專利名稱：基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及汞離子濃度檢測范圍，特別是基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法。
背景技術(shù)：
汞是環(huán)境中重金屬污染的重要元兇之一，是一種具有嚴重生物毒性的化學(xué)物質(zhì)，由于其具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性，使汞成為目前最受關(guān)注的環(huán)境污染物之一，尤其是溶解態(tài)的Hg2+具有較高的化學(xué)活性和穩(wěn)定性，是排入環(huán)境水體中污染物的主要存在形式，對細胞具有腐蝕性和致癌性，因此發(fā)展無污染的、簡便快速、高靈敏度和高特異性的方法進行汞離子的檢測成為必要，開發(fā)和研究新的檢測汞離子的材料和方法成為熱點。隨著指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)的發(fā)展和應(yīng)用，越來越多的對祀分子具有親和性和特異性的核酸適體從大容量的寡核苷酸庫中篩選獲得，研究發(fā)現(xiàn)，一個汞離子能特異地和兩個胸腺嘧啶堿基(T)共價結(jié)合形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，利用這一原理，已經(jīng)建立了多種基于熒光信號轉(zhuǎn)變的檢測萊離子的方法，如Akira Ono等設(shè)計了一條富含堿基(T)的寡核苷酸序列,其5’端標記有猝滅素，3’端標記有熒光素，當(dāng)汞離子存在時，由于T-Hg2+-T的結(jié)合作用而使寡核苷酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致3’端和5’端靠近引起熒光猝滅從而對汞離子進行定量測定(Akira Ono, Humika Togashi. Angew. Chem. , 2004, 116: 4400 4402)。而 Wang Z D 也是利用T-Hg2+-T的結(jié)合原理設(shè)計了發(fā)夾結(jié)構(gòu)的汞離子的寡核苷酸適體，通過熒光強度的上升定量檢測汞離子(Wang Z D, Lee J H, Lu Y. Chem. Commun., 2008，45: 6005 6007)。采用源于鎳離子RNA核酸適體的堿基序列合成的DNA堿基序列，再對它的部分堿基進行改造后獲得新的汞離子核酸適體，并設(shè)計與該汞離子核酸適體匹配的互補序列Q2，建立新的熒光信號轉(zhuǎn)變機制，利用它們檢測汞離子殘留，目前未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于打破之前固有的基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)建立的檢測方法和模式，開創(chuàng)汞離子新型的核酸適體，并利用熒光信號轉(zhuǎn)化機制建立新的檢測汞離子的方法，并將其應(yīng)用于環(huán)境水中汞離子檢測，達到快速、簡便、準確、樣品需求量少的檢測目的。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法，是以標記有熒光基團FAM的汞離子核酸適體與標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列構(gòu)成熒光檢測體系，其特征在于所述的汞離子核酸適體為源于鎳離子RNA核酸適體的堿基序列合成的DNA堿基序列SEQ ID N0. 7中截取的第23位至第44位堿基序列，并對該部分堿基序列進行改造后獲得，獲得的汞離子核酸適體是由27 28個堿基組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，所述互補序列Q2的堿基序列為SEQ ID N0. I ;熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法為
a)將以標記有熒光基團FAM的汞離子核酸適體和標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2按照濃度比1: 2^4投放在bufferA緩沖液中，經(jīng)過變性和復(fù)性，以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，進行熒光檢測，記錄熒光強度； b)將含有不同濃度汞離子的標樣分別加入含有復(fù)合物的bufferA緩沖液，經(jīng)過變性和復(fù)性，萊尚子與互補序列Q2競爭結(jié)合核酸適體，以485nm為激發(fā)波長,535nm為發(fā)射波長,分別進行熒光檢測，記錄與不同濃度汞離子標樣對應(yīng)的熒光強度，建立標準曲線，確定該復(fù)合物的相關(guān)系數(shù)、最小檢出限以及線性檢測范圍，建立與線性檢測范圍對應(yīng)的線性方程；
c)向含有復(fù)合物的bufferA緩沖液中加入待測物質(zhì)，經(jīng)過變性和復(fù)性，待測物質(zhì)中的萊尚子與互補序列Q2競爭結(jié)合核酸適體，以485nm為激發(fā)波長,535nm為發(fā)射波長,進行突光檢測，記錄待測物質(zhì)的熒光強度；
d)將待測物質(zhì)的熒光強度與線性檢測范圍的標準曲線進行對照，通過標準曲線確定或通過線性方程計算得到待測物質(zhì)中的汞離子殘留量；
所用 bufferA 緩沖液的成分為50mM NaCl+7mM MgC12+50mM Tris/HCl, bufferA 緩沖液的 ΡΗ=7· 5 ；
所述的變性和復(fù)性是指在94°C變性5分鐘，然后在25°C復(fù)性30分鐘。在本發(fā)明中，對堿基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指保留堿基序列SEQ ID N0. 7的第23位至第44位堿基，將保留段的第14位堿基A用堿基GC替換，然后在5’端增加堿基GG，在3’端增加堿基CCG，并將保留段中所有堿基U全部替換成堿基T，獲得汞離子核酸適體NI，汞離子核酸適體NI的堿基序列為SEQ ID N0. 2 ；由汞離子核酸適體NI與互補序列Q2在bufferA緩沖液中構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9993，最小檢出限為O. 625ppm，線性檢測范圍I. 25_20ppm。在本發(fā)明中，對堿基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指再以汞離子核酸適體NI的堿基序列SEQ ID N0. 2為基礎(chǔ)，將SEQ ID N0. 2的第13 22位堿基全部替換成堿基T，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位堿基，獲得汞離子核酸適體N4，其堿基序列為SEQ ID N0. 3，由汞離子核酸適體N4與互補序列Q2所構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9703，最小檢出限為O. 156ppm，線性檢測范圍O. 3125_5ppm。在本發(fā)明中，對堿基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指再以汞離子核酸適體NI的堿基序列SEQ ID N0. 2為基礎(chǔ)，將SEQ ID N0. 2的第13 22位堿基替換為TCTTCTTGTT，再剪切SEQ ID N0. 2的剪切第28位堿基，獲得汞離子核酸適體N5，其堿基序列為SEQ ID Ntj. 4，由汞離子核酸適體N5與互補序列Q2所構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9909，最小檢出限為O. 078ppm，線性檢測范圍O. 156-2. 5ppm。在本發(fā)明中，對堿基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指再以汞離子核酸適體NI的堿基序列SEQ ID N0. 2為基礎(chǔ)，將SEQ ID N0. 2的第13 22位堿基替換為TTTCCCCTTTT，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位堿基，獲得汞離子核酸適體N6，其堿基序列為SEQ ID N0. 5，由汞離子核酸適體N6與互補序列Q2所構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9932，最小檢出限為O. 156ppm，線性檢測范圍O. 3125_5ppm。在本發(fā)明中，對堿基序列SEQ ID N。. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指再以汞離子核酸適體NI的堿基序列SEQ ID N0. 2為基礎(chǔ)，將SEQ ID N0. 2的第13 22位堿基替換為TTTGGGGTTTT再剪切SEQ ID N0. 2的第28位堿基，獲得汞離子核酸適體N7，其堿基序列為SEQ ID N0. 6，由汞離子核酸適體N7與互補序列Q2在bufferA緩沖液中構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9583，最小檢出限為O. 156ppm，線性檢測范圍O. 625-lOppm。在本發(fā)明中，所述的將以標記有熒光基團FAM的汞離子核酸適體和標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2按照濃度比1: 2^4投放在bufferA緩沖液中形成復(fù)合物是指汞離子核酸適體的5’端標記熒光基團FAM，互補序列Q2的3’端標記有猝滅基團DABCYL，它們按照濃度比為1: 2^4的比例投放在bufferA緩沖液中，94°C變性5分鐘，25°C下復(fù)性30分鐘后，它們之間通過氫鍵的結(jié)合作用在bufferA緩沖液中形成復(fù)合物；所述的以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，進行熒光檢測是指取出檢測對象50 μ I置于96微孔板中利用熒光檢測儀器進行檢測。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明涉及的汞離子核酸適體是源于鎳離子的改造核酸適體，它具有由27 28個堿基，擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，對汞離子具有較好的結(jié)構(gòu)識別功能，基于堿基T與汞離子特異性結(jié)合的機理，在對汞離子核酸適體的改造過程中，強化了堿基Τ，加強了核酸適體與汞離子的結(jié)合活性，因此本發(fā)明涉及的核酸適體同時兼有對汞離子結(jié)構(gòu)識別和堿基結(jié)合功能。本發(fā)明的優(yōu)點還在于本發(fā)明采用熒光標記寡核苷酸建立熒光檢測汞離子的方法，并將其應(yīng)用于環(huán)境水中加標檢測，具有背景值小，檢測信號高，檢測體系穩(wěn)定，抗基質(zhì)干擾能力強，檢測體系及樣品需求量少(每個樣各需50 μ 1)，檢測總時間為45分鐘，檢測通量可達30樣/板(以96孔，I個樣做3個重復(fù)計算)，汞離子的最低檢出限為78ppb。


圖I汞離子核酸適體NI和鎳離子核酸適體DNAl-B的DNA 二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)。其中a為汞離子核酸適體NI ；b為鎳離子核酸適體DNAl-B
圖2是核酸適體NI熒光猝滅體系的熒光強度變化值與汞離子濃度的關(guān)系。圖3是核酸適體NI改造后的幾種DNA 二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中a為核酸適體N4 ;b為核酸適體N5 ；c為核酸適體N6 ；d為核酸適體N7。圖4是改造后適體熒光猝滅體系的熒光強度變化值與汞離子濃度的關(guān)系。圖5是核酸適體N5熒光猝滅體系與不同金屬離子結(jié)合后熒光強度變化值。圖6鎳離子核酸適體DNAl-IB和汞離子核酸適體N5建立的檢測體系與汞離子作用的比較。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的描述。實施例I
汞離子核酸適體NI的構(gòu)建
首先按照文獻報道的鎳離子RNA核酸適體的堿基序列參照文獻Hofmann, H P, Limmer S，Hornung V, Sprinzl M. RNA, 1997，3: 1289 1300 記載的方法合成其 DNA 序列，其堿基序列為SEQ ID N0. 7
5， -AUAGUCAGGGAACAUGACAAACACAGGGACUUGCGAAAAUCAGUGUUUUG -3'該堿基序列自定義為DNAl-B。構(gòu)建汞離子核酸適體NI時，保留DNAl-B的第23位至第44位堿基，將保留段第14位堿基A (相當(dāng)于DNAl-B的第36位堿基)用GC替換(使該處增加了一位堿基)，最后在5’端增加堿基GG，同時在3’端增加堿基CCG，并將保留段中所有堿基U全部替換成堿基T，即得到汞離子核酸適體NI，其堿基序列為SEQ ID N0. 2
5’ - GGACAGGGACTTGCGGCAAATCAGTCCG-3’。NI和DNAl-B的二級結(jié)構(gòu)見圖I，其中，NI擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，
實施例2
利用核酸適體NI建立熒光檢測體系
合成與核酸適體NI的互補序列Q2，其堿基序列為SEQ ID N0. I
5’ -GTCCCTGTCC-3’ ；
配制 bufferA 緩沖液50mM NaCl+7mM MgCl2+50mM Tris/HCl，緩沖液的 PH=7. 5 ；
熒光基團FAM，由上海捷瑞生物公司合成，并將它標記在核酸適體NI的5’端；
熒光猝滅基團DABCYL，由上海捷瑞生物公司合成，并將它標記在互補序列Q2的3’端。將標記有熒光基團FAM的核酸適體NI和標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2分別以濃度比1:(T4 (核酸適體NI的終濃度為50nmol/L、互補序列Q2的終濃度依次分別為0、50、100、150、200nmol/L)投放在bufferA緩沖液中反應(yīng)30分鐘，在bufferA緩沖液中存在標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2時，它們會形成處于部分熒光猝滅或熒光猝滅狀態(tài)的復(fù)合物，以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，對室溫(25°C)下直接反應(yīng)30分鐘的復(fù)合物(非變性)進行熒光檢測(作為對照組)，在94°C變性5分鐘，然后在室溫(25°C)下復(fù)性30分鐘再檢測，分別將熒光強度結(jié)果記錄在表I中，在表I中，F(xiàn)表示標記有熒光基團FAM的核酸適體NI，Q表示標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2。表I Q2與NI結(jié)合的濃度比及結(jié)合方式對熒光猝滅效率的影響
非變性 Normal變性 Denainration
"q ^熒光強度 I猝滅效率(％) ^焚光優(yōu)度^猝滅效率(^)
Fluorescence Quenching Fluorescence Quenching __tensity__effect (° o)__tensity__effect (°o)_
09946-67=3 73,62__0__10504=148.16__0_
17137.33z14SJ7 28,24__4SS6.4=6S.13__53J8
23S 16=^02 __61-63__11114^55.59__89.42
3lS08=413.iS__S1S2__S20.27=3S.41__92.19
756=6.9394.00T65.33=47,2Q [ 92,72
由表I可見，當(dāng)Q/F比值為2，經(jīng)過變性復(fù)性過程的熒光猝滅效率達到89. 42%，熒光猝滅程度接近90%，因此，當(dāng)Q/F比值為應(yīng)該大于或等于2，即標記有熒光基團FAM的核酸適體NI和標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2分別以濃度比在1:2飛之間為宜，鑒于當(dāng)Q/F比值為3，經(jīng)過變性復(fù)性過程的熒光猝滅效率達到92. 19%，熒光猝滅程度趨于飽和，因此選擇這一參數(shù)為最佳條件。實施例3
核酸適體NI通過不同濃度汞離子建立的檢測標準曲線。
熒光檢測體系的構(gòu)建方法與實施例2相同將NI與Q2按照1:3的比例混勻在bufferA緩沖液體系中(NI終濃度為150nmol/L、Q2終濃度為450nmol/L)。94°C變性5分鐘，25°C下孵育30分鐘，從體系中取出50u I,測定其熒光強度；然后再分別依次加入50 u I的汞離子標準液，汞離子濃度從160ppm到
0.156ppm進行2倍梯度稀釋，并以等體積的bufferA緩沖液作為對照。5分鐘后，在激發(fā)光波長495nm、發(fā)射光波長535nm下測各個孔的熒光強度。標準曲線見圖2，由圖2可見，核酸適體Ni與互補序列Q2所構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為0. 9993，最小檢出限為0. 625ppm，線性檢測范圍I. 25-20ppm。實施例4
基于核酸適體NI的幾種改進
將核酸適體NI的第13 22位堿基全部替換成堿基T，再剪切NI的第28位堿基，獲得核酸適體N4，核酸適體N4保留了核酸適體NI的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)(見圖3中的a)，擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，其堿基序列為SEQ ID N0. 3
5’ - GGACAGGGACTTTTTTTTTTTTAGTCC -3’。對核酸適體NI的第13 22位堿基替換為TCTTCTTGTT，再剪切NI的剪切第28位堿基，獲得核酸適體N5，核酸適體N5保留了核酸適體NI的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)(見圖3中的b)，擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，其堿基序列為SEQ ID N0. 4
5’ - GGACAGGGACTTTCTTCTTGTTAGTCC -3’。對核酸適體NI的第13 22位堿基替換為TTTCCCCTTTT (在這個區(qū)段相比NI增加了一位堿基)，再剪切NI的第28位堿基，獲得核酸適體N6，核酸適體N6保留了核酸適體NI的莖結(jié)構(gòu)(見圖3中的C)，擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，其堿基序列為SEQ IDN0. 5
5’ - GGACAGGGACTTTTTCCCCTTTTAGTCC -3’。對核酸適體NI的第13 22位堿基替換為TTTGGGGTTTT (在這個區(qū)段相比NI增加了一位堿基)，再剪切NI的第28位堿基，獲得核酸適體N7，核酸適體N7保留了核酸適體NI的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)(見圖3中的d)，擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，其堿基序列為SEQ ID N0. 6
5’ - GGACAGGGACTTTTTGGGGTTTTAGTCC -3’。實施例5
NI的幾種改進核酸適體通過不同濃度汞離子建立的檢測標準曲線 按照Q/F比值為3建立含有復(fù)合物的bufferA緩沖液。檢測標準曲線的構(gòu)建方法與實施例3相同，幾種改進核酸適體的檢測標準曲線分別如下
核酸適體N4的檢測標準曲線記錄在圖4a中，由圖4a可見，它對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為0. 9703，最小檢出限為0. 156ppm，線性檢測范圍0. 3125_5ppm。核酸適體N5的檢測標準曲線記錄在圖4b中，由圖4b可見，它對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為0. 9909，最小檢出限為0. 078ppm，線性檢測范圍0. 156-2. 5ppm。核酸適體N6的檢測標準曲線記錄在圖4c中，由圖4c可見，它對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為0. 9932，最小檢出限為0. 156ppm，線性檢測范圍0. 3125_5ppm。
核酸適體N7的檢測標準曲線記錄在圖4d中，由圖4d可見，它對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為0. 9583，最小檢出限為0. 156ppm，線性檢測范圍0. 625-10ppm。由圖4和圖6可見，核酸適體N5建立的檢測體系的線性檢測范圍為
0.156-2. 5ppm，檢測靈敏度最高，說明核酸適體N5與核酸適體NI及另外3個由核酸適體NI改造后的核酸適體相比，它對汞離子具有更強的識別作用。實施例6 汞離子與其適體結(jié)合的特異性檢測
為了考察本發(fā)明的選擇性，配置了 5ppm的各個金屬離子溶液，分別加入N5熒光猝滅體系中，再記錄熒光強度變化值。具體過程如下N5與Q2按照1:3的比例混勻在bufferA緩沖液體系中(NI終濃度為150nmol/L、Q2終濃度為450nmol/L)，94°C變性5分鐘，25°C下孵育30分鐘后，取出50iU于13個孔中測熒光強度，再分別依次加入50iU的bufferA、50 ill 的 5ppm 的 Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cd2+、Ni2+、Pb2+、Cr2+、As2+、Hg2+，5 分鐘后，測熒光強度，然后再于前12個空中均加入50iil、5ppm的Hg2+，記錄熒光強度變化值。如圖5所示，在所有待檢測的金屬離子中，只有Hg2+能使熒光強度明顯上升，其他金屬離子不起作用，但是當(dāng)在其他金屬離子中加入Hg2+后，熒光強度又明顯上升，說明該方法對Hg2+具有良好的選擇性。實施例7
采用實施例4改造的N5為核酸適體，采用實施例2的互補序列Q2作為核酸適體N5的互補序列。以實施例I中自定義的DNAl-B為對照核酸適體，其堿基序列為SEQ ID N0. 7，同時合成與核酸適體DNAl-B的對照互補序列Q1-B，其堿基序列為SEQ ID N0. 8
5’ -ATGTTCCCTGACTAT-3’。使用的熒光基團FAM、熒光猝滅基團DABCYL和緩沖液均與實施例2相同。將熒光基團FAM分別標記在核酸適體N5和對照核酸適DNAl-B的5’端，將熒光猝滅基團DABCYL分別標記在互補序列Q2和對照互補序列Ql-B的3’端。將標記有熒光基團FAM的核酸適體N5和對照核酸適體DNAl-B分別與其匹配的標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2和對照互補序列Ql-B按照物質(zhì)的濃度比為1:3混勻到緩沖液中(N5和DNAl-B終濃度為150nmol/L、Q2和Ql-B終濃度為450nmol/L)，分別建立各自獨立的熒光檢測體系，在94°C變性5分鐘，然后在25°C復(fù)性30分鐘后，取出50 U I于3個孔中測熒光強度，然后再分別依次加入50iU的bufferA緩沖液、5ppm Hg2+、20ppmHg2+，10分鐘后測熒光強度，同時N5作為對照，與DNAl-B做相同處理。如圖6所示，隨著Hg2+濃度的提高，DNAl-B熒光猝滅體系的熒光強度并沒有明顯變化，與不加Hg2+的一致，而N5熒光猝滅體系熒光值隨著Hg2+濃度的提高而不斷顯著升高，說明DNAl-B對汞離子無識別能力。觀察圖I中NUDNAl-B和圖3b中N5的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)盡管三者都具有莖環(huán)構(gòu)成的二級結(jié)構(gòu)，甚至NI的大部分堿基序列與DNAl-B相同，但由于核酸適體NI及N5擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，它們與鎳離子核酸適體DNAl-B的莖環(huán)結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其不能特異性識別汞離子，說明NI及其改造后的適體所特有的堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖是識別汞離子的活性部位。實施例8利用實施例4獲得 的檢測標準曲線，對待測物進行檢測
采集江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院池塘水，將其通過0. 22 y m的濾膜過濾后，添加Hg2+標準液，配置成含終濃度分別為4ppm、2ppm、lppm Hg2+的水樣品，再與實施例7中建立的N5的熒光檢測體系反應(yīng)，測定熒光強度變化值。在N5的熒光檢測體系中加入待測物質(zhì)，在94°C變性5分鐘，然后在25°C復(fù)性30分鐘，以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，進行熒光檢測，記錄待測物質(zhì)的熒光強度；
如表2所示，池塘水樣品中標準Hg2+回收率為85-90. 5%，準確性較好，
說明池塘水中的雜質(zhì)對本發(fā)明檢測Hg2+的干擾很小。將待測物質(zhì)的熒光強度與實施例5獲得的與N5的熒光檢測體系對應(yīng)的線性檢測范圍的標準曲線進行對照，通過標準曲線確定或通過線性方程計算得到待測物質(zhì)中的汞離子殘留量。表2池塘水樣中Hg2+加標回收檢測結(jié)果__
權(quán)利要求
1.一種基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法，是以標記有熒光基團FAM的汞離子核酸適體與標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列構(gòu)成熒光檢測體系，其特征在于所述的汞離子核酸適體為源于鎳離子RNA核酸適體的堿基序列合成的DNA堿基序列SEQ ID N0. 7中截取的第23位至第44位堿基序列，并對該部分堿基序列進行改造后獲得，獲得的汞離子核酸適體是由27 28個堿基組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，所述互補序列Q2的堿基序列為SEQ ID N0. I ;熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法為 a)將以標記有熒光基團FAM的汞離子核酸適體和標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2按照濃度比1: 2^4投放在bufferA緩沖液中，經(jīng)過變性和復(fù)性，以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，進行熒光檢測，記錄熒光強度； b)將含有不同濃度汞離子的標樣分別加入含有復(fù)合物的bufferA緩沖液，經(jīng)過變性和 復(fù)性，萊尚子與互補序列Q2競爭結(jié)合核酸適體，以485nm為激發(fā)波長,535nm為發(fā)射波長,分別進行熒光檢測，記錄與不同濃度汞離子標樣對應(yīng)的熒光強度，建立標準曲線，確定該復(fù)合物的相關(guān)系數(shù)、最小檢出限以及線性檢測范圍，建立與線性檢測范圍對應(yīng)的線性方程； c)向含有復(fù)合物的bufferA緩沖液中加入待測物質(zhì)，經(jīng)過變性和復(fù)性，待測物質(zhì)中的萊尚子與互補序列Q2競爭結(jié)合核酸適體，以485nm為激發(fā)波長,535nm為發(fā)射波長,進行突光檢測，記錄待測物質(zhì)的熒光強度； d)將待測物質(zhì)的熒光強度與線性檢測范圍的標準曲線進行對照，通過標準曲線確定或通過線性方程計算得到待測物質(zhì)中的汞離子殘留量； 所用 bufferA 緩沖液的成分為50mM NaCl+7mM MgC12+50mM Tris/HCl, bufferA 緩沖液的 ΡΗ=7· 5 ； 所述的變性和復(fù)性是指在94°C變性5分鐘，然后在25°C復(fù)性30分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法，其特征在于對堿基序列SEQ ID Ntj. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指保留堿基序列SEQ ID N0. 7的第23位至第44位堿基，將保留段的第14位堿基A用堿基GC替換，然后在5’端增加堿基GG，在3’端增加堿基CCG，并將保留段中所有堿基U全部替換成堿基T，獲得汞離子核酸適體NI，汞離子核酸適體NI的堿基序列為SEQ ID Ntj. 2;由汞離子核酸適體NI與互補序列Q2在bufferA緩沖液中構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9993，最小檢出限為O. 625ppm，線性檢測范圍I. 25_20ppm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法，其特征在于對堿基序列SEQ ID Ntj. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指以汞離子核酸適體NI的堿基序列SEQ ID N0. 2為基礎(chǔ)，將SEQ ID N0. 2的第13 22位堿基全部替換成堿基T，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位堿基，獲得汞離子核酸適體N4，其堿基序列為SEQ ID N0. 3，由汞離子核酸適體N4與互補序列Q2在bufferA緩沖液中構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9703，最小檢出限為O. 156ppm，線性檢測范圍O. 3125_5ppm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法，其特征在于對堿基序列SEQ ID Ntj. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指以汞離子核酸適體NI的堿基序列SEQ ID N0. 2為基礎(chǔ)，將SEQ ID N0. 2的第13 22位堿基替換為TCTTCTTGTT，再剪切SEQ ID N0. 2的剪切第28位堿基，獲得汞離子核酸適體N5，其堿基序列為SEQ ID N0. 4，由汞離子核酸適體N5與互補序列Q2在bufferA緩沖液中構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9909，最小檢出限為O. 078ppm，線性檢測范圍O. 156-2. 5ppm。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法，其特征在于對堿基序列SEQ ID %. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指以汞離子核酸適體NI的堿基序列SEQ ID N0. 2為基礎(chǔ)，將SEQ ID N0. 2的第13 22位堿基替換為TTTCCCCTTTT，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位堿基，獲得汞離子核酸適體N6，其堿基序列為SEQ ID N0. 5，由汞離子核酸適體N6與互補序列Q2在bufferA緩沖液中構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9932，最小檢出 限為O. 156ppm，線性檢測范圍O. 3125_5ppm。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法，其特征在于對堿基序列SEQ ID %. 7中的第23位至第44位堿基進行改造是指以汞離子核酸適體NI的堿基序列SEQ ID N0. 2為基礎(chǔ)，將SEQ ID N0. 2的第13 22位堿基替換為TTTGGGGTTTT再剪切SEQ ID N0. 2的第28位堿基，獲得汞離子核酸適體N7，其堿基序列為SEQ ID N0. 6，由汞離子核酸適體N7與互補序列Q2在bufferA緩沖液中構(gòu)成的復(fù)合物對汞離子殘留量的相關(guān)系數(shù)為O. 9583，最小檢出限為O. 156ppm，線性檢測范圍O. 625_10ppm。
7.根據(jù)權(quán)利要求f6之一所述的基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號轉(zhuǎn)變機制檢測汞離子殘留的方法，其特征在于所述的將以標記有熒光基團FAM的汞離子核酸適體和標記有熒光猝滅基團DABCYL的互補序列Q2按照濃度比1:2 4投放在bufferA緩沖液中形成復(fù)合物是指汞離子核酸適體的5’端標記熒光基團FAM，互補序列Q2的3’端標記有猝滅基團DABCYL,它們按照濃度比為1: 2^4的比例投放在bufferA緩沖液中，94°C變性5分鐘，25 V下復(fù)性30分鐘后，它們之間通過氫鍵的結(jié)合作用在bufferA緩沖液中形成復(fù)合物；所述的以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，進行熒光檢測是指取出檢測對象50 μ I置于96微孔板中利用熒光檢測儀器進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于核酸適體結(jié)構(gòu)及熒光信號轉(zhuǎn)變的機制檢測汞離子殘留的方法，是以標記有熒光素分子的汞離子核酸適體與標記有猝滅素的互補序列構(gòu)成熒光檢測體系，其中汞離子核酸適體由27~28個堿基組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，擁有堿基GGAC和GTCC共價結(jié)合形成的莖，互補序列Q2的堿基序列為SEQIDNO.1；熒光檢測體系檢測汞離子殘留的方法為加入系列濃度的汞離子與互補序列Q2競爭結(jié)合核酸適體，根據(jù)熒光信號的變化來建立標準曲線，確定最低檢出限和線性范圍，然后對待測樣品進行加標檢測，根據(jù)標準曲線判斷樣品中汞離子含量。本方法快速簡單，具有較高的靈敏度和選擇性，樣品需求量少，適用于實際樣品中汞離子的檢測。
文檔編號G01N21/64GK102621120SQ201210095340
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者劉媛, 劉賢金, 張存政, 雷兆靜 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院