物。在上述方法的背景下，這意味著在使用本發(fā)明的一種染料熒光標記的大小標記時，那么根據(jù)所用的4種、5種或更多種不同染料的組合物，可擴增并檢測至少3種核酸序列(即基因座)。若不使用熒光標記的大小標記，那么可擴增并檢測至少4種序列。在上述方法中，為各待擴增(和檢測)序列指定組合物中的一種特定染料，能檢測和區(qū)分各具體擴增產(chǎn)物。本文中的“同時檢測”是指可檢測同一溶液中的多種染料，優(yōu)選在同一時間進行。 因此，可利用例如多個檢測器或濾光器。
本發(fā)明中的“基因座”是待擴增和/或檢測的核酸序列的一部分，所述核酸為例如，染色體、mRNA、質粒、粘粒、DNA或RNA (任何來源的，例如，細菌、病毒、真核、原核、來自植物、真菌或動物，例如人源的)等。本文中的“擴增產(chǎn)物”是擴增反應，例如聚合酶鏈反應的核酸或寡核苷酸產(chǎn)物。例如，它們由擴增所用的引物所定義。本文中的“引物”是指包含與待擴增或轉錄的核酸(“模板”)互補的序列的寡核苷酸。在復制過程中，聚合酶使核苷酸與和模板上相應核苷酸互補的引物的3' -OH端連接。本文中的“寡核苷酸”是指一段核酸，例如RNA或DNA，其包含的序列具有兩個或兩個以上核苷酸，例如2-250個核苷酸，更優(yōu)選2-200個，更優(yōu)選2-100個，更優(yōu)選2_30個，更優(yōu)選2-25個，更優(yōu)選2-20個，更優(yōu)選5-25個，最優(yōu)選10-25個核苷酸。在本方法的第一方面中，在擴增過程中，檢測可采用例如熒光標記的寡核苷酸探針進行?；蛘?，可使用熒光標記的引物。又或者，可使用結合入擴增產(chǎn)物的熒光標記的核苷酸。在該情況中，優(yōu)選每個待擴增或檢測的基因座都在單獨的反應管中進行擴增。隨后，可將擴增產(chǎn)物統(tǒng)一進行檢測。因此，在一些情況中檢測可在擴增過程中進行，例如在聚合酶鏈反應的各循環(huán)后或循環(huán)中和/或在擴增反應完成后。在本方法的第一方面的一種實施方式中，本方法還另外包括在檢測所述擴增產(chǎn)物之前根據(jù)大小或分子量分離擴增產(chǎn)物的步驟。根據(jù)大小或分子量的分離可例如利用電泳例如凝膠電泳或色譜技術進行。擴增反應優(yōu)選選自下組聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、基于轉錄的擴增體系(TAS)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、滾環(huán)擴增(RCA)、轉錄介導的擴增(TMA)、自主序列復制(3SR)、Qi3擴增和(熱穩(wěn)定性)解旋酶依賴性擴增((t)HAD)。更優(yōu)選擴增反應是PCR。最優(yōu)選擴增反應是多重PCR，即在單個管中擴增一種以上目標核酸序列。可同時擴增例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個基因座(目標核酸序列)。如上所述，可例如在同一反應管中同時擴增或例如在不同的反應管中分別擴增核酸序列(即基因座)，。本發(fā)明的方法優(yōu)選同時擴增所述基因座。在同時檢測擴增反應擴增產(chǎn)物的方法的一種具體實施方式
中，擴增反應是實時多重聚合酶鏈反應，所述方法包括以下步驟(i)利用側接所述待擴增序列的引物對同時擴增至少4種核酸序列；(ii)對各待擴增序列采用至少一種寡核苷酸探針檢測所述擴增產(chǎn)物，其中所述寡核苷酸探針與所述擴增產(chǎn)物上的序列基本互補，其中，熒光染料與各寡核苷酸探針共價連接，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料選自ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或DY-520XL。在本發(fā)明的方法一種優(yōu)選實施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-556。在另一種優(yōu)選實施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-555。在另一種優(yōu)選實施方式中，第三染料是ATTO 550。在本方法的一種優(yōu)選實施方式中，第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料選自ROX或DY-510XL。更優(yōu)選地，第四染料是DY-510XL。當使用選自DY-632或DY-520XL的第五染料時，第三染料優(yōu)選ATT0550，第四染料優(yōu)選選自 DY-5IOXL 或 ATTO 565。在本發(fā)明的一些具體實施方式
中，至少一種染料與寡核苷酸大小標記共價連接。 換言之，在一種優(yōu)選實施方式中，至少一種核酸是寡核苷酸大小標記。優(yōu)選地，所述第四核酸為寡核苷酸大小標記。寡核苷酸大小標記是一種大小限定的寡核苷酸或大小限定的寡核苷酸的混合物。在混合物的情況中，所有相同大小的寡核苷酸可與相同的熒光染料連接，或所有寡核苷酸可與相同的熒光染料連接。本發(fā)明還涉及包含以下組分的組合物(i)與選自5-FAM或6-FAM或其混合物的熒光染料共價連接的第一核酸；(ii)與選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532 的熒光染料共價連
接的第二核酸；(iii)與選自ATTO 550、DY-555或DY-556的熒光染料共價連接的第三核酸；和(iv)與選自ROX、DY-510XL或ATTO 565的熒光染料共價連接的第四核酸。在一種具體實施方式
中，所述組合物還包含(ν)與選自DY-632或DY-520XL的熒光染料共價連接的第五核酸。優(yōu)選地，第三染料是ATTO 550，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565。在所述組合物的一種實施方式中，組合物中各核酸是相同等位基因梯的成員。換言之，本發(fā)明在一個方面涉及包含上述標記核酸的組合物的等位基因梯。本發(fā)明的組合物可用作大小標記。在該情況中，各不同核酸具有限定的已知長度。 因此，在所述組合物的一種優(yōu)選實施方式中，至少一種核酸是寡核苷酸大小標記。優(yōu)選地， 所述第四核酸為寡核苷酸大小標記。在本發(fā)明組合物的一種具體實施方式
中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自 DY-530、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、 DY-555或DY-556，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自 DY-632或DY-520XL。在本發(fā)明組合物的另一個具體實施方式
中，第一染料是5-FAM或 6-FAM或其混合物，第二染料選自DY-530或ATTO 532，第三染料選自ATTO 550、DY-555 或DY-556，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或 DY-520XL。本發(fā)明還涉及用于多重PCR的試劑盒，其包含適于共價連接到用于多重PCR的核苷酸、引物、大小標記或寡核苷酸探針的至少4種不同的熒光染料，其中第一染料是5-FAM 或 6-FAM 或其混合物，第二染料選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料選自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料選自R0X、DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或DY-520XL。本發(fā)明在另一方面涉及用于多重PCR的試劑盒，其包含(i)與選自5-FAM或6-FAM或其混合物的熒光染料共價連接的至少一種第一核酸；
(ii)與選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532 的熒光染料共價連
接的至少一種第二核酸；(iii)與選自ATTO 550、DY-555或DY-556的熒光染料共價連接的至少一種第三核酸；和(iv)與選自ROX、DY-510XL或ATTO 565的熒光染料共價連接的至少一種第四核酸。在本發(fā)明試劑盒的具體實施方式
中，所述第一、第二、第三和/或第四核酸可以是探針。這些核酸中的一種或多種還可以是大小標記。具體而言，本發(fā)明的試劑盒是用于多重PCR的試劑盒，其包含(i)至少三種不同的引物對，其中熒光染料與各引物對的至少一種引物共價連接； 和(ii)任選地包含寡核苷酸大小標記，其中熒光染料與所述大小標記共價連接；其中使用至少4種不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、DY_555 或DY-556，第四染料選自R0X、DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632 或DY-520XL。在一種優(yōu)選實施方式中，所述試劑盒包含至少5種不同的熒光染料，其中第三染料是ATTO 550，第四染料選自由DY-510XL或ATTO 565。在本發(fā)明試劑盒的一種具體實施方式
中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自 DY-530、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、 DY-555或DY-556，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自 DY-632或DY-520XL。在本發(fā)明試劑盒的又一種具體實施方式
中，第一染料是5-FAM或 6-FAM或其混合物，第二染料選自DY-530或ATTO 532，第三染料選自ATTO 550、DY-555 或DY-556，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或 DY-520XL。本發(fā)明的范圍還包括至少4種熒光染料的組合物在多重聚合酶鏈反應中的應用， 其中各染料與和側接待擴增基因座的序列基本互補的寡核苷酸引物或和待擴增基因座上的序列基本互補的寡核苷酸探針共價連接，其中(i)第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，(ii)第二染料選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATT0532，(iii)第三染料選自 ATTO 550、DY_555 或 DY-556，(iv)第四染料選自 R0X、DY-510XL 或 ATTO 565，以及選自 DY-632 或 DY-520XL，(ν)任選地，第五染料選自DY-632或DY-520XL。在本發(fā)明所述應用的一種實施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-556。在所述應用的一種實施方式中，第三染料是ATTO 550。 在本發(fā)明所述應用的另一種實施方式中，第三染料是ATTO 550，第四染料選自由 DY-510XL 或 ATTO 565。 在本發(fā)明所述應用的另一種實施方式中，第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料選自ROX或DY-510XL。
當使用選自DY-632或DY-520XL的第五染料時，優(yōu)選第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料是DY-510XL。在至少4種熒光染料的組合物的應用的一種具體實施方式
中，第一染料是5-FAM 或6-FAM或其混合物，第二染料選自DY-530、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料選自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或DY-520XL。在至少4種熒光染料的組合物的應用的另一種具體實施方式
中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自DY-530或ATT0532，第三染料選自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或DY-520XL。在本發(fā)明所述應用的一些實施方式中，一種染料與寡核苷酸大小標記共價連接。本發(fā)明的方法、試劑盒和組合物還可用于法醫(yī)學和親子鑒定。美國專利第6,316,610號和EP 1 155 027 Bl公開了 5_FAM(5_羧基熒光素)和6-FAM(6-羧基熒光素)、HEX(6-羧基-2' ,4,4'，5' ,7,7'-六氯熒光素)、 VIC(2 ‘-氯-7'苯-1，4-二氯-6-羧基熒光素)、NED(2‘-氯 _5 ‘-氟 _7 ‘ ,8'-苯并-1，4-二氯-6-羧基熒光素)和ROX (5-羧基-X-羅丹明)的結構(參見US 6，316，610B2 和 EP 1 155 027 Bl 的圖 3_5)。DY-530、DY-556、DY-510XL、DY-632 和 DY-520XL 的結構分別見附圖IA-E所示。ATTO 565的結構見附圖2所示。CAL Fluor 560 OrangeXAL Fluor Red 590,CAL Fluor Red 610和CALFluor Red 6；35的亞磷酰胺結構分別見附圖3A-D所示。 DY-555 的結構見圖 5 所示。DY-530、DY-556、DY-510XL、DY-632 和 DY-520XL 是德國耶拿的戴歐米克斯公司(Dyomics GmbH, Jena, Germany)的產(chǎn)品。ATTO 532、ATT0550 和 ATTO 565 是德國錫根的 ATTO-TEC 公司(ATTO-TEC GMBH, Siegen,Germany)的產(chǎn)品。VIC、NED、PET 和 LIZ是美國加利福尼亞州福斯特城的應用生物系統(tǒng)公司的產(chǎn)品。CAL Fluor 560 Orange, CAL Fluor Red 590、CALFluor Red 610 和 CAL Fluor Red 635 是美國加利福尼亞州諾瓦托的生物探索技術公司(Biosearch Technologies Inc. , Novato, CA, USA)的產(chǎn)品。本發(fā)明中染料與核苷酸、引物、探針和/或標記的連接可通過技術人員已知的標準偶聯(lián)反應，例如通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯或亞磷酰胺偶聯(lián)實現(xiàn)。本發(fā)明所述熒光染料的具體組合物可用于應用生物系統(tǒng)公司((美國加利福尼亞州福斯特城)的ABI Prism 系列遺傳分析儀(310、3100、3130等)的自動DNA測序裝置。 還可用于使用相同的光學配置進行多波長檢測的其它電泳設備。此外，可使用常規(guī)的實時 PCR設備，例如應用生物系統(tǒng)公司(的ABI Prism 序列檢測系統(tǒng)(SDS)系列、司查塔基公司(Stratagene)(美國加利福尼亞州拉霍亞(La Jolla, CA, USA))的Mx系列或艾本德公司 (Eppendorf)(德國漢堡)的 Mastercycler ep realplex。熒光染料6-FAM、VIC、NED、PET或ROX與LIZ是應用生物系統(tǒng)公司一度最推薦的分別用于多波長檢測試驗中藍、綠、黃、紅和橙色道的染料。本發(fā)明所述熒光染料的具體組合物已與本領域已知組合物進行了比較，如所附實施例3所示具有如下技術優(yōu)勢。本發(fā)明染料組合物的優(yōu)勢特別是其相對靈敏度方面見實施例3的表4所示。與本領域已知的染料組合物相比，獲得了更好的靈敏度，具體而言，ATTO 532、DY-530和CAL Fluor Orange 560與使用VIC的組合物相比靈敏度更好。比較而言，ATTO 550所得結果比NED好，DY-510XL比 PET好。因此，發(fā)現(xiàn)新的染料組合物顯著改善了綠、黃和紅色標記的PCR擴增子的靈敏度。這為設計靈敏的多重PCR提供了更多的靈活度，特別是在法醫(yī)學領域(例如污點檢測)和臨床應用(例如癌癥和產(chǎn)前診斷)中。新的綠、黃和紅色染料還可與已知的兼容染料聯(lián)用， 例如，組合物 6-FAM、VIC、ATT0 550 和 ROX 或 6-FAM、VIC、ATTO 550、PET 和 DY-632 (數(shù)據(jù)未顯示)。可采用其它組合物。此外，鑒定出染料DY-632和DY-520XL可替代LIZ用于新的內部長度標準的合成。 實施例2和4顯示就DY-632而言此類標準在60-380bp范圍內(增幅20bp)的可行性。如實施例1和3所示，無法通過觀察熒光染料的光譜數(shù)據(jù)(例如，最大吸收和發(fā)射、消光系數(shù))來確定它們對多重核酸檢測的染料組合物的適用性。熒光染料的具體組合物的選擇不能僅從各染料的光譜性質推斷得到。如上所述，ABI Prism 遺傳分析儀具有獨特的設置。所述設備的光學規(guī)格尚未完全公開(例如，虛擬濾光片組中數(shù)字帶通濾波器的確切位置、校正染料重疊熒光發(fā)射光譜的算法)。在DNA序列自動裝置的檢測單元中在電泳條件下進行記錄之前，熒光染料的光譜數(shù)據(jù)都不存在，特別是來自應用生物系統(tǒng)公司的染料。因此，無法根據(jù)標準化公開染料光學性質(最大激發(fā)和發(fā)射、量子產(chǎn)率等)或其它設備(例如實時熱循環(huán)儀)的推薦選擇和ABI Prism 遺傳分析儀兼容的染料組合物，而是必須在適當?shù)倪\行(緩沖液、pH)和檢測條件 (虛擬濾光片組、光譜校準)進行評估(見實施例1)。此外，必須確保共價標記的PCR擴增子在毛細管電泳中產(chǎn)生具有精確大小分辨率的單個片段峰。對于只能以非對映異構體混合物形式得到的熒光染料來說，有時并非如此。對于這一事實，按廠商所述為三種非對映異構體的混合物的染料ATTO 550令人感興趣并出乎意料地在50-400堿基范圍內產(chǎn)生明顯的單個擴增子的峰。最后，所有染料在所有應用條件(例如，寡核苷酸合成、寡核苷酸純化、PCR 和毛細管電泳)下必須具有化學和物理穩(wěn)定性。必須憑經(jīng)驗評估各種無法測知性因素。為此，詳細描述了新的基于PCR的染料組合物的評估試驗(實施例3)。附圖簡述

圖1 來自戴歐米克斯公司(德國耶拿)的熒光染料的結構。(A)DY_530游離羧酸， (B)DY-556NHS 酯、一鈉鹽，(C)DY-632 游離酸、二鈉鹽，(D)DY-510XL 游離羧酸，(E)DY_520XL 羧酸。在(A)、(C)、⑶和(E)的情況中，游離羧基用于寡核苷酸5'端的NHS偶聯(lián)。圖2 來自ATTO-TEC公司(德國錫根)的熒光染料的結構。(A)ATTO 565 (高氯酸鹽)NHS酯，(B)ATTO 550，一種非對映異構體的游離酸。游離羧基用于寡核苷酸5'端的 NHS偶聯(lián)。圖3 來自生物探索技術公司(美國加利福尼亞州諾瓦托)的熒光染料的結構。 (A)CAL Fluor Orange 560， (B)CAL Fluor Red 590， (C)CAL Fluor Red 610， (D)CAL Fluor Red 6；35。ift·異丙基，CE β-氰基乙基。圖4:通過多重PCR擴增和具有重疊片段范圍的4種短串聯(lián)重復(STR)的基因分型進行人DNA序型分析。所示電泳圖顯示堿基對[bp]表示的片段大小上6-FAM、DY-530、 ATTO 550、DY-510-XL和DY-632染料的相對熒光單位(RFU)。如實施例4所述，從500pg基因組DNA開始進行多重PCR和基因分型。利用內部DY-632標記的大小標準品計算片段大小(底部的電泳圖)。在各電泳圖的底部空白處標注了 STR基因座的名稱及其片段范圍。圖5 熒光染料DY-555(戴歐米克斯公司(德國耶拿))的結構。DY-555的NHS酯， 氯化鹽的結構。實施例實施例1 記錄溶于電泳緩沖液中的熒光染料標記的寡核苷酸的光譜數(shù)據(jù)熒光染料的光譜特性受到溶劑系統(tǒng)、緩沖液組成和PH值的顯著影響。通常，未偶聯(lián)熒光染料的公開光譜數(shù)據(jù)由染料生產(chǎn)商在水或有機溶劑如甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中記錄。很少得到在限定的PCR緩沖液中測得的數(shù)據(jù)，且此前沒有用DNA序列自動裝置的檢測單元在電泳條件下記錄的數(shù)據(jù)，特別是本發(fā)明關注的那些來自應用生物系統(tǒng)公司(美國加利福尼亞州福斯特城)的染料。此外，已知熒光染料的光譜特性在與寡核苷酸偶聯(lián)后會改變。在服務性實驗室(例如，比利時瑟蘭的友基公司(Eurogentec SA, Seraing, Belgium)；美國加利福尼亞州福斯特城的應用生物系統(tǒng)公司)，通過標準的亞磷酰胺化學法合成寡核苷酸引物。熒光染料通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯偶聯(lián)(Giusti WG,Adriano T. “5'-熒光染料標記的寡核苷酸的合成和表征(Synthesis and characterization of 5 ' -fluorescent-dye-labeled oligonucleotides)，，· PCR Methods Appl 2:223-227, 1993)或標準的亞磷酰胺化學法(Theisen P,McColIum C，Andrus Α. “寡核苷酸的熒光染料亞憐酉先胺標記(Fluorescent dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides)，，· Nucleic Acids Symp Ser 27，pp. 99-100，1992)與寡核苷酸的5'端共價連接。所有引物在服務性實驗室通過離子對反相高效液相色譜或聚丙烯酰胺凝膠電泳按照標準方法純化， 溶于TE-緩沖液(IOmM Tris/HCl，室溫調至pH 8. O, ImM EDTA)至100 μ M濃度，4°C避光保存直至進一步使用。分別將寡核苷酸稀釋20倍和2000倍以便進行紫外/可見光(UV/Vis)光譜和熒光測定，測定在ABI Prism 遺傳分析儀的毛細管電泳凝膠緩沖液中進行，其由IOOmM N-[三-(羥甲基)-甲基-3-氨基]-丙磺酸(TAPS) /NaOH (pH 8. 0，室溫下調節(jié))，8M尿素和 5% 2-吡咯燒酮組成(Rosenblum BB, Oaks F,Menchen S，Johnson B. “改善的毛細管電泳中HilDNA白勺ffiff石角(Improved single-strand DNA sizing accuracy in capillary electrophoresis.) "Nucleic Acids Res，25，pp. 3925-3929，1997)。用 SPEC0RD S 100 Bio UV/VIS-分光光度計(德國耶拿的耶拿艾納立提克公司(Analytik Jena AG, Jena, Germany))記錄200nm到700nm之間的吸收光譜。用SPEX Fluorolog _3熒光分光光度計(美國紐約州愛迪生的荷瑞巴JY公司(H0RIBA Jobin Yvon Inc, Edison, NY, USA))分析熒光光譜。使用與ABI Prism 遺傳分析儀氬激光器的主發(fā)射波長對應的488nm的激發(fā)波長，并記錄520nm到700nm之間的發(fā)射光譜。表2 不同熒光染料在其最大發(fā)射時的最大發(fā)射和相對信號高度。染料標記的寡核苷酸(引物WB 94，DNA序列5'-[染料]-AGATTGTACTGAGAGTG-3')以相同濃度溶于 ABI Prism 遺傳分析儀的毛細管電泳凝膠緩沖液中。使用488nm的激發(fā)波長。將測得的最大激發(fā)和發(fā)射與文獻數(shù)據(jù)比較。記錄最大發(fā)射的信號高度(RFU，相對熒光單位)。將6-FAM 的信號高度設為100%以便計算相對信號高度。
權利要求
1.一種同時檢測樣品中用共價連接染料標記的至少4種核酸的方法，所述方法包括檢測所述熒光染料在激發(fā)后的熒光發(fā)射的步驟，其中(i)選自5-FAM或6-FAM或其混合物的熒光染料與第一核酸共價連接；(ii)選自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532 的熒光染料與第二核酸共價連接；(iii)選自ATTO550、DY-555或DY-556的熒光染料與第三核酸共價連接；和(iv)選自R0X、DY-510XL或ATTO565的熒光染料與第四核酸共價連接；和(ν)任選地，選自DY-632或DY-520XL的熒光染料與第五核酸共價連接。
2.如權利要求1所述的同時檢測核酸擴增反應的擴增產(chǎn)物的方法，其特征在于，其包括以下步驟(a)用側接待擴增序列的引物或引物對擴增3種或3種以上核酸序列；和(b)對熒光標記的擴增產(chǎn)物進行直接檢測或者利用與所述擴增產(chǎn)物互補的熒光標記寡核苷酸探針間接檢測，(c)任選地，檢測熒光標記的大小標記，其中，各待測序列有不同的熒光染料與所述擴增產(chǎn)物和/或所述寡核苷酸探針和/或所述引物和/或所述引物對中至少一個引物共價連接，并任選地與大小標記共價連接，且其中使用至少4種不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、DY_555 或 DY-556，第四染料選自R0X、DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632或 DY-520XL。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述擴增反應選自下組聚合酶鏈反應 (PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、基于轉錄的擴增體系(TAS)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、滾環(huán)擴增(RCA)、轉錄介導的擴增(TMA)、自主序列復制(3SR)、Qi3擴增和(熱穩(wěn)定性)解旋酶依賴性擴增((t)HAD)。
4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述核酸序列是同時擴增的。
5.如權利要求2-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述擴增反應是多重PCR。
6.如權利要求2-5中任一項所述的方法，其特征在于，其還包括在檢測所述擴增產(chǎn)物之前根據(jù)大小或分子量分離所述擴增產(chǎn)物的步驟。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述擴增反應是實時多重聚合酶鏈反應，且所述方法包括以下步驟(i)利用側接所述待擴增序列的引物對同時擴增至少4種核酸序列；( )對各待擴增序列采用至少一種寡核苷酸探針檢測所述擴增產(chǎn)物，其中所述寡核苷酸探針與所述擴增產(chǎn)物上的序列基本互補，其中，熒光染料與各寡核苷酸探針共價連接且采用至少4種不同染料，其中第一染料是 5-FAM 或 6-FAM 或其混合物，第二染料選自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、DY-555 或 DY-556，第四染料選自 R0X、DY-510XL 或 ATTO 565， 且任選地，第五熒光染料選自DY-632或DY-520XL。
8.如權利要求2-6中任一項所述的方法，其特征在于，至少一種核酸是寡核苷酸大小標記。
9.一種組合物，其包含(i)與選自5-FAM或6-FAM或其混合物的熒光染料共價連接的第一核酸；(ii)與選自DY-530、HEX、CALFluor Orange 560或ATTO 532的熒光染料共價連接的第二核酸；(iii)與選自ATTO550、DY-555或DY-556的熒光染料共價連接的第三核酸；和(iv)與選自R0X、DY-510XL或ATTO565的熒光染料共價連接的第四核酸。
10.如權利要求9所述的組合物，其特征在于，其還包含(ν)與選自DY-632或DY-520XL的熒光染料共價連接的第五核酸。
11.如權利要求10或11所述的組合物，其特征在于，至少一種核酸是寡核苷酸大小標記。
12.如權利要求10或11所述的組合物，其特征在于，各核酸是相同的等位基因梯的成員O
13.一種用于多重PCR的試劑盒，其包含(i)與選自5-FAM或6-FAM或其混合物的熒光染料共價連接的至少一種第一核酸；(ii)與選自DY-530、HEX、CALFluor Orange 560或ATTO 532的熒光染料共價連接的至少一種第二核酸；(iii)與選自ATTO550、DY-555或DY-556的熒光染料共價連接的至少一種第三核酸；和(iv)與選自R0X、DY-510XL或ATTO565的熒光染料共價連接的至少一種第四核酸。
14.如權利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述第一、第二、第三和/或第四核酸是探針或引物。
15.如權利要求13所述用于多重PCR的試劑盒，其特征在于，其包含(i)至少3種不同的引物對，其中熒光染料與各引物對的至少一種引物共價連接；和(ii)任選地包含寡核苷酸大小標記，其中熒光染料與所述大小標記共價連接； 其中使用至少4種不同熒光染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自 DY-530、HEX、CAL Fluor 0range560 或 ATTO 532，第三染料選自 ATTO 550、DY-555 或DY-556，第四染料選自R0X、DY-510XL或ATTO 565，且任選地，第五熒光染料選自DY-632 或DY-520XL。
16.如權利要求13-15中任一項所述的試劑盒，其特征在于，其包含至少5種不同的熒光染料，其中第三染料是ATTO 550，第四染料選自DY-510XL或ATTO 565。
17.至少4種熒光染料的組合物在多重聚合酶鏈反應中的應用，其中各染料與和側接待擴增基因座的序列基本互補的寡核苷酸引物或和待擴增基因座上的序列基本互補的寡核苷酸探針共價連接，其中(i)第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，(ii)第二染料選自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，(iii)第三染料選自ATTO 550 或 DY-555、DY-556，(iv)第四染料選自R0X、DY-510XL 或 ATTO 565，以及選自 DY-632 或 DY-520XL， (ν)任選地，第五染料選自DY-632或DY-520XL。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于分子生物學，特別是多重PCR中的熒光染料組合物。具體而言，本發(fā)明涉及用于擴增反應的染料組合物，其中使用至少4種不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料選自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料選自ATTO550、DY-555或DY-556，第四染料選自ROX、DY-510XL或ATTO 565，并任選地，第五熒光染料選自DY-632或DY-520XL。
文檔編號C12Q1/68GK102232118SQ200980149121
公開日2011年11月2日 申請日期2009年12月1日 優(yōu)先權日2008年12月1日
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