專利名稱：一株具有完全反硝化酶系的兼性厭氧反硝化細菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有完全反硝化酶系的兼性厭氧反硝化細菌及其用途，屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和人們生活水平的提高，我國含氮污染物的排放量迅速增力口，大小水體成為這些污染物的“收容所”，水體質(zhì)量急劇惡化。目前，全國各地已經(jīng)建立起了一大批廢水生物處理工程，有效地遏制了水質(zhì)污染持續(xù)惡化的勢頭。但是，污水二級處理后的排放水含氮量依然較高，儼然成為一個嚴重的環(huán)境污染源。在二級生化處理后出水中氨氮和硝態(tài)氮是氮的主要存在形式。氮素污染會對水環(huán)境以及人們的生產(chǎn)生活造成嚴重的的危害，主要表現(xiàn)在(1)加速水體的富營養(yǎng)化；(2)增加給水處理的困難；(3)消耗水體中的溶解氧；(4)對水生生物有毒害作用。因此，必須加大對污水中氮素的治理。對于氮素污染的治理，生物脫氮是最經(jīng)濟有效的治理技術(shù)。生物脫氮技術(shù)通常由 硝化工藝和反硝化工藝組成。硝化工藝以去除氨氮為主，雖然能夠把氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，但是不能徹底將氮素從水體中除去；反硝化工藝則能從根本上消除水體氮素對環(huán)境的污染。反硝化作用是反硝化細菌以硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮為終端電子受體，在反硝化酶系的作用下通過電子傳遞，將硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮逐步還原為氮氣的過程。從N03_還原到N2的脫氮反應(yīng)通常由以下四步組成N03— NO2 — NO — N2O — N2一般在缺氧的情況下，兼性厭氧反硝化菌首選硝酸鹽進行其呼吸作用，將Ν03_-Ν還原為N2,生化反應(yīng)式為N(V+6H.+5e-=l/2N2 (g) +3H20反硝化細菌是反硝化作用發(fā)生的主體，探明反硝化細菌的種屬及特性，搞清它們的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，將有助于廢水生物脫氮工藝的研究、開發(fā)和應(yīng)用。細菌的反硝化是在各種還原酶的催化作用下完成的，各反應(yīng)酶系的活性高低受溫度、PH值、溶解氧、C/N比等條件的影響。理論上講，反硝化作用要求C/N為4. 6 (質(zhì)量比)，但由于細胞的生長繁殖也會消耗溶解性有機碳，實際情況下，要求C/N>4. 6。因此，多數(shù)情況下，可溶性有機碳成為水環(huán)境中反硝化作用的限制因子。PH值也是影響反硝化速率和反硝化終產(chǎn)物的一個重要的環(huán)境因子。對反硝化細菌的生長來說，最佳PH值為6. 5 7. 5。在此pH范圍內(nèi)，反硝化速率最大，當pH值不在最佳范圍時，反硝化速率降低。廢水生物處理中的反應(yīng)溫度，對微生物的生長、繁殖關(guān)系密切，溫度支配著酶反應(yīng)動力學、微生物生長速度以及化合物的溶解度等，因而對污染物的降解轉(zhuǎn)化起著關(guān)鍵作用，溶解氧(DO)的存在對反硝化過程有很大影響。如果反應(yīng)器的溶解氧過多，將會對反硝化菌的異化作用發(fā)生抑制作用。因此考察溫度、pH、溶解氧、C/N比等因素對反硝化菌株發(fā)揮高效反硝化活性的影響，進而獲得高效反硝化菌株，實現(xiàn)廢水高效經(jīng)濟脫氮，對解決日益嚴重的水環(huán)境氮素污染問題具有重要意義。
許多細菌具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的酶，可實現(xiàn)第一步轉(zhuǎn)化，但要完成徹底脫氮，則要求細菌必須具有完整的反硝化酶系。探明反硝化細菌是否具有完整又高效的反硝化酶系是采用生物反硝化工藝脫氮的先決條件。研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明細菌具有完整的反硝化酶系，能夠高效去除水體中的氮素，將硝態(tài)氮還原為氮氣排出體外，實現(xiàn)廢水高效脫氮，為解決日益嚴重的含氮廢水對環(huán)境的污染問題作出貢獻。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上問題，本發(fā)明的目的是提供一株具有完整反硝化酶系的高效兼性厭氧反硝化細菌。該細菌具有完全的反硝化酶系，能夠徹底脫除水體中的氮素，不產(chǎn)生NO、N2O等有害氣體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)條件，使該細菌能夠表現(xiàn)出更強的異養(yǎng)反硝化活性。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)條件，使該細菌表現(xiàn)出完全的反硝化活性。本發(fā)明可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明中的菌種是一株兼性厭氧反硝化細菌，該菌株命名為施氏假單胞菌xp-2，Pseudomonas stutzeri xp_2,屬于施氏假單胞菌，已于2011年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO M 2011431。其菌學特征為細胞呈短桿狀，革蘭氏陰性菌，菌落圓形、淺黃色、中凹、有光澤、邊緣整齊。該菌株能夠利用多種碳源，其中以乙酸鈉為最適碳源。適宜溫度在10 30°C的微氧條件下進行脫氮,最佳C/N (mol/mol)為3，適合的pH值范圍為6. O 9. O。在此條件下脫氮，無亞硝酸鹽積累。該菌株能夠有效脫除水體中的氮元素，適用于較高濃度亞硝酸鹽或硝酸鹽廢水的處理，該菌株具有廣泛的適應(yīng)性。其最佳脫氮條件為溫度10 30°C，pH 6. O 9. 0，最佳C/N為3，溶解氧為微溶氧條件(< O. 5mg/L)。具體應(yīng)用時，使用方法為(I)使用前用LB培養(yǎng)基活化菌株將斜面培養(yǎng)基上保存的施氏假單胞菌XP-2用接種環(huán)刮取I環(huán)菌苔，接種入裝有IOOmL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C搖床震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)12h，即可獲得菌液。(2)將活化后的菌液接種于待處理的含氮廢水中，投加量為受處理廢水體積的10%，pH值范圍在7. O 9. O之間，室溫靜置培養(yǎng)，定時取樣檢測水樣中硝氮去除情況及亞硝酸鹽的積累情況。(3)檢測方法CODcr :重鉻酸鉀法；TN :過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法；NO3--N :紫外分光光度法；NO2--N N- (I-萘基)-乙二胺光度法。OD值采用UV-2450紫外分光光度計(Shimadzu)，在波長600nm下測定培養(yǎng)液的OD值。本發(fā)明的菌株是從南四湖香蒲植物根際土壤中篩選得到的一種具有高效脫氮活性的反硝化細菌，可以通過反硝化作用脫除水體中的亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮。該菌株具有完全的反硝化能力，能夠?qū)⑾鯌B(tài)氮逐步還原為氮氣排出水體，適用于較高濃度亞硝酸鹽或硝酸鹽廢水的處理，該菌株具有廣泛的碳源譜，能夠利用多種碳源，具有廣泛的適用性。使用該菌株處理廢水工藝簡單，脫氮徹底，效果穩(wěn)定，節(jié)約運行成本。本發(fā)明中的脫氮是指水體中無機氮的去除，無機氮是指NH4+、NO3--N和Ν02--Ν。本發(fā)明中的C/N比是指碳元素與氮元素的物質(zhì)的量之比。本發(fā)明中的微溶氧條件是指廢水在靜置且接觸空氣的條件下，溶解氧濃度在
0.5mg/L 以下。本發(fā)明的菌株具有以下優(yōu)點( I)本發(fā)明菌株具有完全的反硝化酶系，能夠?qū)⑾鯌B(tài)氮直接還原為氮氣，實現(xiàn)徹底脫氮且不污染空氣。
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(2)本發(fā)明菌株具有非常高的反硝化活性，可用于處理較高濃度亞硝酸鹽或硝酸鹽廢水。(3)本發(fā)明菌株具有廣泛的碳源譜，能夠利用多種碳源，具有很好的適應(yīng)性。


本發(fā)明的菌株命名為施氏假單胞菌xp-2 Pseudomonas stutzeri xp-2,屬于施氏假單胞菌，已于2011年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為=CCTCCNO M 2011431。圖I :假單胞菌XP-2菌體的掃描電鏡照片。圖2 :假單胞菌XP-2的生長曲線和總氮去除率。
具體實施例方式實施例I本發(fā)明菌株的分離鑒定(I)培養(yǎng)基A、菌株分離、純化、保藏培養(yǎng)基(/L):CH3COONa, 2g ;蛋白胨，15g ;酵母膏，3g ;葡萄糖，Ig ；NaCl，6g ;瓊脂，12g ；ΚΝ03,
1.5g ；pH 控制在 7. 0 7. 2。B、菌株篩選、脫氮培養(yǎng)基(DM :Denitrifying Medium) (/L)CH3COONa, 2g ；KH2PO4,0. 4g ；MgS04 · 7H20，0. 6g ；CaCl2 · 2H20，0. 07g ；KN03, Ig ；Tris緩沖液12mL ;微量元素2mL ；pH控制在7. 0 7. 2。C、LB 培養(yǎng)基(/L ):蛋白胨，IOg ;酵母膏，5g ;氯化鈉，IOg ;pH控制在7. 5。(2)假單胞菌XP-2菌株的分離、純化稱取IOg香蒲植物根際土壤樣品置于250mL三角瓶中，加IOOmL無菌水及幾粒玻璃珠，搖床振蕩15min使土樣分散均勻。待土樣分散后,靜置5min后，吸取ImL 土壤懸液至9mL稀釋液(無菌水)，得到10_2稀釋度懸液，依次按10倍稀釋法稀釋至10_7，由此制得各稀釋度土壤懸液。分別吸取各稀釋度懸液O. ImL至反硝化細菌分離用固體培養(yǎng)基上(已放置過夜，無雜菌生長)，用玻璃刮刀將土壤懸液涂布均勻。之后將平板倒置，放入30°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至長出明顯菌落。挑取單菌株，在平板上多次劃線純化本發(fā)明中的假單胞菌XP-2，直至顯微鏡下觀察顯示無雜菌為止，此時可認為菌株已純化完畢。分離出的菌株在含有硝酸鹽的固體培養(yǎng)基上生長良好，具有潛在的反硝化特性，接種至斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?3)假單胞菌XP-2的硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗為了解本發(fā)明菌株的反硝化能力和特性，對本發(fā)明菌株進行硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗。接種于小試管(規(guī)格15mmX 100mm)中加入IOmL滅菌的反硝化液體培養(yǎng)基，用接種環(huán)挑取純化后的菌落I環(huán)至小試管中，攪拌混勻。之后加入ImL的滅菌后的液體石蠟封口。以未接種菌株的試管作為空白對照。制作完畢后將所有試管一同置入30°C恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后，觀察發(fā)現(xiàn)石蠟與培養(yǎng)基之間有氣泡生成，證明本發(fā)明菌株具有反硝化能力。 (4)假單胞菌XP-2的菌落形態(tài)特征在培養(yǎng)基A上培養(yǎng)2天后，長出圓形菌落、淺黃色、中凹、有光澤、邊緣整齊。(5)假單胞菌XP-2的菌體形態(tài)特征掃描電鏡觀察表明菌體呈短桿狀，550nm 640nmX IlOOnm 2000nm。(6) 16S rDNA 的 PCR 擴增與測序?qū)嶒瀮x器小型離心機(Eppendorf,轉(zhuǎn)速>12000r/min);電泳儀(北京六一儀器廠)；PCR熱循環(huán)擴增儀(Eppendorf);凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。實驗方法從菌株XP-2的新鮮斜面上直接挑取菌體，加入至含100 μ L雙蒸水的離心管中，旋渦混勻后，熱裂解菌懸液，以基因組DNA為模板擴增16S rDNA，擴增引物為一對通用引物。正向引物為27F :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；反向引物為1492R :5’ -GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。PCR反應(yīng)在50yL體系中進行。反應(yīng)體系的組成為模板DNA (50ng/μ L) 2 μ L ;dNTP混合物4 μ L ； TaqDNA聚合酶O. 25yL;正向引物2yL;反向引物2yL;雙蒸水
34.75 μ L0PCR 擴增條件95°C變性 5min ；95°C 30s, 55°C 45s, 72°C Imin 30s，循環(huán) 30 次；72°C延伸10min，4°C保存。用1%的瓊脂糖凝膠對菌株的16S rDNA擴增產(chǎn)物做電泳檢測，驗證后切下膠條，用DNA凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)純化PCR產(chǎn)物。回收后的PCR擴增產(chǎn)物委托山東省農(nóng)科院高新技術(shù)中心進行測序。(7) 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析測序后得到XP-2菌株的16S rDNA長度為1430bp的序列，提交到Genbank與其他菌株進行比對，發(fā)現(xiàn)菌株XP-2與Pseudomonas sp.的進化距離最為接近,確定其屬于假單胞菌屬，命名為施氏假單胞菌xp_2 Pseudomonas stutzeri xp_2。實施例2本發(fā)明菌株的培養(yǎng)( I)所使用的培養(yǎng)基A、菌株保藏培養(yǎng)基(/L):蛋白胨，5g ;酵母膏，3g ;葡萄糖，Ig ；NaCl,6g ;瓊脂，12g ；KNO3,1. 5g ；pH 控制在 7. O 7. 2。
B、菌株反硝化培養(yǎng)基(DM :Denitrifying Medium) (/L) CH3C00Na,2g ；ΚΗ2Ρ04,0. 4g ；MgS04 · 7H20，0. 6g ；CaCl2 · 2H20，0. 07g ；KN03, Ig ；Tris 緩沖液 12mL ;微量元素 2mL ；pH控制在7. 0 7. 2。上述培養(yǎng)基使用前，121 °C，滅菌20分鐘。(2)培養(yǎng)條件將在保藏培養(yǎng)基斜面上保存的假單胞菌XP-2用接種環(huán)刮取I環(huán)菌苔，接種入裝有IOOmL已滅菌的LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C恒溫振蕩培養(yǎng)12h，即可獲得種子液。實驗時，按10%的接種量將種子液接種于反硝化培養(yǎng)基或是廢水中。實施例3本發(fā)明菌株的最佳脫氮條件將IOOmL已滅菌的反硝化培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶中，按照10%的接種量接入種子菌液，靜置培養(yǎng)。在10 30°C范圍內(nèi)，假單胞菌XP-2能夠去除80%以上的總氮，在25°C 時總氮去除率最高，達95%。本發(fā)明菌株適應(yīng)的pH值在6 9之間，能夠?qū)⒓s140mg/L的總氮降到10mg/L以下，且沒有亞硝酸鹽積累。本發(fā)明菌株的最適C/N (mol/mol)比為3，當C/N > 3時，總氮的去除率能達90%以上。靜置培養(yǎng)的微溶解氧環(huán)境最適合于本發(fā)明菌株反硝化活性的發(fā)揮。實施例4本發(fā)明菌株具有完全的反硝化酶系在IL的三角瓶中裝滿接種了 10%種子液的反硝化培養(yǎng)基，密封瓶口，室溫下靜置培養(yǎng)。用氣體收集袋收集實驗過程中釋放的氣體，然后通過氣象色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(GC-MS)分析氣體成分。結(jié)果顯示該氣體分子量為28，且與氮氣的相似度最高，推斷該氣體為N2，無其他氣體。證明本發(fā)明菌株具有完全的反硝化酶系，能夠?qū)⑾鯌B(tài)氮直接還原為N2,能夠發(fā)揮完全的反硝化活性，沒有NO、N2O等有毒有害中間產(chǎn)物氣體的生成。因此，本菌株適宜于工程應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一株具有完全反硝化酶系的兼性厭氧反硝化細菌，其特征在于該菌株命名為Pseudomonas sp. XP-2，屬于假單胞菌屬，已于2011年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCM2011431。
2.權(quán)利要求I所述的具有完全反硝化酶系的兼性厭氧反硝化細菌在廢水脫氮中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于脫氮條件為溫度為10 301，？!1值6 9，C/N ^ 3，溶解氧為微溶氧條件。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于脫氮條件為溫度為25認？!1值6 9，(^為3，溶解氧為微溶氧條件。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于具體應(yīng)用方式為 (1)用LB培養(yǎng)基活化菌株將斜面培養(yǎng)基上保存的假單胞菌XP-2用接種環(huán)刮取I環(huán)菌苔，接種入裝有IOOmL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C搖床震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)12h，即可獲得菌液； (2)將活化后的菌液接種于待處理的含氮廢水中，投加量為受處理廢水體積的10%，pH值范圍在7. (T9. O之間，室溫靜置培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明為一株具有完全反硝化酶系的兼性厭氧反硝化細菌，該菌株命名為Pseudomonassp.XP-2，屬于假單胞菌屬，保藏編號為CCTCC M 2011431。最佳脫氮溫度在10-30℃。該菌株適應(yīng)的pH值在6～9之間，具有高效的反硝化活性。當C/N(mol/mol)比值大于等于3時，該菌株的脫氮率達90%以上。該菌株在微溶氧的環(huán)境條件下，脫氮活性最高。反硝化的終產(chǎn)物氣體為氮氣，說明該菌株具有完全的反硝化能力，能夠?qū)⑺w中硝氮、亞硝氮等無機氮直接還原為無害的氮氣排出水體。該菌株具有廣泛的碳源譜，能夠利用多種碳源。通過對此菌株的性能檢測可以看出，使用其處理含氮廢水工藝簡單，處理效果高效穩(wěn)定，節(jié)約運行成本，且不會產(chǎn)生NO、N2O等溫室氣體，不會造成空氣污染。
文檔編號C12R1/38GK102899263SQ20121020167
公開日2013年1月30日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者裴海燕, 胡文容, 紀雁 申請人:山東大學