本申請(qǐng)含有已經(jīng)以ASCII格式電子遞交的序列表并且該序列表通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。所述ASCII副本創(chuàng)建于2015年5月21日，名稱(chēng)為OX40F-101W01_SL.txt并且大小為31,496字節(jié)。背景OX40(CD134；TNFRSF4)是主要存在于活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和自然殺傷(NK)細(xì)胞上的腫瘤壞死因子受體(克羅夫特(Croft)等人，2009，免疫學(xué)評(píng)論(ImmunolRev)，229：173-91)。OX40具有一個(gè)已知的內(nèi)源性配體，OX40配體(OX40L；CD152；TNFSF4)，該OX40配體以三聚體的形式存在，并且可以使OX40聚集，在T細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致有效的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件(克羅夫特(Croft)等人，2009，免疫學(xué)評(píng)論(ImmunolRev)，229：173-91)。在活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞上通過(guò)OX40發(fā)信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生的增強(qiáng)、顆粒酶和穿孔素釋放、以及效應(yīng)和記憶T細(xì)胞池的擴(kuò)增(延森(Jensen)等人，2010，腫瘤學(xué)研討會(huì)(SeminOncol)，37：524-32)。另外，OX40在Treg細(xì)胞上發(fā)信號(hào)抑制Treg的擴(kuò)增，關(guān)閉Treg的誘導(dǎo)和阻斷Treg抑制性功能(Voo等人，2013，免疫學(xué)雜志(JImmunol)，191：3641-50；Vu等人，2007，血液(Blood)，110：2501-10)。免疫組織化學(xué)研究和早期流式細(xì)胞術(shù)分析表明，OX40在浸潤(rùn)寬范圍的人類(lèi)癌癥的T細(xì)胞上表達(dá)(巴魯阿(Baruah)等人，2011，免疫生物學(xué)(Immunobiology)，217：668-675；柯蒂(Curti)等人，2013，癌癥研究(CancerRes)，73：7189-98；蘭丹尼(Ladanyi)等人，2004，臨床癌癥研究(ClinCancerRes)，10：521-30；佩蒂(Petty)等人，2002，美國(guó)外科雜志(AmJSurg)，183：512-8；Ramstad等人，2000，美國(guó)外科雜志(AmJSurg)，179：400-6；Sarff等人，2008，美國(guó)外科雜志(AmJSurg)，195：621-5，討論625；韋托(Vetto)等人，1997，美國(guó)外科雜志(AmJSurg)，174：258-65)。在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上的OX40表達(dá)與若干種人類(lèi)癌癥中的較長(zhǎng)生存期相關(guān)，表明OX40信號(hào)可在建立抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵的作用(蘭丹尼(Ladanyi)等人，2004，臨床癌癥研究(ClinCancerRes)，10：521-30；佩蒂(Petty)等人，2002，美國(guó)外科雜志(AmJSurg)，183：512-8)。在各種非臨床小鼠腫瘤模型中，OX40的激動(dòng)劑，包括抗體和OX40配體融合蛋白，已被成功地應(yīng)用并具有有希望的結(jié)果(Kjaergaard等人，2000，癌癥研究(CancerRes)，60：5514-21；恩德洛武(Ndhlovu)等人，2001，免疫學(xué)雜志(JImmunol)，167：2991-9；溫伯格(Weinberg)等人，2000，免疫學(xué)雜志(JImmunol)，164：2160-9)。共刺激T細(xì)胞通過(guò)OX40促進(jìn)抗腫瘤活性在一些情況下是持久的，針對(duì)隨后的腫瘤挑戰(zhàn)提供持久的保護(hù)(溫伯格(Weinberg)等人，2000，免疫學(xué)雜志(JImmunol)，164：2160-9)。Treg細(xì)胞抑制和效應(yīng)T細(xì)胞的共刺激被證明對(duì)于OX40激動(dòng)劑的腫瘤生長(zhǎng)抑制是必要的(Piconese等人，2008，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(JExpMed)，205：825-39)。通過(guò)與疫苗、化療、放療、和免疫療法組合，已探索許多策略和技術(shù)以提高OX40激動(dòng)劑治療的抗腫瘤效果(延森(Jensen)等人，2010，腫瘤學(xué)研討會(huì)(SeminOncol)，37：524-32；梅萊羅(Melero)等人，2013，臨床癌癥研究(ClinCancerRes)19：997-1008)。概述本披露涉及多肽亞基，每一個(gè)作為融合多肽都包括OX40配體(OX40L)的受體結(jié)合域、三聚結(jié)構(gòu)域和人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域，這些多肽亞基能夠形成穩(wěn)定的多聚體(例如，六聚體蛋白)。提供的組合物和方法對(duì)于癌癥免疫治療是有用的。本披露提供一種單鏈多肽亞基，該單鏈多肽亞基包括：人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域；功能性三聚結(jié)構(gòu)域；和OX40L的受體結(jié)合域。在某些方面中，所提供的多肽亞基可以自組裝成三聚體或六聚體蛋白。在某些方面中，該多肽亞基包括(從氨基末端到羧基末端)人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域，隨后是三聚結(jié)構(gòu)域，隨后是OX40L受體結(jié)合域。人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域的羧基末端可以直接融合到三聚結(jié)構(gòu)域的氨基末端，且三聚結(jié)構(gòu)域的羧基末端可以直接融合到OX40L受體結(jié)合域的氨基末端。在本披露提供的多肽亞基的進(jìn)一步方面中，IgG4Fc結(jié)構(gòu)域包括IgG4鉸鏈區(qū)，其可以包括賦予完整的重鏈間二硫鍵形成的突變，例如，根據(jù)歐盟編號(hào)在位置228處絲氨酸至脯氨酸的突變(S228P)。在某些方面中，該鉸鏈區(qū)包括SEQIDNO:4的氨基酸1至12。人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域還可以包括CH2區(qū)，和/或CH3區(qū)。在某些方面中，人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:4的氨基酸1至229。由本披露提供的三聚結(jié)構(gòu)域可包括α-螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域、或它們的組合。例如，三聚結(jié)構(gòu)域可起源于TRAF2；血小板反應(yīng)蛋白1；母系蛋白(Matrilin)-4；CMP(母系蛋白-1)；HSF1；和吞飲受體(Cubilin)。在某些方面中，該三聚結(jié)構(gòu)域包括人TRAF2三聚結(jié)構(gòu)域。在某些方面中，TRAF2三聚結(jié)構(gòu)域包括人TRAF2(SEQIDNO:2)的氨基酸310至349。在本披露提供的多肽亞基的另外方面中，OX40L受體結(jié)合域可以包括人OX40L(SEQIDNO:1)的氨基酸51至183。在某些方面中，由本披露提供的多肽亞基可以自組裝成可以特異性結(jié)合于人OX40的六聚體融合蛋白。在某些方面中，該多肽亞基包括氨基酸序列SEQIDNO:4。如在此提供的多肽亞基可進(jìn)一步包括相關(guān)的異源劑。在此提供的異源劑可以是通過(guò)肽鍵融合到該多肽亞基的異源多肽。異源多肽可融合(例如)至IgG4-Fc結(jié)構(gòu)域的N-末端、至OX40L的受體結(jié)合域的C末端、在該IgG4-Fc結(jié)構(gòu)域的C-末端和三聚結(jié)構(gòu)域的N-末端之間，或在三聚結(jié)構(gòu)域的C-末端和OX40L的受體結(jié)合域的N-末端之間。在某些方面中，異源劑可以化學(xué)地軛合于多肽亞基，并且可以是，例如細(xì)胞毒性分子、穩(wěn)定劑、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、或可檢測(cè)的藥劑。在某些方面中，本披露提供了可被用作對(duì)照的多肽亞基。例如，本披露提供了多肽亞基，其中OX40L受體結(jié)合域包括人OX40L(SEQIDNO:1)的氨基酸51至183，除了在位置180處苯丙氨酸至丙氨酸的取代(F180A)之外。從這個(gè)多肽亞基自組裝的六聚體融合蛋白不能夠結(jié)合至人OX40。在某些方面中，這個(gè)對(duì)照多肽亞基包括氨基酸序列SEQIDNO:6。在某些方面中，本披露提供了包括三個(gè)如在此提供的多肽亞基的三聚體蛋白。本披露提供包括六個(gè)如上所述的多肽亞基的六聚體蛋白。在某些方面中，該六個(gè)多肽亞基每一個(gè)包括氨基酸序列SEQIDNO:4。典型的六聚體融合蛋白是OX40LIgG4P融合蛋白。在某些方面中，如由本披露提供的六聚體蛋白可以特異性結(jié)合至OX40，該OX40在來(lái)自人、食蟹猴和/或恒河猴的活化的CD4+或CD8+T細(xì)胞中表達(dá)。例如，該六聚體蛋白可以特異性結(jié)合至OX40，該OX40在來(lái)自人、食蟹猴和/或恒河猴的活化的CD4+T細(xì)胞中表達(dá)。在某些方面中，對(duì)在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞中表達(dá)的人OX40的結(jié)合親和力是約1.0pM至約8.0pM，例如，約3.6pM，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，該六聚體蛋白在約0.5至約3.0pM(例如，約1.8pM)處可實(shí)現(xiàn)在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上20％受體占有率(EC20)，在約3.0至約10pM處(例如，約6.6pM)可實(shí)現(xiàn)在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上50％受體占有率(EC50)，并且在約35至約70pM處(例如，約53pM)可實(shí)現(xiàn)在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上90％受體占有率(EC90)，所有均如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，如由本披露提供的六聚體蛋白具有針對(duì)在OX40過(guò)量表達(dá)的尤爾卡特(Jurkat)細(xì)胞上表達(dá)的人OX40的、為約1.0pM至約24pM(例如，約12pM)的結(jié)合親和力，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，六聚體蛋白質(zhì)在OX40過(guò)量表達(dá)的尤爾卡特細(xì)胞上在約1.0至15pM(例如，約7.2pM)處可實(shí)現(xiàn)EC20，在OX40過(guò)量表達(dá)的尤爾卡特細(xì)胞上在約1.0至40pM(例如，約16pM)處可實(shí)現(xiàn)EC50，并且在OX40過(guò)量表達(dá)的尤爾卡特細(xì)胞上在約10至100pM(例如，約57pM)處可實(shí)現(xiàn)EC90，所有均如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，如由本披露提供的六聚體蛋白具有針對(duì)在初級(jí)活化的食蟹猴CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的食蟹猴OX40的、為約1.0pM至約50pM(例如，約24pM)的結(jié)合親和力，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，如本披露所提供的六聚體蛋白具有針對(duì)在初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的恒河猴OX40的、為約1.0pM至約50pM(例如，約21pM)的結(jié)合親和力，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，在基于平板的測(cè)定法中，如本披露所提供的六聚體蛋白可誘導(dǎo)活化的CD4+T細(xì)胞的劑量依賴(lài)性增殖和來(lái)自活化的CD4+T細(xì)胞的劑量依賴(lài)性細(xì)胞因子釋放。在某些方面中，在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞中在約1.0pM至約15pM(例如，8.0pM)的六聚體蛋白濃度處可實(shí)現(xiàn)20％最大增殖應(yīng)答(EC20)，在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞中在約5.0pM至約25pM(例如，14pM)的六聚體蛋白濃度處可實(shí)現(xiàn)50％最大增殖應(yīng)答(EC50)，并且在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞中在約50pM至約65pM(例如，57pM)的六聚體蛋白濃度處可實(shí)現(xiàn)90％最大增殖應(yīng)答(EC90)，所有如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，六聚體蛋白可誘導(dǎo)IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70和/或IL-1β的劑量依賴(lài)性釋放。在某些方面中，釋放的細(xì)胞因子包括IFNγ、TNFα、IL-5、和/或IL-10。在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白在初級(jí)活化的食蟹猴CD4+T細(xì)胞中和在初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放。在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白在FcγR表達(dá)細(xì)胞的存在下可激活在表達(dá)OX40的T細(xì)胞中的NFκB途徑。例如，表達(dá)OX40的T細(xì)胞可以是表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB螢光素酶報(bào)告細(xì)胞，該尤爾卡特NFκB螢光素酶報(bào)告細(xì)胞在響應(yīng)于NFκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的刺激中產(chǎn)生熒光素酶。由這些細(xì)胞表達(dá)的OX40可以是，例如，人OX40，食蟹猴OX40或恒河猴OX40。在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白，當(dāng)作為有效劑量被給予至需要癌癥治療的受試者時(shí)，可在受試者中抑制腫瘤生長(zhǎng)，例如，在T細(xì)胞的存在下。在某些方面中，與給予同種型匹配的對(duì)照相比，腫瘤生長(zhǎng)可被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％。在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白可通過(guò)結(jié)合至OX40來(lái)誘導(dǎo)活化的、表達(dá)OX40的CD4+T細(xì)胞的增殖，但基本上不觸發(fā)針對(duì)活化的CD4+T細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性或抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。例如，在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白不結(jié)合C1q或不觸發(fā)活化的CD4+T細(xì)胞的NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白，一旦與疫苗抗原一起給予至受試者，可以增加CD4+中央記憶(cM)T細(xì)胞增殖、效應(yīng)記憶(eM)CD8+T細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞增殖、和/或B細(xì)胞增殖。在某些方面中，CD4+cMT細(xì)胞增殖、CD8+eMT細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞增殖、B細(xì)胞增殖、或它們的任意組合是在外周血單核細(xì)胞中作為胞內(nèi)Ki67表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的。在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白，一旦與疫苗抗原一起給予至受試者，可增加可被測(cè)量(例如，作為增加的干擾素γ(IFN-γ)表達(dá))的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答，該疫苗抗原包括但不限于來(lái)自呼吸道合胞病毒(RSV)、乙型肝炎或丙型肝炎病毒、埃博拉病毒、流感病毒、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、難辨梭菌(Clostridiumdifficile)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗原。在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白，一旦與疫苗抗原一起給予至受試者，可增加抗原特異性IgG滴度。在某些方面中，該抗原可以是呼吸道合胞病毒的可溶性F糖蛋白(RSVsF)，并且向受試者共同給予六聚體蛋白和RSV抗原可以增加RSV-中和抗體的滴度。在某些方面中，六聚體蛋白和疫苗抗原共同給予的受試者是非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。在某些方面中，如本披露提供的六聚體蛋白可抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)介導(dǎo)的效應(yīng)T細(xì)胞增殖的抑制，例如，在基于平板的測(cè)定法中。在某些方面中，效應(yīng)T細(xì)胞是效應(yīng)CD4+T細(xì)胞。在某些方面中，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞的比率可以是約1:0.5至約1:3，例如，約1:1或約1:2。本披露還提供了包括在此提供的六聚體蛋白和載體的組合物。在某些方面中，本披露提供了一種多核苷酸，該多核苷酸包括編碼在此提供的多肽亞基的核酸，或在此提供的六聚體蛋白。在某些方面中，該多核苷酸可包括核酸序列SEQIDNO:3。本披露還提供了包含所提供的多核苷酸的載體以及包含所提供的多核苷酸或所提供的載體的宿主細(xì)胞。在相關(guān)的方面中，本披露提供了生產(chǎn)如在此提供的多肽亞基或在此提供的六聚體蛋白的方法，其中該方法包括在表達(dá)由該多核苷酸編碼的多肽亞基或六聚體蛋白的條件下培養(yǎng)所提供的宿主細(xì)胞，并包括回收該多肽亞基或六聚體蛋白。在進(jìn)一步的方面中，本披露提供促進(jìn)活化的T細(xì)胞存活或增殖的方法，其中該方法包括使活化的T細(xì)胞接觸如在此提供的六聚體蛋白，使得六聚體蛋白可以在T細(xì)胞的表面上特異性結(jié)合OX40。本披露進(jìn)一步提供了誘導(dǎo)從活化的T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的方法，其中該方法包括使活化的T細(xì)胞接觸如在此提供的六聚體蛋白，使得六聚體蛋白可以在T細(xì)胞的表面上特異性結(jié)合OX40。在某些方面中，該細(xì)胞因子可以是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70和/或IL-1β，例如，IFNγ、TNFα、IL-5和/或IL-10。在某些方面中，活化的T細(xì)胞是活化的CD4+T細(xì)胞和/或活化的CD8+T細(xì)胞。例如，活化的CD4+T細(xì)胞可以是人CD4+T細(xì)胞、食蟹猴CD4+T細(xì)胞、和/或恒河猴CD4+T細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面中，本披露提供減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)介導(dǎo)的活化的T細(xì)胞增殖的抑制的方法，其中該方法包括使活化的T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的混合物接觸如權(quán)利要求26至70中任一項(xiàng)所述的六聚體蛋白，其中該六聚體蛋白可以在T細(xì)胞的表面上特異性結(jié)合OX40。在又另一個(gè)方面中，本披露提供促進(jìn)T細(xì)胞活化的方法，其中該方法包括使T細(xì)胞接觸如在此提供的六聚體蛋白，使得六聚體蛋白可以在T細(xì)胞的表面上特異性結(jié)合OX40。在某些方面中，這個(gè)方法還包括通過(guò)IgG4-Fc結(jié)構(gòu)域與表達(dá)FcγR的細(xì)胞相互作用使六聚體蛋白交聯(lián)。表達(dá)FcγR的細(xì)胞可以是，例如，B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞或漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞、濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、NK細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞、來(lái)自原發(fā)人腫瘤或腫瘤引流或非引流淋巴結(jié)的CD45+細(xì)胞、和/或來(lái)自其他第二或第三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的CD45+細(xì)胞。在某些方面中，T細(xì)胞的活化可以通過(guò)NFκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的刺激進(jìn)行測(cè)量，并且在某些方面中，活化的T細(xì)胞是活化的CD4+T細(xì)胞和/或活化的CD8+T細(xì)胞，例如，人CD4+T細(xì)胞、食蟹猴CD4+T細(xì)胞、和/或恒河猴CD4+T細(xì)胞。在某些方面中，以上提供的方法包括向需要治療的受試者給予有效量的如本披露所提供的六聚體蛋白或組合物。在相關(guān)的方面中，本披露提供在受試者中治療癌癥的方法，其中該方法包括向需要治療的受試者給予有效量的在此提供的六聚體蛋白。在某些方面中，該癌癥是實(shí)體瘤。在某些方面中，該六聚體蛋白或組合物的給予可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、可以促進(jìn)腫瘤縮小、或兩者。在某些方面中，在T細(xì)胞的存在下實(shí)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)抑制。在又另一個(gè)方面中，本披露提供在受試者中增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，其中該方法包括向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呓o予治療有效量的本披露所提供的六聚體蛋白、或本披露所提供的組合物。對(duì)于在本披露中所提供的任何治療方法，該受試者可以是人類(lèi)受試者。在另外的方面中，本披露提供了在T細(xì)胞上誘導(dǎo)ICOS表達(dá)的方法，該方法包含使T細(xì)胞接觸如本披露所提供的六聚體蛋白，其中該六聚體蛋白可以在T細(xì)胞的表面上特異性結(jié)合OX40。在另一個(gè)方面中，本披露提供了在T細(xì)胞上誘導(dǎo)PD-1表達(dá)的方法，該方法包括使T細(xì)胞接觸如本披露所提供的六聚體蛋白，其中該六聚體蛋白可以在T細(xì)胞的表面上特異性結(jié)合OX40。附圖/圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1.示意性示出了示例性多聚體蛋白質(zhì)，即OX40L融合蛋白。圖2.OX40LIgG4P融合蛋白的氨基酸序列(N至C末端，SEQIDNO:4)。氨基酸序列huIgG4PFcTF20X40LF180A被披露為SEQIDNO:12。圖3A.在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞的表面上表達(dá)的、結(jié)合OX40的OX40LIgG4P融合蛋白和對(duì)照蛋白。數(shù)據(jù)被用于確定表觀親和力(Kd)和表觀濃度以實(shí)現(xiàn)20％、50％和90％的受體占有率(EC20、EC50和EC90值)。圖3B.結(jié)合在尤爾卡特T細(xì)胞上表達(dá)的人OX40的、OX40LIgG4P融合蛋白和對(duì)照蛋白。數(shù)據(jù)被用于確定表觀親和力(Kd)和表觀濃度以實(shí)現(xiàn)20％、50％和90％的受體占有率(EC20、EC50和EC90值)。圖4A.OX40LIgG4P融合蛋白缺乏對(duì)在初級(jí)活化的小鼠CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的OX40的結(jié)合。MFI＝平均熒光強(qiáng)度。nM＝納摩爾。誤差條＝SEM。圖4B.OX40LIgG4P融合蛋白缺乏對(duì)在初級(jí)活化的大鼠CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的OX40的結(jié)合。MFI＝平均熒光強(qiáng)度。nM＝納摩爾。誤差條＝SEM。圖4C.OX40LIgG4P融合蛋白與在初級(jí)活化的食蟹猴CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的OX40的結(jié)合。從兩個(gè)獨(dú)立的測(cè)定平均的單孔數(shù)據(jù)被用于確定表觀親和力(Kd)值。MFI＝平均熒光強(qiáng)度。nM＝納摩爾。圖4D.OX40LIgG4P融合蛋白與在初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的OX40的結(jié)合。從兩個(gè)獨(dú)立的測(cè)定平均的數(shù)據(jù)被用于確定表觀親和力(Kd)值。MFI＝平均熒光強(qiáng)度。nM＝納摩爾。誤差條＝SEM。圖5A-C.OX40LIgG4P融合蛋白與表達(dá)TNFRSF的HEK293和表達(dá)OX40的尤爾卡特的結(jié)合。(A-B)在HEK293細(xì)胞中TNFRSF成員的瞬時(shí)表達(dá)，如直方圖的左側(cè)所指示，以及與TNFRSF-特異性mAb或與OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合，如直方圖上方所指示?；疑狈綀D，熒光染料軛合的同種型對(duì)照抗體對(duì)TNFRSF-特異性mAb的結(jié)合或山羊抗人647二級(jí)抗體對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白的結(jié)合對(duì)照；敞開(kāi)直方圖，TNFRSF-特異性mAb或OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合。(C)OX40LIgG4P融合蛋白與作為陽(yáng)性對(duì)照的、表達(dá)OX40的尤爾卡特的結(jié)合?；疑狈綀D，山羊抗人647二級(jí)抗體結(jié)合對(duì)照；敞開(kāi)直方圖，OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合。圖6.OX40LIgG4P融合蛋白平板結(jié)合生物活性測(cè)定的示意圖。OX40LIgG4P融合蛋白?？?CD3克隆OKT3。圖7A-E.OX40LIgG4P融合蛋白共刺激原代CD4T細(xì)胞增殖并在基于平板的生物活性測(cè)定法中釋放細(xì)胞因子。對(duì)于(A)CD4T細(xì)胞增殖和(B)IFNγ、(C)TNFα、(D)IL-10、(E)IL-13的釋放呈現(xiàn)供體4的代表數(shù)據(jù)；對(duì)于供體1、2、和3發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果。符號(hào)、平均值；誤差條、平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖8.用于測(cè)量OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性的細(xì)胞系統(tǒng)。通過(guò)FcγR表達(dá)細(xì)胞交聯(lián)的OX40LIgG4P融合蛋白介導(dǎo)OX40在表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB螢光素酶克隆64報(bào)告細(xì)胞系上的聚集，導(dǎo)致螢光素酶的NFκB依賴(lài)性產(chǎn)物，該螢光素酶的NFκB依賴(lài)性產(chǎn)物可作為NFκB活性和T細(xì)胞活化的替代品來(lái)測(cè)量。圖9A-C.當(dāng)通過(guò)或不通過(guò)FcγR交聯(lián)時(shí)OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性。(A)OX40LIgG4P融合蛋白與表達(dá)CD32A的HEK293交聯(lián)后的報(bào)告活性。(B)在沒(méi)有FcγR表達(dá)的HEK293親代細(xì)胞的存在下的報(bào)告活性。(C)使用藥物和不使用HEK293細(xì)胞的報(bào)告活性。RLU，相對(duì)光單位。圖10.OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性的實(shí)例，對(duì)于FcγR介導(dǎo)的藥物的交聯(lián)，使用拉吉(Raji)細(xì)胞、表達(dá)CD32B的HEK293細(xì)胞、表達(dá)CD32A的HEK293細(xì)胞、或從原發(fā)人類(lèi)腫瘤中分離的CD45+細(xì)胞，并且對(duì)于生物活性的讀出，使用表達(dá)OX40的尤爾卡特NFkB螢光素酶克隆64報(bào)告細(xì)胞。(A)由拉吉B細(xì)胞聚集的OX40LIgG4P融合蛋白活性；(B)表達(dá)CD32B的HEK293；(C)表達(dá)CD32A的HEK293；(D)從原發(fā)人腫瘤分離的CD45+細(xì)胞。RLU＝相對(duì)光單位。M＝摩爾濃度。圖11.在食蟹猴/恒河猴表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB熒光素酶克隆B2和LCL8664恒河猴B細(xì)胞生物活性測(cè)定中OX40LIgG4P融合蛋白是有活性的。OX40LIgG4P融合蛋白通過(guò)在尤爾卡特NFκB螢光素酶報(bào)告細(xì)胞系的細(xì)胞表面上表達(dá)的食蟹猴/恒河猴OX40誘導(dǎo)發(fā)信號(hào)的、以RLU計(jì)的濃度依賴(lài)性活性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)4個(gè)重復(fù)。誤差條＝SEM。RLU，相對(duì)光單位；n＝2個(gè)測(cè)定；nM＝納摩爾圖12.在食蟹猴/恒河猴表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB熒光素酶和表達(dá)Fcγ受體的恒河猴免疫細(xì)胞生物活性測(cè)定中OX40LIgG4P融合蛋白是有活性的。OX40LIgG4P融合蛋白通過(guò)在尤爾卡特NFκB螢光素酶報(bào)告細(xì)胞系的細(xì)胞表面上表達(dá)的食蟹猴/恒河猴OX40誘導(dǎo)發(fā)信號(hào)的、以RLU計(jì)的濃度依賴(lài)性活性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)2個(gè)重復(fù)。誤差條＝SEM。RLU，相對(duì)光單位；nM＝納摩爾。圖13.OX40LIgG4P融合蛋白引起初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞的增殖。OX40LIgG4P融合蛋白誘導(dǎo)初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期和分裂的濃度依賴(lài)性活性。OX40LIgG4P融合蛋白的特異性活性是通過(guò)僅從百分比CD4除值減去用抗CD3抗體刺激的細(xì)胞的平均值來(lái)進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于2個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)顯示的數(shù)據(jù)，這2個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)具有一式三份的孔。nM＝納摩爾。誤差條＝SEM。圖14A-D.對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白、OX40LIgG1融合蛋白和抗CD20抗體的自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性的評(píng)估，實(shí)驗(yàn)1#。通過(guò)由OX40L融合蛋白IgG1介導(dǎo)，但不由OX40LIgG4P融合蛋白也不由F180AOX40L融合蛋白IgG1和IgG4P對(duì)照介導(dǎo)的初級(jí)活化NK細(xì)胞的表達(dá)OX40的CD4+T細(xì)胞特異性殺傷：(A)用活化的CD4+T細(xì)胞孵育的供體1NK細(xì)胞；(B)用托萊多(Toledo)B細(xì)胞孵育的供體1NK細(xì)胞；(C)用活化的CD4+T細(xì)胞孵育的供體2NK細(xì)胞。在ADCC測(cè)定中使用的初級(jí)活化NK細(xì)胞能夠介導(dǎo)結(jié)合到利妥昔單抗的托萊多B細(xì)胞的有效裂解：(D)與托萊多B細(xì)胞組合的供體2NK細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖15.對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白和OX40配體融合蛋白IgG1的自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性的評(píng)估，實(shí)驗(yàn)2#。通過(guò)由OX40L融合蛋白IgG1介導(dǎo)，但不由OX40LIgG4P融合蛋白也不由F180AOX40L融合蛋白IgG1和IgG4P對(duì)照介導(dǎo)的初級(jí)活化NK細(xì)胞的、表達(dá)OX40的CD4+T細(xì)胞的特異性殺傷。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖16A-B.對(duì)結(jié)合于純化的C1q蛋白的OX40LIgG4P融合蛋白的評(píng)估。(A)將指定濃度的純化的人C1q蛋白注射到生物傳感器芯片上。空白代表注射單獨(dú)的PBS/0.005％吐溫20運(yùn)載體。(B)在相同的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合純化的人C1q的對(duì)照人IgG1。圖17.OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)A375細(xì)胞在小鼠異種移植模型中生長(zhǎng)的影響。每個(gè)組中六只NOD/SCID小鼠在第1天經(jīng)皮下(SC)植入A375細(xì)胞，該A375細(xì)胞以1:6的E:T比值與同種異體反應(yīng)性人CD4+和CD8+T細(xì)胞系混合。試驗(yàn)樣品(同種型對(duì)照或OX40LIgG4P融合蛋白)在第4天、第7天、第9天和第12天經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)給予。示出腫瘤體積的平均值。對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白處理的和同種型對(duì)照處理的動(dòng)物之間進(jìn)行了比較，并且通過(guò)曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和檢驗(yàn)針對(duì)統(tǒng)計(jì)顯著性分析了組間差異。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*：與同種型對(duì)照組相比，TGI>50％，P≤0.05。NOD/SCID＝非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷；SC＝皮下；E:T＝效應(yīng)物:靶標(biāo)比值；IP＝腹膜內(nèi)；TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制圖18.OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)A375細(xì)胞在小鼠異種移植模型中生長(zhǎng)的影響。每個(gè)組中六只NOD/SCID小鼠在第1天經(jīng)皮下(SC)植入單獨(dú)的A375細(xì)胞(無(wú)T細(xì)胞)，或混合有同種異體反應(yīng)性人CD4+和CD8+T細(xì)胞系(比值為2:1)的處于1:6的E:T比值的試驗(yàn)樣品(同種型對(duì)照或OX40LIgG4P融合蛋白)在第3天、第6天、第8天和第10天經(jīng)IP給予。示出腫瘤體積的平均值。對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白處理的和同種型對(duì)照處理的動(dòng)物之間進(jìn)行了比較，并且通過(guò)曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)針對(duì)統(tǒng)計(jì)顯著性分析了組間差異。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*：與同種型對(duì)照組相比，TGI>50％，P≤0.05。NOD/SCID＝非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷；SC＝皮下；E:T＝效應(yīng)物:靶標(biāo)比值；IP＝腹膜內(nèi)；TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制。圖19.小鼠OX40配體融合蛋白對(duì)在小鼠同源模型中Renca細(xì)胞系的生長(zhǎng)的影響。每個(gè)組10只BALB/c小鼠在第1天經(jīng)SC接種Renca細(xì)胞。分別在第4天和第7天經(jīng)IP給予對(duì)照樣品(同種型對(duì)照)和測(cè)試樣品(mOX40LFP)。示出平均(小圖A)和單個(gè)(小圖B)的腫瘤體積的值。對(duì)mOX40LFp處理的和同種型對(duì)照處理的動(dòng)物之間進(jìn)行了比較，并且通過(guò)在第6.8章節(jié)中描述的方法使用圖板棱柱(GraphPadPrism)6.0軟件針對(duì)統(tǒng)計(jì)顯著性分析了組間差異。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*：在第26天與同種型對(duì)照組相比，TGI>50％，P≤0.0001。SC＝皮下；IP＝腹膜內(nèi)；TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制。圖20.小鼠OX40配體融合蛋白對(duì)在小鼠同源模型中CT26細(xì)胞系的生長(zhǎng)的影響。每個(gè)組10只BALB/c小鼠在第1天經(jīng)SC接種CT26細(xì)胞。分別在第4天和第6天經(jīng)IP給予對(duì)照樣品(同種型對(duì)照)和測(cè)試樣品(mOX40LFP)。示出平均(小圖A)和單個(gè)(小圖B)腫瘤體積的值。對(duì)mOX40LFp處理的和同種型對(duì)照處理的動(dòng)物之間進(jìn)行了比較，并且通過(guò)在第6.8章節(jié)中描述的方法使用圖板棱柱6.0軟件針對(duì)統(tǒng)計(jì)顯著性分析了組間差異。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*：在研究第22天與同種型對(duì)照組相比，TGI>50％，P≤0.0001。SC＝皮下；IP＝腹膜內(nèi)；TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制。圖21.小鼠OX40配體融合蛋白對(duì)在小鼠同源模型中4T1細(xì)胞系的生長(zhǎng)的影響。每個(gè)組12只BALB/c小鼠在第1天經(jīng)SC接種4T1細(xì)胞。分別在第4天和第7天經(jīng)IP給予對(duì)照樣品(同種型對(duì)照)和測(cè)試樣品(mOX40LFP)。示出平均(小圖A)和單個(gè)(小圖B)腫瘤體積的值。對(duì)mOX40LFp處理的和同種型對(duì)照處理的動(dòng)物之間進(jìn)行了比較，并且通過(guò)在第6.8章節(jié)中描述的方法使用圖板棱柱6.0軟件針對(duì)統(tǒng)計(jì)顯著性分析了組間差異。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*：在研究第25天與同種型對(duì)照組相比，TGI>50％，P≤0.0006。SC＝皮下；IP＝腹膜內(nèi)；TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制。圖22.小鼠OX40配體融合蛋白對(duì)在小鼠同源模型中MCA205細(xì)胞系的生長(zhǎng)的影響。每個(gè)組14只C57BL/6小鼠在第1天經(jīng)SC接種MCA205細(xì)胞。分別在第11天和第14天經(jīng)IP給予對(duì)照樣品(同種型對(duì)照)和測(cè)試樣品(OX40LFP)。示出平均(小圖A)和單個(gè)(小圖B)腫瘤體積的值。對(duì)mOX40LFp處理的和同種型對(duì)照處理的動(dòng)物之間進(jìn)行了比較，并且通過(guò)在第6.8章節(jié)中描述的方法使用圖板棱柱6.0軟件針對(duì)統(tǒng)計(jì)顯著性分析了組間差異。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*：在研究第22天與同種型對(duì)照組相比，TGI>50％，P≤0.028。SC＝皮下；IP＝腹膜內(nèi)；TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制。圖23.OX40LIgG4P融合蛋白克服了效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制。效應(yīng)CD4+T細(xì)胞使用羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)來(lái)標(biāo)記，并且在抗CD3、抗CD28和試驗(yàn)或?qū)φ諛悠返拇嬖谙率褂煤筒皇褂弥付ū壤恼{(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)來(lái)培養(yǎng)4天。在測(cè)定結(jié)束時(shí)分裂的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的百分比通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估。誤差條表示來(lái)自一式兩份測(cè)定孔的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。顯著性是使用學(xué)生T檢驗(yàn)(Student’sTtest)來(lái)計(jì)算，其中*p＝0.0042；**p＝0.0002，***p<0.0001。圖24.OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制的影響是濃度依賴(lài)性的。效應(yīng)CD4+T細(xì)胞使用羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)來(lái)標(biāo)記，并且在抗CD3、抗CD28和試驗(yàn)或?qū)φ諛悠返拇嬖谙率褂煤筒皇褂锰幱?:1比例的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)來(lái)培養(yǎng)4天。在測(cè)定結(jié)束時(shí)分裂的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的百分比通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估。誤差條表示來(lái)自一式兩份測(cè)定孔的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。顯著性是使用學(xué)生T檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算，其中*p<0.05；**p<0.01。圖25.用于監(jiān)控通過(guò)靜脈途徑向恒河猴給予的OX40L融合蛋白IgG4-FP的藥效學(xué)作用的研究設(shè)計(jì)。圖26A-D.總的CD4記憶T細(xì)胞(A)、初始的CD4T細(xì)胞(B)、總的記憶CD8T細(xì)胞(C)、和初始的CD8T細(xì)胞(D)的藥效學(xué)(如通過(guò)Ki-67表達(dá)測(cè)量的)。圖27A-D.總的CD4記憶T細(xì)胞(A)、初始的CD4T細(xì)胞(B)、總的記憶CD8T細(xì)胞(C)、和初始的CD8T細(xì)胞(D)的藥效學(xué)(如通過(guò)ICOS表達(dá)測(cè)量的)。圖28A-D.總的CD4記憶T細(xì)胞(A)、初始的CD4T細(xì)胞(B)、總的記憶CD8T細(xì)胞(C)、和初始的CD8T細(xì)胞(D)的藥效學(xué)(如通過(guò)PD-1表達(dá)測(cè)量的)。圖29.Lin-CD20+B細(xì)胞的增殖的藥效學(xué)(如通過(guò)Ki-67表達(dá)測(cè)量的)。詳細(xì)說(shuō)明在由抗原致敏(priming)的過(guò)程中或之后不久，OX40受體接合在T細(xì)胞(例如，CD4+T細(xì)胞)上導(dǎo)致T細(xì)胞(例如，CD4+T細(xì)胞)對(duì)抗原的應(yīng)答增加。在本披露的上下文中，術(shù)語(yǔ)“接合”是指結(jié)合并刺激由OX40受體介導(dǎo)的至少一種活性。例如，OX40受體在抗原特異性T細(xì)胞(例如，CD4+T細(xì)胞)上的接合導(dǎo)致與響應(yīng)于單獨(dú)的抗原相比增加的T細(xì)胞增殖，以及增加的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。對(duì)抗原的增加的應(yīng)答可以比在沒(méi)有OX40受體接合下維持實(shí)質(zhì)上更長(zhǎng)的一段時(shí)間。因此，經(jīng)由OX40受體的刺激通過(guò)提高抗原(例如，腫瘤抗原)的T細(xì)胞識(shí)別來(lái)增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答。當(dāng)在由抗原致敏T細(xì)胞的過(guò)程中或之后不久向受試者給予時(shí)，OX40激動(dòng)劑可在受試者(如人類(lèi)受試者)中增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答。OX40激動(dòng)劑包括OX40配體(“OX40L”)，如可溶性O(shè)X40L融合蛋白和抗OX40抗體或其片段。具體的實(shí)例是融合多肽亞基，包含OX40L的受體結(jié)合域、三聚結(jié)構(gòu)域(例如，來(lái)自TRAF-2的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域)、和人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域，其中該多肽亞基自組裝成多聚體(例如，三聚體或六聚體)的融合蛋白。還描述了包括編碼此類(lèi)融合多肽的多核苷酸序列的核酸。本披露還提供了用于在受試者中使用多聚OX40L融合多肽來(lái)增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的方法。在此所披露的關(guān)于OX40L融合蛋白的組合物和方法可更普遍地用于多聚體(例如，三聚體和六聚體)的受體結(jié)合的融合蛋白的生產(chǎn)和使用中。定義術(shù)語(yǔ)“一個(gè)/種(a或an)”實(shí)體是指一個(gè)/種或多個(gè)/種該實(shí)體；例如，“多肽亞基”應(yīng)理解為代表一種或多種多肽亞基。因此，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”(或“一種”)、“一個(gè)或多個(gè)(一種或多種)”、以及“至少一個(gè)(至少一種)”在此可以互換地使用。除非另外定義，否則在此所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本披露涉及的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意義。例如，《簡(jiǎn)明生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)詞典》，佐裴秀(Juo,Pei-Show)，第2版，2002年，CRC出版社；《細(xì)胞與分子生物學(xué)詞典》，第3版，1999年，學(xué)術(shù)出版社；以及《牛津生物化學(xué)與分子生物學(xué)詞典》，修訂版，2000年，牛津大學(xué)出版社，為技術(shù)人員提供了許多在本披露中使用的術(shù)語(yǔ)的綜合詞典。單位、前綴和符號(hào)均以它們的國(guó)際單位系統(tǒng)(SI)接受的形式表示。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)字。除非另外指明，否則氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左到右書(shū)寫(xiě)。在此提供的小標(biāo)題不是本披露的不同方面或方面的限制，可以通過(guò)作為一個(gè)整體參考本說(shuō)明書(shū)來(lái)獲得這些方面。因此，通過(guò)以其全文參考說(shuō)明書(shū)，更完全地定義了就在以下定義的術(shù)語(yǔ)。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“多肽”旨在涵蓋單數(shù)“多肽”和復(fù)數(shù)“多肽”，并且是指由通過(guò)酰胺鍵(也稱(chēng)為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”是指具有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何一個(gè)或多個(gè)鏈，并且不是指產(chǎn)物的具體長(zhǎng)度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或用于指具有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)鏈的任何其他術(shù)語(yǔ)包含在“多肽”的定義中，并且術(shù)語(yǔ)“多肽”可以代替這些術(shù)語(yǔ)中的任何一個(gè)、或可與其互換使用。術(shù)語(yǔ)“多肽”還旨在指多肽在表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)來(lái)進(jìn)行的衍生、蛋白水解裂解或通過(guò)非標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸來(lái)進(jìn)行的修飾。多肽可來(lái)自天然生物來(lái)源或通過(guò)重組技術(shù)來(lái)產(chǎn)生，但不是必然從一個(gè)指定的核酸序列翻譯而來(lái)。它可以按任何方式、包括通過(guò)化學(xué)合成來(lái)產(chǎn)生。如在此使用的，“蛋白質(zhì)”可指單個(gè)多肽，即，如上所定義的單個(gè)氨基酸鏈，而且還可以指相關(guān)聯(lián)的兩個(gè)或更多個(gè)多肽，例如，通過(guò)二硫鍵、氫鍵、或疏水相互作用來(lái)產(chǎn)生多聚體蛋白質(zhì)。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“多肽亞基”是指氨基酸的多肽鏈，該多肽鏈可以與其他多肽亞基(無(wú)論是相同或不同的)相互作用以形成多聚體蛋白，例如，如在此所描述的六聚體蛋白。如在此披露的多肽可以具有約3個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)、75個(gè)或更多個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)、200個(gè)或更多個(gè)、500個(gè)或更多個(gè)、1,000個(gè)或更多個(gè)，或2,000個(gè)或更多個(gè)氨基酸的大小。多肽可以具有一種限定的三維結(jié)構(gòu)，但是它們不是必然具有這種結(jié)構(gòu)。具有限定的三維結(jié)構(gòu)的多肽被稱(chēng)為折疊的，并且不具有限定的三維結(jié)構(gòu)而可采用很多不同構(gòu)象的多肽被稱(chēng)為未折疊的。一種“分離的”多肽或其片段、變體或衍生物意指不存在于其天然環(huán)境中的一種多肽。不要求特定水平的純化。例如，一種分離的多肽可以從其天然或自然環(huán)境中去除。如同已經(jīng)通過(guò)任何合適的技術(shù)來(lái)分離、份化或部分地或基本上純化的天然或重組多肽一樣，如在此披露的，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)也被視為是分離的。在此披露的其他多肽是前述多肽的片段、衍生物、類(lèi)似物或變體，以及其任何組合。當(dāng)提及如在此披露的多肽亞基或多聚體蛋白時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”、“變體”、“衍生物”和“類(lèi)似物”可包括保留完整多肽或蛋白質(zhì)的至少一些活性的任何多肽或蛋白質(zhì)，但其在結(jié)構(gòu)上不同。多肽的片段包括，例如，蛋白水解片段、以及缺失片段。變體包括如上所述的片段，而且還有由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改變的氨基酸序列的多肽。變體可自發(fā)產(chǎn)生或有意構(gòu)造。有意構(gòu)造的變體可以使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。變體多肽可以包括保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已被改變使得展現(xiàn)出在天然多肽上找不到的附加特征的多肽。實(shí)例包括融合蛋白。變體多肽在此還可以稱(chēng)為“多肽類(lèi)似物”。如在此所使用的，“衍生物”是指具有通過(guò)官能側(cè)基的反應(yīng)來(lái)化學(xué)衍生的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的主題多肽。含有二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)或合成的氨基酸衍生物的那些肽也作為“衍生物”包括在內(nèi)。例如，4-羥基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羥基賴(lài)氨酸可以取代賴(lài)氨酸；3-甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可以取代絲氨酸；并且鳥(niǎo)氨酸可以取代賴(lài)氨酸。“保守的氨基酸取代”是一個(gè)氨基酸被具有相似側(cè)鏈的另一個(gè)氨基酸替代。在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸家族，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天門(mén)冬氨酸、谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性的側(cè)鏈(例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、以及芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。例如，苯丙氨酸對(duì)于酪氨酸的取代是保守取代。鑒定不消除蛋白質(zhì)活性的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)，例如，布魯梅爾(Brummell)等人，生物化學(xué)(Biochem.)，32：1180-1187(1993)；小林(Kobayashi)等人，蛋白質(zhì)工程(ProteinEng.)12(10):879-884(1999)；以及伯克斯(Burks)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94：412-417(1997))。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”(或其片段、變體、或衍生物)是指能夠結(jié)合至抗原的抗體的至少最小部分，例如，在由B細(xì)胞產(chǎn)生的典型抗體的情況下，至少重鏈(VH)的可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域。脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中的基礎(chǔ)抗體結(jié)構(gòu)相對(duì)較好理解。參見(jiàn)，例如，哈洛(Harlow)等人，抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies:ALaboratoryManual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，第2版，1988)?？贵w或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人類(lèi)抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、表位結(jié)合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的Fvs(sdFv)、包括VL或VH域的片段、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。ScFv分子在本領(lǐng)域中是已知的并且描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5,892,019之中。本披露涵蓋的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何類(lèi)型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、以及IgY)、類(lèi)別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)或子類(lèi)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”旨在涵蓋單數(shù)核酸連同復(fù)數(shù)核酸，并且是指一種分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如，信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(例如酰胺鍵，諸如在肽核酸(PNA)中所發(fā)現(xiàn))。術(shù)語(yǔ)“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一個(gè)或多個(gè)核酸節(jié)段，例如DNA或RNA片段。“分離的”核酸或多核苷酸意指已經(jīng)從其天然環(huán)境中去除的核酸分子DNA或RNA。例如，在一個(gè)載體中所包含的編碼多肽亞基的重組多核苷酸被視為是分離的，如在此披露。分離的多核苷酸的另外實(shí)例包括維持在異源宿主細(xì)胞中的重組多核苷酸或溶液中的純化(部分地或基本上)多核苷酸。分離的RNA分子包括多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。分離的多核苷酸或核酸進(jìn)一步包括合成產(chǎn)生的這類(lèi)分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調(diào)控元件如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子。如在此使用，“編碼區(qū)”是包含翻譯成氨基酸的密碼子的核酸的一部分。雖然“終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)未被翻譯成氨基酸，它可被認(rèn)為是編碼區(qū)的一部分，但是任何側(cè)翼序列(例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子、以及類(lèi)似序列)并非編碼區(qū)的一部分。兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)可以存在于單一多核苷酸構(gòu)建體中，例如在單一載體上，或在單獨(dú)的多核苷酸構(gòu)建體中，例如在單獨(dú)(不同)載體上。此外，任何載體可以含有單一編碼區(qū)，或可以包括兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)，例如單一載體可以單獨(dú)地編碼一個(gè)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和一個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。另外，載體、多核苷酸、或核酸可以編碼異源編碼區(qū)，無(wú)論是稠合或非稠合至編碼如在此提供的多肽亞單位或融合蛋白的核酸。異源編碼區(qū)包括但不限于特化的元件或基序，如分泌信號(hào)肽或異源功能域。在某些實(shí)施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情況下，包括編碼多肽的核酸的多核苷酸通?？梢园▎?dòng)子和/或可操作地與一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)相關(guān)聯(lián)的其他轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件?？刹僮鞯仃P(guān)聯(lián)或連接是針對(duì)基因產(chǎn)物(例如多肽)的編碼區(qū)按以下這種方式與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列相關(guān)聯(lián)，該方式使得該基因產(chǎn)物的表達(dá)處于這種或這些調(diào)控序列的影響或控制之下。如果啟動(dòng)子功能的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼所希望的基因產(chǎn)物的mRNA的轉(zhuǎn)錄，并且如果兩個(gè)DNA片段之間的連接的性質(zhì)不干擾表達(dá)調(diào)控序列引導(dǎo)基因產(chǎn)物的表達(dá)的能力或不干擾有待轉(zhuǎn)錄的DNA模板的能力，那么兩個(gè)DNA片段(如多肽編碼區(qū)和與其關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子)“可操作地關(guān)聯(lián)”或“可操作地連接”。因此，啟動(dòng)子區(qū)將可操作地與編碼多肽的核酸相關(guān)聯(lián)，只要啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)所述核酸的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以是只在預(yù)定細(xì)胞中引導(dǎo)DNA的實(shí)質(zhì)性轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。除了啟動(dòng)子以外，其他轉(zhuǎn)錄控制元件例如增強(qiáng)子、操縱子、阻遏子以及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可以可操作地與多核苷酸相關(guān)聯(lián)以便引導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。在此披露了合適的啟動(dòng)子和其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。多種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括但不限于在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，如但不限于來(lái)自巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子片段(立即早期啟動(dòng)子，它與內(nèi)含子A相結(jié)合)、猿病毒40(早期啟動(dòng)子)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒(如勞斯(Rous)肉瘤病毒)。其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括得自脊椎動(dòng)物基因如肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白、牛生長(zhǎng)激素以及兔β-球蛋白的那些轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域，連同能夠控制真核細(xì)胞中的基因表達(dá)的其他序列。另外的合適轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，連同淋巴因子可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如可由干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)。類(lèi)似地，多種翻譯控制元件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。這些翻譯控制元件包括但不限于核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始和終止密碼子，以及得自小核糖核酸病毒的元件(特別是內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，或IRES，也稱(chēng)為CITE序列)。在其他實(shí)施例中，多核苷酸可以是例如處于信使RNA(mRNA)形式的RNA。多核苷酸和核酸編碼區(qū)可與編碼分泌肽或信號(hào)肽的另外的編碼區(qū)相關(guān)聯(lián)，這些另外的編碼區(qū)引導(dǎo)由如在此披露的多核苷酸(例如編碼在此提供的多肽亞基的多核苷酸)所編碼的多肽的分泌。根據(jù)信號(hào)假設(shè)，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽或分泌前導(dǎo)序列，一旦已經(jīng)開(kāi)始將生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)鏈輸出橫穿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，該信號(hào)肽或分泌前導(dǎo)序列就從成熟蛋白質(zhì)上裂解。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員意識(shí)到由脊椎動(dòng)物細(xì)胞分泌的多肽一般具有融合至多肽的N末端的信號(hào)肽，這種信號(hào)肽從完整或“全長(zhǎng)”多肽上裂解以便產(chǎn)生分泌或“成熟”形式的多肽。在一些實(shí)施例中，使用天然信號(hào)肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號(hào)肽，或保持引導(dǎo)與其可操作關(guān)聯(lián)的多肽的分泌的能力的所述序列的功能衍生物?？商娲?，可以使用異源哺乳動(dòng)物信號(hào)肽，或其功能衍生物。例如，野生型前導(dǎo)序列可以用人組織纖溶酶原活化劑(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前導(dǎo)序列來(lái)取代?！拜d體”是導(dǎo)入宿主細(xì)胞的核酸分子，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。載體可包括允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，如復(fù)制起點(diǎn)。載體也可以包括一種或多種可選擇的標(biāo)記基因和本領(lǐng)域已知的其他遺傳元件?！稗D(zhuǎn)化的”細(xì)胞或“宿主”細(xì)胞是已經(jīng)通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將核酸分子引入的細(xì)胞。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)化涵蓋可將核酸分子引入這樣的細(xì)胞的所有技術(shù)，這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)染病毒載體，用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，以及通過(guò)電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、和粒子槍加速引入裸DNA。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞或真核細(xì)胞。“特異性結(jié)合”一般是指分子(例如，OX40L或其受體結(jié)合片段)經(jīng)由其受體結(jié)合域來(lái)結(jié)合至另一個(gè)分子(例如，OX40)，并且這種結(jié)合需要抗原結(jié)合域與表位之間有某種互補(bǔ)性。根據(jù)此定義，當(dāng)與配體將結(jié)合至隨機(jī)、不相關(guān)的分子相比，該配體更容易經(jīng)由其受體結(jié)合域來(lái)結(jié)合至那個(gè)受體時(shí)，該配體被認(rèn)為是“特異性地結(jié)合”至該受體。術(shù)語(yǔ)“特異性”在此用于對(duì)某種配體結(jié)合至某種受體的相對(duì)親和力進(jìn)行定性。例如，與配體“B”相比，配體“A”可被視為針對(duì)給定的受體具有較高特異性，或與配體“A”針對(duì)相關(guān)受體“D”所具有的特異性相比，配體“A”可被認(rèn)為以較高特異性結(jié)合至受體“C”。“受體-結(jié)合域”意指包括在配體(例如，如在此所披露的OX40L)中的結(jié)合域。配體，例如，如在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亞基或多聚體融合蛋白可以結(jié)合到受體，該受體例如是具有解離速率(k(解離))小于或等于5x10-2sec-1、10-2sec-1、5x10-3sec-1或10-3sec-1的OX40。配體，例如，如在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亞基或多聚體融合蛋白可以結(jié)合到受體，該受體例如是具有解離速率(k(解離))小于或等于5x10-4sec-1、10-4sec-1、5x10-5sec-1或10-5sec-15x10-6sec-1、10-6sec-1、5x10-7sec-1或10-7sec-1的OX40。術(shù)語(yǔ)“抑制(inhibit)”、“阻斷(block)”和“壓制(suppress)”在此可互換地使用，并且是指任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的生物活性的降低，包括活性的完全阻斷。例如，“抑制”可以指生物活性大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的降低。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“親和力”是指配體與其同源受體的結(jié)合強(qiáng)度的度量。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“親合力”是指配體和受體的群體之間復(fù)合體的總體穩(wěn)定性，即，配體和受體的組合的功能性結(jié)合強(qiáng)度，例如，六聚體OX40L-IgG4融合蛋白與細(xì)胞表面OX40的相互作用。親合力與群體中的單獨(dú)受體結(jié)合域與特定受體的親和力相關(guān)，并且還與配體和受體的效價(jià)相關(guān)。配體，例如，在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亞基或多聚體融合蛋白，也可以就其對(duì)配體的結(jié)合親和力方面來(lái)描述或指定。例如，配體可以按不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的解離常數(shù)或KD來(lái)結(jié)合至受體。配體，例如，如在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亞基或多聚體融合蛋白可以結(jié)合到受體，該受體例如是具有結(jié)合速率(k(結(jié)合))大于或等于103M-1sec-1、5X103M-1sec-1、104M-1sec-1或5X104M-1sec-1的OX40。配體，例如，如在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亞基或多聚體融合蛋白可以結(jié)合到受體，該受體例如是具有結(jié)合速率(k(結(jié)合))大于或等于105M-1sec-1、5X105M-1sec-1、106M-1sec-1、或5X106M-1sec-1、或107M-1sec-1的OX40。OX40，或“OX40受體”是在活化的T細(xì)胞(例如CD4+和CD8+T-細(xì)胞)的表面上以及在Foxp3+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)上表達(dá)的一種蛋白(也不同地稱(chēng)為CD134、腫瘤壞死因子受體超家族成員4、和ACT-35)。初始的CD4+和CD8+T-細(xì)胞不表達(dá)OX40(克羅夫特·M.(Croft,M.)，(2010)免疫學(xué)年鑒(AnnRevImmunol)28：57-78)?！癘X40配體”(“OX40L”)(也不同地稱(chēng)為腫瘤壞死因子配體超家族成員4、gp34、TAX轉(zhuǎn)錄活化糖蛋白1、和CD252)在很大程度上被發(fā)現(xiàn)于抗原呈遞細(xì)胞(APC)，并且可以在活化的B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞(DC)、朗格漢斯細(xì)胞、漿細(xì)胞DC、和巨噬細(xì)胞上被誘導(dǎo)(克羅夫特·M.(Croft,M.)，(2010)免疫學(xué)年鑒(AnnRevImmunol)28：57-78)。其他細(xì)胞，包括活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞可以在響應(yīng)于炎性細(xì)胞因子(Id.)中表達(dá)OX40L。OX40L特異性結(jié)合OX40受體。人類(lèi)蛋白質(zhì)被描述于PCT公開(kāi)號(hào)WO95/21915中。小鼠OX40L被描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,457,035中。OX40L表達(dá)于細(xì)胞的表面上，并包括細(xì)胞內(nèi)、跨膜和細(xì)胞外受體結(jié)合域。OX40L的功能性活性可溶形式可以通過(guò)刪除細(xì)胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生，如描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,457,035和6,312,700以及WO95/21915，出于所有目的將其披露內(nèi)容結(jié)合在此。OX40L的功能性活性形式是保留特異性結(jié)合OX40的能力的形式，即具有OX40“受體結(jié)合域”的形式。一個(gè)實(shí)例是SEQIDNO:1的氨基酸51至183，人OX40L。確定OX40L分子或衍生物特異性結(jié)合OX40的能力的方法在下面討論。制造和使用OX40L及其衍生物(例如，包括OX40結(jié)合域的衍生物)的方法描述于WO95/21915，其還描述了包含連接到其他肽的OX40L的可溶形式的蛋白，例如，人免疫球蛋白(“Ig”)Fc區(qū)，該蛋白可以被產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)OX40配體從培養(yǎng)的細(xì)胞中純化，或被產(chǎn)生來(lái)提高該分子在體內(nèi)給予至哺乳動(dòng)物后的穩(wěn)定性(也參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,457,035和PCT公開(kāi)號(hào)WP2006/121810，這兩個(gè)專(zhuān)利都通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此)。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“OX40L”包括整個(gè)OX40配體、可溶性O(shè)X40配體、和OX40配體的功能性活性部分。在OX40L的定義內(nèi)還包括的是OX40配體變體，其氨基酸序列與天然存在的OX40配體分子不同，但其保留特異性結(jié)合到OX40受體的能力。此類(lèi)變體被描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,457,035和WO95/21915中。在相關(guān)的實(shí)施例中，本披露提供已經(jīng)喪失特異性結(jié)合OX40的能力的OX40L的突變體，例如SEQIDNO:1的氨基酸51至183，其中人OX40L的受體結(jié)合域的位置180處的苯丙氨酸已被替換為丙氨酸(F180A)?！叭劢Y(jié)構(gòu)域”是在多肽內(nèi)促進(jìn)該多肽裝配成三聚體的氨基酸序列。例如，三聚可經(jīng)由與其他三聚結(jié)構(gòu)域(具有相同或不同的氨基酸序列的另外的多肽的三聚結(jié)構(gòu)域)關(guān)聯(lián)來(lái)促進(jìn)裝配成三聚體。該術(shù)語(yǔ)也被用于指編碼這樣的肽或多肽的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“Fc”域是指抗體恒定區(qū)的一部分。傳統(tǒng)上，術(shù)語(yǔ)Fc結(jié)構(gòu)域是指涵蓋抗體的配對(duì)CH2、CH3和鉸鏈區(qū)的蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶)裂解產(chǎn)物。在本披露的上下文中，術(shù)語(yǔ)Fc結(jié)構(gòu)域或Fc是指不管生產(chǎn)手段的任何多肽(或編碼這樣的多肽的核酸)，其包括免疫球蛋白多肽的CH2、CH3和鉸鏈區(qū)的全部或一部分，例如，人IgG4Fc。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“CH2域”包括重鏈分子的Fc結(jié)構(gòu)域的部分，使用常規(guī)的編號(hào)方案該部分例如從抗體的約氨基酸244延伸至氨基酸360(氨基酸244至360，卡巴特編號(hào)系統(tǒng)；以及氨基酸231-340，EU編號(hào)系統(tǒng))。還被文獻(xiàn)充分證明的是CH3域從CH2域延伸至IgG分子的C末端并且包括近似108個(gè)氨基酸。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”包括重鏈分子的Fc結(jié)構(gòu)域的將CH1域接合至CH2域的那部分。這個(gè)鉸鏈區(qū)包括近似25個(gè)氨基酸并且是柔性的，由此允許兩個(gè)N末端抗原結(jié)合區(qū)獨(dú)立地移動(dòng)。鉸鏈區(qū)可細(xì)分成三個(gè)相異的域：上、中、以及下鉸鏈域(魯(Roux)等人，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)161：4083(1998))。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“二硫鍵”包括在兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。氨基酸半胱氨酸包括可以與第二硫醇基形成二硫鍵或二硫橋的硫醇基。在在此提供的某些方面中，人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域可以在鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變以確保兩個(gè)鉸鏈區(qū)之間二硫鍵形成，具體地，在位置228處絲氨酸至脯氨酸(根據(jù)EU編號(hào))的突變。包含S228P突變的人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域在此被稱(chēng)為“IgG4PFc結(jié)構(gòu)域”。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“連接”、“融合(fused)”或“融合(fusion)”可互換地使用。這些術(shù)語(yǔ)是指通過(guò)包括化學(xué)軛合或重組手段的任何手段將兩個(gè)更多個(gè)元件或組分連接在一起。“框內(nèi)融合”是指連接兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸開(kāi)放閱讀框架(ORF)以便以維持原始ORF的正確翻譯閱讀框架的方式來(lái)形成連續(xù)更長(zhǎng)的ORF。因此，重組融合蛋白是含有對(duì)應(yīng)于由原始ORF編碼的多肽的兩個(gè)或更多個(gè)節(jié)段的單一蛋白質(zhì)(這些節(jié)段天然地通常并不這樣連接)，例如，如在此提供的OX40LIgG4P融合蛋白。雖然閱讀框架由此在整個(gè)融合節(jié)段上被致使連續(xù)，但是這些節(jié)段可以被例如框內(nèi)接頭序列在物理上或空間上分離。在多肽的情況下，“線性序列”或“序列”是多肽中的在氨基至羧基末端方向上的氨基酸順序，其中在多肽的一級(jí)活化的結(jié)構(gòu)中，在序列上彼此鄰接的氨基酸是連續(xù)的。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指基因產(chǎn)生生物化學(xué)物質(zhì)例如多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括基因在細(xì)胞內(nèi)的功能性存在的任何表現(xiàn)，包括但不限于基因敲除和瞬態(tài)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)兩者。它包括而不限于將基因轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)，和將這種mRNA翻譯成多肽。如果最終所希望的產(chǎn)物是生物化學(xué)物質(zhì)，那么表達(dá)包括所述生物化學(xué)物質(zhì)和任何前體的產(chǎn)生?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)生“基因產(chǎn)物”。如在此使用，基因產(chǎn)物可以是核酸，例如通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生的信使RNA，或從轉(zhuǎn)錄物翻譯的多肽。在此描述的基因產(chǎn)物進(jìn)一步包括具有轉(zhuǎn)錄后修飾(例如多聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻譯后修飾(例如甲基化、糖基化、添加脂質(zhì)、與其他蛋白質(zhì)亞單位相關(guān)聯(lián)、蛋白裂解等)的多肽。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“治療(treat、treatment、或treatmentof)”(例如，在短語(yǔ)“治療癌癥患者”中)是指減少疾病病理的可能性，減少疾病癥狀的發(fā)生，例如在一定程度上受試者具有更長(zhǎng)的存活期或減少的不適。例如，治療可以是指當(dāng)向受試者給予療法時(shí)該療法減少疾病癥狀、體征或病因的能力。治療還指緩和或減少至少一種臨床癥狀和/或抑制或延遲病癥的進(jìn)展和/或預(yù)防或延遲疾病或疾患的發(fā)作?！笆茉囌摺被颉皞€(gè)體”或“動(dòng)物”或“患者”或“哺乳動(dòng)物”是指希望診斷、預(yù)后或治療的任何受試者，特別是哺乳動(dòng)物受試者。哺乳動(dòng)物受試者包括人、家畜、農(nóng)畜、體育動(dòng)物、和動(dòng)物園動(dòng)物，包括例如人、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、熊等。術(shù)語(yǔ)“藥用組合物”是指一種呈關(guān)于允許活性成分的生物活性有效的這種形式的制劑，以及不包含對(duì)于該組合物將給予的受試者而言具有不可接受毒性的額外組分的制劑。這種組合物可以是無(wú)菌的。如在此披露的，抗體的“有效量”是足以實(shí)施具體闡述目的的量。關(guān)于闡述的目的，“有效量”可以經(jīng)驗(yàn)為主地并且以常規(guī)方式來(lái)確定。OX40LIgG4融合多肽亞基本披露涉及可以裝配成六聚體蛋白并具有增強(qiáng)的刺激人T細(xì)胞的能力的OX40L融合多肽亞基。在此提供的多肽亞基包含人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域，例如人IgG4PFc結(jié)構(gòu)域、三聚結(jié)構(gòu)域(例如，TRAF-2異亮氨酸拉鏈三聚結(jié)構(gòu)域)、和人OX40L的受體結(jié)合域。示例性實(shí)施例示意性地在圖1示出。典型地，IgG4Fc結(jié)構(gòu)域、三聚結(jié)構(gòu)域和OX40L受體結(jié)合域以N-末端至C-末端方向排列。示例性O(shè)X40L融合多肽亞基由SEQIDNO:4所代表。在示例性實(shí)施例中，OX40L受體結(jié)合域是人OX40L的胞外結(jié)構(gòu)域。一個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域的序列是由SEQIDNO:1的氨基酸51至183所代表。>sp|P23510|TNFL4_人腫瘤壞死因子配體超家族成員4OS＝智人GN＝TNFSF4PE＝1SV＝1MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL保留結(jié)合于OX40受體所希望的性質(zhì)的任何OX40L多肽序列適用于在此所述的融合多肽和方法。毗連OX40L受體結(jié)合域的是三聚結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)“毗連”包括，例如，經(jīng)由接頭或異源劑鄰接或關(guān)聯(lián)。三聚結(jié)構(gòu)域的作用是促進(jìn)單個(gè)OX40L融合多肽分子自組裝成三聚體蛋白。因此，具有三聚結(jié)構(gòu)域的OX40L融合多肽自組裝成三聚體OX40L融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，該三聚結(jié)構(gòu)域是亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。示例性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域是工程化的酵母GCN4亮氨酸變體，被描述于Harbury等人(1993)科學(xué)(Science)262：1401-1407，將其披露內(nèi)容結(jié)合在此用于所有目的。示例性三聚結(jié)構(gòu)域包括：TNF受體相關(guān)因子2(TRAF2)(登錄號(hào)Q12933[gi:23503103]；氨基酸310-349)；血小板反應(yīng)蛋白1(登錄號(hào)PO7996[gi:135717]；氨基酸291-314)；母系蛋白-4(登錄號(hào)O95460[gi:14548117]；氨基酸594-618；軟骨基質(zhì)蛋白(母系蛋白-1)(登錄號(hào)NP002370[gi:4505111]；氨基酸463-496；熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)(登錄號(hào)AAX42211[gi:61362386]；氨基酸165-191；和吞飲受體(登錄號(hào)NP001072[gi:4557503]；氨基酸104-138。在某些方面中，三聚結(jié)構(gòu)域包括人TRAF2(SEQIDNO:2)的氨基酸310至349。>sp|Q12933|TRAF2_人腫TNF受體相關(guān)因子2OS＝智人GN＝TRAF2PE＝1SV＝2MAAASVTPPGSLELLQPGFSKTLLGTKLEAKYLCSACRNVLRRPFQAQCGHRYCSFCLASILSSGPQNCAACVHEGIYEEGISILESSSAFPDNAARREVESLPAVCPSDGCTWKGTLKEYESCHEGRCPLMLTECPACKGLVRLGEKERHLEHECPERSLSCRHCRAPCCGADVKAHHEVCPKFPLTCDGCGKKKIPREKFQDHVKTCGKCRVPCRFHAIGCLETVEGEKQQEHEVQWLREHLAMLLSSVLEAKPLLGDQSHAGSELLQRCESLEKKTATFENIVCVLNREVERVAMTAEACSRQHRLDQDKIEALSSKVQQLERSIGLKDLAMADLEQKVLEMEASTYDGVFIWKISDFARKRQEAVAGRIPAIFSPAFYTSRYGYKMCLRIYLNGDGTGRGTHLSLFFVVMKGPNDALLRWPFNQKVTLMLLDQNNREHVIDAFRPDVTSSSFQRPVNDMNIASGCPLFCPVSKMEAKNSYVRDDAIFIKAIVDLTGL除了OX40L受體結(jié)合域和三聚結(jié)構(gòu)域之外，融合多肽包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，例如恒定區(qū)或“Fc”結(jié)構(gòu)域。本披露提供了包括至少鉸鏈區(qū)的人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域。在某些方面中，人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包括CH2域。在某些方面中，人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包括CH3域。在某些方面中，該鉸鏈區(qū)包括在位置228(根據(jù)EU編號(hào))處的絲氨酸至脯氨酸的突變，該突變賦予完整的重鏈間二硫鍵形成。在某些方面中，該鉸鏈區(qū)包括SEQIDNO:4的氨基酸1至12。在某些方面中，人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:4的氨基酸1至229。與將三個(gè)OX40L受體結(jié)合域帶到一起的三聚結(jié)構(gòu)域結(jié)合，在兩個(gè)IgG4Fc結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵形成導(dǎo)致六聚體蛋白的形成(圖1)。因此，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域用作二聚結(jié)構(gòu)域促進(jìn)兩個(gè)三聚體融合多肽之間經(jīng)由不配對(duì)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域之間的相互作用組裝成穩(wěn)定的六聚體(即包含六個(gè)OX40L融合多肽亞基的多聚體)。在某些方面中，人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域?yàn)榱垠w蛋白提供穩(wěn)定性而不促進(jìn)效應(yīng)功能例如抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。在某些方面中，本披露提供自組裝以形成能夠特異性結(jié)合OX40的六聚體蛋白的單鏈多肽亞基。示例性單鏈多肽亞基包括：人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域、功能性三聚結(jié)構(gòu)域、和OX40L的受體結(jié)合域。在某些方面中，該多肽亞基可以自組裝成三聚體或六聚體蛋白。在某些方面中，該多肽亞基(從氨基末端到羧基末端)被安排如下：人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域，隨后是三聚結(jié)構(gòu)域，隨后是OX40L受體結(jié)合域。三個(gè)結(jié)構(gòu)域可以是直接毗連的。例如，在某些方面中，人IgG4Fc結(jié)構(gòu)域的羧基末端直接融合到三聚結(jié)構(gòu)域的氨基末端，且三聚結(jié)構(gòu)域的羧基末端直接融合到OX40L受體結(jié)合域的氨基末端。可替代地，該三個(gè)結(jié)構(gòu)域可以被一個(gè)或多個(gè)接頭、間隔子或其他異源多肽分離。在某些方面中，如在此提供的OX40L融合多肽亞基可以特異性結(jié)合至人OX40。在某些方面中，如在此提供的OX40L融合多肽亞基可以特異性結(jié)合至非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)OX40，例如，食蟹猴OX40或恒河猴OX40。在某些方面中，如在此提供的OX40L融合多肽亞基不結(jié)合小鼠OX40或大鼠OX40。如在此提供的OX40L亞基多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸改變，例如，多達(dá)十個(gè)保守性變化(例如，兩個(gè)取代的氨基酸、三個(gè)取代的氨基酸、四個(gè)取代的氨基酸、或五個(gè)取代的氨基酸等)，只要可以在該多肽中進(jìn)行該變化而不改變OX40L融合多肽亞基或六聚體蛋白的生化功能。例如，可以在OX40L受體結(jié)合域中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)保守性改變，而不改變其結(jié)合OX40能力。同樣地，可以在三聚結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)保守性變化，而不改變其進(jìn)行三聚的能力。另外，多肽結(jié)構(gòu)域的一部分可以被缺失而不損害或消除它的全部功能。同樣地，如下所述，可以在多肽鏈中進(jìn)行插入或添加，例如，添加表位標(biāo)簽，而不損害或消除其功能?？梢赃M(jìn)行的、不實(shí)質(zhì)性損害多肽的一個(gè)或多個(gè)功能的其他修飾包括，例如，在體內(nèi)或體外結(jié)合了不常見(jiàn)氨基酸的化學(xué)和生化修飾。這樣的修飾包括，例如，乙?；?、羧化、磷酸化、糖基化、標(biāo)記(例如，使用放射性核素)、以及各種酶修飾，如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將很容易理解的。各種用于標(biāo)記多肽的方法和對(duì)于這樣的目的有用的標(biāo)記在本領(lǐng)域中是公知的，并且包括放射性同位素如32P、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑、酶和抗配體。融合多肽亞基可進(jìn)一步包括異源劑，例如，穩(wěn)定劑、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、或可檢測(cè)的藥劑。在某些方面中，異源劑包括經(jīng)由肽鍵融合到多肽亞基的一個(gè)或多個(gè)另外的多肽序列，例如信號(hào)序列(例如，分泌信號(hào)序列)、接頭序列、氨基酸標(biāo)簽或標(biāo)記、或有助于純化的肽或多肽序列。在某些方面中，異源多肽可融合到IgG4-Fc結(jié)構(gòu)域的N-末端，異源多肽可融合至OX40L的受體結(jié)合域的C-末端，異源多肽可融合至IgG4-Fc結(jié)構(gòu)域的C-末端和三聚結(jié)構(gòu)域的N-末端，或異源多肽可融合至三聚結(jié)構(gòu)域的C-末端和OX40L的受體結(jié)合域的N-末端。可替代地，異源多肽可以在任何IgG4Fc結(jié)構(gòu)域、三聚結(jié)構(gòu)域、或OX40L受體結(jié)合域內(nèi)發(fā)生內(nèi)部融合，只要保持該結(jié)構(gòu)域的功能特性。在某些方面中，可以將異源劑化學(xué)軛合至多肽亞基?？梢曰瘜W(xué)軛合至多肽亞基的示例性異源劑包括但不限于，接頭、藥物、毒素、顯像劑、放射性化合物、有機(jī)和無(wú)機(jī)聚合物、以及能夠提供不為多肽亞基本身所提供的希望的活性的任何其他組合物。具體的試劑包括但不限于聚乙二醇(PEG)、細(xì)胞毒性劑、放射性核素、顯像劑、生物素。在某些方面中，本披露提供了某些OX40L相關(guān)的多肽亞基，被用作對(duì)照或研究工具。例如，本披露提供如上所述的OX40L相關(guān)亞基多肽，其中OX40L受體結(jié)合域包括人OX40L的氨基酸51到183(SEQIDNO:1)，除了在位置180處的單個(gè)苯丙氨酸至丙氨酸的取代(F180A)。這個(gè)包含SEQIDNO:6的OX40L相關(guān)的多肽亞基不能結(jié)合人OX40。在另一個(gè)實(shí)例中，本披露提供可形成如上所述的六聚體蛋白的OX40L多肽亞基，但是其中OX40L受體結(jié)合域是小鼠或大鼠OX40L受體結(jié)合域，并且Fc結(jié)構(gòu)域是鼠類(lèi)IgG1Fc結(jié)構(gòu)域，并且三聚結(jié)構(gòu)域是小鼠TRAF2三聚結(jié)構(gòu)域。這個(gè)小鼠源性構(gòu)建體可被用于在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。多聚體OX40LIgG4P融合蛋白如上所述的OX40L融合多肽亞基可自組裝成三聚體或六聚體OX40L融合蛋白。因此，本披露提供包括六個(gè)如上所述的多肽亞基的六聚體蛋白。在實(shí)例中所描述的示例性多肽亞基自組裝成在此指定為“OX40LIgG4P融合蛋白”的六聚體蛋白。除非特別注明，在此所用的術(shù)語(yǔ)“OX40LIgG4P融合蛋白”是指人OX40LIgG4P融合蛋白。自組裝成六聚體蛋白OX40IgG4P融合蛋白的多肽亞基的氨基酸序列提供在SEQIDNO:4中。盡管如此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，許多其他序列也滿(mǎn)足在此闡述的關(guān)于六聚體OX40L融合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)。在某些方面中，OX40L融合多肽亞基也可以自組裝成包括三個(gè)多肽亞基的三聚體蛋白。例如，在Fc結(jié)構(gòu)域不展現(xiàn)完整的二聚化的情況下，這可能會(huì)發(fā)生。當(dāng)OX40在初級(jí)活化的T細(xì)胞(例如，來(lái)自人、食蟹猴、恒河猴或其任意組合的初級(jí)活化的CD4+T細(xì)胞)上表達(dá)時(shí)，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以特異性結(jié)合該OX40。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，結(jié)合親和力為約0.01pM至約1nM，例如，約0.1pM至約100pM，例如，約1pM至約10pM，例如，約1.0pM至約8.0pM，所有均如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。例如，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，結(jié)合親和力為約0.1pM、約0.5pM、約1pM、約2pM、約3pM、約4pM、約5pM、約6pM、約7pM、約8pM、約9pM、約10pM、約20pM、約30pM、約40pM、約50pM、約60pM、約70pM、約80pM、約90pM、約100pM、約500pM、或約1nM，所有均如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，結(jié)合親和力為約3.6pM。結(jié)合親和力可通過(guò)許多不同的方法和/或儀器進(jìn)行測(cè)量，相對(duì)結(jié)合親和力可以依賴(lài)于方法或儀器而變化，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員或普通技術(shù)人員將很好地理解的。如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)鑒于其多價(jià)的特性可以占據(jù)和交聯(lián)在細(xì)胞(例如，初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞)表面上的一些或全部OX40分子。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，并能實(shí)現(xiàn)在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上的20％受體占有率(EC20)，該六聚體蛋白的濃度為約0.01pM至約1nM，例如，約0.1pM至約100pM，例如，約0.5pM至約10pM，例如，或約0.5至約3.0pM，例如，約0.5pM、約0.6pM、約0.7pM、約0.8pM、約0.9pM、約1pM、約2pM、或約3pM，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，并能實(shí)現(xiàn)在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上的50％受體占有率(EC50)，該六聚體蛋白的濃度為約0.01pM至約1nM，例如，約0.1pM至約100pM，例如，約0.5pM至約10pM，例如，或約3.0pM至約10pM，例如，約2pM、約3pM、約4pM、約5pM、約6pM、約7pM、約8pM、約9pM、或約10pM，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，并能實(shí)現(xiàn)在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上的90％受體占有率(EC90)，該六聚體蛋白的濃度為約0.1pM至約10nM，例如，約1pM至約1nM，例如，約10pM至約100pM，例如，或約35至約70pM，例如，約30pM、約40pM、約50pM、約60pM、或約70pM，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，并可在約1.8pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC20，在約6.6pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC50，以及在約53pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC90，全部如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。例如，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在OX40過(guò)量表達(dá)尤爾卡特細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，結(jié)合親和力為約1.0pM至約24pM，例如，約12pM，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在OX40過(guò)量表達(dá)尤爾卡特細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，并可在約1.0pM至約15pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC20，在約1.0pM至約40pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC50，以及在約10pM至約100pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC90，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在OX40過(guò)量表達(dá)尤爾卡特細(xì)胞上表達(dá)的人OX40，并可在約7.2pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC20，在約16pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC50，以及在約57pM的濃度下實(shí)現(xiàn)EC90，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在另一個(gè)實(shí)例中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的食蟹猴CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的食蟹猴OX40，結(jié)合親和力為約1.0pM至約50pM，例如，約24pM，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在另一個(gè)實(shí)例中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以結(jié)合至在初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞上表達(dá)的恒河猴OX40，結(jié)合親和力為約1.0pM至約50pM，例如，約21pM，如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)在基于平板的測(cè)定法中可誘導(dǎo)活化的CD4+T細(xì)胞的劑量依賴(lài)性增殖。例如，在體外測(cè)定中使用在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)，在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞中在約1.0pM至約15pM(例如，8.0pM)的六聚體蛋白濃度處可實(shí)現(xiàn)20％最大增殖應(yīng)答(EC20)，在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞中在約5.0pM至約25pM(例如，14pM)的六聚體蛋白濃度處可實(shí)現(xiàn)50％最大增殖應(yīng)答(EC50)，并且在初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞中在約50pM至約65pM(例如，57pM)的六聚體蛋白濃度處可實(shí)現(xiàn)90％最大增殖應(yīng)答(EC90)，所有如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的。在某些方面中，在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可誘導(dǎo)從活化的CD4+T細(xì)胞(例如，人初級(jí)活化的CD4+T細(xì)胞)的劑量依賴(lài)性細(xì)胞因子釋放。在某些方面中，釋放的細(xì)胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或它們的任意組合。在某些方面中，該細(xì)胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、或它們的任意組合。同樣地，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可在初級(jí)活化的食蟹猴CD4+T細(xì)胞中和在初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放。在另外的方面中，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可在表達(dá)OX40的T細(xì)胞中在FcγR表達(dá)細(xì)胞的存在下激活NFκB途徑。例如，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可在表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB熒光素酶報(bào)告細(xì)胞中激活NFκB途徑，該尤爾卡特NFκB熒光素酶報(bào)告細(xì)胞在響應(yīng)于NFκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的刺激中產(chǎn)生熒光素酶?？商娲?，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可在表達(dá)人OX40、食蟹猴OX40或恒河猴OX40的細(xì)胞中激活NFκB途徑。在又另一個(gè)方面中，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)，當(dāng)作為有效劑量向需要癌癥治療的受試者給予時(shí)，可以促進(jìn)癌癥治療，例如通過(guò)減緩腫瘤生長(zhǎng)、停止腫瘤生長(zhǎng)、或減小現(xiàn)有腫瘤的尺寸。在某些方面中，可以在T細(xì)胞的存在下實(shí)現(xiàn)癌癥治療的促進(jìn)。在某些方面中，當(dāng)作為有效劑量向需要治療的受試者給予時(shí)，與給予同種型匹配的對(duì)照分子相比，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以使腫瘤生長(zhǎng)減少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％。在又進(jìn)一步方面中，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)，可通過(guò)結(jié)合至OX40來(lái)誘導(dǎo)活化的表達(dá)OX40的CD4+T細(xì)胞的增殖，但基本上不觸發(fā)針對(duì)活化的CD4+T細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性或抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。此外，在某些方面中，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可通過(guò)結(jié)合至OX40來(lái)誘導(dǎo)活化的、表達(dá)OX40的CD4+T細(xì)胞的增殖，但不結(jié)合C1q或不觸發(fā)NK細(xì)胞介導(dǎo)的活化的CD4+T細(xì)胞的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。編碼OX40L融合蛋白的多核苷酸本披露進(jìn)一步提供了包含編碼OX40L融合多肽亞基、或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸。編碼OX40LIgG4P融合蛋白的多肽亞基的示例性多核苷酸序列由SEQIDNO:3所代表。在某些方面中，編碼IgG4Fc結(jié)構(gòu)域、三聚結(jié)構(gòu)域和OX40L受體結(jié)合域的核酸序列以5'至3'方向連接，例如，以5'至3’方向連續(xù)地連接起來(lái)。在其他方面中，所提供的多核苷酸可進(jìn)一步包括信號(hào)序列，該信號(hào)序列編碼，例如，分泌信號(hào)肽或膜定位序列。本披露提供了編碼任何和所有OX40L融合多肽亞基體或多聚體(例如，包含該亞基的六聚體蛋白)的多核苷酸。在某些方面中，本披露提供了包含編碼OX40LIgG4P融合蛋白的核酸的多核苷酸。在某些方面中，核酸序列包含SEQIDNO:3。在此提供的編碼對(duì)照蛋白的多核苷酸，例如，本披露提供了包含編碼HuIgG-4FcPTF2OX40LF180A的核酸的多核苷酸。在某些方面中，該核酸包含SEQIDNO:5。編碼OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如OX40LIgG4P融合蛋白)的多核苷酸包括脫氧核糖核苷酸(DNA，cDNA)或核糖核苷酸(RNA)序列、或任一核苷酸的修飾形式，其編碼在此描述的融合多肽。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式的DNA和/或RNA。還提供的是包含含有一個(gè)或少數(shù)個(gè)缺失、添加和/或取代的核酸序列的多核苷酸。這樣的改變可以是連續(xù)的，或者可以分布在該核酸的不同位置?；旧舷嗤暮怂嵝蛄锌梢裕?，具有1個(gè)、或2個(gè)、或3個(gè)、或4個(gè)、或甚至更多的核苷酸缺失、添加和/或取代。在某些方面中，一個(gè)或更多個(gè)缺失、添加和/或取代不改變由多核苷酸序列編碼的閱讀框，使得修飾的(“突變體”)但基本上相同的多肽經(jīng)核酸的表達(dá)而產(chǎn)生。氨基酸(和/或核酸)的序列之間的相似性按照序列之間的相似性來(lái)表達(dá)，否則被稱(chēng)為序列一致性。序列一致性經(jīng)常按照一致性(或相似性)百分比來(lái)測(cè)量；百分比越高，兩個(gè)序列的初級(jí)活化結(jié)構(gòu)越相似?！耙恢滦园俜直?％)”在此被定義為在比對(duì)序列并且(必要時(shí))在候選和/或選擇的序列中引入空位以便獲得最大的序列一致性百分比之后，并且不考慮將任何保守氨基酸取代作為序列一致性的一部分，在候選序列中與所選擇的序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。因此，包括含有編碼OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸可以是至少約95％、或至少96％、經(jīng)常至少97％、98％、或99％相同于SEQIDNO:4或相同于其中的至少一個(gè)子序列。出于確定百分比同源性(即，序列相似性)或一致性百分比的目的的比對(duì)可以用在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式(例如，使用公眾或?qū)Ｓ兴惴?來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可使用成對(duì)比對(duì)方法來(lái)確定序列相似性，這些成對(duì)比對(duì)方法例如是BLAST、BLAST-2、ALIGN、或ALIGN-2、或多重序列比對(duì)方法，如Megalign(DNASTAR)、ClustalW或T-咖啡(T-Coffee)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定適當(dāng)?shù)挠?jì)分函數(shù)，例如，缺口罰分或得分矩陣用于測(cè)量比對(duì)，包括在被比較序列的全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最佳比對(duì)質(zhì)量所需的任何算法。此外，可以用結(jié)構(gòu)比對(duì)方法(例如，使用二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)信息來(lái)對(duì)齊兩個(gè)或更多個(gè)序列的方法)，或組合序列、結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育信息來(lái)鑒定和最佳對(duì)齊候選蛋白質(zhì)序列的混合法來(lái)實(shí)現(xiàn)序列比對(duì)。NCBI基本局部比對(duì)搜索工具(BLAST)(阿爾丘爾(Altschul)等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)(1990)215:403)可從若干來(lái)源獲得，這些來(lái)源包括國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，貝塞斯達(dá)，馬里蘭州)和在互聯(lián)網(wǎng)上，用于與序列分析程序BLASTP、BLASTN、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX連接使用。如何使用這個(gè)程序確定序列一致性的描述在互聯(lián)網(wǎng)的NCBI網(wǎng)站上可獲得。因此，基本上相同或基本上相似于SEQIDNO:4的核酸序列被涵蓋在本披露之內(nèi)。如果序列是以逐個(gè)核苷酸為基礎(chǔ)與參比序列(例如，SEQIDNO:4)的至少一個(gè)子序列相同，則序列基本上與SEQIDNO:4相同。這樣的核酸可以包括，例如，相對(duì)于SEQIDNO:4的插入、缺失和取代。例如，這些核酸可以與參比核酸至少約70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或甚至99％相同，或可以編碼與參考多肽序列(例如，SEQIDNO:4)至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或甚至99％相同的多肽。另外，包括編碼OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸也可以包括多核苷酸序列，例如，促進(jìn)核酸的表達(dá)或復(fù)制的表達(dá)調(diào)控序列和/或載體序列。同樣地，包括編碼OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸可以包括對(duì)所編碼的多肽賦予功能屬性的另外的編碼序列。這樣的序列包括分泌信號(hào)序列和膜定位信號(hào)。包括編碼OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)被引入載體，例如真核表達(dá)載體。因此，本披露提供了包含在此提供的多核苷酸的載體。將表達(dá)載體設(shè)計(jì)來(lái)通過(guò)提供啟動(dòng)和增強(qiáng)cDNA的轉(zhuǎn)錄和保證其正確的剪接和聚腺苷酸化的調(diào)控序列允許編碼OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的多核苷酸序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。許多表達(dá)載體是對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言已知的，并且是商業(yè)上可獲得的，或可以根據(jù)傳統(tǒng)的分子生物學(xué)程序從個(gè)別組件組裝的。表達(dá)調(diào)控序列和表達(dá)載體的選擇將依賴(lài)于宿主細(xì)胞的選擇?？梢圆捎枚喾N多樣的表達(dá)宿主/載體組合。對(duì)于真核宿主有用的表達(dá)載體包括例如含有來(lái)自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、以及巨細(xì)胞病毒的表達(dá)控制序列的載體。對(duì)于細(xì)菌宿主有用的表達(dá)載體包括已知細(xì)菌質(zhì)粒，諸如來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括pCR1、pBR322、pMB9以及其衍生物，更廣泛的宿主范圍質(zhì)粒，諸如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。對(duì)于表達(dá)OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的合適的宿主細(xì)胞包括在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下的原核生物、酵母、昆蟲(chóng)或高等真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭陰性或革蘭陽(yáng)性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。高等真核細(xì)胞包括如下所述哺乳動(dòng)物起源的已建立的細(xì)胞系。還可以采用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)生(包括抗體產(chǎn)生)方法的其他信息可以在例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2008/0187954、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,413,746和6,660,501、以及國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO2004/009823中找到，這些專(zhuān)利各自通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。還提供的是包括如在此提供的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。還可以有利地采用不同的哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以表達(dá)在此提供的多肽亞基或六聚體蛋白?？梢栽诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，因?yàn)榇祟?lèi)蛋白質(zhì)總體上被正確地折疊，適當(dāng)?shù)匦揎棽⑶彝耆鹱饔?。適合的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括HEK-293和HEK-293T、由格盧茲曼(Gluzman)(細(xì)胞23:175，1981)描述的猴腎細(xì)胞的COS-7系、以及包括例如L細(xì)胞、C127、3T3、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK細(xì)胞系的其他細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包含非轉(zhuǎn)錄元件，諸如復(fù)制原點(diǎn)、連接有待表達(dá)的基因的適合的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、以及其他5'或3'側(cè)接非轉(zhuǎn)錄序列、以及5'或3'非翻譯序列(諸如必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn))，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。用于產(chǎn)生昆蟲(chóng)細(xì)胞中的異源蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)通過(guò)盧科和薩莫斯(Luckow和Summers)，生物技術(shù)(BioTechnology)6:47(1988)評(píng)價(jià)。蛋白質(zhì)例如OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的表達(dá)和純化可以使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行。在此討論或參考了這樣的方法的實(shí)例。表達(dá)后，純化的蛋白質(zhì)有許多用途，包括例如功能分析、抗體產(chǎn)生和診斷，以及如下所述的預(yù)防和治療用途。例如，在此提供的多肽亞基或六聚體蛋白可被用于生產(chǎn)藥物組合物，包括適合用于預(yù)防和/或治療給藥的疫苗組合物。通過(guò)轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以按照任何合適的方法來(lái)純化。此類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)方法包括色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜以及尺寸分級(jí)柱色譜)、離心、差別溶解度，或者通過(guò)用于蛋白質(zhì)純化的任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。親和標(biāo)簽諸如六組氨酸(SEQIDNO:11)、麥芽糖結(jié)合域、流感外殼序列以及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可以附接至蛋白質(zhì)，以便允許蛋白質(zhì)通過(guò)合適的親和柱后較容易地得到純化。還可以使用諸如蛋白質(zhì)水解、核磁共振和x射線結(jié)晶的此類(lèi)技術(shù)來(lái)物理性表征分離的蛋白質(zhì)。例如，可以首先使用商業(yè)上可獲得的蛋白濃縮過(guò)濾器例如艾美康恩(Amicon)或密理博皮里康恩(MilliporePellicon)超濾單元濃縮來(lái)自將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中的系統(tǒng)的上清液。濃縮步驟之后，濃縮物可以施加到適合的純化基質(zhì)?？商娲?，可以采用陰離子交換樹(shù)脂，例如具有側(cè)接的二乙氨基乙基(DEAE)基團(tuán)的基質(zhì)或基底?；|(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、右旋糖酐、纖維素或在蛋白質(zhì)純化中常用的其他類(lèi)型?？商娲兀梢圆捎藐?yáng)離子交換步驟。適合的陽(yáng)離子交換劑包括含有磺丙基或羧甲基的各種不可溶基質(zhì)。最后，可以使用采用疏水性RP-HPLC介質(zhì)(例如，具有側(cè)接甲基或其他脂族基團(tuán)的硅膠)的一個(gè)或多個(gè)反相高效液相色譜(RP-HPLC)步驟，以便進(jìn)一步純化流感B/山形病毒結(jié)合分子。還可以采用不同組合的一些或所有上述純化步驟以便提供均質(zhì)的重組蛋白。在細(xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的OX40L融合多肽亞基或如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以例如通過(guò)以下方法分離：最初從細(xì)胞沉淀提取，然后進(jìn)行一次或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻色譜步驟。可以采用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行最終純化步驟。用于重組蛋白表達(dá)的微生物細(xì)胞可以通過(guò)任何常規(guī)方法來(lái)破壞，這些方法包括凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破壞或使用細(xì)胞溶解劑。藥物組合物和給藥方法制備和給予如在此提供的六聚體蛋白(例如，如在此提供的OX40LIgG4P融合蛋白)至對(duì)其有需要的受試者，例如，以便增強(qiáng)在癌癥患者中的免疫應(yīng)答的方法，例如，以便抑制或減少腫瘤生長(zhǎng)的方法，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的或可以容易地確定的。如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的給藥途徑可以是，例如，口服、腸胃外、通過(guò)吸入或局部。如在此所用的術(shù)語(yǔ)腸胃外包括例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸或經(jīng)陰道給藥。雖然所有這些給藥形式可清楚地考慮為適合的形式，但對(duì)于給予形式的另一個(gè)實(shí)例是用于注射、特別是用于靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射或滴注的溶液。通常，合適的藥物組合物可以包括但不限于緩沖液(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液)、表面活性劑(如聚山梨酯)、穩(wěn)定劑試劑(例如人類(lèi)白蛋白)等。在與在此的傳授內(nèi)容相容的其他方法中，如在此提供的六聚體蛋白(例如，在此提供的OX40LIgG4P融合蛋白)可直接遞送到有害細(xì)胞群的位點(diǎn)，從而增加患病組織對(duì)治療劑的暴露。如在此提供的某些藥物組合物可以按一種可接受的劑型(包括例如膠囊、片劑、水性混懸液或溶液)來(lái)口服給予。某些藥物組合物也可以通過(guò)鼻氣霧劑或吸入來(lái)給予。使用芐醇或其他合適的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進(jìn)劑、和/或其他常規(guī)增溶劑或分散劑，這樣的組合物可以作為鹽水中的溶液來(lái)制備?？膳c載體材料相組合以便產(chǎn)生單一劑型的如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的量將取決于所治療的受試者和具體給予模式而變化。該組合物可以作為單次劑量，多次劑量或在一個(gè)既定時(shí)間段中的輸注給藥。也可以調(diào)整劑量方案以便提供最佳期望應(yīng)答(例如治療性或預(yù)防性應(yīng)答)?！爸委熡行┝炕蛄俊被颉坝行Я俊币庵溉缭诖颂峁┑牧垠w蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)當(dāng)被給予時(shí)引起對(duì)患有待治療疾病或病癥的治療的積極治療應(yīng)答的量。試劑盒本披露進(jìn)一步提供包含如在此提供的六聚體蛋白(例如，在此描述的OX40LIgG4P融合蛋白)和可用于執(zhí)行在此描述的方法的試劑盒。在某些實(shí)施例中，試劑盒在一個(gè)或多個(gè)容器中包含至少一種純化的如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到所披露的、如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以容易地與在本領(lǐng)域中熟知的已建立的試劑盒形式之一結(jié)合。免疫測(cè)定如在此提供的六聚體蛋白，例如，OX40LIgG4P融合蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法測(cè)定特異性和/或選擇性結(jié)合。可使用的免疫測(cè)定包括但不限于使用如以下技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)，例如：蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、熒光集落測(cè)定(FFA)、微量中和測(cè)定、血凝抑制測(cè)定(HAI)、“夾心”免疫測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定、補(bǔ)體固定測(cè)定、免疫放射測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、僅舉幾個(gè)例子。此類(lèi)測(cè)定是常規(guī)的并且在本領(lǐng)域是熟知的(參見(jiàn)，例如奧蘇貝爾等人編著，1994，《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(約翰威利父子公司，紐約)第1卷，其通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此)。FFA，微量中和測(cè)定，和HAI將在以下實(shí)例中進(jìn)行詳細(xì)討論。適合于確定在此提供的六聚體蛋白的結(jié)合特性的方法和試劑是在本領(lǐng)域中已知的和/或可商購(gòu)的。設(shè)計(jì)用于此類(lèi)動(dòng)力學(xué)分析的設(shè)備和軟件是可商購(gòu)的(例如，軟件，GE醫(yī)療集團(tuán)；軟件，Sapidyne儀器)。免疫增強(qiáng)和治療的方法在抗原激活過(guò)程中或之后通過(guò)在活化的T細(xì)胞(例如活化的CD4+T細(xì)胞)上接合OX40在受試者(例如，哺乳動(dòng)物受試者，如人類(lèi)受試者)內(nèi)增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答可以利用各種各樣的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。選擇的方法將主要取決于期望增強(qiáng)免疫應(yīng)答的抗原的類(lèi)型，并且可用的各種方法將在下面討論。無(wú)論哪種方法被選中，可向受試者(例如人類(lèi)受試者)給予如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)使得在T細(xì)胞被抗原致敏過(guò)程中或之后不久它呈現(xiàn)于受試者的T細(xì)胞。在受試者(例如人類(lèi)受試者)內(nèi)使用如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)激活免疫應(yīng)答的示例性方法被呈現(xiàn)于PCT公開(kāi)號(hào)WO2006/121810中，其通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。在某些方面中，本披露提供了促進(jìn)活化的T細(xì)胞(例如，活化的CD4+T細(xì)胞)存活或增殖的方法，該方法包括在該六聚體蛋白可特異性結(jié)合在T細(xì)胞(例如，活化的CD4+T細(xì)胞)表面上的OX40的條件下使活化的T細(xì)胞(例如，活化的CD4+T細(xì)胞)接觸如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)。在某些方面中，該接觸是體外的。在某些方面中，該接觸是體內(nèi)的，例如，經(jīng)由向需要治療的受試者給予有效劑量的六聚體蛋白。在某些方面中，該接觸與T細(xì)胞激活(例如，抗原激活)同時(shí)發(fā)生，在某些方面中，該接觸在T細(xì)胞激活后發(fā)生。在進(jìn)一步方面中，本披露提供誘導(dǎo)從活化的T細(xì)胞(例如，活化的CD4+T細(xì)胞)的細(xì)胞因子釋放的方法，該方法包括使活化的T細(xì)胞(例如，活化的CD4+T細(xì)胞)接觸如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)，其中該六聚體蛋白可特異性結(jié)合在活化的T細(xì)胞(例如，活化的CD4+T細(xì)胞)表面上。在某些方面中，該接觸是體外的。在某些方面中，該接觸是體內(nèi)的，例如，經(jīng)由向需要治療的受試者給予有效劑量的六聚體蛋白。在某些方面中，該接觸與T細(xì)胞激活(例如，抗原激活)同時(shí)發(fā)生，在某些方面中，該接觸在T細(xì)胞激活后發(fā)生。在某些方面中，該細(xì)胞因子可以是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或它們的任意組合。在某些方面中，該細(xì)胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、或它們的任意組合。在某些方面中，活化的T細(xì)胞(例如，活化的CD4+T細(xì)胞)是人CD4+T細(xì)胞、食蟹猴CD4+T細(xì)胞、恒河猴CD4+T細(xì)胞、或它們的組合。本披露進(jìn)一步提供促進(jìn)T細(xì)胞活化的方法，該方法包括使T細(xì)胞接觸如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)，其中該六聚體蛋白可以特異性結(jié)合T細(xì)胞表面上的OX40。在某些方面中，在抗原，例如，腫瘤抗原的存在下接觸發(fā)生。在某些方面中，該方法進(jìn)一步包括通過(guò)IgG4-Fc結(jié)構(gòu)域與表達(dá)FcγR的細(xì)胞的相互作用使六聚體蛋白交聯(lián)，這些表達(dá)FcγR的細(xì)胞例如是：B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞或漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞、濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、NK細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞、來(lái)自原發(fā)人腫瘤或腫瘤引流或非引流淋巴結(jié)的CD45+細(xì)胞、來(lái)自其他二級(jí)或三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的CD45+細(xì)胞，或它們的組合。在某些方面中，T細(xì)胞活化可以通過(guò)NFκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的刺激進(jìn)行測(cè)量。在某些方面中，該接觸是體外的。在某些方面中，該接觸是體內(nèi)的，例如，經(jīng)由向需要治療的受試者給予有效劑量的六聚體蛋白。本披露進(jìn)一步提供誘導(dǎo)ICOS或程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)在T-細(xì)胞上的表達(dá)的方法，該方法包括使T細(xì)胞接觸如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)，其中該六聚體蛋白可以特異性結(jié)合T細(xì)胞表面上的OX40。本披露進(jìn)一步提供在受試者中治療癌癥的方法，該方法包括向需要治療的受試者給予有效量的在此提供的六聚體蛋白，例如，OX40LIgG4P融合蛋白或包含六聚體蛋白的組合物或配制品。在某些方面中，該癌癥是實(shí)體瘤。根據(jù)這個(gè)方法，該六聚體蛋白或組合物的給予可以抑制腫瘤生長(zhǎng)；可以促進(jìn)腫瘤縮小、或兩者。在某些方面中，在T細(xì)胞的存在下實(shí)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)抑制。術(shù)語(yǔ)“癌癥”、“腫瘤”、“癌性的”以及“惡性的”是指或描述典型地特征為細(xì)胞生長(zhǎng)失控的哺乳動(dòng)物的生理病狀。癌癥的實(shí)例包括但不限于惡性腫瘤，包括腺癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病。此類(lèi)癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(諸如肝癌和肝細(xì)胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌(包括激素介導(dǎo)的乳腺癌，參見(jiàn)例如，英尼斯(Innes)等人(2006)英國(guó)癌癥雜志(Br.J.Cancer)94:1057-1065)、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、骨髓瘤(諸如多發(fā)性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌(諸如腎細(xì)胞癌和維爾姆斯氏瘤)、基底細(xì)胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食道癌、各種類(lèi)型的頭頸癌(包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌)、以及粘液性起源的癌癥(諸如粘液性卵巢癌)、膽管癌(肝)以及腎乳頭狀癌。一些實(shí)施例針對(duì)在對(duì)其有需要的受試者中預(yù)防或治療癌癥的方法，該方法包括向受試者給予有效量的如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)、包含六聚體蛋白的組合物或配制品、或如在此所述的多核苷酸、載體、或宿主細(xì)胞。用于治療癌癥的組合物的有效劑量取決于許多不同因素而變化，這些因素包括給予方式、靶標(biāo)部位、患者的生理狀態(tài)、患者是人還是動(dòng)物、所給予的其他藥劑，以及治療是預(yù)防性還是治療性的。通常，患者是人，但是也可以治療非人哺乳動(dòng)物包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。治療劑量可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來(lái)滴定，以最優(yōu)化安全性和功效。本披露的組合物可以通過(guò)任何合適方法來(lái)給予，例如腸胃外、心室內(nèi)、口服、通過(guò)吸入噴霧劑、局部、直腸、經(jīng)鼻、口腔、經(jīng)陰道或經(jīng)由植入的儲(chǔ)槽。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病變內(nèi)以及顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。本披露進(jìn)一步提供在受試者中增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呓o予治療有效量的如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)或包含六聚體蛋白的組合物或配制品。待治療的受試者可以是需要治療的任何動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物，在某些方面中，受試者是人類(lèi)受試者。在其最簡(jiǎn)單的形式中，將向受試者給予的制劑是以常規(guī)的劑量形式給予的如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)，并且在一些方面中，與如本文別處描述的藥用賦形劑、載體或稀釋劑組合。如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可以通過(guò)如本文中別處所述的任何合適的方法給予，例如，通過(guò)靜脈內(nèi)輸注給予。在某些方面中，如在此提供的六聚體蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)可被引入到腫瘤中或引入到腫瘤細(xì)胞附近。所有類(lèi)型的腫瘤都潛在適合于通過(guò)這個(gè)方法來(lái)治療，這些腫瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、腎癌、結(jié)腸癌和膀胱癌、以及黑色素瘤、肉瘤和淋巴瘤。***除非另外指示，否則本披露采用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA以及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。此類(lèi)技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分解釋。參見(jiàn)，例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，編著(1989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(MolecularCloningALaboratoryManual)(第2版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))；薩姆布魯克等人，編著(1992)《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約)；D.N.格洛弗(D.N.Glover)編著，(1985)《DNA克隆》(DNACloning)，第I卷和第II卷；蓋特(Gait)，編著，(1984)《寡核苷酸合成》(OligonucleotideSynthesis)；穆利斯(Mullis)等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,195；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)，編著，(1984)《核酸雜交》(NucleicAcidHybridization)；黑姆斯和希金斯，編著，(1984)《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(TranscriptionAndTranslation)；Freshney(1987年)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(CultureOfAnimalCells)(阿倫利斯公司(AlanR.Liss,Inc.))；《固定化細(xì)胞與酶》(ImmobilizedCellsAndEnzymes)(IRL出版社)(1986)；派爾巴爾(Perbal)(1984)《分子克隆實(shí)用指南》(APracticalGuideToMolecularCloning)；專(zhuān)注，《酶學(xué)方法》(MethodsInEnzymology)(學(xué)術(shù)出版社公司(AcademicPress,Inc.)，紐約)；米勒(Miller)和卡洛斯(Calos)編著(1987)《用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(GeneTransferVectorsForMammalianCells)，(冷泉港實(shí)驗(yàn)室)；吳(Wu)等人，編著，《酶學(xué)方法》(MethodsInEnzymology)，第154和155卷；邁耶(Mayer)和沃克(Walker)，編著，(1987)《在細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology)(學(xué)術(shù)出版社，倫敦)；韋爾(Weir)和布萊克威爾(Blackwell)，編著，(1986)《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》(HandbookOfExperimentalImmunology)，卷I-IV；《操縱小鼠胚胎》(ManipulatingtheMouseEmbryo)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，(1986)；和奧蘇貝爾(Ausubel)等人(1989)《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(約翰威利父子公司(JohnWileyandSons)，巴爾的摩，馬里蘭州)。在博雷貝克(Borrebaeck)，編著(1995)《抗體工程》(AntibodyEngineering)(第2版；牛津大學(xué)出版社)中，提出了抗體工程化的普遍原理。在雷克伍德(Rickwood)等人，編著(1995)《蛋白質(zhì)工程實(shí)用方法》(ProteinEngineering,APracticalApproach)(在牛津大學(xué)出版社的IRL出版社，牛津，英格蘭)中提出了蛋白質(zhì)工程化的普遍原理。在Nisonoff(1984)《分子免疫學(xué)》(MolecularImmunology)(第2版；Sinauer協(xié)會(huì)，桑德蘭，馬薩諸塞州)；以及斯圖爾德(Steward)(1984)《抗體，它們的結(jié)構(gòu)和功能》(Antibodies,TheirStructureandFunction)(查普曼(Chapman)和霍爾(Hall)，紐約，紐約州)中提出了抗體和抗體半抗原結(jié)合的普遍原理。另外，本領(lǐng)域中已知的免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法，不再做具體的描述，大體上遵循以下：《免疫學(xué)現(xiàn)代方法》，約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons)，紐約；斯蒂茨(Stites)等人，編著(1994)《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)》(第8版；阿普爾頓和蘭格公司(Appleton&Lange)，諾瓦克，康涅狄格州)；以及米歇爾(Mishell)和椎木(Shiigi)編著(1980)《在細(xì)胞免疫學(xué)中的選擇方法》(SelectedMethodsinCellularImmunology)(W.H.弗里曼與公司(W.H.FreemanandCo.)，紐約州)。提出免疫學(xué)的普遍原理的標(biāo)準(zhǔn)參考著作包括《免疫學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinImmunology)，約翰·威利與父子公司(JohnWiley&Sons)，紐約；克萊因(KleinJ.)(1982)，《免疫學(xué)：自身-非自身辨別科學(xué)》(Immunology:TheScienceofSelf-NonselfDiscrimination)(約翰·威利與父子，紐約)；肯尼特(Kennett)等人，編著(1980)《單克隆抗體、雜交瘤：生物分析中的新維度》(MonoclonalAntibodies,Hybridoma:ANewDimensioninBiologicalAnalyses)(Plenum出版社，紐約州)；坎貝爾(Campbell)(1984)《生物化學(xué)與分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的“單克隆抗體技術(shù)”》("MonoclonalAntibodyTechnology"inLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)，編著，伯登(Burden)等人，(愛(ài)思唯爾公司(Elsevier)，阿姆斯特丹)；格士柏(Goldsby)等人，編著(2000)《庫(kù)比免疫學(xué)》(KubyImmunology)(第4版；H.Freemand與公司)；羅義特(Roitt)等人，(2001)《免疫學(xué)》(Immunology)(第6版；倫敦：莫斯比)；阿巴斯(Abbas)等人，(2005)，《細(xì)胞和分子免疫學(xué)》(CellularandMolecularImmunology)(第5版；愛(ài)思唯爾公司健康科學(xué)部(ElsevierHealthSciencesDivision))；Kontermann和迪貝爾(Dubel)(2001)《抗體工程》(AntibodyEngineering)(施普林格出版社(SpringerVerlag))；薩姆布魯克(Sambrook)和拉塞爾(Russell)(2001)《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(冷泉港出版社)；勒溫(Lewin)(2003)《基因VIII》(GenesVIII)(普倫蒂斯·霍爾出版(PrenticeHall)2003)；哈洛(Harlow)和萊恩(Lane)(1988)《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies:ALaboratoryManual)(冷泉港出版社)；迪芬巴赫(Dieffenbach)和Dveksler(2003)PCR引物(PCRPrimer)(冷泉港出版社)。以上引用的所有參考文獻(xiàn)，連同在此引用的所有參考文獻(xiàn)，是通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。通過(guò)說(shuō)明而不是通過(guò)限制的方式，提供以下實(shí)例。實(shí)例表1-1：縮略詞列表與術(shù)語(yǔ)定義縮略詞或術(shù)語(yǔ)定義1A7小鼠IgG1κ同種型對(duì)照抗體A丙氨酸A375人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)DCC抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性BSA牛血清白蛋白℃攝氏度CI置信區(qū)間CDC補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性CR完全應(yīng)答Cyno食蟹猴DM-L密度介質(zhì)-淋巴細(xì)胞EC有效濃度ECf導(dǎo)致最大效應(yīng)的f％的有效濃度EC20導(dǎo)致最大效應(yīng)的20％的有效濃度EC50半最大有效濃度EC90導(dǎo)致最大效應(yīng)的90％的有效濃度表1-1：縮略詞列表與術(shù)語(yǔ)定義表1-1：縮略詞列表與術(shù)語(yǔ)定義縮略詞或術(shù)語(yǔ)定義PBS磷酸鹽緩沖鹽水PHA-L植物血凝素-白細(xì)胞凝集素PI碘化丙啶pM皮摩爾RBC紅血球RBD受體結(jié)合域Rh重組人ROA給藥途徑rpm每分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù)RT室溫SC皮下SD標(biāo)準(zhǔn)偏差TCRT細(xì)胞受體TGI腫瘤生長(zhǎng)抑制TNFR腫瘤壞死因子受體TRAF2腫瘤壞死相關(guān)因子2TregT調(diào)節(jié)性V體積實(shí)例1：OX40LIgG4PFc融合蛋白的工程化OX40LIgG4P融合蛋白是遺傳工程化的人OX40配體(OX40L)六聚體融合蛋白，該六聚體融合蛋白由三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成(圖1)：人IgG4PFc、TRAF2的異亮氨酸拉鏈、和人OX40L的受體結(jié)合域。N末端Fc由鉸鏈區(qū)(HC)和人類(lèi)免疫球蛋白G4(IgG4)的γ重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2和3(CH2，CH3)組成。核心鉸鏈區(qū)包括在位置228(根據(jù)EU編號(hào))處的絲氨酸至脯氨酸的突變，該突變賦予完整的重鏈間二硫鍵形成。IgG4PFc結(jié)構(gòu)域直接融合到人腫瘤壞死因子2(TRAF2)的氨基酸殘基310-349衍生的異亮氨酸拉鏈三聚結(jié)構(gòu)域。融合到TRAF2域的C-末端的是人OX40L(基因名稱(chēng)TNFSF4)的胞外受體結(jié)合域(RBD)的氨基酸殘基51-183。該TRAF2域穩(wěn)定OX40LRBD的同源三聚體結(jié)構(gòu)以便使OX40能夠結(jié)合和活化，而IgG4PFc結(jié)構(gòu)域賦予血清穩(wěn)定性、OX40L三聚體的二聚化，并促進(jìn)六聚體融合蛋白的Fcγ受體聚集。遺傳工程化OX40LIgG4P融合蛋白是通過(guò)將兩個(gè)單獨(dú)的DNA片段融合在一起，且然后將融合的DNA克隆入質(zhì)粒載體，從而產(chǎn)生編碼完整融合蛋白的單個(gè)基因(稱(chēng)為huIgG4PFcTF2OX40L)。含有預(yù)先通過(guò)位點(diǎn)定向誘變引入到IgG4DNA序列中的S228PIgG4P突變的內(nèi)部質(zhì)粒在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中作為模板以產(chǎn)生IgG4PFcDNA片段。含有編碼TRAF2和OX40LRBD的融合物的DNA序列的獨(dú)立的內(nèi)部質(zhì)粒被用作PCR的模板以產(chǎn)生第二DNA片段。后一片段通過(guò)重疊延伸PCR與IgG4PFc片段重新組合，產(chǎn)生編碼全長(zhǎng)融合蛋白的單個(gè)DNA片段。在PCR中使用的寡核苷酸引物被設(shè)計(jì)來(lái)引入5′BssHII限制位點(diǎn)和3′N(xiāo)heI限制位點(diǎn)來(lái)在內(nèi)部pOE質(zhì)粒表達(dá)載體上消化、連接并克隆全長(zhǎng)片段。插入物的核苷酸序列包含下列核苷酸序列(SEQIDNO：3)，并且來(lái)自這個(gè)構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物(在此也被稱(chēng)為huIgGFcPTF2OX40L)包括下列氨基酸序列(SEQIDNO：4)：SEQIDNO：3：huIgG4FcPTF2OX40L的DNA序列(5’至3’開(kāi)放閱讀框)GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTCTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAGGACCAGGATAAGATCGAGGCTCTGTCCTCCAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCCATCGGCCTGAAGGACCTGGCCATGGCTGACCTGGAACAGAAAGTGCTGGAAATGGAAGCCTCCACACAGGTGTCACACAGATACCCCCGGATCCAGTCCATTAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTTATCCTGACCTCCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACTCCGTGATCATCAACTGCGACGGGTTCTACCTGATCTCCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGAACATCTCCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACTCCCTGATGGTGGCCTCTCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCTCCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGTTCTGCGTGCTGSEQIDNO：4：huIgG4FcPTF2OX40L的氨基酸序列(N至C末端)IgG4P-Fc結(jié)構(gòu)域以常規(guī)字體顯示，其中S228P突變帶有下劃線，TRAF2三聚結(jié)構(gòu)域帶有下劃線，并且OX40L的RBD以粗體表示。除了這個(gè)構(gòu)建體，也產(chǎn)生了變體(F180A)，其編碼對(duì)應(yīng)于OX40L中的位置180處的氨基酸的苯丙氨酸(F)至丙氨酸(A)的突變。這種突變消除了OX40L蛋白的OX40受體結(jié)合活性，因此所得的分子可以作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照以驗(yàn)證融合蛋白的特異性活性。這個(gè)變體是使用編碼位置180處的丙氨酸的引物和編碼融合蛋白的質(zhì)粒作為模板通過(guò)位點(diǎn)定向誘變產(chǎn)生的。插入物的核苷酸序列包含下列核苷酸序列(SEQIDNO：5)，并且來(lái)自這個(gè)構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物(在此也被稱(chēng)為huIgGFcPTF2OX40LF180A)包括下列氨基酸序列(SEQIDNO：6)：huIgG4FcPTF2OX40LF180A的DNA序列(5’至3’開(kāi)放閱讀框)GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTCTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAGGACCAGGATAAGATCGAGGCTCTGTCCTCCAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCCATCGGCCTGAAGGACCTGGCCATGGCTGACCTGGAACAGAAAGTGCTGGAAATGGAAGCCTCCACACAGGTGTCACACAGATACCCCCGGATCCAGTCCATTAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTTATCCTGACCTCCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACTCCGTGATCATCAACTGCGACGGGTTCTACCTGATCTCCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGAACATCTCCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACTCCCTGATGGTGGCCTCTCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCTCCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGGCCTGCGTGCTGhuIgG4PFcTF2OX40LF180A的氨基酸序列(N至C末端)IgG4P-Fc結(jié)構(gòu)域以常規(guī)字體顯示，S228P突變帶有下劃線，TRAF2三聚結(jié)構(gòu)域帶有下劃線，OX40L的RBD以粗體表示，并且F180A突變帶有雙下劃線。huIgG4PFcTF2OX40L和huIgG4PFcTF2OX40LF180A構(gòu)建體用圖示于圖2中。還構(gòu)建了第三種變體，huIgGlFcTF2OX40L，其用人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域替換了IgG4PFc結(jié)構(gòu)域。電腦設(shè)計(jì)這個(gè)構(gòu)建體并通過(guò)基因合成(基因技術(shù)生命技術(shù)公司(LifeTechnologies))來(lái)制備，而不是采用重疊延伸PCR。如先前所描述的，合成的基因片段被用作PCR模板，以引入BssHII和NheI限制位點(diǎn)，用于消化和連接到pOE質(zhì)粒表達(dá)載體。插入物的核苷酸序列包含下列核苷酸序列(SEQIDNO：7)，并且來(lái)自這個(gè)構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物(在此也被稱(chēng)為huIgGFcPTF2OX40LF180A)包括下列氨基酸序列(SEQIDNO：8)：SEQIDNO：7：huIgG1TF2OX40L的DNA序列(5’至3’開(kāi)放閱讀框)GATAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCTAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAGGACCAGGATAAGATCGAGGCTCTGTCCTCCAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCCATCGGCCTGAAGGACCTGGCCATGGCTGACCTGGAACAGAAAGTGCTGGAAATGGAAGCCTCCACACAGGTGTCACACAGATACCCCCGGATCCAGTCCATTAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTTATCCTGACCTCCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACTCCGTGATCATCAACTGCGACGGGTTCTACCTGATCTCCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGAACATCTCCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACTCCCTGATGGTGGCCTCTCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCTCCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGTTCTGCGTGCTGSEQIDNO：8：huIgG1FcTF2OX40L的氨基酸序列(N至C末端)IgG1-Fc結(jié)構(gòu)域以常規(guī)字體顯示，TRAF2三聚結(jié)構(gòu)域帶有下劃線，并且OX40L的RBD以粗體表示。所產(chǎn)生的、編碼用于融合蛋白的pOE質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中用于瞬時(shí)表達(dá)，然后通過(guò)蛋白A層析和凝膠過(guò)濾將可溶性融合蛋白從培養(yǎng)介質(zhì)中純化。使用均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法(Cisbio，目錄#62C16PAE)來(lái)對(duì)純化的融合蛋白進(jìn)行生化表征。進(jìn)行HTRF競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)以評(píng)估huIgG4PFcTF2OX40L對(duì)CD16a(FcγRIIIa)的V158高親和力變體的結(jié)合活性，該CD16A(FcγRIIIa)的V158高親和力變體介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)。在這個(gè)測(cè)定中，F(xiàn)cγRIIIa和γ鏈在HEK293細(xì)胞中共表達(dá)，并使用SNAP-鋱供體染料標(biāo)記。在0.1-1μM之間濃度的huIgG4PFcTF2OX40L蛋白的制劑被添加到標(biāo)記的細(xì)胞中，隨后加入受體染料標(biāo)記的人IgG抗體(IgG-d2)。IgG-d2結(jié)合標(biāo)記的FcγRIIIa，并引發(fā)了可測(cè)量的FRET信號(hào)。通過(guò)huIgG4PFcTF2OX40L競(jìng)爭(zhēng)IgG-d2結(jié)合抑制了FRET，并且這個(gè)負(fù)信號(hào)與融合蛋白對(duì)于FcγRIIIa的結(jié)合親和力成反比。HuIgG4PFcTF2OX40L結(jié)合FcγRIIIa，半最大應(yīng)答(EC50)為500nM。相比之下，人IgG1單克隆抗體結(jié)合的EC50為220nM，表明相對(duì)于典型的IgG1抗體，該融合蛋白對(duì)于FcγRIIIa的親和力減少約2.3倍。huIgG1FcTF2OX40L變體也在HTRF測(cè)定中進(jìn)行了測(cè)試，并且它結(jié)合FcγRIIIa的EC50為4nM，或者相對(duì)于IgG1抗體親和力增加了約55倍。實(shí)例2：OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)在活化的人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、大鼠和小鼠T細(xì)胞表面上表達(dá)的天然OX40的結(jié)合親和力和受體占有率在這個(gè)實(shí)例中，進(jìn)行了基于細(xì)胞的平衡結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)量OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)人、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、大鼠和小鼠T細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的OX40的結(jié)合的表觀親和力。另外，進(jìn)行該平衡結(jié)合測(cè)定以確定OX40LIgG4P融合蛋白在什么濃度下實(shí)現(xiàn)了20％、50％、或90％的人OX40受體占有率(EC20、EC50、和EC90)。OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞和表達(dá)OX40的尤爾卡特T細(xì)胞的結(jié)合OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合至人OX40的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)和在平衡時(shí)結(jié)合20％、50％、或90％的人OX40受體(EC20、EC50和EC90)的濃度是從OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)表達(dá)OX40的初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞或表達(dá)OX40的人尤爾卡特T細(xì)胞的結(jié)合曲線計(jì)算的。對(duì)于結(jié)合于活化的初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞，CD4+細(xì)胞首先從肝素鈉抗凝全血中分離，該肝素鈉抗凝全血是通過(guò)米迪繆尼供血者程序(MedImmuneBloodDonorProgram)從健康的供體中獲得的，根據(jù)以下方案進(jìn)行：1.將1mL干細(xì)胞技術(shù)RosetteSepCD4+T細(xì)胞分離試劑盒抗體混合物添加至每20mL的全血，混合，并在室溫(RT)下孵育20分鐘(min)。2.將血液用無(wú)菌的室溫FACS緩沖液(PBS中的2％熱滅活的新生小牛血清，pH7.2)以1:1稀釋?zhuān)⑶以贒M-L介質(zhì)上鋪一薄層，接著在臺(tái)式離心機(jī)中以380g(1200rpm)離心，持續(xù)20分鐘停止。3.離心后，用10mL移液管將含有人CD4+T細(xì)胞的血沉棕黃層移除，并且將細(xì)胞用RTFACS緩沖液洗滌一次并用RT完全RPMI培養(yǎng)基洗滌一次。4.細(xì)胞在Vi細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞數(shù)量和活力，并且將CD4+T細(xì)胞以1.0×106/ml的濃度懸浮于完全RPMI培養(yǎng)基中。在2μg/mLPHA-L和20IU/mLrhIL-2存在下，初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞(1.0×106/ml在完全RPMI培養(yǎng)基中)在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中在37℃和5％CO2下培養(yǎng)48小時(shí)以激活T細(xì)胞并上調(diào)OX40。隨后，將這些細(xì)胞用于OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)中。在下面的表格和圖表中的所有供體代表獨(dú)立的個(gè)體；即，CD4+T細(xì)胞不從同一供體中分離用于重復(fù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。在結(jié)合實(shí)驗(yàn)之前，表達(dá)OX40的人尤爾卡特NFκB-熒光素酶克隆64細(xì)胞在完全RPMI中進(jìn)行培養(yǎng)，但沒(méi)有激活。用于結(jié)合實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞隨后通過(guò)離心(380g在RT下持續(xù)5分鐘)收集，懸浮于FACS緩沖液并在貝克曼庫(kù)爾特公司(BeckmanCoulter)Vi細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞活力。隨后，將確定為>95％存活的細(xì)胞在FACS緩沖液中稀釋至1.0×106細(xì)胞/mL后用于結(jié)合試驗(yàn)。然后，將100μL的活菌(100,000)添加到非TC處理的96孔圓底板的每個(gè)孔中用于結(jié)合試驗(yàn)。為了將OX40LIgG4P融合蛋白與細(xì)胞結(jié)合，將藥物在4℃FACS緩沖液中稀釋至1μg/mL，并且在15點(diǎn)稀釋系列上稀釋3倍。稀釋后，加入到96孔板的細(xì)胞在380g下離心以沉淀細(xì)胞，并且將FACS緩沖液除去。然后，將含有OX40LIgG4P融合蛋白的100μLFACS緩沖液加入細(xì)胞，并于4℃孵育1小時(shí)。OX40LIgG4P融合蛋白孵育后，將細(xì)胞用4℃FACS緩沖液洗滌三次，每次洗滌使用200μL。然后，在黑暗中在4℃下將細(xì)胞與100μLFACS緩沖液一起孵育30分鐘，該FACS緩沖液含有25μg/mL647標(biāo)記的山羊抗-人二級(jí)抗體和1μg/mL碘化丙啶(PI)。在二級(jí)抗體孵育后，將細(xì)胞用4℃FACS緩沖液(每次洗滌200μL)洗滌兩次，然后懸浮于100μL的FACS緩沖液中用于在BDLSRII流式細(xì)胞儀上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。為了補(bǔ)償，將含有結(jié)合到10μg/mL抗體(無(wú)PI)的表達(dá)OX40的細(xì)胞、僅結(jié)合于二級(jí)647標(biāo)記的Ab試劑的細(xì)胞、或用0.1％皂苷透化并用1μg/mLPI處理的細(xì)胞的孔制備用于單染色補(bǔ)償對(duì)照。為了背景減除，如上所述，還制備了不存在第一抗體而含有二級(jí)抗體的細(xì)胞。F180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P對(duì)照在與早期實(shí)驗(yàn)中的OX40LIgG4P融合蛋白相同的濃度下被用于證明OX40LIgG4P融合蛋白由結(jié)合活化的T細(xì)胞上的OX40的OX40L特異性介導(dǎo)。這種突變的對(duì)照蛋白代表在位置180處具有單一氨基酸突變(F至A的氨基酸改變)的OX40LIgG4P融合蛋白，該OX40LIgG4P融合蛋白防止OX40L結(jié)合OX40但不影響OX40LIgG4P融合蛋白的整體結(jié)構(gòu)；它不結(jié)合天然的OX40，從而證明在活化的T細(xì)胞的受體占有率是通過(guò)OX40L：OX40相互作用特異性介導(dǎo)的。對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白和對(duì)照蛋白結(jié)合細(xì)胞的分析，使用了樹(shù)星公司(TreeStar)的流式喬細(xì)胞術(shù)分析軟件(FlowJocytometryanalysissoftware)。使用補(bǔ)償對(duì)照來(lái)定義補(bǔ)償矩陣的熒光補(bǔ)償之后，對(duì)活的(PI陰性)細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控并確定二級(jí)抗體的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。將OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合的MFI對(duì)蛋白質(zhì)濃度(M)進(jìn)行作圖以確定結(jié)合曲線，表觀平衡解離結(jié)合常數(shù)(Kd)和表示20％、50％和90％的受體占有率(分別為EC20、EC50、和EC90)的濃度分別在圖板棱柱(GraphPadprism)中用單位點(diǎn)(雙曲線)非線性回歸方程和在ECf計(jì)算中使用S形劑量-響應(yīng)曲線(可變斜率)來(lái)確定。相較于使用原發(fā)人CD4T細(xì)胞起源的和使用表達(dá)OX40的尤爾卡特細(xì)胞起源的表觀Kd和EC20、EC50、和EC90值的2尾學(xué)生T檢驗(yàn)確定的p值(如果有的話)呈現(xiàn)在總結(jié)表中。OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合到活化的人CD4+T細(xì)胞，平均Kd為3.6±4.3pM，并且EC20、EC50、和EC90受體占有值分別為1.8±1.1pM、6.6±2.8pM、和53±17pM(表2-1和圖3A)。OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合到表達(dá)OX40的尤爾卡特T細(xì)胞，平均Kd為12±12pM，并且EC20、EC50、和EC90受體占有值分別為7.2±8.8pM、16±16pM、和57±46pM(表2-2和圖3B)。在表達(dá)OX40的激活初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞和表達(dá)OX40的尤爾卡特細(xì)胞之間計(jì)算的結(jié)合親和力或受體占有值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如表2-3中所示。表2-1對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合到表達(dá)OX40的激活的初級(jí)活化人CD4+T細(xì)胞的表觀親和力(Kd)和受體占有值(EC20、EC50、EC90)表2-2：對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合到表達(dá)OX40的人尤爾卡特NFkB-熒光素酶克隆64細(xì)胞的表觀親和力(Kd)和受體占有值(EC20、EC50、EC90)表2-3：初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞和表達(dá)OX40的人尤爾卡特之間的表觀親和力和受體占有值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合至小鼠CD4+T細(xì)胞使用表達(dá)OX40的、激活的初級(jí)活化小鼠CD4+T細(xì)胞對(duì)結(jié)合小鼠OX40的OX40LIgG4P融合蛋白進(jìn)行了研究。根據(jù)以下方案，從收獲的正常Balb/C小鼠脾臟中分離小鼠CD4+T細(xì)胞：1.抵靠70μM尼龍過(guò)濾器將脾臟搗碎，該尼龍過(guò)濾器后面是無(wú)菌的3mL注射器柱塞以釋放脾細(xì)胞，并且用1mL完全培養(yǎng)基(RPMI1640，具有10％胎牛血清(FBS)、1％抗生素/抗真菌溶液、和55μMβ巰基乙醇(BME))沖洗過(guò)濾器。2.脾細(xì)胞在臺(tái)式離心機(jī)在室溫下以330×g(1200rpm)離心10分鐘以沉淀細(xì)胞。3.棄去上清液，且沉淀用5mL的1X紅血細(xì)胞(RBC)裂解緩沖液處理，并在室溫下孵育5分鐘以裂解RBC。將45mL完全培養(yǎng)基加入到該混合物，以在孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)恢復(fù)同滲容摩。4.細(xì)胞在離心機(jī)中在330×g下沉淀10分鐘，并在美天旎(Miltenyi)MACS緩沖液(PBSpH7.2+0.5％牛血清白蛋白(BSA)+2mM乙二胺四乙酸(EDTA))中洗滌兩次。5.棄去上清液，且將細(xì)胞沉淀物懸浮在冷的MACS緩沖液中，并用Vi細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞數(shù)量和活力。6.根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用美天旎加工試劑盒(Miltenyiprocesskit)進(jìn)行小鼠CD4+T細(xì)胞分離。然后，將CD4+陽(yáng)性T細(xì)胞以1.5×106/mL在完全培養(yǎng)基中懸浮。小鼠CD4+T細(xì)胞(150,000每孔在100μL完全培養(yǎng)基中)在涂有2μg/mL倉(cāng)鼠抗小鼠CD3和倉(cāng)鼠抗小鼠CD28抗體的96孔平板中培養(yǎng)以激活T細(xì)胞和誘導(dǎo)OX40表達(dá)，并在37℃和5％CO2下在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中孵育過(guò)夜?；罨腃D4+T細(xì)胞從孵育平板中除去，并且將100,000個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到非組織培養(yǎng)處理的96孔圓底板的各孔用于結(jié)合試驗(yàn)，并且細(xì)胞用FACS緩沖液(PBSpH7.2，具有2％FBS)洗滌一次。用1μg/mLOX40LIgG4P融合蛋白和大鼠抗小鼠克隆OX86(陽(yáng)性對(duì)照)抗體進(jìn)行結(jié)合，該OX40LIgG4P融合蛋白和該大鼠抗小鼠克隆OX86抗體于FACS緩沖液中連續(xù)稀釋3倍用于10點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線，并且1μg/mLF180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P(陰性對(duì)照)在深孔聚丙烯板中稀釋6倍用于3點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線。將50μL含OX40LIgG4P融合蛋白或抗體的FACS緩沖液加入一式兩份的細(xì)胞，并在4℃下孵育45分鐘。初級(jí)活化孵育后，將細(xì)胞洗滌兩次，每次洗滌用200μL冷(4℃)的FACS緩沖液。然后，在4℃下在黑暗中將細(xì)胞與50μLFACS緩沖液一起孵育30分鐘，該FACS緩沖液含有10μg/mL488標(biāo)記的山羊抗人二級(jí)或488標(biāo)記的山羊抗大鼠二級(jí)抗體和5μg/mL碘化丙啶(PI)。在二級(jí)抗體孵育后，將細(xì)胞用4℃FACS緩沖液(每次洗滌200μL)洗滌兩次，并且懸浮于100μL的FACS緩沖液中用于在BDLSRII流式細(xì)胞儀上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。制備含有表達(dá)OX40的細(xì)胞(無(wú)PI)、僅結(jié)合于二級(jí)488標(biāo)記的抗體試劑的細(xì)胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mLPI處理的細(xì)胞的孔，用于單染色補(bǔ)償對(duì)照。流式喬細(xì)胞術(shù)分析軟件(樹(shù)星(TreeStar)，阿什蘭，俄勒岡州)被用來(lái)確定與細(xì)胞結(jié)合的OX40LIgG4P融合蛋白和對(duì)照蛋白質(zhì)。使用補(bǔ)償對(duì)照來(lái)定義補(bǔ)償矩陣，對(duì)活的(PI陰性)細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控并確定二級(jí)抗體的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。將OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合的MFI對(duì)蛋白質(zhì)濃度(M)進(jìn)行作圖以確定結(jié)合曲線，并且表觀平衡解離結(jié)合常數(shù)(Kd)使用圖板棱柱(GraphPadprism)(拉霍亞，加利福利亞州)中和用單位點(diǎn)(雙曲線)非線性回歸方程來(lái)確定。對(duì)于活化的小鼠CD4+T細(xì)胞的結(jié)合測(cè)定結(jié)果示于圖4A中。OX40LIgG4P融合蛋白不結(jié)合活化的小鼠CD4+T細(xì)胞。OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合至大鼠CD4+T細(xì)胞。使用表達(dá)OX40的、激活的初級(jí)活化大鼠CD4+T細(xì)胞對(duì)結(jié)合大鼠OX40的OX40LIgG4P融合蛋白進(jìn)行了研究。根據(jù)以下方案，將大鼠CD4+細(xì)胞從新鮮收獲的正常斯普瑞格-道利(SpragueDawley)大鼠脾臟中分離：1.抵靠70μM尼龍過(guò)濾器將脾臟搗碎，該尼龍過(guò)濾器后面是無(wú)菌的3mL注射器柱塞以釋放脾細(xì)胞，并且用完全培養(yǎng)基(RPMI1640，具有10％FBS、1％抗生素/抗真菌溶液、和55μMBME)沖洗過(guò)濾器。2.脾細(xì)胞在臺(tái)式離心機(jī)在室溫下以330×g(1200rpm)離心10分鐘以沉淀細(xì)胞。3.棄去上清液，且沉淀用5mL的1XRBC裂解緩沖液處理，并在室溫下孵育5分鐘。將45mL完全培養(yǎng)基加入到該沉淀以在孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)停止裂解。4.細(xì)胞在離心機(jī)中在330×g下沉淀10分鐘，并在美天旎MACS緩沖液(PBSpH7.2+0.5％BSA+2mMEDTA)中洗滌兩次。5.棄去上清液，且將細(xì)胞沉淀物懸浮在冷的MACS緩沖液中，并用Vi細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞數(shù)量和活力。6.根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用R&D系統(tǒng)Magcellect試劑盒進(jìn)行大鼠CD4+T細(xì)胞分離。然后，將CD4+陽(yáng)性T細(xì)胞以1.5×106/mL在完全培養(yǎng)基中懸浮。大鼠CD4+T細(xì)胞(1x106/mL完全培養(yǎng)基)在具有1μg/mL伴刀豆球蛋白A(ConA)和500IU/mLIL-2的T75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)以激活T細(xì)胞和誘導(dǎo)OX40表達(dá)，并在37℃和5％CO2下在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中孵育過(guò)夜。活化的CD4+T細(xì)胞從燒瓶中除去，并且將100,000個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到非組織培養(yǎng)處理的96孔圓底板的各孔用于結(jié)合試驗(yàn)，并且細(xì)胞用FACS緩沖液洗滌一次。用10μg/mLOX40LIgG4P融合蛋白和小鼠抗大鼠克隆OX40(陽(yáng)性對(duì)照)抗體和10μg/mLF180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P(陰性對(duì)照)進(jìn)行結(jié)合，該OX40LIgG4P融合蛋白和該小鼠抗大鼠克隆OX40抗體于FACS緩沖液中連續(xù)稀釋3倍用于10點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線，該F180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P在深孔聚丙烯板中連續(xù)稀釋6倍用于3點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線。將100μLOX40LIgG4P融合蛋白、對(duì)照蛋白或抗體加入一式兩份的細(xì)胞，并在4℃下孵育1小時(shí)。初級(jí)活化孵育后，將細(xì)胞洗滌兩次，每次洗滌用200μL冷(4℃)的FACS緩沖液。然后，在4℃下在黑暗中將細(xì)胞與100μLFACS緩沖液一起孵育30分鐘，該FACS緩沖液含有10μg/mL488標(biāo)記的山羊抗人或488標(biāo)記的山羊抗小鼠二級(jí)抗體和5μg/mL碘化丙啶(PI)。在二級(jí)抗體孵育后，將細(xì)胞用4℃FACS緩沖液(每次洗滌200μL)洗滌兩次，并且重懸浮于100μL的FACS緩沖液中用于在BDLSRII流式細(xì)胞儀上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。制備含有表達(dá)OX40的細(xì)胞(無(wú)PI)、僅結(jié)合于二級(jí)488標(biāo)記的抗體試劑的細(xì)胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mLPI處理的細(xì)胞的孔，用于單染色補(bǔ)償對(duì)照。流式喬細(xì)胞術(shù)分析軟件(樹(shù)星(TreeStar)，阿什蘭，俄勒岡州)被用來(lái)確定與細(xì)胞結(jié)合的OX40LIgG4P融合蛋白和對(duì)照蛋白質(zhì)。使用補(bǔ)償對(duì)照來(lái)定義補(bǔ)償矩陣，對(duì)活的(PI陰性)細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控并確定二級(jí)抗體的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。將OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合的MFI對(duì)蛋白質(zhì)濃度(M)進(jìn)行作圖以確定結(jié)合曲線，并且表觀平衡解離結(jié)合常數(shù)(Kd)使用圖板棱柱(GraphPadprism)(圣地亞哥，加利福尼亞州)中和用單位點(diǎn)(雙曲線)非線性回歸方程來(lái)確定。對(duì)于活化的大鼠CD4+T細(xì)胞的結(jié)合測(cè)定結(jié)果示于圖4B中。OX40LIgG4P融合蛋白不結(jié)合活化的大鼠CD4+T細(xì)胞。OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合至食蟹猴CD4+T細(xì)胞。對(duì)于結(jié)合食蟹猴(cyno)OX40的OX40LIgG4P融合蛋白的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)，使用表達(dá)OX40的、激活的初級(jí)活化食蟹猴CD4+T細(xì)胞來(lái)確定。根據(jù)以下方案，將食蟹猴CD4+T細(xì)胞從來(lái)自萬(wàn)維網(wǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)(WorldWidePrimates)(邁阿密，佛羅里達(dá)州)的健康食蟹猴供體(N＝2)獲得的肝素鈉抗凝全血中分離：1.(試驗(yàn)1)通過(guò)組合52.8mL珀可(Percoll)附加液、1.2mL的1MHEPES、6mL的10XPBSpH7.2和40mL的1×PBSpH7.2來(lái)制備60％珀可，然后將10mL全血在50mL錐形離心管中在30mL的60％珀可上鋪一薄層。(試驗(yàn)2)在室溫下，通過(guò)將15mL的PBS加入85mL的淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)(LSM)中將LSM稀釋至85％，然后將20mL全血在15mL的85％LSM上鋪一薄層。2.(試驗(yàn)1)在沒(méi)有制動(dòng)的臺(tái)式離心機(jī)中，在室溫下將血液于400×g下離心30分鐘。(試驗(yàn)2)在沒(méi)有制動(dòng)的臺(tái)式離心機(jī)中，在室溫下將血液于1100×g下離心20分鐘。3.外周血單核細(xì)胞(PBMC)在界面收集并用冷的(4℃)美天旎MACS緩沖液洗滌兩次，在1200轉(zhuǎn)進(jìn)行10分鐘。4.棄去上清液，且沉淀用5mL的1XRBC裂解緩沖液處理，并在室溫下孵育5分鐘。將45mL完全培養(yǎng)基(RPMI，具有10％FBS和1％抗生素/抗真菌劑)加入沉淀以在孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)停止裂解過(guò)程。5.然后，將細(xì)胞在330×g下離心10分鐘沉淀，并用20mL冷(4℃)的美天旎MACS緩沖液洗滌兩次。6.棄去上清液，且將細(xì)胞沉淀物懸浮在冷(4℃)的MACS緩沖液中，并用Vi細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞數(shù)量和活力。7.根據(jù)制造商的說(shuō)明，用美天旎非人靈長(zhǎng)類(lèi)試劑盒進(jìn)行食蟹猴CD4+T細(xì)胞分離，然后如上所述CD4+T細(xì)胞在在Vi細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)并以1x106/mL懸浮在完全培養(yǎng)基中。食蟹猴CD4+T細(xì)胞(1x106/mL完全培養(yǎng)基)在具有2μg/mLPHA-L和20IU/mLIL-2的T75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)以激活T細(xì)胞和誘導(dǎo)OX40表達(dá)，并在37℃和5％CO2下在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中孵育48小時(shí)。活化的CD4+T細(xì)胞從燒瓶中除去，并且將100,000個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到非組織培養(yǎng)處理的96孔圓底板的各孔用于結(jié)合試驗(yàn)，并且細(xì)胞用200μLFACS緩沖液洗滌一次。用1μg/mLOX40LIgG4P融合蛋白和1μg/mLF180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P(陰性對(duì)照)進(jìn)行結(jié)合，該OX40LIgG4P融合蛋白于FACS緩沖液中連續(xù)稀釋3倍用于10點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線，該F180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P在深孔聚丙烯板中稀釋8倍用于3點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線。將100μL含OX40LIgG4P融合蛋白或?qū)φ盏鞍椎腇ACS緩沖液加入一式兩份的細(xì)胞，并在4℃下孵育1小時(shí)。初級(jí)活化孵育后，將細(xì)胞每次洗滌用200μL冷(4℃)的FACS緩沖液洗滌兩次。然后，在4℃下在黑暗中將細(xì)胞與100μLFACS緩沖液一起孵育30分鐘，該FACS緩沖液含有10μg/mL488標(biāo)記的山羊抗人二級(jí)抗體和5μg/mL碘化丙啶(PI)。在二級(jí)抗體孵育后，將細(xì)胞用4℃FACS緩沖液(每次洗滌200μL)洗滌兩次，并且懸浮于100μL的FACS緩沖液中用于在BDLSRII流式細(xì)胞儀上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。制備含有表達(dá)OX40的細(xì)胞(無(wú)PI)、僅結(jié)合于二級(jí)488標(biāo)記的抗體試劑的細(xì)胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mLPI處理的細(xì)胞的孔，用于單染色補(bǔ)償對(duì)照。流式喬細(xì)胞術(shù)分析軟件(樹(shù)星(TreeStar)，阿什蘭，俄勒岡州)被用來(lái)確定與細(xì)胞結(jié)合的OX40LIgG4P融合蛋白和對(duì)照蛋白質(zhì)。使用補(bǔ)償對(duì)照來(lái)定義補(bǔ)償矩陣，對(duì)活的(PI陰性)細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控并確定二級(jí)抗體的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。將OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合的MFI對(duì)蛋白質(zhì)濃度(nM)進(jìn)行作圖以確定結(jié)合曲線，并且表觀平衡解離結(jié)合常數(shù)(Kd)使用圖板棱柱(GraphPadprism)(圣地亞哥，加利福尼亞州)中和用單位點(diǎn)(雙曲線)非線性回歸方程來(lái)確定。對(duì)于使用表達(dá)OX40的、激活的初級(jí)活化食蟹猴CD4+T細(xì)胞(N＝2)的結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果示于表2-4和圖4C中。平衡解離常數(shù)(Kd)的計(jì)算表明，OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)活化的食蟹猴CD4+T細(xì)胞結(jié)合的平均Kd為24.2±31.4pM。食蟹猴Kd和人Kd測(cè)量值之間的比率是七倍。表2-4：對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)食蟹猴的表達(dá)OX40的、激活的初級(jí)活化CD4+T細(xì)胞的結(jié)合的表觀親和力(Kd)結(jié)合蛋白N次實(shí)驗(yàn)Kd±SD(pM)OX40LIgG4P融合蛋白224.2±31.4F180AOX40L融合蛋白人IgG4P2無(wú)結(jié)合OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合至恒河猴CD4+T細(xì)胞對(duì)于結(jié)合恒河猴OX40的OX40LIgG4P融合蛋白的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)使用表達(dá)OX40的、激活的初級(jí)活化恒河猴CD4+T細(xì)胞來(lái)確定。根據(jù)以下方案，將恒河猴CD4+T細(xì)胞從來(lái)自全球靈長(zhǎng)類(lèi)(WorldWidePrimates)(邁阿密，佛羅里達(dá)州)的健康恒河猴供體(N＝2)獲得的肝素鈉抗凝全血中分離：1.在室溫下，將淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)(LSM)通過(guò)將5ml的PBS加入95mL的LSM稀釋至95％。2.在室溫下使用PBS將肝素化恒河猴血以1:1稀釋?zhuān)⑶?0mL稀釋的全血在50mL錐形離心管中在15mL的95％LSM上鋪一薄層。3.在沒(méi)有制動(dòng)的臺(tái)式離心機(jī)中，在室溫下將血液于400×g下離心30分鐘。4.外周血單核細(xì)胞(PBMC)在界面收集并用冷的美天旎MACS緩沖液洗滌兩次，在1200轉(zhuǎn)進(jìn)行10分鐘。5.棄去上清液，且沉淀用5mL的1XRBC裂解緩沖液處理，并在室溫下孵育5分鐘。將45mL完全培養(yǎng)基(RPMI，具有10％FBS和1％抗生素/抗真菌劑)加入沉淀以在孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)停止裂解過(guò)程。6.然后，將細(xì)胞在330×g下離心10分鐘沉淀，并用20mL冷的美天旎MACS緩沖液洗滌兩次。7.棄去上清液，且將細(xì)胞沉淀物懸浮在冷的MACS緩沖液中，并用Vi細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞數(shù)量和活力。8.根據(jù)制造商的說(shuō)明，用美天旎非人靈長(zhǎng)類(lèi)試劑盒進(jìn)行恒河猴CD4+T細(xì)胞分離，然后如上所述CD4+T細(xì)胞在在Vi細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)并以1x106/mL重懸浮于完全培養(yǎng)基中。恒河猴CD4+T細(xì)胞(1x106/mL完全培養(yǎng)基)在具有2μg/mLPHA-L和20IU/mLIL-2的T75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)以激活T細(xì)胞和誘導(dǎo)OX40表達(dá)，并在37℃和5％CO2下在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中孵育48小時(shí)?；罨腃D4+T細(xì)胞從燒瓶中除去，并且將100,000個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到非組織培養(yǎng)處理的96孔圓底板的各孔用于結(jié)合試驗(yàn)，并且細(xì)胞用200μLFACS緩沖液洗滌一次。用1μg/mLOX40LIgG4P融合蛋白和1μg/mLF180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P(陰性對(duì)照)進(jìn)行結(jié)合，該OX40LIgG4P融合蛋白在深孔聚丙烯板中于FACS緩沖液中連續(xù)稀釋3倍用于10點(diǎn)(試驗(yàn)1)或12點(diǎn)(試驗(yàn)2)數(shù)據(jù)曲線，該F180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P稀釋6倍用于2點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線。將100μL含OX40LIgG4P融合蛋白或?qū)φ盏鞍椎腇ACS緩沖液加入一式兩份孔中的細(xì)胞，并在4℃下孵育1小時(shí)。初級(jí)活化孵育后，將細(xì)胞洗滌兩次，每次洗滌用200μL冷(4℃)的FACS緩沖液。然后，在4℃下在黑暗中將細(xì)胞與100μLFACS緩沖液一起孵育30分鐘，該FACS緩沖液含有10μg/mL488標(biāo)記的山羊抗人或488標(biāo)記的山羊抗小鼠二級(jí)抗體和5μg/mL碘化丙啶(PI)。在二級(jí)抗體孵育后，將細(xì)胞用4℃FACS緩沖液(每次洗滌200μL)洗滌兩次，并且懸浮于100μL的FACS緩沖液中用于在BDLSRII流式細(xì)胞儀上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。將含有表達(dá)OX40的細(xì)胞(無(wú)PI)、僅結(jié)合于二級(jí)488標(biāo)記的Ab試劑的細(xì)胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mLPI處理的細(xì)胞的孔制備用于單染色補(bǔ)償對(duì)照。流式喬細(xì)胞術(shù)分析軟件(樹(shù)星(TreeStar)，阿什蘭，俄勒岡州)被用來(lái)確定與細(xì)胞結(jié)合的OX40LIgG4P融合蛋白和對(duì)照蛋白質(zhì)。使用補(bǔ)償對(duì)照來(lái)定義補(bǔ)償矩陣，對(duì)活的(PI陰性)細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控并確定二級(jí)抗體的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。將OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合的MFI對(duì)蛋白質(zhì)濃度(nM)進(jìn)行作圖以確定結(jié)合曲線，并且表觀平衡解離結(jié)合常數(shù)(Kd)使用圖板棱柱(GraphPadprism)(圣地亞哥，加利福尼亞州)中和用單位點(diǎn)(雙曲線)非線性回歸方程來(lái)確定。對(duì)于使用表達(dá)OX40的、激活的初級(jí)活化恒河猴CD4+T細(xì)胞(N＝2)的結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果示于表2-5和圖4D。平衡解離常數(shù)(Kd)的計(jì)算表明，OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞結(jié)合的平均Kd為20.65±22.56pM。恒河猴Kd和人Kd測(cè)量值之間的比率是六倍。表2-5：對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)恒河猴OX40表達(dá)活化的初級(jí)CD4+T細(xì)胞的結(jié)合的表觀親和力(Kd)結(jié)合蛋白N次實(shí)驗(yàn)Kd±SD(pM)OX40LIgG4P融合蛋白220.65±22.56F180AOX40L融合蛋白人IgG4P2無(wú)結(jié)合SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差統(tǒng)計(jì)方法為了確定OX40LIgG4P融合蛋白與人、小鼠、大鼠、食蟹猴、恒河猴OX40結(jié)合的表觀解離平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)，使用用于Windows的圖板棱柱(GraphPadPrism)版本5.01(圖板軟件公司，圣地亞哥，加利福尼亞州，美國(guó)，www.graphpad.com)，對(duì)于一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合(雙曲線)采用了非線性回歸(曲線擬合)方程。為了確定20％、50％、和90％的OX40受體被抗體占有的濃度，首先利用方程X＝log[X]轉(zhuǎn)化濃度值(M)，隨后使用圖板棱柱(GraphPadPrism)軟件從S形劑量應(yīng)答(可變斜率濃度-MFI)結(jié)合曲線對(duì)f＝20、f＝50、和f＝90確定EC任何值(ECf)。Ecf是激動(dòng)劑給出底端和頂端之間通路的f％應(yīng)答的濃度，并且在這種情況下當(dāng)設(shè)置為20、50、或90時(shí)分別代表20％、50％、和90％的受體占有率，并且其中所計(jì)算曲線的頂端代表100％受體占有率。為了確定從初級(jí)活化的人T細(xì)胞或OX40表達(dá)的尤爾卡特的結(jié)合試驗(yàn)中確定的表觀Kd值或表觀EC20、EC50或EC90值之間的統(tǒng)計(jì)顯著性，在圖板棱柱軟件中利用具有95％置信水平的兩側(cè)不配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)和韋爾奇校正以解釋具有不同標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)據(jù)集。從數(shù)據(jù)獲得的顯著的p值(如果有的話)呈現(xiàn)于鄰近描述性統(tǒng)計(jì)(即平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差)的總結(jié)表和圖表中。在這項(xiàng)研究中使用的材料在表2-6中列出。表2-6：材料結(jié)論OX40LIgG4P融合蛋白與在初級(jí)活化的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的OX40結(jié)合，表觀Kd對(duì)于人類(lèi)OX40為3.6pM、對(duì)于食蟹猴OX40為24pM并且對(duì)于恒河猴OX40為21pM。OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合到在食蟹猴的細(xì)胞表面上的OX40的平均Kd值相比于結(jié)合到人初級(jí)活化的T細(xì)胞表面上表達(dá)的OX40的平均Kd值的所得比率被計(jì)算為7，OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合到在恒河猴的細(xì)胞表面上表達(dá)的OX40的平均Kd值相比于結(jié)合到人初級(jí)活化的T細(xì)胞表面上表達(dá)的OX40的平均Kd值的所得比率被計(jì)算為6。OX40LIgG4P融合蛋白不結(jié)合在大鼠或小鼠T細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的OX40。另外，在平衡時(shí)實(shí)現(xiàn)20％、50％、或90％人OX40受體占有率(EC20、EC50和EC90)的OX40LIgG4P融合蛋白的濃度分別被計(jì)算為1.8pM、6.6pM和53pM。實(shí)例3：OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)在細(xì)胞表面上表達(dá)的OX40相比于對(duì)在細(xì)胞表面上表達(dá)的相關(guān)人腫瘤壞死因子受體超家族成員的結(jié)合特異性的確定在這個(gè)實(shí)例中，使用人胚腎(HEK293)細(xì)胞在基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞結(jié)合測(cè)定中確定了OX40LIgG4P融合蛋白的特異性，該人胚腎(HEK293)細(xì)胞使用cDNA構(gòu)建體來(lái)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，該cDNA構(gòu)建體指導(dǎo)與OX40具有高度序列一致性的TNFR超家族(TNFRSF)成員的表達(dá)。方法搜索與人OX40具有親近序列同源性的蛋白為了鑒定與人OX40具有親近氨基酸序列一致性的人類(lèi)蛋白質(zhì)，用OX40的蛋白序列進(jìn)行了序列同源性搜索。利用UniProt網(wǎng)站(http://www.uniprot.org)用于搜索和確定人OX40和所鑒定的人類(lèi)蛋白質(zhì)之間的氨基酸一致性的百分比(表3-1)。表3-1：與人OX40具有最高同源性的12個(gè)TNFRSF成員的氨基酸序列一致性。NA＝不適用OX40LIgG4P融合蛋白的結(jié)合特異性在轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)能夠指導(dǎo)個(gè)體TNFRSF成員的表達(dá)的cDNA構(gòu)建體從傲銳基因技術(shù)公司(OrigeneTechnologies)獲得。這些cDNA構(gòu)建體由在米迪繆尼公司(MedImmune)(蓋瑟斯堡，馬里蘭州)的蛋白質(zhì)科學(xué)組擴(kuò)增并純化用于在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中使用。對(duì)于每個(gè)TNFRSF成員的表達(dá)，使用脂質(zhì)體2000與2.5μgDNA的編碼TNFRSF成員之一的表達(dá)載體組合單獨(dú)地轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞；遵循制造商對(duì)于脂質(zhì)體2000建議的方案。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將細(xì)胞通過(guò)胰蛋白酶化和胰蛋白酶從組織培養(yǎng)平板中除去，該胰蛋白酶通過(guò)加入含有血清的完全培養(yǎng)基中和，接著是細(xì)胞沉淀和在完全培養(yǎng)基中洗滌。然后，將細(xì)胞懸浮在冷的FACS緩沖液(PBS+2％FBS)中，并且涂板于96孔非TC處理的平板用于使用TNFRSF-特異性mAb和OX40LIgG4P融合蛋白的結(jié)合研究。對(duì)于結(jié)合抗體，將細(xì)胞沉淀，移除FACS緩沖液，并且將細(xì)胞懸浮于FACS緩沖液中，該FACS緩沖液含有1μg/mL碘化丙啶(PI)以及由生產(chǎn)商推薦體積的特異于轉(zhuǎn)染的TNFRSF成員的熒光染料標(biāo)記的mAb或具有以1μg/ml濃度的OX40LIgG4P融合蛋白。對(duì)于結(jié)合對(duì)照，將細(xì)胞單獨(dú)與熒光染料標(biāo)記的同種型對(duì)照抗體一起孵育。在黑暗中4℃下將細(xì)胞與抗體孵育1小時(shí)。此后，與熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體一起孵育的細(xì)胞在冷的FACS緩沖液中洗滌2次，然后使用LSRII流式細(xì)胞儀通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析事件。與OX40LIgG4P融合蛋白一起孵育的細(xì)胞在冰冷的FACS緩沖液中洗滌3次，然后在25μg/mL的647山羊抗人IgG(H+L)二級(jí)抗體中懸浮并在黑暗中4℃下孵育另外的30分鐘。對(duì)于結(jié)合對(duì)照，一些細(xì)胞在OX40LIgG4P融合蛋白不存在但單獨(dú)的熒光染料標(biāo)記的二級(jí)抗體的存在下孵育。此后，將細(xì)胞用冷的FACS緩沖液額外洗滌兩次并懸浮在冷的FACS緩沖液中用于在LSRII流式細(xì)胞儀上分析。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)分析，流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(FCS)數(shù)據(jù)使用的流式喬(FlowJo)軟件檢查。為了分析mAb結(jié)合，將細(xì)胞第一次門(mén)控為活的(PI陰性)細(xì)胞，然后將MFI對(duì)事件數(shù)目作圖以產(chǎn)生結(jié)合直方圖。另外，對(duì)于每個(gè)結(jié)合確定了活的細(xì)胞的幾何平均熒光強(qiáng)度，使得對(duì)于背景(同種型對(duì)照或單獨(dú)的二級(jí)抗體)的MFI倍數(shù)可以被確定。在這項(xiàng)研究中使用的材料在表3-2中列出。表3-2：材料在OX40上的序列同源性BLAST搜索發(fā)現(xiàn)12個(gè)人TNFRSF蛋白與OX40共享10％或更多的氨基酸序列一致性。蛋白質(zhì)和序列一致性的比例在表3-1中列出。為了確認(rèn)OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)人OX40結(jié)合的特異性，OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)工程化以表達(dá)人OX40的尤爾卡特細(xì)胞系或?qū)Ρ磉_(dá)人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137或HVEM的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的結(jié)合通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估。如由MFI確定的OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)表達(dá)OX40的尤爾卡特細(xì)胞系的結(jié)合比單獨(dú)的二級(jí)抗體的MFI大17倍(圖5A-B)。使用商購(gòu)的對(duì)每個(gè)人TNFRSF蛋白特異的抗體來(lái)確認(rèn)人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137和HVEM的細(xì)胞表面表達(dá)；相比于對(duì)每個(gè)TNFRSF蛋白的同種型對(duì)照抗體的在MFI的倍數(shù)增加在表12-2中示出。OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)表達(dá)人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137和HVEM的HEK293細(xì)胞的結(jié)合不是如以上所看見(jiàn)的單獨(dú)的二級(jí)抗體對(duì)這些相同的細(xì)胞的結(jié)合(表3-3，圖5C)。表3-3.熒光染料標(biāo)記的TNFRSF特異的mAb和OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)表達(dá)TNFRSF的HEK293細(xì)胞的結(jié)合倍數(shù)或OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)表達(dá)OX40的尤爾卡特細(xì)胞的結(jié)合倍數(shù)。MFI＝平均熒光強(qiáng)度；ND＝未確定。結(jié)論OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)人OX40的結(jié)合是特異的。OX40LIgG4P融合蛋白與TNFRSF的高度相關(guān)抗原沒(méi)有交叉反應(yīng)。實(shí)例4：OX40LIgG4P融合蛋白的體外生物活性：采用初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞的基于平板的生物測(cè)定法在這個(gè)實(shí)例中，在基于平板的測(cè)定法中使用初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞啦確定OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性。將激活的初級(jí)活化的人CD4+細(xì)胞涂抹到平板捕獲的次優(yōu)抗CD3(OKT3)單克隆抗體用于TCR刺激和OX40LIgG4P融合蛋白的劑量滴定，用于OX40受體介導(dǎo)的共刺激。對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子釋放進(jìn)行確定以測(cè)量OX40生物活性。為了確定OX40LIgG4P融合蛋白增加T細(xì)胞活化同時(shí)增加通過(guò)TCR(共刺激)的活化的能力，進(jìn)行了基于平板的生物活性測(cè)定并評(píng)估了T細(xì)胞活化。T細(xì)胞共刺激的測(cè)量包括CD4+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放的確定。含有不能結(jié)合OX40的OX40LECD的OX40LIgG4P融合蛋白的突變版本(F180AOX40L融合蛋白IgG4P)被用于替代OX40LIgG4P融合蛋白來(lái)證明共刺激需要OX40接合。在基于平板的藥物捕獲試驗(yàn)中，利用激活的初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞因子釋放作為活性讀數(shù)來(lái)確定OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性(圖6)。為了測(cè)量OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性，使用以下方案：第0天：·以白樸(leukopak)形式的人免疫細(xì)胞從全細(xì)胞(AllCells)中獲得。隨后，根據(jù)制造商的方案，使用EasySepCD4+T細(xì)胞富集試劑盒純化CD4+T細(xì)胞?！ぴ谕耆玆PMI培養(yǎng)基中懸浮CD4+T細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0x106/ml。添加含有PHA-L和重組人IL-2分別至終濃度2μg/mL和20IU/mL，并且在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中在37℃和5％CO2下培養(yǎng)細(xì)胞2天以活化T細(xì)胞。第1天：·在非TC處理的圓底96孔分析平板上涂抹100μL的、在PBS中的2μg/mL的Fcγ特異性的山羊抗小鼠IgG和2μg/mL的Fcγ特異性的山羊抗人IgG?！ぴ?℃下孵育過(guò)夜第2天：·用200μLPBS洗滌平板·在37℃下用在PBS中的1％BSA(1％BSA/PBS)阻斷平板90分鐘·用PBS洗滌平板3次·在37℃下加入在1％BSA/PBS中重構(gòu)的2ng/ml的抗CD3克隆OKT3持續(xù)90分鐘·用PBS洗滌平板3次·添加OX40LIgG4P融合蛋白或?qū)φ誇180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P，這兩種蛋白從1μg/mL開(kāi)始在1％BSA/PBS中稀釋(100μL每孔；3nM)且持續(xù)進(jìn)行3倍稀釋系列。在37℃下孵育90分鐘·在此期間，收集激活的初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞，并調(diào)整在室溫(RT)完全RPMI中的濃度至1×106活細(xì)胞/毫升?！こ擞?.25μMCFSE代替推薦的5μM在37℃下孵育10分鐘之外，根據(jù)制造商的指示使用CFSE標(biāo)記細(xì)胞，在完全RPMI中懸浮細(xì)胞，并調(diào)整濃度至0.5×106/ml·用PBS洗滌平板3次·每孔添加200μL的細(xì)胞(100,000)。在臺(tái)式離心機(jī)上以100xg通過(guò)離心溫和地沉淀細(xì)胞。在37℃和5％CO2下在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中放置3天第3天·第二天(24小時(shí)孵育時(shí)間)，移除40μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于細(xì)胞因子釋放測(cè)量第5天·72小時(shí)孵育時(shí)間后，移除40μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于細(xì)胞因子釋放測(cè)量·在380g下沉淀CD4+T細(xì)胞，且使用含有2％FBS的4℃PBS(FACS緩沖液)洗滌一次·在含有抗體和碘化丙啶的結(jié)合混合物中懸浮細(xì)胞，該抗體用于標(biāo)記CD4+T細(xì)胞，該碘化丙啶用于辨別活的/無(wú)活力的細(xì)胞。孵育30分鐘，接著在4℃FACS緩沖液中洗滌2次。重新懸浮于4℃FACS緩沖液中，并采用LSRII流式細(xì)胞儀通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和用于分析FCS流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的流式喬(FlowJo)軟件來(lái)分析事件。對(duì)于細(xì)胞因子釋放的分析，使用來(lái)自MSD的10-叢Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子分析試劑盒，根據(jù)制造商的方案分析培養(yǎng)72小時(shí)后獲得的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的細(xì)胞因子含量。這個(gè)試劑盒采用電化學(xué)檢測(cè)方法來(lái)定量測(cè)量以下細(xì)胞因子：IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、和IL-1β。在以前的實(shí)驗(yàn)中，72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)已被證明能定性地反映在較早的時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞因子釋放，因此，在這些條件下不支持或反對(duì)某些Th1/Th2細(xì)胞因子的檢測(cè)。對(duì)于細(xì)胞增殖的分析，使用流式喬(FlowJo)軟件對(duì)活的(PI陰性)事件進(jìn)行門(mén)控，并且顯示CFSE稀釋的CD4+T細(xì)胞的百分比被確定為經(jīng)歷增殖的細(xì)胞的百分比的測(cè)量。在增殖或細(xì)胞因子釋放方面產(chǎn)生半最大應(yīng)答(EC50)的OX40LIgG4P融合蛋白的濃度，并且對(duì)于20％和90％的最大應(yīng)答(EC20和EC90)的藥物濃度是利用在圖版棱柱(GraphPadPrism)版本5.01中的非線性回歸分析來(lái)確定。在這項(xiàng)研究中使用的材料在表4-1中列出。表4-1：材料對(duì)于IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10，關(guān)于誘導(dǎo)增殖和細(xì)胞因子釋放，富集的CD4+T細(xì)胞顯示了對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白的劑量依賴(lài)性應(yīng)答，對(duì)于IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、和IL-1β，形成的曲線不佳。對(duì)于四個(gè)供體之一給出劑量應(yīng)答的結(jié)果的實(shí)例顯示于圖7A-E。對(duì)于這些供體的總結(jié)數(shù)據(jù)概述于表4-2中。因?yàn)閷?duì)于IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、和IL-1β細(xì)胞因子釋放觀察到形成不佳的劑量應(yīng)答曲線，對(duì)于這些測(cè)量沒(méi)有獲得有效價(jià)值。對(duì)于四個(gè)供體關(guān)于CD4+T細(xì)胞增殖的平均EC20、EC50、和EC90值為8.0±7.6、14±11、和57±5.8pM。對(duì)于細(xì)胞因子釋放的平均EC20、EC50、和EC90值為如下：INFγ，45±39、65±41、和140±45pM；TNFα，22±17、48±26、和230±132pM；IL-10，32±20、53±34、和137±70pM；IL-5，43±28、59±40、和134±57pM。因此，CD4+T細(xì)胞的增殖是OX40LIgG4P融合蛋白效價(jià)以這種形式的最敏感的測(cè)量。表4-2：在基于平板的生物活性測(cè)定中OX40LIgG4P融合蛋白的增殖和細(xì)胞因子釋放活性。實(shí)例5：OX40LIgG4P融合蛋白的體外活性：使用尤爾卡特NFkB-熒光素酶報(bào)告T細(xì)胞的基于2-細(xì)胞的生物活性測(cè)定在這個(gè)實(shí)例中，在基于2-細(xì)胞的生物活性測(cè)定中使用表達(dá)OX40的尤爾卡特NFkB-熒光素酶報(bào)告細(xì)胞系來(lái)確定OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性。具體來(lái)說(shuō)，OX40尤爾卡特NFkB熒光素酶報(bào)告細(xì)胞與表達(dá)FcγR的HEK293細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞系、或與從原發(fā)人腫瘤中分離的CD45+細(xì)胞、連同用于OX40受體介導(dǎo)的NFkB信號(hào)的激活的OX40LIgG4P融合蛋白的劑量滴定一起涂抹。NFkB信號(hào)傳導(dǎo)是OX40信號(hào)傳導(dǎo)中公知的下游事件，并且與T細(xì)胞激活的其他測(cè)量例如增殖和細(xì)胞因子釋放定性地良好相關(guān)。為了確定OX40LIgG4P融合蛋白增加T細(xì)胞的活化的能力，進(jìn)行了一組2-細(xì)胞報(bào)告生物活性測(cè)定并評(píng)估了T細(xì)胞活化。通過(guò)采用在響應(yīng)NFkB信號(hào)途徑的刺激中產(chǎn)生熒光素酶的表達(dá)OX40的尤爾卡特NFkB-熒光素酶T細(xì)胞報(bào)告系實(shí)現(xiàn)了T細(xì)胞活化的測(cè)量(圖8)，初級(jí)活化的人T細(xì)胞活化的典型結(jié)果?？赏ㄟ^(guò)向細(xì)胞裂解液添加熒光素酶底物和用光度計(jì)通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)量所發(fā)出的光來(lái)測(cè)量熒光素酶的量，從而激活T細(xì)胞。使用表達(dá)FcγR的不同補(bǔ)體的細(xì)胞，對(duì)于可溶性O(shè)X40LIgG4P融合蛋白以及FcγR交聯(lián)的OX40LIgG4P融合蛋白測(cè)量了T細(xì)胞活化。同樣地，含有使得ECD不能結(jié)合OX40的在OX40LECD中F至A氨基酸取代的OX40LIgG4P融合蛋白的突變版本(F180AOX40LFPIgG4P)被用于替代OX40LIgG4P融合蛋白來(lái)證明對(duì)于OX40接合的效果的特異性。試驗(yàn)1使用2-細(xì)胞生物活性測(cè)定對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白進(jìn)行了測(cè)試，該2-細(xì)胞生物活性測(cè)定使用表達(dá)OX40的人尤爾卡特NFkB-熒光素酶報(bào)告克隆64(OX40尤爾卡特報(bào)告)用于讀出OX40激動(dòng)(NFkB活性)和介導(dǎo)OX40LIgG4P融合蛋白交聯(lián)的第二FcγR-表達(dá)細(xì)胞系，該OX40LIgG4P融合蛋白交聯(lián)在表達(dá)OX40的尤爾卡特報(bào)告細(xì)胞上的簇OX40(圖8)。用于藥物交聯(lián)的FcγR-表達(dá)細(xì)胞系包括拉吉(Raji)B細(xì)胞腫瘤系、表達(dá)CD32B的HEK293、表達(dá)CD32A的HEK293、或從原發(fā)人腫瘤或正常鄰近組織分離的CD45+免疫細(xì)胞。為了確定OX40LIgG4P融合蛋白的可溶性活性，使用親本HEK293細(xì)胞(無(wú)FcγR)代替表達(dá)FcγR的細(xì)胞系或在沒(méi)有第二交聯(lián)細(xì)胞系一起存在下進(jìn)行生物活性測(cè)定。為了證明在報(bào)告細(xì)胞上的OX40接合要求，對(duì)于OX40結(jié)合減少的突變的OX40L融合蛋白IgG4P或突變的OX40L融合蛋白IgG1被用來(lái)替代OX40LIgG4P融合蛋白。在使用前，在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中在37℃和5％CO2下以0.5-1.5e6/ml的密度在完全RPMI中培養(yǎng)OX40尤爾卡特報(bào)告細(xì)胞，在生物試驗(yàn)之前的那天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代至1e6/ml的濃度。OX40LIgG4P融合蛋白的生物試驗(yàn)使用下面的方案建立：第0天·在50mL離心管中收集OX40尤爾卡特報(bào)告細(xì)胞和FcγR-表達(dá)細(xì)胞系、或HEK親本細(xì)胞，并以380g(1200rpm)沉淀細(xì)胞。對(duì)于從初級(jí)活化的人腫瘤和正常鄰近的組織中分離的CD45+細(xì)胞，將組織解離，且將CD45+細(xì)胞分離并重懸浮在完全RPMI培養(yǎng)基中用于在生物活性測(cè)定中使用，如下所述。·將每種類(lèi)型的細(xì)胞重新懸浮在完全RPMI中并在稀釋抗體時(shí)挑出。·進(jìn)行OX40LIgG4P融合蛋白的連續(xù)稀釋?zhuān)讦蘥/mL范圍開(kāi)始并在完全RPMI培養(yǎng)基中稀釋3倍至亞-ng/mL的濃度。在完全RPMI培養(yǎng)基中稀釋F180AOX40L融合蛋白作為對(duì)照?！X40報(bào)告細(xì)胞加上FcγR表達(dá)的細(xì)胞系或HEK親本細(xì)胞(各以每孔100,000個(gè)細(xì)胞)置于96孔平板中?！X40LIgG4P融合蛋白添加到在完全RPMI培養(yǎng)基中的細(xì)胞至終濃度，該終濃度從1μg/mL開(kāi)始稀釋下降3倍，如上所述。F180AOX40L融合蛋白稀釋至1μg/mL的終濃度作為對(duì)照。第1天·第二天(16-24小時(shí)孵育時(shí)間)，加入100μL的室溫重構(gòu)的來(lái)自普洛麥格公司(Promega)的穩(wěn)定輝光(SteadyGlo)熒光素酶測(cè)定溶液至每孔并混勻孔以裂解細(xì)胞。·在室溫下孵育5分鐘以平衡熒光素酶信號(hào)，并利用反向移液技術(shù)(避免產(chǎn)生氣泡)從每個(gè)孔轉(zhuǎn)移150μL穩(wěn)定輝光/樣品裂解物到96孔白壁測(cè)定板用于檢測(cè)和使用珀金埃爾默預(yù)想(PerkinElmerEnvision)發(fā)光讀數(shù)器來(lái)讀出發(fā)光信號(hào)?！ねㄟ^(guò)將對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白的濃度(x軸以摩爾濃度的log10計(jì))對(duì)發(fā)光的RLU(y軸)作圖來(lái)分析數(shù)據(jù)。通過(guò)使用圖板棱柱(GraphPadPrism)版本5.01軟件經(jīng)由非線性回歸分析來(lái)確定EC20、EC50、和EC90值。以下方案被用于分離來(lái)自人腫瘤和正常鄰近組織的原生人CD45+細(xì)胞：·從傳輸介質(zhì)中除去腫瘤或正常鄰近組織樣本并放置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。添加漢克氏緩沖鹽溶液并解剖可見(jiàn)壞死組織或來(lái)自腫瘤樣本的任何正常組織?！な褂描囎雍图舻叮瑢⒔M織切成小塊(約1mm)并放置于50ml的錐形管中，并添加10-20mL膠原酶III酶混合物(250IU/ml膠原酶III、3mMCaCl2、315μg/mLDNA酶I)?；靹?，并在30℃保溫箱中孵育約半小時(shí)?！ねㄟ^(guò)70微米的過(guò)濾器過(guò)濾被消化的樣品。依靠后端有1mL注射器活塞的過(guò)濾器輕壓材料，并頻繁地用冷的MACS緩沖經(jīng)常清洗過(guò)濾網(wǎng)以幫助洗滌細(xì)胞穿過(guò)?！ぴ?℃下以900rpm(190gRCF)沉淀解離的細(xì)胞15分鐘?！な褂肰i細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞數(shù)量和活力?！?duì)于每1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，懸浮于80μLMACS緩沖液(PBSpH7.2加上0.5％BSA和2mMEDTA)中，并添加20μL的CD45微珠?！ぴ?℃下，于冰上孵育15分鐘。·洗滌細(xì)胞，每1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞用2mL冷的MACS緩沖液洗滌?！ぴ賾腋∮?00μL冷的MACS緩沖液中·對(duì)于每個(gè)選擇腫瘤和正常組織樣品用3mL冷的MACS緩沖液預(yù)濕一個(gè)LS柱·將500μL結(jié)合微珠的細(xì)胞懸浮液應(yīng)用于柱子，并加入3X3mL的冷的MACS緩沖液(總共9mL)以洗滌未結(jié)合的細(xì)胞穿過(guò)柱子?！ねㄟ^(guò)從磁鐵移除柱子和加入5mL的MACS緩沖液來(lái)洗脫微珠結(jié)合的CD45+細(xì)胞。使用活塞輕輕推送MACS緩沖液與細(xì)胞一起穿過(guò)柱子。將CD45+細(xì)胞沉淀并重新懸浮于完全RPMI培養(yǎng)基中，并在如上所述的生物活性測(cè)定中使用。在這項(xiàng)研究中使用的材料在表5-1中列出表5-1：材料2-細(xì)胞生物活性測(cè)定結(jié)果在第二細(xì)胞類(lèi)型不存在下或在缺乏外源表達(dá)的FcγR的HEK293細(xì)胞的存在下，使用表達(dá)OX40的尤爾卡特NFkB-熒光素酶報(bào)告細(xì)胞加上OX40LIgG4P融合蛋白作為可溶性蛋白來(lái)測(cè)試OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性。在這些條件下，OX40LIgG4P融合蛋白表現(xiàn)出少許報(bào)告活性。然而，在表達(dá)FcR的細(xì)胞系如表達(dá)CD32A的HEK293的存在下，OX40LIgG4P融合蛋白展示出有效的T細(xì)胞刺激活性，如通過(guò)NFkB途徑刺激測(cè)得的(圖9)。如在表達(dá)CD32A的HEK存在下，在使用拉吉(Raji)B細(xì)胞、表達(dá)CD32B的HEK293細(xì)胞、表達(dá)CD32A的HEK293、或從原發(fā)人腫瘤分離的用于藥物交聯(lián)的CD45+細(xì)胞的2-細(xì)胞試驗(yàn)中，OX40LIgG4P融合蛋白展示了有效的生物活性(圖10)。對(duì)于2-細(xì)胞生物試驗(yàn)的效價(jià)值(EC20、EC50、和EC90)總結(jié)于表5-2。對(duì)于試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差EC20、EC50、EC90值分別為35±29pM、59±47pM、和141±114pM。表5-2：OX40LIgG4P融合蛋白的2-細(xì)胞生物活性。如所指示的，試驗(yàn)使用了拉吉(Raji)細(xì)胞、表達(dá)CD32B的HEK293細(xì)胞、表達(dá)CD32A的HEK293細(xì)胞、或從具有表達(dá)OX40的尤爾卡特NFkB螢光素酶克隆64報(bào)告細(xì)胞的原發(fā)人腫瘤中分離的CD45+細(xì)胞。如通過(guò)在表達(dá)OX40的尤爾卡特NFkB-螢光素酶報(bào)告系中的NFkB途徑的激活所測(cè)量的，OX40LIgG4P融合蛋白介導(dǎo)人T細(xì)胞的活化。在表達(dá)能夠經(jīng)由OX40LIgG4P融合蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域交聯(lián)藥物的FcR的細(xì)胞不存在下，這個(gè)生物活性很低。在2-細(xì)胞系統(tǒng)中使用表達(dá)FcR的細(xì)胞(拉吉(Raji)細(xì)胞、表達(dá)CD32A或CD32B的HEK293)(用于藥物交聯(lián))和尤爾卡特NFkB-螢光素酶報(bào)告系(用于T細(xì)胞活化的讀出)，MEDI介導(dǎo)有效的T細(xì)胞活化，平均EC50值為60±52pM。實(shí)例6：使用OX40LIgG4P融合蛋白以及食蟹猴和恒河猴T細(xì)胞的體外可比性研究食蟹猴(cyno)和恒河猴已被用于對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白和共享相同OX40序列的物種的安全性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)建模。在這個(gè)實(shí)例中，在基于2-細(xì)胞的生物活性測(cè)定中使用表達(dá)食蟹猴/恒河猴OX40的尤爾卡特NFκB-熒光素酶報(bào)告細(xì)胞系來(lái)確定OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性。食蟹猴/恒河猴OX40尤爾卡特NFκB-熒光素酶報(bào)告細(xì)胞與Fcγ受體表達(dá)的恒河猴B細(xì)胞系或分離的含有抗原呈遞細(xì)胞的恒河猴細(xì)胞一起涂板，然后用OX40LIgG4P融合蛋白劑量滴定處理用于OX40受體介導(dǎo)的NFκB信號(hào)傳導(dǎo)的激活。NFκB信號(hào)傳導(dǎo)是在OX40信號(hào)傳導(dǎo)中的公知的下游事件，并且可以與T細(xì)胞活化的其他措施如增殖和細(xì)胞因子釋放相關(guān)。另外，在基于平板的增殖試驗(yàn)中使用初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞確定OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性。將初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞涂板到平板捕獲的次優(yōu)抗CD3單克隆抗體用于TCR刺激連同OX40LIgG4P融合蛋白的劑量滴定用于OX40受體介導(dǎo)的共刺激。對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)量以確定OX40生物活性。食蟹猴/恒河猴2-細(xì)胞生物活性試驗(yàn)使用具有Fcγ受體表達(dá)的細(xì)胞的2-細(xì)胞試驗(yàn)來(lái)測(cè)試OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性，該Fcγ受體表達(dá)的細(xì)胞被用于介導(dǎo)OX40LIgG4P融合蛋白交聯(lián)，因此，介導(dǎo)在尤爾卡特報(bào)告細(xì)胞上聚集的OX40。因?yàn)槭承泛锖秃愫雍锕蚕硐嗤腛X40序列，第一細(xì)胞類(lèi)型是用于讀出OX40激動(dòng)(NFκB活性)的食蟹猴/恒河猴表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB-螢光素酶報(bào)告細(xì)胞系(克隆B2)。第二細(xì)胞類(lèi)型是Fcγ受體表達(dá)細(xì)胞系、恒河猴B細(xì)胞系LCL8664、或來(lái)自正常恒河猴的全血的Fcγ受體表達(dá)的免疫細(xì)胞。為了確定可溶性O(shè)X40LIgG4P融合蛋白的活性，在第二交聯(lián)的細(xì)胞系(“僅靶標(biāo)”)不存在下進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。不加OX40LIgG4P融合蛋白(“靶標(biāo)+效應(yīng)物”)下對(duì)背景生物活性進(jìn)行了評(píng)估。為了證明在報(bào)告細(xì)胞上要求OX40接合，具有降低的OX40結(jié)合的突變的F180AOX40L融合蛋白IgG4P被用來(lái)替代OX40LIgG4P融合蛋白。按照以下方案進(jìn)行了使用LCL8664的OX40LIgG4P融合蛋白2-細(xì)胞生物活性試驗(yàn)：試驗(yàn)前一天：1.將完全培養(yǎng)基(具有10％FBS的RPMI)加入食蟹猴/恒河猴表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB-熒光素酶報(bào)告克隆B2和恒河猴B細(xì)胞系以分別實(shí)現(xiàn)大約500,000和400,000個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞濃度以促進(jìn)在試驗(yàn)中好的細(xì)胞活力。第0天：1.食蟹猴/恒河猴的表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB-熒光素酶報(bào)告克隆B2和恒河猴B細(xì)胞系LCL8664被收集在單獨(dú)的50mL錐形離心管中，在330×g下沉淀并棄去上清液。然后，將細(xì)胞懸浮于10mL完全培養(yǎng)基中，使用Vi細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞懸浮液，且如先前描述將兩種細(xì)胞系的細(xì)胞濃度在完全培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)至2.5×106。2.在深孔聚丙烯板中在完全培養(yǎng)基中將10μg/mLOX40LIgG4P融合蛋白連續(xù)稀釋3倍增量用于11點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線。將10μg/mLF180A突變的OX40L融合蛋白和IgG4P抗體(陰性同種型對(duì)照)類(lèi)似地稀釋6倍增量用于5點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線。3.食蟹猴/恒河猴表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB-熒光素酶報(bào)告克隆B2和恒河猴B細(xì)胞系LCL8664以等體積混合至每種細(xì)胞1.25×106/mL的終濃度，然后將80mL的混合細(xì)胞懸浮液分配到96孔底部無(wú)組織培養(yǎng)物處理的平板的每個(gè)孔。4.然后將20μL的OX40LIgG4P融合蛋白或F180A突變的OX40L融合蛋白IgG4P加入到各孔，并將平板轉(zhuǎn)移到具有濕潤(rùn)的5％CO2氣體的37℃培養(yǎng)箱。第1天：1.孵育16小時(shí)后，使平板適應(yīng)室溫30分鐘；然后將100μL的重構(gòu)的室溫才穩(wěn)定輝光(SteadyGlo)螢光素酶測(cè)定溶液(普洛麥格公司(Promega))加入每個(gè)孔以裂解細(xì)胞。2.平板在旋轉(zhuǎn)振蕩器上于室溫下孵育5分鐘以平衡熒光素酶信號(hào)。從每個(gè)孔轉(zhuǎn)移150μL穩(wěn)定輝光/樣品裂解物到96孔白壁測(cè)定板并使用珀金埃爾默預(yù)想(PerkinElmerEnvision)發(fā)光讀數(shù)器來(lái)讀出發(fā)光信號(hào)。以下方案用于從來(lái)自健康印度起源的恒河猴供體(全球靈長(zhǎng)類(lèi)(WorldWidePrimates)，邁阿密，佛羅里達(dá)州)獲得的肝素鈉抗凝全血中分離表達(dá)Fcγ受體的免疫細(xì)胞：1.將5mL的新鮮全血加入50mL錐形管中，并添加45mL的氯化銨溶液。將細(xì)胞混合物在冰上孵育10分鐘。2.將細(xì)胞混合物在300×g離心10分鐘；然后棄去上清液。3.如前所述細(xì)胞沉淀用40mL完全細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌兩次，然后細(xì)胞準(zhǔn)備在2-細(xì)胞生物活性試驗(yàn)中使用。如先前所述使用LCL8664恒河猴B細(xì)胞系進(jìn)行使用恒河猴全溶解的血液的2-細(xì)胞生物活性試驗(yàn)，除了NIP228IgG4P在僅10μg/mL濃度下被用作陰性對(duì)照抗體。恒河猴CD4+T細(xì)胞增殖試驗(yàn)在基于平板的藥物捕獲試驗(yàn)中，利用激活的初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞來(lái)確定OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性，并且測(cè)量了CD4+T細(xì)胞的增殖。根據(jù)以下方案，使用恒河猴CD4+T細(xì)胞來(lái)評(píng)估OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性，該恒河猴CD4+T細(xì)胞是從來(lái)自全球靈長(zhǎng)類(lèi)(WorldWidePrimates)(邁阿密，佛羅里達(dá)州)的健康恒河猴供體(N＝2)獲得的肝素鈉抗凝全血中分離的：第1天：1.在室溫下，將淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)(LSM)通過(guò)將5ml的PBS加入95mL的LSM稀釋至95％。2.在室溫下使用PBS將新鮮的肝素化恒河猴血以1:1稀釋?zhuān)⑶胰缓?0mL稀釋的全血在50mL錐形離心管中在15mL的95％LSM上鋪一薄層。3.在沒(méi)有制動(dòng)的臺(tái)式離心機(jī)中，在室溫下將血液于400×g下離心30分鐘。4.外周血單核細(xì)胞(PBMC)在界面收集并用冷的美天旎MACS緩沖液洗滌兩次，在1200轉(zhuǎn)進(jìn)行10分鐘。5.棄去上清液，且細(xì)胞沉淀用5mL的室溫1XRBC裂解緩沖液處理，并在室溫下孵育5分鐘。將45mL完全培養(yǎng)基(具有10％FBS和1％抗生素/抗真菌劑的高級(jí)RPMI)加入沉淀以在孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)停止裂解過(guò)程。6.然后，將PBMC細(xì)胞在330×g下離心10分鐘沉淀，并用20mL冷的美天旎MACS緩沖液洗滌兩次。7.棄去上清液，且將細(xì)胞沉淀物懸浮在冷的MACS緩沖液中，并用Vi細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞數(shù)量和活力。8.根據(jù)制造商的說(shuō)明，用美天旎非人靈長(zhǎng)類(lèi)試劑盒進(jìn)行恒河猴CD4+T細(xì)胞分離，然后如先前所述CD4+T細(xì)胞在Vi細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)并以1x106/mL懸浮于完全細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中。9.恒河猴CD4+T細(xì)胞(1×106/ml在完全RPMI培養(yǎng)基中)在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中在37℃和5％CO5下在具有5μg/mL伴刀豆球蛋白A和1000IU/mLIl-2的細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)48小時(shí)以激活T細(xì)胞和誘導(dǎo)OX40表達(dá)。第2天：1.在非組織培養(yǎng)處理的圓底96孔分析平板上涂覆100μL的、在PBS中的2μg/mL的山羊抗小鼠IgG(Fcγ特異的)和2μg/mL的山羊抗人IgG(Fcγ特異的)，然后在4℃下孵育過(guò)夜。第3天：1.抗體覆蓋的平板用200μLPBS洗滌一次，然后在37℃下平板用PBS中的1％BSA(1％BSA/PBS)阻斷90分鐘。2.平板用200μLPBS洗滌兩次；然后將在1％BSA/PBS中100μL的2ng/mL抗CD3克隆SP34-2添加到每孔，并在37℃下孵育90分鐘。3.平板用200μLPBS洗滌兩次；然后用100μL的0.5μg/mL(試驗(yàn)1)或1μg/mL(試驗(yàn)2)OX40LIgG4P融合蛋白在1％BSA/PBS中連續(xù)稀釋3倍用于10點(diǎn)數(shù)據(jù)曲線或?qū)?duì)照NIP228IgG4P同種型以1μg/mL添加到每個(gè)孔。在37℃下將平板孵育90分鐘。4.如先前所述，在室溫完全培養(yǎng)基中將活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)至1×106活細(xì)胞/毫升。5.除了用1.25μM羧基二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(CFSE)代替推薦的5μM和在37℃下孵育10分鐘之外，根據(jù)制造商的指示對(duì)恒河猴CD4+T細(xì)胞用CFSE進(jìn)行標(biāo)記。細(xì)胞標(biāo)記后，如先前所述將細(xì)胞懸浮于完全RPMI中，并將濃度調(diào)整至1.5×106/ml。6.將100μL活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞(150,000)添加到每個(gè)孔中，并且將平板放置于在37℃和5％CO2的濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中三天。第5天：1.在380xg下離心來(lái)沉淀CD4+T細(xì)胞，使用200μL的含有2％FBS的4℃PBS(FACS緩沖液)洗滌一次。2.在含有2.5μLCD4-V450抗體和碘化丙啶的4℃結(jié)合混合物中懸浮細(xì)胞，該抗體用于標(biāo)記恒河猴CD4+T細(xì)胞，該碘化丙啶用于辨別活的/非活的細(xì)胞。3.細(xì)胞平板在4℃下孵育30分鐘，然后每孔用200μL的4℃FACS緩沖液洗滌兩次。將細(xì)胞懸浮于每孔100μL的4℃FACS緩沖液中，并采用LSRII流式細(xì)胞儀通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和用于分析FCS流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的流式喬(FlowJo)軟件來(lái)分析細(xì)胞。如表6-3所示，使用初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞在兩個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中重復(fù)該試驗(yàn)。對(duì)于細(xì)胞增殖的分析，使用流式喬(FlowJo)軟件對(duì)活的(PI陰性)事件進(jìn)行門(mén)控，并且顯示CFSE稀釋的CD4+門(mén)控細(xì)胞的百分比被確定為經(jīng)歷增殖的細(xì)胞的百分比的測(cè)量。在圖板棱柱(GraphPadPrism)版本5.01(圣地亞哥，加利福尼亞州)中使用非線性回歸分析(劑量應(yīng)答對(duì)數(shù)、4參數(shù)擬合曲線)產(chǎn)生在生物活性和增殖方面的半最大(EC50)應(yīng)答的OX40LIgG4P融合蛋白的濃度。標(biāo)準(zhǔn)偏差作為個(gè)體實(shí)驗(yàn)和供體之間偏差的度量被確定。在這項(xiàng)研究中使用的材料在表6-1中列出。表6-1：材料結(jié)果食蟹猴/恒河猴2-細(xì)胞生物活性試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)于食蟹猴/恒河猴2-細(xì)胞生物活性試驗(yàn)的結(jié)果顯示于表6-2和6-3以及圖11和12中。在恒河猴B細(xì)胞系LCL8664存在下OX40LIgG4P融合蛋白顯示出在尤爾卡特T細(xì)胞中激活OX40信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力，平均EC50為49.9±4.60pM(N＝2個(gè)試驗(yàn))。如在表6-5中所示，相比在人類(lèi)2-細(xì)胞試驗(yàn)中，在食蟹猴/恒河猴2-細(xì)胞試驗(yàn)中使用拉吉(Raji)B細(xì)胞系對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白活性的EC50值為高于3.6倍。另外，在表達(dá)Fcγ受體的總體恒河猴免疫細(xì)胞存在下OX40LIgG4P融合蛋白在尤爾卡特細(xì)胞中激活了OX40信號(hào)傳導(dǎo)途徑，平均EC50為50.8(95％CI45.7，56.4)pM(N＝1個(gè)試驗(yàn))。表6-2：在食蟹猴/恒河猴表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB-熒光素酶克隆B2和LCL8664恒河猴B細(xì)胞生物活性試驗(yàn)中的OX40LIgG4P融合蛋白的平均EC50值SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差表6-3：在食蟹猴/恒河猴表達(dá)OX40的尤爾卡特NFκB熒光素酶克隆B2和表達(dá)Fcγ受體的恒河猴免疫細(xì)胞生物活性試驗(yàn)中OX40LIgG4P融合蛋白的EC50值結(jié)合蛋白實(shí)驗(yàn)的數(shù)目EC50(95％CI)OX40LIgG4P融合蛋白150.8(45.7，56.4)NIP228IgG4P同種型1無(wú)活性CI＝置信區(qū)間恒河猴初級(jí)活化的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)于恒河猴初級(jí)活化的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)(N＝2)的結(jié)果示于表6-4和圖13中。OX40LIgG4P融合蛋白誘導(dǎo)初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞的增殖，平均EC50為134±144pM(N＝2個(gè)試驗(yàn))。如在表6-6中所示，相比在人類(lèi)CD4+T細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，在恒河猴CD4+T細(xì)胞增殖試驗(yàn)中對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白活性的EC50值為高于9.6倍。表6-4：在初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞增殖試驗(yàn)中對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白的平均EC50結(jié)合蛋白實(shí)驗(yàn)的數(shù)目平均EC50±SD(pM)OX40LIgG4P融合蛋白2134±144NIP228IgG4P同種型2無(wú)活性SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差表6-5：相比表達(dá)OX40的人尤爾卡特NFκB-熒光素酶克隆64和拉吉(Raji)人B細(xì)胞生物活性試驗(yàn)，在表達(dá)OX40的食蟹猴/恒河猴尤爾卡特NFκB-熒光素酶克隆B2和LCL8664恒河猴B細(xì)胞生物活性試驗(yàn)中對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白的平均EC50值SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差表6-6：相比人CD4+T細(xì)胞增殖試驗(yàn)，在恒河猴中對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白的平均EC50值SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差在恒河猴B細(xì)胞或來(lái)自全裂解血液的表達(dá)Fcγ受體的恒河猴免疫細(xì)胞的存在下，在食蟹猴/恒河猴表達(dá)OX40的T細(xì)胞中，OX40LIgG4P融合蛋白激活了OX40信號(hào)傳導(dǎo)途徑。另外，OX40LIgG4P融合蛋白誘導(dǎo)了初級(jí)活化的恒河猴CD4+T細(xì)胞的增殖。實(shí)例7：確定OX40LIgG4P融合蛋白引發(fā)效應(yīng)功能的能力這個(gè)實(shí)例評(píng)估OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合C1q并引發(fā)針對(duì)表達(dá)高水平的OX40的初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞的自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力。具有人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域的OX40LIgG4P融合蛋白的版本(OX40LFPIgG1)被產(chǎn)生以評(píng)估已知的且能引發(fā)ADCC或結(jié)合C1q的Fc域的貢獻(xiàn)。在OX40L受體結(jié)合域中具有點(diǎn)突變(F180A)的OX40LIgG4P融合蛋白和OX40LFPIgG1的版本對(duì)于OX40具有降低的結(jié)合能力，并被產(chǎn)生以評(píng)估OX40結(jié)合域引發(fā)對(duì)表達(dá)OX40細(xì)胞的ADCC的貢獻(xiàn)。抗CD20抗體利妥昔單抗結(jié)合至表達(dá)CD20的B細(xì)胞，并被用作用于ADCC實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。因?yàn)槌跫?jí)活化的人CD4+T細(xì)胞不表達(dá)CD20，使用不表達(dá)CD20的托萊多(Toledo)B細(xì)胞系進(jìn)行了單獨(dú)的試驗(yàn)以確認(rèn)該ADCC試驗(yàn)系統(tǒng)是有效的。人IgG1對(duì)照抗體被用作用于C1q結(jié)合試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性相對(duì)于OX40L融合蛋白IgG1和利妥昔單抗的ADCC活性，使用富集的初級(jí)活化的人NK細(xì)胞作為效應(yīng)物和表達(dá)OX40的初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞作為靶標(biāo)測(cè)試了OX40LIgG4P融合蛋白的ADCC活性。對(duì)于初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞的分離，肝素抗凝全血通過(guò)米迪繆尼供血者程序(MedImmuneBloodDonorProgram)從健康的供體中獲得并根據(jù)以下方案進(jìn)行處理：1.將1mL干細(xì)胞技術(shù)RosetteSepCD4+T細(xì)胞分離試劑盒抗體混合物添加至每20mL的全血，混合，并在室溫(RT)下孵育20分鐘(min)。2.將血液用無(wú)菌的室溫FACS緩沖液(PBS中的2％熱滅活的新生小牛血清，pH7.2)以1:1稀釋?zhuān)⑶以贒M-L介質(zhì)上鋪一薄層，接著在臺(tái)式離心機(jī)中以380g(1200rpm)離心，持續(xù)20分鐘停止。3.離心后，用10mL移液管將含有人CD4+T細(xì)胞的血沉棕黃層移除，并且將細(xì)胞用RTFACS緩沖液洗滌一次并用RT完全RPMI培養(yǎng)基洗滌一次。4.細(xì)胞在Vi細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞數(shù)量和活力，并且CD4+T細(xì)胞以1.0×106/ml的濃度懸浮于完全RPMI培養(yǎng)基中。在2μg/mLPHA-L和20IU/mLrhIL-2存在下，初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞(1.0×106/ml在完全RPMI培養(yǎng)基中)在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中在37℃和5％CO2下培養(yǎng)48小時(shí)以激活T細(xì)胞并上調(diào)OX40，并且隨后用于OX40LIgG4P融合蛋白ADCC試驗(yàn)中。在下面的表格和圖表中的所有供體代表單獨(dú)的個(gè)體；即，CD4+T細(xì)胞不從相同的供體中分離用于重復(fù)ADCC實(shí)驗(yàn)。初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞活化后，效應(yīng)NK細(xì)胞從來(lái)自米迪繆尼供血者程序的肝素鈉抗凝血液中分離，使用與如上的針對(duì)CD4+T細(xì)胞相同的方案，除了使用了1mL的RosetteSepNk細(xì)胞分離試劑盒抗體混合物代替1mL的RosetteSepCD4+T細(xì)胞分離試劑盒抗體混合物之外。分離的初級(jí)活化的人NK細(xì)胞用溫的完全RPMI培養(yǎng)基(RPMI-1640加10％FBS)洗滌兩次，然后以2.67×106/mL的濃度懸浮于完全RPMI中。同樣地，激活的初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞也在溫的完全RPMI中洗滌兩次，并以2.67×105/mL的濃度懸浮。此后，將75μL初級(jí)活化的人NK細(xì)胞(200,000)和75μL激活的初級(jí)活化的人CD4+T細(xì)胞(20,000)加入到無(wú)菌的無(wú)TC處理的圓底96孔板的孔中，效應(yīng)物:靶標(biāo)比例為10:1。向平板中的細(xì)胞里加入50μL的含有OX40LIgG4P融合蛋白或OX40L融合蛋白IgG1的稀釋系列的完全RPMI。10μg/mL利妥昔單抗對(duì)照抗體在孔中作為陽(yáng)性對(duì)照，該孔含有表達(dá)CD20的拉吉(Raji)B細(xì)胞代替激活的初級(jí)活化人CD4+T細(xì)胞。在ADCC試驗(yàn)中的細(xì)胞通過(guò)離心(在室溫下以100g持續(xù)2分鐘)輕輕地沉淀，且隨后在在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)保溫箱中在37℃和5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)。在孵育期結(jié)束時(shí)，細(xì)胞通過(guò)在380g離心沉淀，然后懸浮于含有10μg/mL碘化丙啶的100μLFACS緩沖液中，該碘化丙啶用于在BDLSRII流式細(xì)胞儀上通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)辨別非活的細(xì)胞。為了補(bǔ)償，將含有結(jié)合到10μg/mL抗體(Ab)(無(wú)PI)的表達(dá)OX40的細(xì)胞、僅結(jié)合于二級(jí)647標(biāo)記的抗體試劑的細(xì)胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mLPI處理的細(xì)胞的孔制備用于單染色補(bǔ)償對(duì)照。為了背景減除，如上所述，還制備了不存在初級(jí)活化的抗體而含有二級(jí)抗體的細(xì)胞。OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合至C1qProteOnXPR36儀器被用來(lái)確定從人血清池純化的人補(bǔ)體蛋白C1q對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白的結(jié)合參數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)被用于使OX40LIgG4P融合蛋白固定在GLC生物傳感器芯片的表面上。將在從26nM至1.6nM范圍內(nèi)的5個(gè)濃度的人C1q懸浮在PBS/0.005％吐溫20，pH7.4中。將樣品以30μL/min注射200秒，并且接下來(lái)是解離相持續(xù)600秒。使用ProteOnManager2.1軟件(伯樂(lè)公司(Bio-Rad))使用1:1擬合來(lái)對(duì)傳感圖數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。在這項(xiàng)研究中使用的材料在表7-1中列出。表7-1：材料治療性抗體基于它們引發(fā)效應(yīng)器功能的潛能總體上可分為三類(lèi)(蔣(Jiang)等人，2011)。I類(lèi)和II類(lèi)抗體與細(xì)胞結(jié)合的抗原結(jié)合，且III類(lèi)抗體結(jié)合和中和可溶性抗原。通常，I類(lèi)抗體的作用機(jī)制涉及Fc效應(yīng)功能，例如CDC和ADCC。與此相反，F(xiàn)c效應(yīng)功能預(yù)計(jì)不是II類(lèi)和III類(lèi)抗體的作用機(jī)制的一部分。OX40LIgG4P融合蛋白是特異性結(jié)合OX40(細(xì)胞表面相關(guān)蛋白)的人OX40配體IgG4P融合蛋白。包含IgG4P的分子展示與Fcγ受體相對(duì)較低的親和力相互作用且缺乏效應(yīng)子功能(蔣(Jiang)等，2011)。因此，OX40LIgG4P融合蛋白被分類(lèi)為II類(lèi)抗體，并且預(yù)期不會(huì)引發(fā)可測(cè)量的效應(yīng)子功能。作為這項(xiàng)研究的一部分，在ADCC試驗(yàn)和補(bǔ)體C1q結(jié)合試驗(yàn)中確認(rèn)了OX40LIgG4P融合蛋白的效應(yīng)子功能的缺乏。使用富集的初級(jí)活化的人NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞和表達(dá)高水平OX40的活化的人類(lèi)CD4+細(xì)胞作為靶標(biāo)細(xì)胞來(lái)評(píng)估OX40LIgG4P融合蛋白介導(dǎo)的ADCC的潛能。對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白和OX40L融合蛋白IgG1的ADCC活性進(jìn)行了評(píng)估；抗CD20抗體(利妥昔單抗)被用作陽(yáng)性對(duì)照抗體。OX40L融合蛋白IgG1展示出濃度依賴(lài)性ADCC活性(圖14A和C；圖15)。與此相反，且如基于IgG4PFc結(jié)構(gòu)域所預(yù)期的那樣，OX40LIgG4P融合蛋白沒(méi)有任何可檢測(cè)的ADCC(圖14A和C；圖15)。另外，每個(gè)OX40L融合蛋白IgG1和IgG4P的F180A突變的版本沒(méi)有任何可檢測(cè)的ADCC活性(圖14A和C；圖15)，確認(rèn)了ADCC活性依賴(lài)于融合蛋白接合在靶標(biāo)細(xì)胞上的OX40。針對(duì)人CD20的陽(yáng)性對(duì)照抗體也展示出ADCC(圖14B和D)；這支持了試驗(yàn)的有效性?？偟膩?lái)說(shuō)，這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)OX40LIgG4P融合蛋白不會(huì)引發(fā)針對(duì)表達(dá)高水平OX40的靶標(biāo)細(xì)胞的ADCC。使用表面等離子體共振試驗(yàn)評(píng)價(jià)了OX40LIgG4P融合蛋白結(jié)合到人補(bǔ)體成分C1q的潛能。在這個(gè)試驗(yàn)中，結(jié)合C1q被用作為補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性測(cè)定的替代品(達(dá)爾阿夸·W.F.(Dall'Acqua，W.F.)，K.E.庫(kù)克(K.E.Cook)，M.M.·達(dá)姆施羅德(M.M.Damschroder)，R.M·伍茲(R.M.Woods)和H·吳(HWu)2006.免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)177:1129-1138)。人IgG1抗體被用作陽(yáng)性對(duì)照抗體。如預(yù)期的，對(duì)照人類(lèi)IgG1展示出濃度依賴(lài)性的結(jié)合至純化的人C1q蛋白的能力(圖16)。OX40LIgG4P融合蛋白沒(méi)有任何可檢測(cè)的與C1q蛋白質(zhì)的結(jié)合(圖16)。結(jié)論OX40LIgG4P融合蛋白不結(jié)合C1q或針對(duì)表達(dá)高水平OX40的活化的CD4+T細(xì)胞引發(fā)ADCC。實(shí)例8：在人類(lèi)癌癥的小鼠模型中OX40LIgG4P融合蛋白的活性這個(gè)實(shí)例測(cè)試OX40LIgG4P融合蛋白是否可有效地作為用于癌癥治療的單一試劑治療以及T細(xì)胞是否有助于OX40LIgG4P融合蛋白的體內(nèi)抗癌活性。這項(xiàng)研究是在免疫功能低下的NOD/SCID(非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷，表8-1)小鼠中的人類(lèi)癌癥的異種移植模型中進(jìn)行的。測(cè)試動(dòng)物表8-1：測(cè)試動(dòng)物安置按照米迪繆尼公司的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源設(shè)施的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理的動(dòng)物認(rèn)證和美國(guó)農(nóng)業(yè)部特許機(jī)構(gòu))批準(zhǔn)的協(xié)議，這些動(dòng)物被人道待遇和安置。將動(dòng)物保持在無(wú)菌微型隔離單元中，提供有無(wú)菌草墊和食物、以及自由采食的酸化飲用水。環(huán)境條件是標(biāo)準(zhǔn)化的(室溫：20℃±1℃；相對(duì)濕度：50％±10％；12小時(shí)明暗循環(huán))。動(dòng)物每天監(jiān)測(cè)不良的臨床癥狀和每周檢測(cè)體重。對(duì)于有和沒(méi)有T細(xì)胞的存在的測(cè)試OX40LIgG4P融合蛋白的活性的實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有每周收集體重。如果注意到后肢麻痹、呼吸窘迫、20％體重?fù)p失、或腫瘤體積大于2000mm3，立即通過(guò)用CO2窒息人道地將動(dòng)物處死。異種移植物的建立用于研究中的人細(xì)胞系表8-2：細(xì)胞系的說(shuō)明：A375細(xì)胞系A(chǔ)375組織起源人黑色素瘤細(xì)胞系來(lái)源ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州生長(zhǎng)培養(yǎng)基DMEM，10％FCS生長(zhǎng)條件37℃，5％CO2，濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱DMEM＝杜爾貝科(Dulbecco’s)改良的伊格爾(Eagle)培養(yǎng)基；FCS＝小牛胎血清移植細(xì)胞的制備人癌性A375細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)物收獲，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌一次并重新懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。隨后，A375細(xì)胞在移植到動(dòng)物中之前與A375腫瘤細(xì)胞系同種異體反應(yīng)性的CD4+和CD8+T細(xì)胞系混合。為了產(chǎn)生CD4+和CD8+T細(xì)胞系，來(lái)自健康供體的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)通過(guò)向每20mL全血加入1mLRosetteSepT細(xì)胞富集產(chǎn)品來(lái)富集CD4+或CD8+T細(xì)胞。接下來(lái)是20分鐘孵育和隨后使用RosetteSepDM-L致密培養(yǎng)基通過(guò)密度梯度離心來(lái)分離。離心后，將細(xì)胞用補(bǔ)充有2％胎牛血清(FBS)的PBS洗滌3次，并再懸浮于補(bǔ)充有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中。將富集的CD4+和CD8+T細(xì)胞在補(bǔ)充有重組人白介素-2(rhIL-2)的培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)7至10天，且各自與絲裂霉素C處理的A375細(xì)胞相組合。將T細(xì)胞收集并也在補(bǔ)充有rhIL-2的培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)7至10天，且與絲裂霉素C處理的A375細(xì)胞相組合。將CD4+和CD8+T細(xì)胞收集并以2:1的比例組合。用來(lái)富集CD4+和CD8+T細(xì)胞的A375細(xì)胞和PBMC在移植前即刻以6A375細(xì)胞比1T細(xì)胞的比例混合。異種移植物的移植通過(guò)皮下(SC)注射3.5×106個(gè)細(xì)胞(A375細(xì)胞與人T細(xì)胞以1:6的效應(yīng)物:靶標(biāo)[E:T]，并懸浮于200μLPBS中)進(jìn)入動(dòng)物的右側(cè)翼來(lái)建立異種移植物。隨機(jī)化、組名稱(chēng)和劑量水平在SC注射細(xì)胞前，六只動(dòng)物被隨機(jī)分配給每個(gè)實(shí)驗(yàn)組。目前還沒(méi)有動(dòng)物替換。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)的組名稱(chēng)和劑量水平在表8-3和表8-4中列出。測(cè)試和對(duì)照樣品以200μL的總體積經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)給予。測(cè)試和對(duì)照樣品的第一劑量在癌性/效應(yīng)T細(xì)胞移植后第3天或第4天被給予。在某些天收到多達(dá)3個(gè)額外劑量的測(cè)試和對(duì)照樣品的動(dòng)物在圖例圖17和18中列出。在每只動(dòng)物中觀察腫瘤的形成，每周1或2次。在這項(xiàng)研究中的主要活化終點(diǎn)是2000mm3的腫瘤體積或總的腫瘤壞死中的任一個(gè)。腫瘤測(cè)量腫瘤通過(guò)卡尺測(cè)量且腫瘤體積(V)使用下面的公式計(jì)算：腫瘤體積＝[長(zhǎng)(mm)×寬(mm)2]/2對(duì)于每個(gè)組，結(jié)果以算術(shù)平均值報(bào)告?？拱┳饔帽槐硎緸槟[瘤生長(zhǎng)抑制百分比(％TGI)，其計(jì)算如下：％TGI＝(1-[治療組的平均腫瘤V]÷[對(duì)照組的平均腫瘤V])×100。統(tǒng)計(jì)方法對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白處理的和同種型對(duì)照處理的動(dòng)物之間進(jìn)行了比較，并且通過(guò)曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)針對(duì)統(tǒng)計(jì)顯著性分析了組間差異。從曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和檢驗(yàn)獲得的顯著的p值呈現(xiàn)于鄰近的算術(shù)平均值和該平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的總結(jié)表和圖表中。在這項(xiàng)研究中使用的材料和它們的來(lái)源在表8-5中列出。表8-5材料在這項(xiàng)研究中，研究了OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)在人類(lèi)癌癥的小鼠模型中腫瘤的生長(zhǎng)的活性。免疫缺陷的NOD/SCID雌性動(dòng)物用混合有同種異體反應(yīng)性人CD4+和CD8+T細(xì)胞系的人類(lèi)癌性細(xì)胞系來(lái)移植。CD4+和CD8+T細(xì)胞起源于從健康人供體中分離的PBMC。動(dòng)物在異種移植物移植后3或4天接受測(cè)試和對(duì)照樣品的首次劑量，并如所指示的被給予測(cè)試和對(duì)照樣品的額外劑量。如與同種型對(duì)照組相比，OX40LIgG4P融合蛋白顯著地抑制A375細(xì)胞生長(zhǎng)多達(dá)74％(表8-3、表8-4、圖17和圖18)。OX40LIgG4P融合蛋白的抗腫瘤活性依賴(lài)于同種異體反應(yīng)性人類(lèi)T細(xì)胞的添加(表8-4和圖18)。OX40LIgG4P融合蛋白在人T細(xì)胞的存在下抑制A375細(xì)胞的生長(zhǎng)，而在T細(xì)胞不存在時(shí)不抑制。表8-3：治療組與在第28天在A375異種移植模型中的TGI百分比TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制；NA＝不適用；IP＝腹腔內(nèi)；V＝體積a每組動(dòng)物的數(shù)目：6。b所有動(dòng)物在第4、7、9和12天接受200μL測(cè)試樣品(IP)。c％TGI＝[1-(治療組的平均腫瘤V)÷(對(duì)照組的平均腫瘤V)]×100表8-4：治療組與在第30天在A375異種移植模型中的TGI百分比TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制；NA＝不適用；IP＝腹腔內(nèi)；V＝體積a每組動(dòng)物的數(shù)目：6。b所有動(dòng)物在第3、6、8、10天接受200μL測(cè)試樣品(IP)。c％TGI＝[1-(治療組的平均腫瘤V)÷(對(duì)照組的平均腫瘤V)]×100OX40LIgG4P融合蛋白證明在人類(lèi)癌癥的小鼠模型中具有有效的抗癌活性。這些結(jié)果提供證據(jù)表明：1)OX40LIgG4P融合蛋白可有效地作為單一試劑治療用于癌癥患者的治療，2)T細(xì)胞從而有助于OX40LIgG4P融合蛋白在體內(nèi)的抗癌活性。實(shí)例9：鼠類(lèi)OX40配體融合蛋白抑制同源模型中的小鼠癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)OX40LIgG4P融合蛋白不與小鼠(m)OX40發(fā)生交叉反應(yīng)(參見(jiàn)實(shí)例2)；因此，不可能在免疫活性小鼠模型中測(cè)試其活性。為了更充分地研究OX40激動(dòng)的作用，產(chǎn)生了小鼠OX40配體小鼠IgG1融合蛋白(mOX40LFp)，該mOX40LFp特異性結(jié)合小鼠OX40受體并引發(fā)通過(guò)小鼠OX40受體進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)。DNA和氨基酸序列分別表示為SEQIDNO：9和SEQIDNO：10。mOX40LFP被選定為對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白的替代的小鼠OX40LFP。進(jìn)行這項(xiàng)非GLP研究以評(píng)估在4個(gè)癌癥小鼠模型中mOX40LFP的單一藥劑活性。SEQIDNO：9：小鼠構(gòu)建體mIgG1mTF2mOX40L的DNA序列(5’至3’開(kāi)放閱讀框)GTGCCTAGAGATTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACCGTGCCCGAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACATCAGCAAGGACGACCCCGAGGTGCAGTTCAGTTGGTTCGTGGACGACGTGGAAGTGCACACCGCCCAGACCCAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCGCCGCCTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACCATCCCCCCACCCAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCGATTTCTTCCCAGAGGACATCACCGTGGAATGGCAGTGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACTACAAGAACACCCAGCCCATCATGGACACCGACGGCAGCTACTTCGTGTACAGCAAGCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAGTCCCTGAGCCACAGCCCCGGCAAGCGGCTGGACCAGGACAAGATCGAGGCCCTGAGCAACAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCTATCGGCCTGAAGGACCTGGCTATGGCCGACCTGGAACAGAAAGTGTCTGAGCTGGAAGTGTCCACCAGCAGCCCCGCCAAGGACCCTCCCATCCAGAGACTGAGAGGCGCCGTGACCAGATGCGAGGACGGCCAGCTGTTCATCAGCAGCTACAAGAACGAGTACCAGACCATGGAAGTGCAGAACAACAGCGTGGTCATCAAGTGCGACGGCCTGTACATCATCTACCTCAAGGGCAGCTTCTTCCAGGAAGTGAAGATCGACCTGCACTTCAGAGAGGACCACAACCCCATCAGCATCCCCATGCTGAACGACGGCAGACGGATCGTGTTCACCGTGGTGGCTAGCCTGGCCTTCAAGGACAAAGTGTATCTGACCGTGAACGCCCCCGACACCCTGTGCGAGCATCTGCAGATCAACGACGGCGAGCTGATCGTGGTGCAGCTGACCCCCGGCTACTGTGCCCCTGAGGGCAGCTACCACAGCACCGTGAACCAGGTGCCCCTGSEQIDNO：10：小鼠構(gòu)建體mIgG1FcmTF2mOX40L的氨基酸序列(N至C末端)小鼠IgG1Fc結(jié)構(gòu)域小鼠TRAF2結(jié)構(gòu)域(粗體)試驗(yàn)動(dòng)物描述于表9-1和9-2中。表9-1：試驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c小鼠表9-2：試驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠殼體按照米迪繆尼公司的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源設(shè)施的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理的動(dòng)物認(rèn)證和美國(guó)農(nóng)業(yè)部特許機(jī)構(gòu))批準(zhǔn)的協(xié)議，這些動(dòng)物被人道待遇和安置。將動(dòng)物保持在無(wú)菌微型隔離單元中，提供有無(wú)菌草墊和食物、以及自由采食的酸化飲用水。環(huán)境條件是標(biāo)準(zhǔn)化的(室溫：20℃±1℃；相對(duì)濕度：50％±10％；12小時(shí)明暗循環(huán))。動(dòng)物每天監(jiān)測(cè)不良的臨床癥狀和每周檢測(cè)體重。如果注意到后肢麻痹、呼吸窘迫、20％體重?fù)p失、或腫瘤體積大于2000mm3，立即通過(guò)用CO2窒息人道地將動(dòng)物處死。同源腫瘤的建立在同源腫瘤模型中使用的細(xì)胞系描述在表9-3至9-6中。表9-3：細(xì)胞系的說(shuō)明：Renca細(xì)胞系Renca組織起源腎臟，小鼠來(lái)源ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％FBS的RPMI1640生長(zhǎng)條件在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)箱中，37℃，5％CO2表9-4：細(xì)胞系的說(shuō)明：CT26細(xì)胞系CT26組織起源結(jié)腸，小鼠來(lái)源ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％FBS的RPMI1640生長(zhǎng)條件在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)箱中，37℃，5％CO2表9-5：細(xì)胞系的說(shuō)明：4T1細(xì)胞系4T1組織起源乳腺，小鼠來(lái)源ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％FBS的RPMI1640生長(zhǎng)條件在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)箱中，37℃，5％CO2表9-6：細(xì)胞系的說(shuō)明：MCA205RPMI1640＝洛斯維公園紀(jì)念研究所(RoswellParkMemorialInstitute)1640培養(yǎng)基；FBS＝牛胎兒血清同源腫瘤的移植通過(guò)將懸浮于0.1mLPBS的5.0×105Renca細(xì)胞、5.0×105CT26細(xì)胞或1.0×1054T1細(xì)胞皮下(SC)注射到被隨機(jī)分配到研究組的7至9周大的BALB/c小鼠的右側(cè)翼來(lái)建立同種異體移植物；而將懸浮于0.1mLPBS的2.5×106MCA205細(xì)胞注射到7至9周大的C57BL/6小鼠的右側(cè)翼。隨機(jī)化、組名稱(chēng)和劑量水平BALB/c(總共150只)和C57BL/6(總共70只)雌性小鼠被用于這項(xiàng)研究中。在注射Renca和CT26腫瘤細(xì)胞系之前，將BALB/c小鼠隨機(jī)分配到治療組中。在移植后3天，使用4T1腫瘤細(xì)胞移植的Balb/c小鼠通過(guò)體重隨機(jī)化。移植后11天，在腫瘤長(zhǎng)到每個(gè)組平均體積為95mm3之后隨機(jī)分配C57BL/6小鼠。組名稱(chēng)、動(dòng)物數(shù)目、劑量水平和劑量時(shí)間表呈現(xiàn)于表9-7、表9-8、表9-9和表9-10中。如在表9-7、表9-8、表9-9和表9-10中所呈現(xiàn)，所有治療在適合的研究天數(shù)經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)給予。目前還沒(méi)有動(dòng)物替換。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到大約2000mm3時(shí)，來(lái)自每個(gè)組的動(dòng)物被處死。表9-7：在OX40-013-029(Renca癌細(xì)胞系)研究中的組名稱(chēng)和劑量水平F＝雌性；M＝雄性；NA＝因?yàn)闆](méi)有處理動(dòng)物而不適用；IP＝腹膜內(nèi)；ROA＝給予的途徑；mOX40LFP＝鼠類(lèi)OX40配體鼠類(lèi)IgG1融合蛋白a劑量體積：0.2ml表9-8：在OX40-013-039(CT26癌細(xì)胞系)研究中的組名稱(chēng)和劑量水平表9-7：在OX40-013-029(Renca癌細(xì)胞系)研究中的組名稱(chēng)和劑量水平F＝雌性；M＝雄性；NA＝因?yàn)闆](méi)有處理動(dòng)物而不適用；IP＝腹膜內(nèi)；ROA＝給予的途徑；mOX40LFP＝鼠類(lèi)OX40配體鼠類(lèi)IgG1融合蛋白；mOX40LFP(Y182A)＝使得融合蛋白不能結(jié)合鼠類(lèi)OX40的在OC40L中的點(diǎn)突變a劑量體積：0.2ml表9-9：在IMT-14-003(4T1癌細(xì)胞系)研究中的組名稱(chēng)和劑量水平F＝雌性；M＝雄性；NA＝因?yàn)闆](méi)有處理動(dòng)物而不適用；IP＝腹膜內(nèi)；ROA＝給予的途徑；mOX40LFP＝鼠類(lèi)OX40配體鼠類(lèi)IgG1融合蛋白a劑量體積：0.2ml表9-10：在OX40-013-065(MCA205癌細(xì)胞系)研究中的組名稱(chēng)和劑量水平F＝雌性；M＝雄性；IP＝腹膜內(nèi)；ROA＝給予的途徑；mOX40LFP＝鼠類(lèi)OX40配體鼠類(lèi)IgG1融合蛋白；mOX40LFP(Y182A)＝使得融合蛋白不能結(jié)合鼠類(lèi)OX40的在OC40L中的點(diǎn)突變a劑量體積：0.2ml腫瘤測(cè)量腫瘤通過(guò)卡尺測(cè)量且腫瘤體積使用以下公式計(jì)算：腫瘤體積＝[長(zhǎng)(mm)×寬(mm)2]/2其中，長(zhǎng)被定義為較大邊且寬被定義為垂直于長(zhǎng)的較小邊。每個(gè)組的抗腫瘤作用被表示為腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)，其計(jì)算如下：TGI百分比＝(1-T/C)×100其中，T＝末次劑量后來(lái)自治療組的最終腫瘤體積，且C＝末次劑量后來(lái)自對(duì)照組的最終腫瘤體積。如果沒(méi)有可測(cè)量的腫瘤，則腫瘤生長(zhǎng)應(yīng)答被歸類(lèi)為完全應(yīng)答(CR)。統(tǒng)計(jì)方法單因子方差分析(One-wayANOVA)被用于確定平均腫瘤體積差異。在顯著的F測(cè)試的情況下，使用鄧尼特的(Dunnett’s)或Sidak’s多重比較試驗(yàn)(適用時(shí))。適用時(shí)，對(duì)腫瘤體積應(yīng)用log10轉(zhuǎn)化來(lái)解釋異方差性。p值<0.05被認(rèn)為是顯著的。在這項(xiàng)研究中使用的材料和它們的來(lái)源在表9-11中列出。表9-11：材料相比使用同種型對(duì)照，使用鼠類(lèi)OX40配體融合蛋白IgG1(mOX40LFp)治療小鼠導(dǎo)致Renca、CT26、4T1、和MCA205腫瘤細(xì)胞的顯著減小的生長(zhǎng)(表9-7、表9-8、表9-9、和表9-10、圖19、圖20、圖21和圖22)。在同源模型中通常顯示混合的應(yīng)答。使用mOX40LFP治療的應(yīng)答從個(gè)體動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)圖中更清楚(圖19、圖20、圖12-3和圖21的小圖B)。由于大腫瘤尺寸在第25天(圖19、圖21)、第42天(圖22)或第43天(圖20)對(duì)未處理的和同種型對(duì)照處理的動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死?；谀[瘤生長(zhǎng)抑制(表9-12、圖19)或具有完全應(yīng)答動(dòng)物的數(shù)目(表9-13、表9-14和表9-15)，在使用mOX40LFP治療的小鼠中觀察到劑量應(yīng)答。表9-12：治療組和在第26天的TGI百分比以及在Renca同源模型中完全應(yīng)答的數(shù)目TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制；NA＝不適用；IP＝腹腔內(nèi)；V＝體積a每組動(dòng)物的數(shù)目：10。b所有動(dòng)物在第4和7天接受200μL測(cè)試樣品(IP)。c％TGI＝[1-(治療組的平均腫瘤V)÷(對(duì)照組的平均腫瘤V)]×100d在研究結(jié)束時(shí)具有腫瘤體積測(cè)量被記錄為0的組的動(dòng)物的數(shù)目。表9-13：治療組和在第22天的TGI百分比以及在CT26同源模型中完全應(yīng)答的數(shù)目TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制；NA＝不適用；IP＝腹腔內(nèi)；V＝體積a每組動(dòng)物的數(shù)目：10。b所有動(dòng)物在第4和7天接受200μL測(cè)試樣品(IP)。c％TGI＝[1-(治療組的平均腫瘤V)÷(對(duì)照組的平均腫瘤V)]×100d在研究結(jié)束時(shí)具有腫瘤體積測(cè)量被記錄為0的組的動(dòng)物的數(shù)目。表9-14：治療組和在第25天的TGI百分比以及在4T1同源模型中完全應(yīng)答的數(shù)目表9-14：治療組和在第25天的TGI百分比以及在4T1同源模型中完全應(yīng)答的數(shù)目TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制；NA＝不適用；IP＝腹腔內(nèi)；V＝體積a每組動(dòng)物的數(shù)目：12。b所有動(dòng)物在第4和7天接受200μL測(cè)試樣品(IP)。c％TGI＝[1-(治療組的平均腫瘤V)÷(對(duì)照組的平均腫瘤V)]×100d在研究結(jié)束時(shí)具有腫瘤體積測(cè)量被記錄為0的組的動(dòng)物的數(shù)目。表9-15：治療組、在第22天在MCA205同源模型中的TGI百分比和完全應(yīng)答的數(shù)目TGI＝腫瘤生長(zhǎng)抑制；NA＝不適用；IP＝腹腔內(nèi)；V＝體積a每組動(dòng)物的數(shù)目：14。b所有動(dòng)物在第4和7天接受200μL測(cè)試樣品(IP)。c％TGI＝[1-(治療組的平均腫瘤V)÷(對(duì)照組的平均腫瘤V)]×100d在研究結(jié)束時(shí)具有腫瘤體積測(cè)量被記錄為0的組的動(dòng)物的數(shù)目。結(jié)論相比未處理的和同種型對(duì)照處理的組，荷瘤小鼠使用mOX40LFP的單一藥劑治療導(dǎo)致四個(gè)不同腫瘤生長(zhǎng)顯著減少的劑量依賴(lài)性抗腫瘤活性。實(shí)例10：在非人靈長(zhǎng)類(lèi)疫苗接種模型中對(duì)OX40LIgG4P融合蛋白的應(yīng)答在這個(gè)實(shí)例中，在非人靈長(zhǎng)類(lèi)(NHP)疫苗接種模型中評(píng)估了OX40激動(dòng)劑的體內(nèi)活性。用于這項(xiàng)研究的抗原是呼吸道合胞體病毒可溶性F糖蛋白(RSVsF)抗原，其能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答和在食蟹猴中的抗體應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。已顯示被稱(chēng)為克隆L106的抗人OX40單克隆抗體增強(qiáng)類(lèi)人猿免疫缺陷病毒糖蛋白130(SIVgp1340)疫苗接種的非人靈長(zhǎng)類(lèi)(NHP)模型中的T和B細(xì)胞應(yīng)答(溫伯格·AD(Weinberg，AD)等人，免疫治療雜志(JImmunother)29:575-585(2006))。在1期人臨床試驗(yàn)中，在癌癥患者中，MEDI6469(小鼠抗人OX40單克隆抗體，也被稱(chēng)為克隆9B12)被顯示刺激針對(duì)共同給予抗原的T細(xì)胞增殖應(yīng)答(對(duì)破傷風(fēng)類(lèi)毒素的回憶應(yīng)答和針對(duì)鑰孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白的從頭應(yīng)答兩者)，在一些患者中發(fā)生腫瘤消退(柯蒂·BD(CurtiBD)等人，癌癥研究(CancerRes)73:7189-98(2013))。材料與方法表10-1描述了組名稱(chēng)和給藥方案。在這項(xiàng)研究中使用了兩只雌性和兩只雄性實(shí)驗(yàn)初始的中國(guó)食蟹猴。將動(dòng)物隨機(jī)化并分配給各組。在給藥的時(shí)候，動(dòng)物大約2.3至5.5歲，體重范圍為從2.5至3.5千克。在研究過(guò)程中動(dòng)物被社會(huì)化。表10-1：治療組和給藥方案從全血中分離食蟹猴外周血單核細(xì)胞外周血單核細(xì)胞(PBMC)在可珀(Percoll)梯度上分離。簡(jiǎn)言之，將全血(約15mL)在50mL錐形管中的30mL的60％可珀(Percoll)工作溶液上鋪一薄層，并在1100×g下在室溫(RT)下離心20分鐘。PBMC從可珀(Percoll)界面收獲，轉(zhuǎn)移到新的錐形管，并用1×磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，沉淀，并在RT下再懸浮于2mL氯化銨鉀裂解緩沖液以裂解紅血細(xì)胞。將PBMC用1×PBS洗滌，然后沉淀并再懸浮于25mL的1×PBS中，用于在番石榴(Guava)easyCyte-HT儀器(密理博公司(Millipore)；比勒利卡，馬薩諸塞州)上計(jì)數(shù)。使用在ViaCount試劑中的1:20稀釋獲得總活PBMC計(jì)數(shù)。離心前，來(lái)自每只動(dòng)物的PBMC樣品分成兩個(gè)管：一個(gè)用于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISpot)測(cè)定和一個(gè)用于Ki67測(cè)定，因?yàn)槊總€(gè)測(cè)定類(lèi)型需要不同的細(xì)胞濃度。離心后，將酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)PBMC以2×106PBMC/mL再懸浮于CTL測(cè)試培養(yǎng)基(具有谷氨酰胺)且Ki67PBMC以5×106PBMC/mL再懸浮于培養(yǎng)基中。細(xì)胞內(nèi)Ki67染色試驗(yàn)Ki67是用于增殖的細(xì)胞內(nèi)(核)標(biāo)記，允許在全血或純化的PBMC中的多個(gè)免疫亞群中同時(shí)評(píng)估細(xì)胞增殖。Ki67增殖是在CD4+和CD8+記憶T細(xì)胞中測(cè)量OX40激動(dòng)劑的體內(nèi)活性的既定藥效標(biāo)志物(柯蒂·BD(CurtiBD)等人，癌癥研究(CancerRes)73:7189-98(2013))。在第7、42、和56天使用純化的PBMC和在第28、35、和38天使用全血，在中央記憶(cM)CD4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶(eM)CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、和B細(xì)胞中評(píng)估了所有猴子的Ki67水平。將100微升的全血或PBMC的100μL的等分(106細(xì)胞/孔)移液到96孔V形底板的多個(gè)孔中，每個(gè)免疫表現(xiàn)型面板一個(gè)孔(即，一個(gè)用于記憶T細(xì)胞，一個(gè)用于NK細(xì)胞，以及一個(gè)用于B細(xì)胞)。CD4+cM亞群(CD95+、CCR5-)代表大多數(shù)的CD4+記憶T細(xì)胞，而CD8+eM(CD95+、CCR5+)亞群代表了大多數(shù)的CD8+記憶T細(xì)胞。集中這些亞群增加了測(cè)定的分辨率。使用表10-2中列出的抗體制備了用于NHP記憶T細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫表現(xiàn)型抗體混合物。免疫表現(xiàn)型抗體混合物與100μL的全血或PBMC在室溫下孵育20分鐘?？子脽晒饧せ罴?xì)胞分選(FACS)染色緩沖液(FSB)洗滌兩次，隨后用FACSTM裂解液在室溫下重懸浮細(xì)胞沉淀10分鐘。然后，細(xì)胞沉淀用FSB洗滌并在室溫下用FACS彼爾姆(Perm)透化10分鐘(兩次)。將細(xì)胞沉淀用FSB洗滌另一次后，在黑暗中室溫下向每個(gè)孔添加10μL的Ki67異硫氰酸熒光素抗體，持續(xù)45分鐘。細(xì)胞沉淀用200μLFSB洗滌兩次并再懸浮于200μLFSB中。在流式細(xì)胞儀上獲得每個(gè)樣品100,000個(gè)事件，且使用FACS迪瓦(Diva)和流式喬(FlowJo)10.6軟件(樹(shù)星(TreeStar)，阿什蘭，俄勒岡州)分析數(shù)據(jù)。NHPIFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定IFNγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定是用于通過(guò)捕獲和定量對(duì)應(yīng)于分泌IFNγ細(xì)胞因子的各個(gè)細(xì)胞的個(gè)別膜斑點(diǎn)來(lái)檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的頻率的96孔測(cè)定。這項(xiàng)測(cè)定是該領(lǐng)域中用于檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的最靈敏的測(cè)定。抗猴IFNγ試劑盒包括抗體預(yù)涂板，且檢測(cè)抗體從Mabtech公司(馬里蒙特，俄亥俄州)購(gòu)得并根據(jù)制造商的說(shuō)明使用。平板用CTL-測(cè)試培養(yǎng)基阻斷。每孔200,000個(gè)PBMC的樣品用模擬液(mock)(CTL-測(cè)試培養(yǎng)基+二甲基亞砜)或RSVF肽池(2μg/mL)刺激三次，而每孔20,000個(gè)PBMC用葡萄球菌腸毒素B(1μg/mL)刺激三次作為陽(yáng)性對(duì)照。將平板在37℃孵育22±2小時(shí)，然后用PBS洗滌10次。IFNγ斑點(diǎn)檢測(cè)通過(guò)用檢測(cè)抗體(7-B6-1-生物素，1:1000)在室溫孵育2小時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)，接著是另一次洗滌和與二級(jí)檢測(cè)抗體(鏈霉親和素-ALP，1:1000)在室溫孵育1小時(shí)。然后添加BCIP/NBT附加底物來(lái)可視化斑點(diǎn)4分鐘，平板用水洗滌來(lái)停止斑點(diǎn)顯影，在黑暗中室溫下干燥過(guò)夜。第二天，每個(gè)孔中的斑點(diǎn)使用CTL免疫斑點(diǎn)板讀數(shù)器和免疫斑點(diǎn)5.1軟件(CTL公司；克利夫蘭，俄亥俄州)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在減去二甲基亞砜孔(背景)之后，結(jié)果使用圖板棱柱(GraphPadPrism)6(圖板軟件公司，拉霍亞，加利福尼亞州)作為F-特異性斑點(diǎn)形成計(jì)數(shù)(SFC)/106PBMC繪圖。RSV-F特異性血清IgG檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)于RSV-FIgG酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，高結(jié)合的96孔平底板在4℃用0.1μg/mLRSVsF蛋白涂覆過(guò)夜。血清樣品在稀釋緩沖液(補(bǔ)充有10％超級(jí)塊的PBS吐溫20[PBST])中手動(dòng)稀釋1:100，然后在96孔樣品稀釋塊(0.5mL)中使用布拉沃(Bravo)液體處理器SRT以1:3連續(xù)稀釋7倍。每個(gè)樣品稀釋塊還包括人類(lèi)血清作為陽(yáng)性對(duì)照和無(wú)抗血清的陰性對(duì)照用于測(cè)量試驗(yàn)背景。測(cè)定板用PBST洗滌3次和在室溫下使用超級(jí)塊阻斷1小時(shí)后，與封閉1小時(shí)在室溫下，將在96孔樣品稀釋塊中的血清稀釋物轉(zhuǎn)移至96孔測(cè)定板，并在室溫持續(xù)振蕩下進(jìn)一步孵育1小時(shí)。在孵育結(jié)束后，將測(cè)定板用PBST洗滌3次，并在室溫持續(xù)振蕩下與辣根過(guò)氧化物酶軛合的抗猴IgG(1:80000)一起孵育1小時(shí)。測(cè)定板用PBST洗滌3次，然后在3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)中顯影8-15分鐘。彩色顯影用1NHCl終止，且這些孔在平板讀數(shù)器上在光密度(OD)450被讀出。血清滴度以給出每個(gè)檢測(cè)板的平均背景4倍以上OD450值的倒數(shù)倍血清稀釋來(lái)定量。RSV-F抗原特異性IgGELISA滴度是log2轉(zhuǎn)化并作圖的。對(duì)于這個(gè)試驗(yàn)的檢測(cè)極限(LOD)被確定為對(duì)血清樣品進(jìn)行第一次血清稀釋的倒數(shù)，即1:100稀釋意味著LOD為100或log26.6且對(duì)于<100的樣品的估算LOD值是LOD的一半，其在這個(gè)實(shí)例的情況下為50或log25.6。RSVA2微量中和試驗(yàn)血清RSV中和滴度通過(guò)RSVA2綠色熒光蛋白(GFP)微量中和試驗(yàn)來(lái)確定。在56℃下將對(duì)照和測(cè)試樣品血清熱滅活一小時(shí)以滅活補(bǔ)體。使用布拉沃(Bravo)SRT液體處理器(安捷倫公司(Agilent)；圣克拉拉，加利福尼亞州)，將熱滅活血清對(duì)照和測(cè)試樣品連續(xù)稀釋3倍，從1:5或1:10開(kāi)始進(jìn)行8次稀釋。將工程化以表達(dá)GFP的RSVA2(RSV-GFP)添加到每個(gè)血清稀釋且病毒地將孔控制在實(shí)現(xiàn)每孔大約500熒光聚焦單位的稀釋。同時(shí)，制備了韋羅(Vero)細(xì)胞，該韋羅細(xì)胞被鋪板在96孔板中以達(dá)到95％-100％融合性單層。血清-病毒混合物在室溫孵育1小時(shí)用于中和，然后加至重復(fù)，使用布拉沃(Bravo)SRT液體處理器洗滌韋羅(Vero)細(xì)胞板兩次。受感染的細(xì)胞板在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育22-24小時(shí)。通過(guò)ImageXpress微XL自動(dòng)成像平臺(tái)(分子裝置公司(MolecularDevices)，桑尼維爾，加利福尼亞州)獲得平板數(shù)據(jù)后，枚舉出由非中和RSVGFP產(chǎn)生的熒光聚焦。在每個(gè)板上，使用從歸一化至病毒對(duì)照的數(shù)據(jù)的2-點(diǎn)插值，將聚焦計(jì)數(shù)登錄到自動(dòng)數(shù)據(jù)分析工作表以確定log250％抑制濃度滴度。2-點(diǎn)插值從病毒的50％中和周?chē)?點(diǎn)線性回歸計(jì)算。對(duì)于這個(gè)試驗(yàn)，LOD被確定為對(duì)樣品進(jìn)行第一次稀釋的倒數(shù)，即1:10稀釋意味著LOD為10或log23.3且對(duì)于<10的樣品的估算LOD值是LOD的一半，其在這個(gè)實(shí)例的情況下為5或log22.3。統(tǒng)計(jì)方法使用混合效應(yīng)模型得到顯著的p值(布朗H(BrownH)和普雷斯科特R(PrescottR)，《在醫(yī)中應(yīng)用混合模型》，紐約，紐約州：約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons)，1999年)。顯著性設(shè)定為p<0.05。出于分析和評(píng)估的目的，還報(bào)道和鑒定了在0.05和0.1之間的、已接近顯著的值，p值。在特定的時(shí)間點(diǎn)在特定的組內(nèi)，使用來(lái)自4個(gè)個(gè)體動(dòng)物試驗(yàn)值的計(jì)算的幾何平均值(GeoMean)執(zhí)行了統(tǒng)計(jì)顯著性的分析以進(jìn)行跨組和跨天的比較。在這項(xiàng)研究中使用的材料在表10-2中列出。表10-2：材料結(jié)果細(xì)胞內(nèi)Ki67水平在CD4+cMT細(xì)胞中的Ki67表10-3總結(jié)了CD4+cMT細(xì)胞增殖結(jié)果(Ki67誘導(dǎo)百分比)。評(píng)估CD4+cMT細(xì)胞增殖的最佳時(shí)間點(diǎn)(基于最高Ki67水平)通常是在第35至42天。在第29、31、和33天被給予3次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白的猴子(第10組)在第42天具有CD4+cMT細(xì)胞增殖的最強(qiáng)增加，顯著高于任何其他組。與第28天(p＝0.0003)基線相比，Ki67刺激百分比的增加高度顯著，并引起在第35和42天的CD4+cMT細(xì)胞增殖超過(guò)70％。第56天，由OX40LIgG4P融合蛋白引起的CD4+cMT細(xì)胞增殖幾乎恢復(fù)到基線。然而，第4組動(dòng)物被給予3次劑量的5mg/kg的OX40LIgG4P融合蛋白，第5組動(dòng)物被給予單一的1mg/kg劑量的OX40LIgG4P融合蛋白。由一次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白引發(fā)的應(yīng)答比得上由3次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白治療方案引起的應(yīng)答，并且顯著強(qiáng)于PBS或mIgG1同種型對(duì)照組的那些，表明在單一劑量后在食蟹猴中OX40LIgG4P融合蛋白可實(shí)現(xiàn)顯著的OX40激動(dòng)。相比于PBS對(duì)照組，MEDI6469在CD4+cMT細(xì)胞增殖試驗(yàn)中未顯示顯著的活性(見(jiàn)表10-3)。表10-3：CD4+cMT細(xì)胞增殖結(jié)果的總結(jié)使用第42天時(shí)間點(diǎn)確定了相對(duì)于基線的組變化和組與組比較的統(tǒng)計(jì)顯著性。ap<0.05，與第28天(基線)相比。bp<0.05，測(cè)試組與第1組相比。在CD8+eMT細(xì)胞中的Ki67表10-4總結(jié)了CD8+eMT細(xì)胞增殖結(jié)果(Ki67誘導(dǎo)百分比)。CD8+eMT細(xì)胞增殖是在第42天最佳。OX40LIgG4P融合蛋白在第42天顯示出與基線相比最強(qiáng)的CD8+eMT細(xì)胞增殖應(yīng)答(p＝0.0095)。MEDI6469也在第42天誘導(dǎo)了與基線(p＝0.007)和同種型對(duì)照mIgG1(p＝0.015)相比強(qiáng)的CD8+eMT細(xì)胞增殖。對(duì)于OX40LIgG4P融合蛋白(3次劑量)觀察到的CD8+eMT細(xì)胞增殖應(yīng)答的峰值幅度在50％以上(在CD8+eMT細(xì)胞中的％Ki67+細(xì)胞)。OX40LIgG4P融合蛋白和MEDI6469是唯一的OX40激動(dòng)劑，它們的活性與PBS和mIgG1同種型對(duì)照組相比在CD8+eMT細(xì)胞增殖中達(dá)到顯著水平。表10-4：CD8+eMT細(xì)胞增殖結(jié)果的總結(jié)使用第42天時(shí)間點(diǎn)確定了相對(duì)于基線的組變化和組與組比較的統(tǒng)計(jì)顯著性。ap<0.05，與第28天(基線)相比。bp<0.05，測(cè)試組與第1組相比。cp<0.1，與第28天(基線)相比。dp<0.1，測(cè)試組與第1組相比。在NK細(xì)胞中的Ki67表10-5總結(jié)了NK細(xì)胞增殖結(jié)果(Ki67+NK細(xì)胞百分比)。據(jù)報(bào)道OX40在NK細(xì)胞上以低水平表達(dá)(克羅夫特·M(CroftM)等人，免疫學(xué)評(píng)論(ImmunolRev)229:173-91(2009))，因此，NK細(xì)胞可以是OX40激動(dòng)作用的直接靶標(biāo)，或者可以通過(guò)與T細(xì)胞相互作用而受影響。OX40LIgG4P融合蛋白在所測(cè)試的所有組的第42天引起最高的NK細(xì)胞增殖應(yīng)答；應(yīng)答與PBS對(duì)照(p＝0.020)和mIgG1同種型對(duì)照(p＝0.032)相比是顯著的并且類(lèi)似于MEDI6469(p＝0.74)。單一的1mg/kg劑量的OX40LIgG4P融合蛋白與3次劑量(5mg/kg)方案(p＝0.48)是相似的。在第42天MEDI6469增強(qiáng)NK細(xì)胞增殖，其比PBS對(duì)照(p＝0.0083)和mIgG1同種型對(duì)照(p＝0.042)組顯著更高。表10-5：NK細(xì)胞增殖結(jié)果的總結(jié)使用第42天時(shí)間點(diǎn)確定了相對(duì)于基線的組變化和組與組比較的統(tǒng)計(jì)顯著性。ap<0.05，與第28天(基線)相比。bp<0.05，測(cè)試組與第1組相比。cp<0.1，與第28天(基線)相比。dp<0.1，測(cè)試組與第1組相比。在B細(xì)胞中的Ki67表10-6總結(jié)了B細(xì)胞增殖結(jié)果(Ki67+B細(xì)胞百分比)。已知B細(xì)胞不表達(dá)OX40，但它們可通過(guò)與活化的T細(xì)胞相互作用而受影響。使用3次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白方案和1次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白方案，在第42天觀察到相比基線的顯著的B細(xì)胞增殖(p<0.05)。在3次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白方案中，觀察到與基線的差異，但是這可能是由于2只動(dòng)物基線值的缺失和小的樣本大小，結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。PBS對(duì)照組也顯示出與基線不同的B細(xì)胞增殖的增加(p＝0.0007)。因?yàn)槿绱?，具有比PBS對(duì)照組顯著更高的B細(xì)胞增殖的唯一組為1次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白組(p＝0.0316)。顯示比mIgG1同種型對(duì)照組的B細(xì)胞增殖顯著增加的唯一組是1次劑量OX40LIgG4P融合蛋白的方案。該1次劑量OX40LIgG4P融合蛋白方案類(lèi)似于3次劑量OX40LIgG4P融合蛋白的方案。表10-6：B細(xì)胞增殖結(jié)果的總結(jié)使用第42天時(shí)間點(diǎn)確定了相對(duì)于基線的組變化和組與組比較的統(tǒng)計(jì)顯著性。ap<0.05，與第28天(基線)相比。bp<0.05，測(cè)試組與第1組相比。cp<0.1，與第28天(基線)相比。dp<0.1，測(cè)試組與第1組相比。NHPIFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)表10-7總結(jié)了如通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定的RSV-F特異性IFNγ的T細(xì)胞應(yīng)答。對(duì)RSVsF初次-加強(qiáng)疫苗接種方案的最佳T細(xì)胞應(yīng)答可在給予加強(qiáng)抗原后14-28天(其對(duì)應(yīng)于這項(xiàng)研究的第42-56天)觀察到。如果動(dòng)物具有它基線水平(免疫接種前)4倍的應(yīng)答水平和≥50斑點(diǎn)/百萬(wàn)PBMC，則該動(dòng)物被認(rèn)為是一個(gè)應(yīng)答者。3次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白方案展現(xiàn)出RSV-F特異的T細(xì)胞應(yīng)答的最強(qiáng)誘導(dǎo)，其是在第42和56天檢測(cè)到的，4只猴子全部在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都具有積極的應(yīng)答。應(yīng)答與基線相比在第42天(p＝0.012)和第56天(p＝0.010)是顯著的，并且與PBS對(duì)照(p＝0.0023)和mIgG1同種型對(duì)照(p＝0.0024)組顯著不同。在第42天(p＝0.47)和第56天(p＝0.38)，在給予1次劑量OX40LIgG4P融合蛋白的動(dòng)物中的應(yīng)答相似于給予3次劑量OX40LIgG4P融合蛋白的動(dòng)物中的應(yīng)答。表10-7：RSVF-特異的IFN-γT細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)結(jié)果的總結(jié)使用第42天時(shí)間點(diǎn)確定了相對(duì)于基線的組變化和組與組比較的統(tǒng)計(jì)顯著性。ap<0.1，測(cè)試組與第1組相比。bp<0.05，測(cè)試組與第1組相比。cp<0.1，第28天(基線)。dp<0.05，與第28天(基線)相比。在第42天，MEDI6469引起了25％的應(yīng)答率，其沒(méi)有與PBS對(duì)照組(p＝0.093)或mIgG1同種型對(duì)照組(p＝0.066)顯著不同。在第56天，MEDI6469具有50％的應(yīng)答率，與mIgG1同種型對(duì)照組(p＝0.039)顯著不同。鑒于抗原加強(qiáng)后沒(méi)有延遲，這種應(yīng)答沒(méi)有與MEDI6469顯著不同?？筊SV-FIgG滴度表10-8總結(jié)了抗RSV-FIgG滴度。B細(xì)胞可以通過(guò)與活化的T細(xì)胞相互作用來(lái)為共享的抗原靶標(biāo)制造更多或更高親和力的抗體而受影響。如在表10-6中所示的Ki67數(shù)據(jù)，通過(guò)若干個(gè)OX40激動(dòng)劑方案誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖。對(duì)抗原特異性抗體滴度進(jìn)行評(píng)估以確定這種增殖是否轉(zhuǎn)化為功能性效果。在第0天第一次免疫接種之前，RSV-F-特異性IgG水平在大多數(shù)(或全部)動(dòng)物中低于試驗(yàn)檢測(cè)極限。在第14天，在所有RSVsF免疫組但不在PBS對(duì)照組中檢測(cè)到低水平的抗RSV-FIgG抗體。在第42天(OX40激動(dòng)劑給藥后14天)觀察到最高的抗體應(yīng)答。mIgG1同種型對(duì)照組初次免疫后(第14和28天)展示出在RSV-FIgG滴度的增加(從基線至大約1:256滴度或8log2)，其在單獨(dú)的RSV-F抗原加強(qiáng)后第42和56天進(jìn)一步增加了約8倍(大約1:2048滴度或11log2)。相比mIgG1同種型對(duì)照組(p＝0.050)，使用MEDI6469的OX40激動(dòng)作用在第42天顯著增強(qiáng)了抗RSV-FIgG抗體(大約1:16,400滴度或14log2)，具有從基線的300倍的增加。3次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白組在第42天顯示出抗RSV-FIgG抗體的強(qiáng)的誘導(dǎo)，其類(lèi)似于MEDI6469(分別為p＝0.33和p＝0.44)。對(duì)于這兩個(gè)組在大小和顯著性上第56天的應(yīng)答等同于第42天的應(yīng)答。另外，在誘發(fā)抗RSV-FIgG抗體方面，1次劑量OX40LIgG4P融合蛋白組等同于3次劑量OX40LIgG4P融合蛋白組(p＝0.23)。表10-8：RSVF特異性IgG滴度的總結(jié)RSV中和的抗體滴度表10-9總結(jié)了在動(dòng)物的血清中觀察到的平均(每個(gè)組)RSV中和滴度。這個(gè)試驗(yàn)比RSV-FIgG試驗(yàn)的敏感性少，因?yàn)樗鼉H評(píng)估可中和RSV病毒的抗體。正的中和應(yīng)答被定義為在基線以上的中和抗體滴度的4倍升高。最大的RSV中和抗體在第42和56天觀察到。觀察到在這個(gè)試驗(yàn)中最大的應(yīng)答為產(chǎn)生100％應(yīng)答率(4/4動(dòng)物)的3次劑量OX40LIgG4P融合蛋白組。1次劑量OX40LIgG4P融合蛋白組在第56天達(dá)到了75％的應(yīng)答率，應(yīng)答大小顯著高于它的基線，并且在第42天(p＝0.21)和第56天(p＝0.45)類(lèi)似于3次劑量OX40LIgG4P融合蛋白組。1次劑量和3次劑量OX40LIgG4P融合蛋白組是在第56天(對(duì)于兩個(gè)組p＝0.029)顯示與PBS對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的僅有的組。表10-9：RSVA2中和抗體滴度的總結(jié)使用第42天時(shí)間點(diǎn)確定了相對(duì)于基線的組變化和組與組比較的統(tǒng)計(jì)顯著性。ap<0.05，與第28天(基線)相比。結(jié)論OX40LIgG4P融合蛋白在Ki67增殖水平和在RSV-F抗原特異性應(yīng)答兩者方面引起強(qiáng)的應(yīng)答。MEDI6469誘發(fā)CD8+eMT細(xì)胞增殖的活性類(lèi)似于OX40LIgG4P融合蛋白的活性，且誘發(fā)RSVF特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答比OX40LIgG4P融合蛋白更弱?？傮w而言，一次劑量的OX40LIgG4P融合蛋白(以1mg/kg)在評(píng)估的大多數(shù)試驗(yàn)中誘導(dǎo)與3次劑量(5mg/kg)類(lèi)似的應(yīng)答，盡管3次劑量方案在Ki67增殖和誘發(fā)RSV中和抗體方面優(yōu)越。OX40LIgG4P融合蛋白與RSVsF一起給予導(dǎo)致與基線相比顯著的F-特異性IFNγ應(yīng)答。這項(xiàng)NHP研究的結(jié)果提供了證據(jù)表明向NHP給予OX40激動(dòng)劑可以驅(qū)動(dòng)定義的抗原特異性免疫應(yīng)答。實(shí)例11：人OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)Treg介導(dǎo)的人CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的抑制的影響在這個(gè)實(shí)例中，研究了OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制效果的影響。材料與方法效應(yīng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分離匿名人類(lèi)白細(xì)胞錐是由在英國(guó)的國(guó)家衛(wèi)生服務(wù)輸血服務(wù)(NHSBT)中心提供。人外周血單核細(xì)胞(PBMC)通過(guò)在菲科帕克+(Ficoll-PaquePlus)上分層血液和按照制造商的說(shuō)明(GE醫(yī)療集團(tuán)，查爾方特圣吉爾斯，英國(guó))離心從白細(xì)胞錐中分離。人CD4+效應(yīng)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞使用人T調(diào)節(jié)性細(xì)胞分離試劑盒按照制造商的說(shuō)明(生命技術(shù)公司(LifeTechnologies)，佩斯利，英國(guó))從PBMC中分離。簡(jiǎn)言之，這個(gè)過(guò)程涉及通過(guò)非CD4+細(xì)胞的抗體標(biāo)記的總CD4+細(xì)胞的陰性選擇，和通過(guò)使用基于磁珠的消耗除去它們。然后，將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)標(biāo)記抗CD25從效應(yīng)CD4+細(xì)胞中分離，接著是使用磁珠的陽(yáng)性選擇，這些磁珠隨后從分離的細(xì)胞中除去。圓底96孔組織培養(yǎng)板在兩個(gè)連續(xù)的步驟中涂覆上抗CD3抗體和測(cè)試樣品。首先，將100μL的0.5μg/mL抗CD3抗體加入各孔，且平板在4℃孵育過(guò)夜。然后，平板用PBS洗滌，100μL測(cè)試或?qū)φ諛悠凡钜赃m宜的濃度加入到相關(guān)孔且平板在4℃孵育過(guò)夜。孵育之后，在隨后的抑制試驗(yàn)中使用前，將平板再次用PBS洗滌。使用細(xì)胞蹤跡(CellTrace)TMCFSE細(xì)胞增殖試劑盒(生命技術(shù)公司，佩斯利，英國(guó))根據(jù)制造商的說(shuō)明，將效應(yīng)CD4+T細(xì)胞使用羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記。效應(yīng)CD4+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在抗CD3涂覆的平板中以1:1或1:2比率共培養(yǎng)。培養(yǎng)基是含有1％v/v青霉素和鏈霉素、5％v/v人AB血清和1μg/mL抗CD28抗體的RPMI-1640Glutamax-I。培養(yǎng)條件為37℃的溫度和5％CO2的空氣。培養(yǎng)細(xì)胞從培養(yǎng)板中除去4天后，在PBS中洗滌兩次，并根據(jù)制造商的說(shuō)明(eBiosciences公司，哈特菲爾德，英國(guó))用可固定活性染料780染色。染色之后，細(xì)胞在FACS緩沖液(eBioscience公司)中洗滌和通過(guò)重懸浮于100μL的細(xì)胞固定(CellFix)TM(貝克頓·迪金森公司(BectonDickinson)，牛津，英國(guó))中來(lái)固定，接著是在室溫下孵育15分鐘。將固定的細(xì)胞懸浮于FACS緩沖液中，并使用貝克頓·迪金森公司(BectonDickinson)的FACSCantoII流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。熒光補(bǔ)償后，分裂效應(yīng)T細(xì)胞(CFSE低)的百分比使用流式喬(FlowJo)軟件(版本vX.0.7)來(lái)評(píng)估。將非存活的(eFluor陽(yáng)性)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CFSE陰性)區(qū)分，并且從分析中排除。數(shù)據(jù)的圖解表示(包括平均值和該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差的確定)使用用于Windows的圖板棱柱(GraphPadPrism)版本6.0來(lái)產(chǎn)生。在這個(gè)實(shí)例中使用的材料在表11-1中列出。表11-1：材料結(jié)果人OX40LIgG4P融合蛋白克服了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的人效應(yīng)CD4+T細(xì)胞增殖的抑制。人效應(yīng)CD4+T細(xì)胞在刺激不存在下不分裂。抗CD3和抗CD28的添加導(dǎo)致分裂細(xì)胞的百分比增加至33％。40nM或10nM的濃度的OX40LIgG1融合蛋白的添加分別使分裂細(xì)胞的百分比顯著地增加至41％和61％(圖23)。40nM或10nM的濃度的對(duì)照構(gòu)建體(F180AOX40LFPIgG1；這個(gè)苯丙氨酸(F)至丙氨酸(A)突變消除OX40L蛋白的OX40受體結(jié)合活性，參見(jiàn)實(shí)例1)的添加相對(duì)于單獨(dú)的抗CD3+抗CD28沒(méi)有顯著地增加分裂細(xì)胞的％(圖23“同種型對(duì)照”(F180AOX40LFPIgG1))。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)以1:1的效應(yīng)物:Treg比例的添加減少分裂的細(xì)胞的百分比至15％。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)以1:2的效應(yīng)物:Treg比例的添加減少分裂細(xì)胞的百分比進(jìn)一步至12％。40nM或10nM的對(duì)照構(gòu)建體(F180AOX40LFPIgG1)的添加未顯著影響當(dāng)以1:1或1:2的效應(yīng)物:Treg比例存在時(shí)通過(guò)Treg的效應(yīng)T細(xì)胞分裂的抑制。與此相反，40nM或10nM的OX40LIgG1融合蛋白添加分別顯著地增加當(dāng)在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的存在下以1:1的效應(yīng)物:Treg比例培養(yǎng)時(shí)分裂的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的百分比至52％和67％。40nM和10nM的OX40LIgG1融合蛋白添加顯著地增加當(dāng)在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的存在下以1:2的效應(yīng)物:Treg比例培養(yǎng)時(shí)分裂的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的百分比至53％和66％(圖23)。OX40LIgG4P融合蛋白對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞增殖的抑制的影響是濃度依賴(lài)性的。在隨后的試驗(yàn)中，對(duì)如上所述的OX40LIgG4P融合蛋白介導(dǎo)的影響的濃度依賴(lài)性進(jìn)行了評(píng)估。在這個(gè)試驗(yàn)中，抗CD3和抗CD28的添加導(dǎo)致3.4％分裂的CD4+效應(yīng)細(xì)胞。這通過(guò)OX40LIgG4P融合蛋白的加入增加了，但這些增加沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性，除了在2.5nM處OX40LIgG4P融合蛋白增加了分裂的效應(yīng)細(xì)胞的百分比至17％(圖24)之外。Treg以1:1的比例的添加減少了分裂的效應(yīng)T細(xì)胞的百分比至2.5％。40nM和2.5nM(而不是10nM和0.62nM)的OX40L融合蛋白IgG4-FPat的添加，分別顯著地增加分裂的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的百分比至6.7％和24％(圖24)。40nM的濃度的對(duì)照樣品(NIP228IgG4P(見(jiàn)表1-1))的添加沒(méi)有顯著增加當(dāng)單獨(dú)培養(yǎng)或在Treg的存在下培養(yǎng)時(shí)分裂的CD4+效應(yīng)細(xì)胞的％(圖24)。結(jié)論OX40L融合蛋白可克服Treg細(xì)胞對(duì)CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的增殖的抑制影響。OX40L融合蛋白對(duì)Treg細(xì)胞介導(dǎo)的抑制的影響是濃度依賴(lài)性的，且需要至少2.5nM的OX40L融合蛋白。實(shí)例12：OX40激動(dòng)劑在恒河猴中的藥效學(xué)Ox40激動(dòng)劑的藥效學(xué)在靜脈內(nèi)注射恒河猴后進(jìn)行了確定。在給予MEDI6469(9B12抗體)或OX40L融合蛋白IgG4-FP后，值是基于外周血T、B、和NK細(xì)胞(如細(xì)胞表面免疫調(diào)節(jié)蛋白和免疫細(xì)胞上的細(xì)胞內(nèi)Ki-67的變化)。作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，以及免疫調(diào)節(jié)蛋白例如PD-1和ICOS，在這些細(xì)胞群體上對(duì)Ki-67的表達(dá)進(jìn)行了檢查。另外的組接受生理鹽水作為對(duì)照。研究設(shè)計(jì)如下(也參見(jiàn)，圖25)：表12-1：研究設(shè)計(jì)和組存活的單細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析以確定藥效學(xué)標(biāo)志物的變化?？偟挠洃汣D4和CD8T細(xì)胞分別被定義為CD3+CD4+CD95+CD20-和CD3+CD8+CD95+CD20-。中央記憶CD4和CD8T細(xì)胞分別被定義為CD3+CD4+CD28+CD95+CCR5-CCR7+CD20-和CD3+CD8+CD28+CD95+CCR5-CCR7+CD20-。效應(yīng)記憶CD4和CD8T細(xì)胞分別被定義為CD3+CD4+CD28-CD95+CCR7-CD20-和CD3+CD8+CD28-CD95+CCR7-CD20-。B細(xì)胞被定義為CD3-CD20+細(xì)胞(見(jiàn)下面表12-2)。表12-2：免疫分型板與PBS對(duì)照組相比，MEDI6469和OX40L融合蛋白IgG4-FP的結(jié)果在最高生物效應(yīng)方面在數(shù)量上和性質(zhì)上都不同。相對(duì)于PBS處理組，MEDI6469在總的記憶CD4T細(xì)胞增殖方面顯示了3.5倍平均增加(30％相比7.6％)。這反映在中央記憶CD4的3.0倍增加(23％相比7.7％)和效應(yīng)記憶CD4T細(xì)胞的3.2倍增加(22％相比6.8％)。OX40L融合蛋白IgG4-FP誘導(dǎo)了總記憶CD4+T細(xì)胞增殖的7倍增加(52％相比7.6％)。OX40L融合蛋白IgG4-FP誘導(dǎo)的效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞增殖(第14天)的最大增加相對(duì)于總的和中央記憶CD4T細(xì)胞增殖(第10天)觀察到的最大增加被延遲。響應(yīng)于OX40L融合蛋白IgG4-FP的CD8+總記憶T細(xì)胞增殖的增加(19％相比7.6％；2.5倍)類(lèi)似于對(duì)于MEDI6469所觀察的(17％相比9.2％；1.8倍)。對(duì)于OX40L融合蛋白IgG4-FP，總記憶CD8T細(xì)胞的增加反映在中央記憶CD8T細(xì)胞的3.3倍變化(29％相比8.9％)，以及效應(yīng)記憶CD8T細(xì)胞的1.9倍變化(21％相比11％)。與對(duì)于CD4T細(xì)胞所觀察的類(lèi)似，在OX40L融合蛋白IgG4-FP治療后的效應(yīng)記憶CD8T細(xì)胞增殖的最高值(第14天)相對(duì)于總的和中央記憶CD8T細(xì)胞增殖的最高值(第10天)被延遲了。對(duì)于OX40L融合蛋白IgG4-FP和MEDI6469，觀察到初始的CD4或CD8T細(xì)胞增殖沒(méi)有實(shí)質(zhì)性變化(圖26)。在總的記憶CD4T細(xì)胞中ICOS+細(xì)胞的增加在性質(zhì)上與對(duì)于OX40L融合蛋白IgG4-FP的OX40介導(dǎo)的總記憶CD4T細(xì)胞的增殖相符，顯示平均％陽(yáng)性細(xì)胞的6.4倍增加(15％與對(duì)于PBS的2.3％相比)，雖然代表在細(xì)胞上更低的總體誘導(dǎo)總百分比。還觀察到ICOS+記憶CD8T細(xì)胞的6.0倍增加(3.8％相比0.64％)，高于CD8記憶T細(xì)胞增殖(Ki67；2.5倍)的相對(duì)增加，但低于總體誘導(dǎo)總％。與OX40L融合蛋白IgG4-FP相反，MEDI6469誘導(dǎo)了對(duì)于ICOS誘導(dǎo)的較低2.4倍的增加，類(lèi)似與在總記憶CD4T細(xì)胞上的增殖(Ki67)的3.5倍誘導(dǎo)。在MEDI6469治療總記憶CD8T細(xì)胞之后沒(méi)有觀察到ICOS誘導(dǎo)，其因而與OX40L融合蛋白IgG4-FP的結(jié)果不同。對(duì)于OX40L融合蛋白IgG4-FP或MEDI6469，沒(méi)有觀察到在初始的CD4或CD8T細(xì)胞上ICOS表達(dá)的變化(圖27)。OX40L融合蛋白IgG4-FP給予后，總記憶CD4T細(xì)胞上的PD-1表達(dá)增加了3.1倍(3.3％相比1.1％PBS組)，而對(duì)于MEDI6469給予那個(gè)增加是大約5.1倍(1.1％至5.4％)，雖然在總百分比基礎(chǔ)上的誘導(dǎo)是低的(分別為2.0％和4.0％)。對(duì)于總記憶CD8T細(xì)胞，OX40L融合蛋白IgG4-FP和MEDI6469分別在PD-1表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)了2.7倍(2.5％相比0.92％)和5.0倍(2.6％相比0.54％)的最大增加，雖然對(duì)于每一個(gè)來(lái)說(shuō)在總百分比基礎(chǔ)上的增加是相當(dāng)?shù)偷?分別為1.6％和2.1％)。由MEDI6469在總記憶CD4和CD8T細(xì)胞上的PD-1的更大的誘導(dǎo)與對(duì)于ICOS所觀察的定性地不同，其中OX40L融合蛋白IgG4-FP誘導(dǎo)的變化更大。對(duì)于OX40L融合蛋白IgG4-FP或MEDI6469，沒(méi)有觀察到在初始的CD4或CD8T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的變化(圖28)。OX40L融合蛋白IgG4-FP和MEDI6469誘導(dǎo)了CD20+B細(xì)胞的增殖。在最大值處，OX40L融合蛋白IgG4-FP使在B細(xì)胞中Ki67表達(dá)增加了2.8倍(24％相比8.5％)，并且MEI6469使在B細(xì)胞中Ki67表達(dá)增加了2.5倍(17％相比6.7％)(圖29)。結(jié)論OX40L融合蛋白IgG4-FP誘導(dǎo)總的、中央、和效應(yīng)記憶CD4和CD8T細(xì)胞的增殖。CD4比CD8T細(xì)胞群體影響的大小更大。效應(yīng)記憶CD4和CD8T細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)相對(duì)于總的和中央記憶T細(xì)胞被延遲，表明對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞群體間接的或延遲的生物效應(yīng)。OX40L融合蛋白IgG4-FP比MEDI6469誘導(dǎo)更高水平的總記憶CD4T細(xì)胞的增殖，雖然誘導(dǎo)總的記憶CD8T細(xì)胞增殖在這些劑量和藥物時(shí)間表是相似的。OX40L融合蛋白IgG4-FP誘導(dǎo)了在總記憶CD4和CD8T細(xì)胞上的ICOS和PD-1表達(dá)，對(duì)于每一個(gè)在總記憶CD4T細(xì)胞上觀察到相比總記憶CD8T細(xì)胞更高的總百分比誘導(dǎo)。相比MEDI6469，對(duì)OX40L融合蛋白IgG4-FP觀察到在總記憶CD4和CD8T細(xì)胞上更多的ICOS誘導(dǎo)。然而，在總記憶CD4T細(xì)胞上，相比對(duì)OX40L融合蛋白IgG4-FP所觀察的，有通過(guò)MEDI6469的對(duì)PD-1的更大誘導(dǎo)，表明OX40L融合蛋白IgG4-FP誘導(dǎo)PD-1T細(xì)胞抑制性蛋白的能力相對(duì)于在這些細(xì)胞上的激動(dòng)劑mAbMEDI6469的可能的生物學(xué)差異。***本披露的寬度和范圍應(yīng)當(dāng)不限于以上描述的示例性實(shí)施例中的任一個(gè)，而應(yīng)當(dāng)僅根據(jù)以下權(quán)利要求書(shū)和它們的等效物來(lái)限定。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3