本申請聲明于2014年4月10日申請的美國專利申請?zhí)?1/977,824，以及2014年9月30日申請的美國專利申請?zhí)?2/057,381的權(quán)益，其全部內(nèi)容于此并入本文中作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于對腫瘤相關(guān)糖類抗原的抗體，其包含特定針對至少一個腫瘤相關(guān)糖類抗原或其片段的特定部份或變異體、以及編碼這些抗體的核酸、互補核酸、載體、宿主細胞和其制造與使用方法，其包括包含所述抗體的治療制劑及藥學(xué)組成物。進一步，提供用于給予有效量的抗體予受試者以抑制癌細胞的方法。
背景技術(shù)：
：數(shù)種表面糖類會表現(xiàn)在惡性腫瘤細胞上。舉例來說，GloboH(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)已經(jīng)顯示出在多種上皮癌中會過表現(xiàn)，且其在乳癌和小細胞肺癌中與腫瘤侵襲性和差預(yù)后有關(guān)聯(lián)。先前研究顯示出GloboH及階段特異性胚抗原3(Stage-specificembryonicantigen3，SSEA3，也被稱為Gb5)于乳癌和乳癌干細胞上被觀察到(WWChang等人，「GloboH與SSEA3在乳癌干細胞中的表現(xiàn)以及巖藻醣基轉(zhuǎn)移酶1和2在GloboH合成中的參與」(ExpressionofGloboHandSSEA3inbreastcancerstemcellsandtheinvolvementoffucosyltransferases1and2inGloboHsynthesis)，PNAS，105(33)：11667-11672)。這些發(fā)現(xiàn)支持針對腫瘤相關(guān)糖類抗原的抗體的發(fā)展的合理解釋，然而仍有針對癌癥在有效治療及/或預(yù)防上的未滿足需求。本發(fā)明提供對腫瘤相關(guān)糖類抗原的抗體以滿足這些與其他需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含結(jié)合至糖類抗原的可變域、這些抗體的共軛版本、編碼或互補核酸、載體、宿主細胞、組成物、制劑、裝置、基因轉(zhuǎn)殖動物、其相關(guān)的基因轉(zhuǎn)殖植物、以及其制造及使用方法，如本文所描述和啟用的，與本發(fā)明所屬領(lǐng)域公知的組合?？贵w或其抗原結(jié)合部份可具有大約10E-7M或更小、大約10E-8M或更小、大約10E-9M或更小、大約10E-10M或更小、大約10E-11M或更小、或大約10E-12M或更小的解離常數(shù)(KD)?？贵w或其抗原結(jié)合部份可為人源化的或嵌合的。在一個實施例中，本發(fā)明提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:3所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域。在另一個實施例中，本發(fā)明提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。在又另一個實施例中，本發(fā)明提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:3所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域；以及包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。在第四個實施例中，本發(fā)明提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含重鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含三個互補決定區(qū)(complementaritydeterminingregion(s)，CDRs)，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:5、6及7中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一個例示性實施例中，重鏈進一步包含在前導(dǎo)序列和所述CDR1之間的框架(Framework)，其具有大約80％至大約100％與SEQIDNO:87同源的氨基酸序列。在另一個實施例中，重鏈進一步包含在所述CDR2和CDR3之間的框架，其具有大約80％至大約100％與SEQIDNO:89同源的氨基酸序列。在又另一個例示性實施例中，重鏈進一步包含在具有大約80％至大約100％與SEQIDNO:11同源的氨基酸序列的重鏈的所述CDR1和CDR2之間的框架，其中所述框架含有在位置9的甘氨酸，且其抗體或其抗原結(jié)合部份結(jié)合至糖類抗原，諸如GloboH。在第五個實施例中，本發(fā)明提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含輕鏈區(qū)，其中輕鏈區(qū)包含三個CDR，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至100％與SEQIDNOs:8、9及10中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一個例示性實施例中，輕鏈進一步包含在前導(dǎo)序列和所述CDR1之間的框架，其具有大約80％至大約100％與SEQIDNO:88同源的氨基酸序列。在另一個例示性實施例中，輕鏈進一步包含在輕鏈的所述CDR2和CDR3之間的框架，其具有大約80％至大約100％與SEQIDNO:90同源的氨基酸序列。在又另一個例示性實施例中，輕鏈進一步包含在具有大約80％至大約100％與SEQIDNO:12同源的氨基酸序列的輕鏈的所述CDR1和CDR2之間的框架，其中所述框架含有在位置12的脯氨酸，且抗體或其抗原結(jié)合部份結(jié)合至GloboH。在又另一個例示性實施例中，輕鏈進一步包含在具有大約80％至大約100％與SEQIDNO:12同源的氨基酸序列的輕鏈的所述CDR1和CDR2之間的框架，其中所述框架含有在位置13的色氨酸，且抗體或其抗原結(jié)合部份結(jié)合至糖類抗原，諸如GloboH。在第六個實施例中，本發(fā)明提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含三個CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:5、6及7中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列，且其中輕鏈區(qū)包含三個CDR，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:8、9及10中闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含：重鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:5、6或7的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。在其他實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含輕鏈區(qū)，其中輕鏈區(qū)包含具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:8、9或10的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。本發(fā)明也針對抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:13所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域。本發(fā)明也關(guān)于抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:14所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。本發(fā)明也關(guān)于抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:13所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域；以及包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:14所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。一例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含重鏈區(qū)，其中重鏈區(qū)包含三個CDR，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:15、16及17中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。另一個例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含輕鏈區(qū)，其中輕鏈區(qū)包含三個CDR，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:18、19及20中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。另一個例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中重鏈區(qū)包含三個CDR，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:15、16及17中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列，且其中輕鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:18、19及20所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些實施例中，所提供的是抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：重鏈區(qū)，其中重鏈區(qū)包括具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:15、16或17的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。在其他實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含輕鏈區(qū)，其中輕鏈區(qū)包含具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:18、19或20的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。本發(fā)明的一個實施例是抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:21所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域。另一個本發(fā)明的實施例是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:22所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。在本發(fā)明的另一個實施例是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:21所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域；以及包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:22中所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。一例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含重鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:23、24及25中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。另一個例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含輕鏈區(qū)，其中所述輕鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:26、27及28中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。另一個例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包括重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中重鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:23、24及25中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列，且其中輕鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:26、27及28所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含：重鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包括具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:23、24或25的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。在其他實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含輕鏈區(qū)，其中輕鏈區(qū)包括具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:26、27或28的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。本發(fā)明也揭露抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:29所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域。本發(fā)明也揭露抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:30所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。本發(fā)明也揭露抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:29所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域；以及包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:30所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。一例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含重鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:31、32及33中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。另一個例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含輕鏈區(qū)，其中所述輕鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:34、35及36中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。另一個例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中重鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:31、32及33中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列，且其中輕鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:34、35及36所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含：重鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包括具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:31、32或33的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。在其他實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含輕鏈區(qū)，其中輕鏈區(qū)包含具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:34、35或36的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。本發(fā)明的一個實施例是抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:37所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域。另一個本發(fā)明的實施例提供抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:38所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。在本發(fā)明的另一個實施例中提供抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含：包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:37所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變域；以及包括大約80％至大約100％與SEQIDNO:38中所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的輕鏈可變域。一例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含重鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:39、40及41中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。另一個例示性實施例揭露抗體、或其抗原結(jié)合部份，包含輕鏈區(qū)，其中所述輕鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:42、43及44中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。另一個例示性實施例提供抗體、或其抗原結(jié)合部份，其包含重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中重鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:39、40及41中所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列，且其中輕鏈區(qū)包含三個CDRs，CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有大約80％至大約100％與SEQIDNOs:42、43及44所闡明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含：重鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:39、40或41的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。在其他實施例中，所提供的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含輕鏈區(qū)，其中輕鏈區(qū)包含具有大約80％至大約100％與選自SEQIDNOs:42、43或44的氨基酸序列同源的氨基酸序列的CDR。本發(fā)明提供包含如本文描述的抗體或其抗原結(jié)合部份以及至少一個藥學(xué)上可接受的載體的藥學(xué)組成物。本發(fā)明也提供用于抑制GloboH表現(xiàn)的癌細胞的方法，其包含對需要的受試者投以如本文所提供的抗體或其抗原結(jié)合部份的有效量，其中GloboH表現(xiàn)的癌細胞被抑制。本發(fā)明也提供指定為2C2(寄存于美國菌種保存中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)寄存號碼PTA-121138)；3D7(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121310)；7A11(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121311)；2F8(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121137；以及1E1(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121312)的雜交瘤克隆(clones)，以及從其產(chǎn)生的抗體與抗原結(jié)合部份。附圖說明第1圖為顯示PBS、GloboH-VK9mAbs、GloboH-2C2mAbs和GloboH-3D7mAb對于在小鼠中胰腺癌(HPAC)體積的效果的線性圖。第2圖為顯示正常食鹽水和GloboH-2C2mAbs的不同劑量對于在小鼠中乳癌(MCF7)體積的效果的線性圖。第3A圖至第3F圖為顯示GloboH-2C2mAb(第3A圖)、GloboH-7A11mAb(第3B圖)、GloboH-3D7mAb(第3C圖)、GloboH-2F8mAb(第3D圖)、GloboH-1E1mAb(第3E圖)以及GloboH-VK9mAb(第3F圖)與多種糖類抗原的結(jié)合親和力的條形圖。具體實施方式如本文所使用的，文章「一」指稱文章的文法對象的一個或一個以上(即，至少一個)。以實例的方式，「一組件」意思為一個組件或一個以上組件。如本文所使用的「有效量」，意指足以降低癌癥的癥狀和征象的疫苗或藥學(xué)組成物的劑量，癌癥的癥狀和征象諸如體重減輕、疼痛和可觸及腫塊，其為臨床上為可觸及腫塊或通過多種成像裝置放射性地可偵測的。術(shù)語「有效量」和「治療有效量」可互換使用。術(shù)語「受試者」可指稱具有癌癥的脊椎動物或被認為需要癌癥治療的脊椎動物。受試者包括所有溫血動物，諸如哺乳動物、諸如靈長類，以及優(yōu)選地，人類。非人類的靈長類也是受試者。術(shù)語受試者包括馴養(yǎng)動物，諸如貓、狗等，家畜(舉例來說，牛、馬、豬、綿羊、山羊等)以及實驗動物(舉例來說，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。如此，獸醫(yī)用途和醫(yī)藥制劑是本文所預(yù)期的。所有本文的數(shù)目是近似值且可以「大約」修飾。本發(fā)明提供用于癌細胞的治療或抑制的藥學(xué)組成物和方法。藥學(xué)組成物包含辨識糖類抗原的抗體，其包括小鼠單株抗體、人源化抗體、嵌合抗體、或前述的任一抗原結(jié)合部份。這些抗體(或其抗原結(jié)合部份)可中和糖類抗原，及/或抑制癌細胞。因此，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份可被使用于癌細胞的治療或抑制。本發(fā)明的抗體包括包含重鏈或輕鏈、或其配體結(jié)合部份的至少一個互補決定區(qū)(CDR)的任何蛋白或肽，其源自如本文所描述的，指定為2C2(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121138)的雜交瘤；指定為3D7(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121310)的雜交瘤；指定為7A11(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121311)的雜交瘤；指定為2F8(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121137)的雜交瘤；或指定為1E1(寄存于美國菌種保存中心寄存號碼PTA-121312)的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體?？贵w包括抗體片段、抗體變異體、單株抗體、多株抗體；以及重組抗體之類。抗體可在小鼠、兔或人類中產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體也包括從本發(fā)明的抗體產(chǎn)生的嵌合的或人源化的單株抗體。如此，本發(fā)明的抗癌抗體包括非鼠類來源的重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架區(qū)、或任何其部份的組合，優(yōu)選地為人類來源，其可并入本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體能夠調(diào)節(jié)、減少、拮抗、減輕、緩和、阻斷、抑制、消除及/或干擾在體外、原位及/或體內(nèi)的至少一個Globo-H表現(xiàn)的癌細胞活性。術(shù)語「抗體」進一步旨在涵蓋抗體、消化片段、特異的部份和其變異體，其包括抗體模擬物或包含模擬抗癌抗體或其特異片段或部份的結(jié)構(gòu)及/或功能的抗體的部份，其包括其單鏈抗體及片段，每一個含有至少一個從本發(fā)明的抗癌抗體衍生的CDR。功能片段包括結(jié)合至Globo-H表現(xiàn)的癌細胞的抗原結(jié)合片段。舉例來說，能夠結(jié)合至Globo-H表現(xiàn)的癌細胞的抗體片段或其部份，其包括，但不限于，F(xiàn)ab(例如，通過木瓜酶消化)、Fab'(例如，通過胃蛋白酶消化且部份還原)、F(ab')2(例如，通過胃蛋白酶消化)、facb(例如，通過胞漿素消化)、pFc'(例如，通過胃蛋白酶或胞漿素消化)、Fd(例如，通過胃蛋白酶消化、部份還原和再聚集)、Fv或scFv(例如，通過分子生物技術(shù))片段，被涵蓋在本發(fā)明中(參見，例如，Colligan，免疫學(xué)(Immunology)，如上述)。如本文使用的，2C2指稱雜交瘤克隆或通過相應(yīng)的雜交瘤克隆產(chǎn)生的抗體。抗體的抗原結(jié)合部份可包括特異性結(jié)合至糖類抗原(例如，GloboH、SSEA-3或SSEA-4)的抗體的一部份。本發(fā)明的人源化抗體是來自非人類物種的抗體，其中在非抗原結(jié)合區(qū)(及/或所述抗原結(jié)合區(qū))中的氨基酸序列被改變，使得所述抗體更接近類似于人類抗體，然而同時維持其原有的結(jié)合能力。.人源化抗體可通過以源自人類可變區(qū)的等價序列來替換非直接涉及抗原結(jié)合的可變區(qū)的序列來產(chǎn)生。這些方法包括分離、操作、以及表現(xiàn)編碼來自重鏈或輕鏈的至少一個的全部或部分可變區(qū)的核酸序列。這樣的核酸的來源對所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員而言是公知的。編碼人源化抗體、或其片段的重組DNA，可接著被轉(zhuǎn)殖進入合適的表現(xiàn)載體?？贵w輕鏈或重鏈可變區(qū)包含被三個高度變異區(qū)中斷的框架區(qū)，稱為CDR。在一個實施例中，人源化抗體是具有來自非人類物種的一個、兩個或全部CDRs，以及來自人類免疫球蛋白分子的一個、兩個或全部三個框架區(qū)的源自非人類物種的抗體分子。根據(jù)本發(fā)明的一個態(tài)樣，CDRs和框架殘基的位置是通過揭露于Kabat，E.A.，等人，(1991年)《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列》(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第五版，美國，衛(wèi)生和公眾服務(wù)部(DepartmentofHealthandHumanServices)，NIH出版No.91-3242的方法來測定。根據(jù)本發(fā)明的另一個態(tài)樣，抗體或其抗原結(jié)合部份可具有下列結(jié)構(gòu)：前導(dǎo)序列-FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-，其中，框架區(qū)FW1、FW2、FW3及CDRs，CDR1、CDR2、CDR3具有揭露于表1的氨基酸序列。本發(fā)明的人源化抗體可通過所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的方法來制造。舉例來說，一旦獲得非人類(例如，鼠類)抗體，可變區(qū)可被定序、且CDRs的位置和框架殘基可被測定。Kabat，E.A.等人，(1991年)《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列》，第五版，美國，衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，NIH出版No.91-3242。Chothia，C.等人，(1987年)，分子生物學(xué)期刊(J.Mol.Biol.)，196:901-917，編碼輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA可選擇地被連接至相應(yīng)的恒定區(qū)且接著次轉(zhuǎn)殖進入合適的表現(xiàn)載體。CDR接枝的抗體分子可通過CDR接枝或CDR取代來產(chǎn)生。免疫球蛋白鏈的一個、兩個或全部CDRs可被替換。舉例來說，特定的抗體的CDRs的全部可來自非人類動物(例如，小鼠諸如表1所示的CDRs)的至少一部份或所述CDRs的僅一些可被替換。只需要保持需要用于抗體對預(yù)定的糖類抗原(例如，GloboH)的結(jié)合的CDRs。Morrison，S.L.，1985年，科學(xué)期刊(Science)，229:1202-1207。Oi等人，1986年，生物技術(shù)期刊(BioTechniques)，4:214。美國專利號(PatentNos.)5,585,089；5,225,539；5,693,761及5,693,762。EP519596。Jones等人，1986年，自然期刊(Nature)，321:552-525。Verhoeyan等人，1988，科學(xué)期刊(Science)，239:1534。Beidler等人，1988年，免疫學(xué)期刊(J.Immunol.)，141:4053-4060。本發(fā)明亦涵蓋的是抗體或其抗原結(jié)合部份，其包含一個或兩個如本文所揭露的可變區(qū)，具被來自至少一個不同物種的序列所替換的其他區(qū)，至少一個不同物種包括但不限于，人類、兔、綿羊、狗、貓、母牛、馬、山羊、豬、猴、猿、大猩猩、黑猩猩、鴨、鵝、雞、兩棲類、爬蟲類以及其他動物。嵌合抗體是其中不同部份源自不同動物物種的分子。舉例來說，抗體可含有源自鼠類mAb的可變區(qū)和人類免疫球蛋白恒定區(qū)。嵌合抗體可通過重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生。Morrison等人，美國國家科學(xué)院院刊(ProcNatlAcadSci)，81:6851-6855(1984年)。舉例來說，編碼鼠類(或其他物種)抗體分子的基因是用限制酶來酶切以移除編碼所述鼠類Fc的區(qū)域，且編碼人類Fc恒定區(qū)的基因的等價部份接著取代進入所述重組DNA分子。嵌合抗體也可通過重組DNA技術(shù)來創(chuàng)造，其中編碼鼠類V區(qū)域的DNA可被接合至編碼所述人類恒定區(qū)的DNA。Better等人，科學(xué)期刊(Science)，1988年，240:1041-1043。Liu等人，美國國家科學(xué)院院刊(PNAS)，1987年，84:3439-3443。Liu等人，免疫學(xué)期刊(J.Immunol.)，1987年，139:3521-3526。Sun等人，美國國家科學(xué)院院刊(PNAS)，1987年，84:214-218。Nishimura等人，癌癥研究期刊(Canc.Res.)，1987年，47:999-1005。Wood等人，自然期刊(Nature)，1985年，314:446-449。Shaw等人，美國國家癌癥研究所期刊(J.Natl.CancerInst.)，1988年，80:1553-1559。國際專利公開號WO1987002671及WO86/01533。歐洲專利申請?zhí)?84,187；171,496；125,023；以及173,494。美國專利號4,816,567?？贵w可為全長或可包含具有抗原結(jié)合部份的抗體的片段(或復(fù)數(shù)個片段)，其特征在于，但不限于，F(xiàn)ab、F(ab')2、Fab'、F(ab)'、Fv、單鏈Fv(scFv)、二價的scFv(bi-scFv)、三價的scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段(例如，Ward等人，自然期刊(Nature)，341:544-546(1989年))、分離的CDR、二聚抗體、三聚抗體、四聚抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、以及從抗體片段形成的多特異性抗體。通過使用重組方法、或合成的鏈接物來接附抗體片段所產(chǎn)生的單鏈抗體，也被本發(fā)明所涵蓋。Bird等人，科學(xué)期刊(Science)，1988年，242:423-426。Huston等人，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，美國，1988年，85:5879-5883。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份可為單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性或雙特異性抗體或其片段可針對一個目標糖類(例如，GloboH)的不同表位為特異性，或可含有針對一個以上目標糖類(例如，針對GloboH、SSEA-3與SSEA-4特異性的抗原結(jié)合域)特異性的抗原結(jié)合域。在一個實施例中，多特異性抗體或其抗原結(jié)合部份包含至少兩個不同的可變域，其中每一個可變域能夠特異地結(jié)合至分開的糖類抗原或是在相同的糖類抗原上的不同表位。Tutt等人，1991年，免疫學(xué)期刊(J.Immunol.)，147:60-69。Kufer等人，2004年，生物技術(shù)趨勢(TrendsBiotechnol.)，22:238-244。本發(fā)明的抗體可鏈接到另一個功能性分子或與另一個功能性分子共表現(xiàn)，例如，另一個肽或蛋白質(zhì)。舉例來說，抗體或其片段可功能性地連接(例如，通過化學(xué)耦合、遺傳融合、非共價結(jié)合或其他方式)至一個或多個其他分子實體，諸如另一個抗體或抗體片段以產(chǎn)生雙特異性或有著第二結(jié)合特異性的多特異性抗體。所有抗體同型被本發(fā)明所涵蓋，其包括IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE(所有類型和子類型被本發(fā)明所涵蓋)。抗體或其抗原結(jié)合部份可為哺乳類(例如，小鼠、人類)抗體或其抗原結(jié)合部份?？贵w的輕鏈可為κ或λ類型。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的可變區(qū)可來自非人類或人類來源。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的框架可為人類、人源化的、非人類(例如，修飾以減少在人類中的抗原性的鼠類框架)、或合成的框架(例如，共有框架)。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份，包含至少一個重鏈可變區(qū)及/或至少一個輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份以小于約10E-7M、小于約10E-8M、小于約10E-9M、小于約10E-10M、小于約10E-11M、或小于約10E-12M的解離常數(shù)(KD)特異性地結(jié)合至GloboH。在一個實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份具有1～10x10E-9或小于其的解離常數(shù)(KD)。在另一個實施例中，Kd是通過表面等離子共振來測定。抗體有著可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)以至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源于由克隆2C2所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)，并且也可結(jié)合至糖類抗原(例如，GloboH)。同源性可以氨基酸或核苷酸序列層級來表現(xiàn)。在一些實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份，舉例來說，通過雜交瘤2C2、雜交瘤3D7、雜交瘤7A11、雜交瘤2F8、以及雜交瘤1E1所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈及/或可變輕鏈，顯示于表1中。在相關(guān)的實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份包括，舉例來說，從雜交瘤2C2、雜交瘤3D7、雜交瘤7A11、雜交瘤2F8、以及雜交瘤1E1產(chǎn)生的抗體的可變重鏈的CDRs及/或可變輕鏈的CDRs。來自這些雜交瘤克隆中可變重鏈和可變輕鏈的CDRs和框架顯示于表1。表1：SEQIDNO:1–90本發(fā)明也涵蓋編碼可特異地結(jié)合至糖類抗原的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的核酸。在一個實施例中，糖類抗原是GloboH。在另一個實施例中，糖類抗原是SSEA-3。在又另一個實施例中，糖類抗原是SSEA-4。核酸可表現(xiàn)在一細胞中以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份。在特定實施例中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份包括包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至下列：a)SEQIDNO:3(雜交瘤2C2)；b)SEQIDNO:13(雜交瘤3D7)；c)SEQIDNO:21(雜交瘤7A11)；d)SEQIDNO:29(雜交瘤2F8)；或e)SEQIDNO:37(雜交瘤1E1)的任一個的氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。在特定實施例中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份包括包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至下列：a)SEQIDNO:4(雜交瘤2C2)；b)SEQIDNO:14(雜交瘤3D7)；c)SEQIDNO:22(雜交瘤7A11)；d)SEQIDNO:30(雜交瘤2F8)；或e)SEQIDNO:38(雜交瘤1E1)的任一個的氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)。在特定實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:3的氨基酸序列，且抗體或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:4的氨基酸序列。在特定實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:13的氨基酸序列，且抗體或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:14的氨基酸序列。在特定實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:21的氨基酸序列，且抗體或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:22的氨基酸序列。在特定實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:29的氨基酸序列，且抗體或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:30的氨基酸序列。在特定實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:37的氨基酸序列，且抗體或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源至SEQIDNO:38的氨基酸序列。抗體或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)可包含一個、兩個、三個或更多CDRs包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至下列：a)通過雜交瘤2C2所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:5、6及7)；b)通過雜交瘤3D7所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:15、16及17)；c)通過雜交瘤7A11所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:23、24及25)；d)通過雜交瘤2F8所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:31、32及33)；或e)通過雜交瘤1E1所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNo:39、40及41)任一個的氨基酸序列?？贵w或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)可包含一個、兩個、三個或更多CDRs包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至下列：a)通過雜交瘤2C2所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:8、9及10)；b)通過雜交瘤3D7所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:18、19及20)；c)通過雜交瘤7A11所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:26、27及28)；d)通過雜交瘤2F8所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:34、35及36)；或e)通過雜交瘤1E1所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:42、43及44)任一個的氨基酸序列?？贵w或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)可包含一個、兩個或三個或更多CDRs包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至通過雜交瘤2C2所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:5、6及7)、或通過雜交瘤3D7所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:15、16及17)的氨基酸序列，且抗體或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)可包含一個、兩個或三個或更多CDRs，包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至通過雜交瘤2C2所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:8、9及10)或通過雜交瘤3D7所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:18、19及20)的氨基酸序列。在一個實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份進一步包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至SEQIDNO:83(2C2抗體的重鏈框架1)或SEDIDNO:87(人源化2C2抗體的重鏈框架1，參見表1)的框架，其中框架是在前導(dǎo)序列與通過雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDR1之間。在另一個實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份進一步包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至SEQIDNO:84(2C2抗體的輕鏈框架1)或SEDIDNO:88(人源化2C2抗體的輕鏈框架1，參見表1)的框架，且所述框架是在前導(dǎo)序列與通過雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDR1之間。在一個實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份進一步包含介于由雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDR1和CDR2之間的框架，其中框架可至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源于SEQIDNO:11(在表1中的重鏈框架2)。在例示性實施例中，在具有大約80％至大約100％同源至SEQIDNO:11的氨基酸序列的可變重鏈區(qū)的CDR1和CDR2之間的框架，含有在位置9的甘氨酸。SEQIDNO:11的氨基酸的位置如下描述：*在FW2(W)的位置1的氨基酸是鄰近于CDR1的殘基。**在FW2(A)的位置14的氨基酸是鄰近于CDR2的殘基。在另一個實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份進一步包含在由雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDR1和CDR2之間的框架，其中框架是至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源于SEQIDNO:12(在表1中的輕鏈框架2)。在一例示性實施例中，在通過雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDR1和CDR2之間的框架含有在位置12的脯氨酸。在另一個例示性實施例中，在通過雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDR1和CDR2之間的框架含有在位置13的色氨酸。在又另一個例示性實施例中，在通過雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDR1和CDR2之間的框架含有在位置12的脯氨酸和位置13的色氨酸。SEQIDNO:12的氨基酸的位置如下描述：*在FW2(W)的位置1的氨基酸是鄰近于CDR1的殘基。**在FW2(Y)的位置15的氨基酸是鄰近于CDR2的殘基。在一個實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份進一步包含至少大約70％、至少大約75％、至少大約80％、至少大約85％、至少大約90％、至少大約95％、至少大約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至SEQIDNO:85(重鏈框架3)或SEDIDNO:89(人源化抗體的重鏈框架3，見于表1)的框架，其中所述框架是在通過雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDR2和CDR3之間。在另一個實施例中，抗體或其抗原結(jié)合部份進一步包含至少大約70％、至少大約75％、至少大約80％、至少大約85％、至少大約90％、至少大約95％、至少大約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至SEQIDNO:86(輕鏈框架3)或SEQIDNO:90(人源化抗體的輕鏈框架3，見于表1)的框架，且所述框架是在通過雜交瘤2C2產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDR2和CDR3之間?？贵w或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)可包含一個、兩個或三個或更多CDRs包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至通過雜交瘤7A11所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:23、24及25)的氨基酸序列，且抗體或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)可包含一個、兩個或三個或更多CDRs包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至通過雜交瘤7A11所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:26、27及28)的氨基酸序列?？贵w或其抗原結(jié)合部份的可變重鏈區(qū)可包含一個、兩個或三個或更多CDRs包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至通過雜交瘤2F8所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:31、32及33)、或通過雜交瘤1E1所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:39、40及41)的氨基酸序列，且抗體或其抗原結(jié)合部份的可變輕鏈區(qū)可包含一個、兩個或三個或更多CDRs，包含至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％同源至通過雜交瘤2F8所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:34、35及36)或通過雜交瘤1E1所產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDRs(SEQIDNOs:42、43及44)的氨基酸序列。在特定實施例中，對應(yīng)于表1中可變區(qū)的可變區(qū)具有序列變異。舉例來說，一重鏈可變區(qū)，在其中有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個殘基，或小于40％、小于約30％、約25％、約20％、約15％、約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、約4％、約3％、約2％或約1％氨基酸殘基經(jīng)取代或剔除，但保有實質(zhì)上相同的免疫特質(zhì)，其包括，但不限于，結(jié)合至糖類抗原。在特定實施例中，相應(yīng)于在表1中的CDRs的CDRs具有序列變異。舉例來說，CDRs，在其中1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個殘基，或在CDR中的總殘基的小于20％、小于30％、或小于約40％經(jīng)取代或剔除，可存在于結(jié)合至糖類抗原的抗體(或其抗原結(jié)合部份)中。抗體或其抗原結(jié)合部份可為肽。這類肽可包括肽的變異型、類似物、異種同源物、同源物以及衍生物，其展現(xiàn)生物活性，例如糖類抗原的結(jié)合。肽可含有一個或多個氨基酸的類似物(其包括，舉例來說，非天然存在的氨基酸、僅天然存在于非相關(guān)生物系統(tǒng)中的氨基酸、源自哺乳類系統(tǒng)修飾的氨基酸等)、有著取代鍵聯(lián)(substitutedlinkages)的肽、以及所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的其他修飾物。也在本發(fā)明的范疇中的是抗體或其抗原結(jié)合部份，在其中特異的氨基酸已經(jīng)被取代、剔除或添加。在例示性實施例中，這些替換不具有對于肽的生物特質(zhì)上的實質(zhì)效應(yīng)，諸如結(jié)合親和力。在另一個例示性實施例中，抗體可具有在框架區(qū)中的氨基酸取代基，如此以增進所述抗體對抗原的結(jié)合親和力。在又另一個例示性實施例中，一個選定的，受體的框架殘基的小數(shù)目可通過相應(yīng)的供體氨基酸來替換。供體框架可為成熟或生克隆人類抗體框架序列或相應(yīng)的序列?？紤]如何制造表型靜默氨基酸取代作用的導(dǎo)引提供于Bowie等人，科學(xué)期刊(Science)，247:1306-1310(1990年)。Cunningham等人，科學(xué)期刊(Science)，244:1081-1085(1989年)。Ausubel(編著)，《分子生物學(xué)現(xiàn)行操作方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，約翰威立出版公司(JohnWileyandSons，Inc.)(1994年)。T.Maniatis，E.F.Fritsch及J.Sambrook，《分子選殖：實驗室手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，冷泉港實驗室(ColdSpringHarborlaboratory)，冷泉港出版社(ColdSpringHarbor)，N.Y.(1989年)。Pearson，分子生物學(xué)方法期刊(MethodsMol.Biol.)，243:307-31(1994年)。Gonnet等人，科學(xué)期刊(Science)，256:1443-45(1992年)?？贵w、或其抗原結(jié)合部份，可被衍生或鏈接至另一個功能分子。舉例來說，抗體可為功能性地連接(通過化學(xué)耦合、遺傳融合、非共價交互作用等)至一個或多個其他分子實體，諸如另一個抗體、可偵測試劑、細胞毒性試劑、藥學(xué)試劑、可介導(dǎo)關(guān)聯(lián)另一個分子(諸如鏈霉親和素核心區(qū)或聚組氨酸標簽)的蛋白或肽、氨基酸連接物、訊息序列、免疫性的載體、或有用于蛋白質(zhì)純化的配體，諸如麩胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase)、組氨酸標簽、以及葡萄球菌的蛋白A。衍生的蛋白質(zhì)的一個類型是通過交聯(lián)兩個或更多(相同類型或不同類型的)蛋白質(zhì)來產(chǎn)生。合適的交聯(lián)物包括那些為異雙官能者，具有被合適的間隔物(例如，M-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester))分開的兩個相異反應(yīng)基團，或同雙官能的(例如，雙琥珀酰亞胺辛二酸酯(disuccinimidylsuberate))。這類鏈接物可從Pierce化學(xué)公司，Rockford，IL取得。藉以可衍生(或標記)蛋白質(zhì)的有用的可偵測試劑包括熒光化合物、多種酵素、輔基、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、以及放射性材料。非限制性的例示熒光可偵測試劑包括熒光素、硫氰酸鹽熒光素、玫瑰紅、以及藻紅素。蛋白質(zhì)或抗體也可以可偵測酵素衍生化，諸如堿性磷酸酶、山葵過氧化酶、β-半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶之類。蛋白質(zhì)也可以輔基衍生化(例如，鏈霉親和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素)。編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的功能性活性變異型的核酸也可被本發(fā)明涵蓋。這些核酸分子可在中度嚴謹、高嚴謹或非常高嚴謹?shù)臈l件的下與編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的任一個的核酸雜合。用于執(zhí)行雜合反應(yīng)的引導(dǎo)可在《分子生物學(xué)的現(xiàn)行操作》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，JohnWiley&Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1989年中找到。其通過參考并入本文。本文所稱的特異的雜合條件可如下：1)中度嚴謹雜合條件：6XSSC于大約45℃，隨后以0.2XSSC，0.1％SDS于60℃洗滌一次或多次；2)高嚴謹雜合條件：6XSSC于大約45℃，隨后在0.2XSSC，0.1％SDS于65℃洗滌一次或多次；以及3)非常高嚴謹雜合條件：0.5M磷酸鈉，7％SDS于65℃，隨后在0.2XSSC，1％SDS于65℃洗滌一次或多次。編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的核酸可被引介進入可在合適的表現(xiàn)系統(tǒng)中表現(xiàn)的表現(xiàn)載體中，接續(xù)分離或純化所述表現(xiàn)抗體或其抗原結(jié)合部份?？蛇x地，編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的核酸可被轉(zhuǎn)譯到無細胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中。美國專利號4,816,567。Queen等人，美國國家科學(xué)院院刊(ProcNatlAcadSci)，美國，86:10029-10033(1989年)。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份可通過轉(zhuǎn)形有著編碼所期望的抗體的輕鏈和重鏈(或其部分)的DNA的宿主細胞來產(chǎn)生。抗體可從這些培養(yǎng)上清液及/或細胞使用標準技術(shù)來分離和純化。舉例來說，宿主細胞可被轉(zhuǎn)形有著編碼抗體的輕鏈、重鏈、或兩者的DNA。重組DNA技術(shù)也可被使用以移除一些或全部編碼不需要用于結(jié)合的輕鏈和重鏈的任一者或兩者的DNA，例如，恒定區(qū)。本發(fā)明的核酸可在多種合適的細胞中表現(xiàn)，其包括原核和真核細胞，例如，細菌細胞(例如，E.coli)、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、以及哺乳類細胞。許多哺乳類細胞株可為在所屬領(lǐng)域中為公知的，且包括從美國菌種保存中心(ATCC)可得的永生細胞株。細胞的非限制性實例包括哺乳類來源或是類似哺乳類特性的全部細胞株，其包括但不限于，猴子腎細胞(COS，例如，COS-1、COS-7)、HEK293、幼倉鼠腎(BHK，例如，BHK21)、中國倉鼠卵巢(CHO)、NS0、PerC6、BSC-1、人類肝細胞癌細胞(例如，HepG2)、SP2/0、HeLa、Madin-Darby牛腎(MDBK)、骨髓瘤以及淋巴瘤細胞的親代細胞、衍生物及/或改造變異型。改造變異型包括，例如，聚醣譜修飾及/或位置特異性整合位置衍生物。本發(fā)明也提供用于包含本文所描述的核酸的細胞。細胞可為雜交瘤或轉(zhuǎn)染子，諸如指名為2C2的雜交瘤。替選地，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份可通過所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
所公知的固相程序來合成。《固相肽合成：實行方法》(SolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach)，E.Atherton與R.C.Sheppard著，IRL于牛津大學(xué)出版社(OxfordUniversityPress)出版(1989年)。《分子生物學(xué)方法》(MethodsinMolecularBiology)，卷35：肽合成程序(PeptideSynthesisProtocols)，(M.W.Pennington與B.M.Dunn編著)，第七章。《固相肽合成》，第二版，Pierce化學(xué)公司，Rockford，IL(1984年)。G.Barany與R.B.Merrifield，《肽：分析、合成、生物學(xué)》(ThePeptides:Analysis，Synthesis，Biology)，編者E.Gross與J.Meienhofer，卷1及卷2，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，NewYork，(1980年)，頁次3-254。M.Bodansky，《肽合成原則》(PrinciplesofPeptideSynthesis)，Springer-Verlag，柏林(1984年)。本發(fā)明提供用于制造特異性地結(jié)合至糖類抗原(例如，GloboH)的抗體或其抗原結(jié)合部份的方法。舉例來說，非人類動物是以包括糖類抗原(例如，GloboH)的組成物來免疫接種(isimmunizedwith)，且接著特異性抗體從所述動物分離。所述方法可進一步包括評估抗體對糖類抗原的結(jié)合。各種糖類抗原的任何一個，特別是GloboH，可被使用于本發(fā)明的實踐中。糖類抗原的實例包括，但不限于Globo抗原諸如GloboH、階段特異性胚抗原3(SSEA-3)(也被稱為Gb5)、階段特異性胚抗原4(SSEA-4)、Gb-4以及Gb-3、Lewis抗原諸如sLex、Lex、sLea、Lea以及Ley，多醣抗原諸如聚唾液酸(PSA)、sTn(c)以及Tn(c)、Thomsen-Friedenreich抗原(TF(c))、神經(jīng)節(jié)苷脂諸如GD1、GD2、GD3、巖藻糖基GM1、GM1、GM2、GM3、GD1α以及GM2、硫脂抗原(sulfitideantigen)諸如6Gal-HSO3-SiaLex以及6GluNAc-HSO3-SiaLex。其他糖類抗原包括，但不限于：α-半乳糖、α-Man-6-磷酸鹽(α-Man-6-phosphate)、α-L-鼠李糖、α-GalNAc(Tn)、α-NeuAc-OCH2C6H4-p-NHCOOCH2、Fucα1-2Galβ1-4GalNAcβ(H第三型)、NeuAcα2-8NeuAcα、(NeuAcα2-8)2聚唾液酸、NeuAca2-6Galb、NeuAcb2-6Gala(STn)、Gala1-3Galb1-4GlaNAcb(NeuAca2-8)3、GalNAcαa-3(Fucα1-2)Galβ(血型A型)、Galα1-3(Fucα1-2)Galβ(血型B型)、6Gal-HSO3-SiaLex、6GluNAc-HSO3-SiaLex以及α2-6唾液酸二天線型N-聚糖(α2-6sialylateddiantennaryN-glycans)。在一個實施例中，抗-GloboH抗體或其抗原結(jié)合部份可交互反應(yīng)或與其他有著高選擇性的糖類抗原結(jié)合，諸如在第3A圖和第3B圖中所繪示的。糖類抗原的非限制性實例為：SSEA-3、SSEA-4、Lewis抗原。在一個實施例中，本發(fā)明提供用于制作表現(xiàn)特異性結(jié)合至糖類抗原(例如，GloboH)的抗體的雜交瘤的方法。所述方法含有下列步驟：以包括糖類抗原(例如，GloboH)的組成物來免疫化動物；從所述動物分離脾細胞；從脾細胞產(chǎn)生雜交瘤；以及挑選產(chǎn)生特異性結(jié)合至GloboH的抗體的雜交瘤。Kohler及Milstein，自然期刊(Nature)，256:495，1975年。Harlow，E.及Lane，D.，《抗體：實驗室手冊》(Antibodies:ALaboratoryManual)，冷泉港實驗室出版(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港實驗室，N.Y.，1988年。在一個實施例中，糖類抗原被用于皮下注射地免疫化小鼠。可或可不施予一或多次追加。在血漿中抗體的效價可通過，例如ELISA(酵素結(jié)合免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay))或流動式細胞測量術(shù)監(jiān)測。有著足夠抗糖類抗原抗體的效價的小鼠被使用于融合。小鼠在犧牲及移除脾臟前三天可以或可不以抗原追加。小鼠脾細胞被分離且以PEG融合成小鼠骨髓瘤細胞株。所得雜交瘤接著被篩選制備抗原特異性抗體。細胞被涂盤，且接著在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。來自個別孔的上清液接著通過ELISA針對人類抗糖類抗原單株抗體來篩選。分泌抗體的雜交瘤被重新涂盤，再次篩選，且如果針對抗糖類抗原抗體仍為陽性，可通過限制性稀釋次轉(zhuǎn)殖。佐劑可被使用以增加糖類抗原的一個或多個的免疫原性。佐劑的非限制性實例包括鋁磷酸鹽、氫氧化鋁、MF59(4.3％w/v角鯊烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween80)、0.5％w/v山梨醇三油酸酯(Span85))、含有CpG-的核酸、QS21(皂苷佐劑)、α-半乳糖苷腦酰胺或其合成的類似物(例如，C34，參見US8,268,969)、MPL(單磷酸脂質(zhì)A(MonophosphorylLipidA))、3DMPL(3-O-去酰MPL)、源自安奎拉(Aquila)的萃取物、ISCOMS(參見，Sjolander等人，(1998年)，白血球生物學(xué)期刊(J.LeukocyteBiol.)，64:713；WO90/03184；WO96/11711；WO00/48630；WO98/36772；WO00/41720；WO06/134423以及WO07/026190)、LT/CT突變、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、QuilA、介白素、佛朗氏佐劑(Freund's)、N-乙?；?胞壁酰-L-蘇胺酰基-D-異麩酰氨酸(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙胺?；?D-異麩酰氨酸(CGP11637，稱為nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙胺?；?D-異麩酰氨酸-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-羥基磷酰)-乙胺(CGP19835A，稱為MTP-PE)、以及RIBI，其含有從細菌萃取的三種成分：單磷酸脂質(zhì)A、繭蜜糖二霉菌酸酯(trehalosedimycolate)以及細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)于2％的角鯊烯/吐恩80(Tween80)乳化液。免疫化動物可為當給予免疫原時，任何能夠產(chǎn)生可恢復(fù)抗體的動物，諸如但不限于，兔、小鼠、大鼠、倉鼠、山羊、馬、猴、狒狒、以及人類。在一個態(tài)樣中，宿主是基因轉(zhuǎn)殖的且產(chǎn)生人類抗體，例如，表現(xiàn)人類免疫球蛋白基因區(qū)段的小鼠。美國專利號8,236,311；7,625,559以及5,770,429，其每一篇揭露整體作為參考并入本文。Lonberg等人，自然期刊(Nature)，368(6474)：856-859，1994年。Lonberg，N.，《實驗藥理學(xué)課本》(HandbookofExperimentalPharmacology)，113:49-101，1994年。Lonberg，N.以及Huszar，D.，免疫學(xué)國際評論(Intern.Rev.Immunol.)，13：65-93，1995。Harding，F(xiàn).以及Lonberg，N.，紐約科學(xué)學(xué)院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，764:536-546，1995年。在宿主被免疫化且抗體生成后，抗體被檢測以確定其對目標抗原是特異性的，且確定其是否展現(xiàn)與其他抗原的任何交互反應(yīng)。執(zhí)行這些檢測的一個方法是血清篩選檢測，如描述于美國專利公開號2004/0126829?？固穷惪乖贵w可通過多種公知技術(shù)定性為結(jié)合至所述糖類。舉例來說，在ELISA中，微量滴定盤涂布在PBS中的毒素或類毒素抗原，且接著以不相關(guān)的蛋白質(zhì)來阻斷，諸如稀釋于PBS中的牛血清白蛋白(BSA)。來自毒素免疫化的小鼠的血漿的稀釋液被添加至每一個孔且培養(yǎng)。微量滴定盤被洗滌且接著以共軛至酵素(例如，堿性磷酸酶)的二級抗體培養(yǎng)。在洗滌的后，微量滴定盤以酵素的基質(zhì)(例如，ABTS)顯影，且在特定OD下被分析。在其他實施例中，為了測定選定的單株抗體是否結(jié)合至目標糖類抗原或表位，抗體可被生物素化，其接著可以鏈霉親和素標記探針來偵測。抗糖類抗原抗體可通過西方印漬術(shù)測試與糖類的反應(yīng)性。產(chǎn)生結(jié)合至糖類抗原的抗體的雜交瘤，優(yōu)選地以高親和力結(jié)合至糖類抗原的抗體的雜交瘤，可接著被次轉(zhuǎn)殖且進一步被定性。源自各雜交瘤維持親代細胞的反應(yīng)性(依ELISA)的一個克隆，可接著被挑選用于制作細胞庫，且用于抗體純化。本發(fā)明的抗體、或抗原結(jié)合片段、其變異型或衍生物也可以就其對抗原的結(jié)合親和力而言來描述或指定。針對糖類抗原的抗體的親和力可使用任何合適的方法來實驗地測定(參見，例如，Berzofsky等人，《抗體-抗原交互作用》(Antibody-AntigenInteractions)，于《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)，Paul，W.E.編著，RavenPress:NewYork，N.Y.(1984年)；Kuby，Janis，《免疫學(xué)》(Immunology)，W.H.Freeman以及Company：NewYork，N.Y.(1992年)；以及本文所描述的方法)。特定抗體-糖類抗原交互作用的測量親和力若在不同條件下(例如，鹽濃度、pH)測量可能有所變化。如此，親和力以及其他抗原結(jié)合參數(shù)(例如，KD、Ka、Kd)的測量可優(yōu)選地以抗體和抗原的標準化溶液、以及標準化緩沖液進行。本抗體或其抗原結(jié)合部份具有體外和體內(nèi)治療、預(yù)防、及/或診斷效用。舉例來說，這些抗體可被給藥至培養(yǎng)基中的細胞，例如，體外或離體、或給藥至受試者，例如，體內(nèi)、以處理、抑制、防止復(fù)發(fā)、及/或診斷癌癥?？贵w或其抗原結(jié)合部份可被使用在培養(yǎng)基中的細胞上，例如，體外或離體。舉例來說，細胞可在體外于培養(yǎng)基中被培養(yǎng)，且通過抗GloboH抗體或其片段來接觸。所述方法可在存在于受試者中的細胞上執(zhí)行，作為體內(nèi)程序的一部份(例如，治療的或預(yù)防的)。針對體內(nèi)實施例，接觸步驟在受試者內(nèi)是有效的，且包括給藥抗毒素抗體或其部份予所述受試者，在有效于允許抗體或其部份，對表現(xiàn)在受試者內(nèi)的一個或更多癌細胞上，例如，乳癌細胞上的糖類抗原(例如，GloboH)的結(jié)合條件下?？贵w或其抗原結(jié)合部份可單獨給藥或可與另一個治療劑組合給藥，例如，第二單株或多株抗體或其抗原結(jié)合部份或化學(xué)治療劑。組合產(chǎn)物可為兩個化合物的混合物或其可為共價地連接。在一個實例中，特異地接合至GloboH的抗體或其抗原結(jié)合部份可與特異地結(jié)合VEGF的抗體(單株或多株)或其抗原結(jié)合部份組合。在另一個實例中，第二用劑是化學(xué)治療劑(例如，環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶或放射菌素-D)?？贵w也可以與癌癥疫苗組合給藥，例如，GloboH共軛至白喉毒素以及皂苷佐劑。用于抑制癌細胞的方法本發(fā)明也提供用于抑制在體外、離體、或體內(nèi)的細胞生長的方法，其中所述細胞，諸如癌細胞，可與如本文所描述的抗體或其抗原結(jié)合部份的有效量接觸。病理細胞或組織諸如過度增生細胞或組織可通過接觸所述細胞或所述組織與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的有效量來處理。細胞、諸如癌細胞，可為原發(fā)癌細胞或可為從組織銀行可得的培養(yǎng)細胞，諸如美國菌種保存中心(ATCC)。病理學(xué)細胞可為表現(xiàn)GlolobH的癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦脊髓膜瘤、垂體線瘤、或從全身性癌、肺癌、前列腺癌、乳癌、造血性癌或卵巢癌的CNS轉(zhuǎn)移的細胞。細胞可來自脊椎動物，優(yōu)選地為哺乳類，更佳地為人類。美國專利公開號2004/0087651。Balassiano等人，(2002年)，分子醫(yī)學(xué)國際期刊(Intern.J.Mol.Med.)，10:785-788。Thorne，等人，(2004年)，神經(jīng)科學(xué)期刊(Neuroscience)，127:481-496。Fernandes等人，(2005年)，腫瘤報告(OncologyReports)，13:943-947。DaFonseca等人，(2008年)，神經(jīng)外科期刊(SurgicalNeurology)，70:259267。DaFonseca等人，(2008年)，實驗免疫學(xué)與治療學(xué)文獻(Arch.Immunol.Ther.Exp.)，56:267-276。Hashizume等人，(2008年)，神經(jīng)腫瘤學(xué)期刊(Neuroncology)，10:112-120。在一個實施例中，癌癥是表現(xiàn)GloboH的癌。在另一個實施例中，癌癥是表現(xiàn)SSEA-3的癌。在又另一個實施例中，癌癥是表現(xiàn)SSEA-4的癌。表現(xiàn)GloboH的癌、表現(xiàn)SSEA-3的癌以及表現(xiàn)SSEA-4的癌包括，但不限于，乳癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌以及子宮內(nèi)膜癌以及結(jié)腸癌、肝癌、鼻咽癌、皮膚癌、口腔癌、腎癌、腦癌、子宮頸癌以及膀胱癌。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的體外功效可使用所屬領(lǐng)域中公知的方法來測定。舉例來說，抗體或其抗原結(jié)合部份的細胞毒性可通過MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑溴化物](3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)細胞毒性檢測來研究。MTT檢測是基于MTT、四唑鹽被代謝地活性細胞所攝取的原理進行，其中其代謝為可以光譜測定的藍色甲臘產(chǎn)物(bluecoloredformazonproduct)。免疫學(xué)方法期刊(J.ofImmunologicalMethods)，65:5563，1983年。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的細胞毒性可通過集落形成檢測來研究。針對結(jié)合GloboH抗原的功能性檢測可通過ELISA來執(zhí)行。依照抗體或其抗原結(jié)合部份的細胞周期鐘可通過標準碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染色以及流動式細胞測量術(shù)來研究。侵入抑制可通過博伊登室(Boydenchamber)來研究。在此檢測中，重新建構(gòu)的基底膜的一層，Matrigel，被涂在趨化性濾過器上，且作為在博伊登室中細胞遷移的屏障。只有有著侵入能力的細胞可穿過所述Matrigel屏障。其他檢測包括，但不限于，細胞活力檢測、細胞凋亡檢測、以及形態(tài)檢測。檢測也可使用鼠類模型在體內(nèi)進行。參見，例如，B.Teicher，用于測定功效的腫瘤模型(TumorModelsforEfficacyDetermination)，分子癌癥治療期刊(MolCancerTher)，2006年；5:2435-2443。藥學(xué)組成物在一個實施例中，本發(fā)明提供藥學(xué)組成物，其包含本文描述的抗體或其抗原結(jié)合部份、以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一個實施例中，藥學(xué)組成物包含編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的分離核酸、以及藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體包括任何及所有生理上兼容的溶劑、分散介質(zhì)、等張和吸收延遲劑以及類似物。在一個實施例中，組成物有效于在受試者中抑制癌細胞。本發(fā)明的藥學(xué)組成物的給藥途徑包括，但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下的、經(jīng)口、局部、皮下的、皮內(nèi)、經(jīng)皮、真皮下、非經(jīng)口、直腸、脊髓、或表皮給藥。本發(fā)明的藥學(xué)組成物可被制備為可注射的，不論為液體溶液或是懸浮液、或在注射之前于液體載體中適用為溶液或懸浮液的固體形式。藥學(xué)組成物也可被制備成固體形式、乳化或封在脂質(zhì)體載體或其他被使用于持續(xù)遞送的顆粒載體中的活性成分。舉例來說，藥學(xué)組成物可為油乳化劑的形式、油包水乳劑、水包油包水乳劑、位置特異性的乳劑、穩(wěn)定乳劑、黏性乳劑、微乳劑、奈米乳劑、脂質(zhì)體、微顆粒、微球、奈米球、奈米顆粒以及多種天然或合成聚合物，諸如不可吸收的不滲透聚合物諸如乙烯醋酸乙烯酯共聚合物以及共聚合物、可吞的聚合物諸如水凝膠、或可吸收的聚合物諸如膠原蛋白和特定聚合酸或聚酯，諸如被用以制作可吸收縫線者，其允許藥學(xué)組成物的持續(xù)釋放。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部份被制劑進入藥學(xué)組成物用于遞送至哺乳類受試者。藥學(xué)組成物是單獨給藥、及/或與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或載體混合。合適的載體諸如、舉例來說，水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、或類似物、以及其組合物。此外，載體可含有少量輔助物質(zhì)諸如潤濕或乳化劑、pH緩沖劑、或佐劑。藥學(xué)上可接受的載體可含有作用如，例如，穩(wěn)定、或增加或減少本發(fā)明的藥學(xué)上組成物的吸收或清除率的生理上可接受化合物。生理上可接受化合物可包括，例如，糖類，諸如葡萄糖、蔗糖、或聚葡糖；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或麩胱甘肽；螯合劑；低分子重量的蛋白質(zhì)；清潔劑；脂質(zhì)體載體；或賦形劑或其他穩(wěn)定劑及/或緩沖液。其他生理上可接受的化合物包括潤濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑。參見，例如，《芮明通藥理學(xué)科學(xué)》(Remington’sPharmaceuticalScience)的第二十一版，MackPublishingCompany，Easton，Pa.(“Remington’s”)。本發(fā)明的藥學(xué)組成物也可包括輔助物質(zhì)，諸如藥學(xué)劑、細胞介素、或其他生物反應(yīng)修飾物。此外，藥學(xué)組成物可被制劑為中性或鹽形式的藥學(xué)組成物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(以活性多肽的自由胺基團形成)，且其以無機酸形成，諸如，舉例來說，氫氯酸或磷酸；或以有機酸形成，諸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等。從自由羧基團形成的鹽也可從無機堿衍生，諸如，舉例來說，鈉、鉀、銨、鈣、或氫氧化鐵，以及諸如有機堿如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組氨酸、普羅卡因等。制備這類劑量形式的實際方法是公知的，或?qū)λ鶎?br>技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員而言是顯而易見的。參見，例如，《芮明通藥理學(xué)科學(xué)》，MackPublishingCompany，Easton，賓州，Pennsylvania，第二十一版。藥學(xué)組成物可依行程表以單一劑量治療或于多重劑量處理來給藥，且歷時對所述受試者的年齡、體重和情況適合的時間期間，使用特定的組成物以及給藥的路徑、不論所述藥學(xué)組成物被使用于預(yù)防或治病目的等。舉例來說，在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的藥學(xué)組成物是每月一次、每月兩次、每月三次、每隔周一次(qow)、每周一次(qw)、每周兩次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔日一次(qod)、每日(qd)、一日兩次(qid)、或一日三次(tid)給藥。根據(jù)本發(fā)明的抗體的給藥期間，例如，藥學(xué)組成物被給藥的時間時段，可取決于多種變因中的任一個來變化，例如受試者的反應(yīng)等。舉例來說，藥學(xué)組成物可歷時范圍從大約一或多秒至一或多個小時、一天至約一周、從大約兩周至大約四周、從大約一個月至大約兩個月、從大約兩個月至大約四個月、從大約四個月至大約六個月、從大約六個月至約八個月、從約八個月至約1年、從約1年至2年、或從約2年至約4年或更多的時間期間來給藥。為了便于劑量的給藥和均勻性，依單位劑量形式的口服或非經(jīng)口的藥物組成物可被使用。本文所使用的單位劑量形式指物理性的離散單位，適合作為用于要被治療的受試者的單一劑量；每一劑量含有與需要的藥學(xué)載體相關(guān)聯(lián)的計算好產(chǎn)生期望治療效果的活性化合物預(yù)定量。從細胞培養(yǎng)檢測以及動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于制定針對動物使用的劑量范圍。在一個實施例中，這樣的化合物的劑量處于包括ED50具極小或無毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可在此范圍內(nèi)取決于執(zhí)行的劑量形式和給藥利用的途徑而變化。在另一個實施例中，治療有效劑量可初始地從細胞培養(yǎng)檢測來估計。在動物模型中劑量可被制劑以達到循環(huán)血漿濃度范圍，包括如在細胞培養(yǎng)中所測定的IC50(即，達到癥狀的半最大抑制的測試化合物的濃度)。Sonderstrup，Springer，病理免疫學(xué)研討會(Sem.Immunopathol.)，25:35-45，2003年。Nikula等人，吸入毒理學(xué)(Inhal.Toxicol.)4(12):123-53，2000年。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的治療或預(yù)防有效量的例示性非限制范圍是從約0.001至約60mg/kg體重、約0.01至約30mg/kg體重、約0.01至約25mg/kg體重、約0.5至約25mg/kg體重、約0.1至約20mg/kg體重、約10至約20mg/kg體重、約0.75至約10mg/kg體重、約1至約10mg/kg體重、約2至約9mg/kg體重、約1至約2mg/kg體重、約3至約8mg/kg體重、約4至約7mg/kg體重、約5至約6mg/kg體重、約8至約13mg/kg體重、約8.3至約12.5mg/kg體重、約4至約6mg/kg體重、約4.2至約6.3mg/kg體重、約1.6至約2.5mg/kg體重、約2至約3mg/kg體重、或約10mg/kg體重。藥學(xué)組成物被制劑以含有本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份的有效量，其中所述量取決于要被治療的動物和被治療的情況。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部份是以范圍從約0.01mg至約10g、從約0.1mg至約9g、從約1mg至約8g、從約2mg至約7g、從約3mg至約6g、從約10mg至約5g、從約20mg至約1g、從約50mg至約800mg、從約100mg至約500mg、從約0.01μg至約10g、從約0.05μg至約1.5mg、從約10μg至約1mg蛋白質(zhì)、從約30μg至約500μg、從約40μg至約300μg、從約0.1μg至約200μg、從約0.1μg至約5μg、從約5μg至約10μg、從約10μg至約25μg、從約25μg至約50μg、從約50μg至約100μg、從約100μg至約500μg、從約500μg至約1mg、從約1mg至約2mg的劑量來給藥。針對任何特定受試者的特異劑量程度取決于多種因素，其包括經(jīng)受療程的特異性肽活性、年齡、體重、整體健康、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、以及排泄速率、藥物組合和特定疾病嚴重性，且所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員不須過度實驗便可決定。本發(fā)明的抗體和其抗原結(jié)合部份、藥學(xué)組成物和方法可使用于所有脊椎動物，例如，哺乳類和非哺乳類，其包括人類、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、狗、貓、牛、馬、山羊、綿羊、豬、猴、猿、大猩猩、黑猩猩、兔、鴨、鵝、雞、兩棲類、爬蟲類以及其他動物。所用于執(zhí)行本發(fā)明的特定態(tài)樣的下列實例僅是為了描述的目的提供，而非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范疇。實例實例1：雜交瘤融合和篩選執(zhí)行典型的雜交瘤融合。小鼠接受以GloboH-KLH(鑰孔笠貝血藍蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin))與皂苷佐劑共軛的初次免疫接種(immunization)，且在第7、14、及24天依續(xù)追加。在第10、17、21及24天執(zhí)行出血試驗，且血清被檢測以檢查抗GloboH抗體的效價。有五只小鼠被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生高抗GloboHIgG以及抗GloboHIgM效價，且被使用用于雜交瘤生產(chǎn)。小鼠雜交瘤細胞被使用以與小鼠脾細胞融合，依照和Milstein(G.及MilsteinC，1975年)的程序。雜交瘤上清液通過親和力ELISA以0.2μgGloboH-腦酰胺/孔來篩選。抗GloboHVk9mAb作為正控制組。具上清液無稀釋的雜交瘤克隆的OD>兩倍背景值被挑選。前五個雜交瘤克隆為1E1、2C2、2F8、3D7、7A11。實例2：小鼠單株抗體的動力學(xué)分析動力學(xué)結(jié)合實驗在25℃下，以BiacoreT100(奇異醫(yī)療(GEHealthcare))通過單循環(huán)動力學(xué)(single-cyclekinetics，SCK)和多循環(huán)動力學(xué)(multi-cyclekinetics，MCK)方法執(zhí)行。根據(jù)制造商的指示，GloboH通過胺耦合來固定(immobilized)。GloboH-胺在固定緩沖液中(10mM的醋酸鈉，pH4.5)被稀釋成15mg/ml，且在25℃使用5μl/分的流速固定?？笹loboH抗體(GloboH-Vk9mab、GloboH-2C2mAb以及GloboH-3D7mAb)在電泳緩沖液中被稀釋成200nM(50nM)。200μl的200nM(50nM)溶液可與200μl的電泳緩沖液混合以獲得100nM(25nM)溶液。持續(xù)稀釋成下列系列稀釋：200、100、50、25以及12.5nM(分析濃度：50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM)。稀釋樣本被放置在擱架位置(RackPositions)上，并通過MCK和SCK方法測試。用于MCK和SCK序列的樣本接受420秒的解離時間。表面被10mM甘氨酸pH2.0/1.5(v/v＝1)溶液的40秒注射再生。SCK和MCK數(shù)據(jù)以BiacoreEvluation軟件2.0套入1:1結(jié)合模型。對結(jié)果分析解離常數(shù)(KD)，其為被使用以描述抗體和抗原之間的結(jié)合強度的量值；kon(1/Ms)，其為抗體抗原復(fù)合物形成的結(jié)合速率；koff(1/s)，抗體抗原復(fù)合物解離的解離速率；Rmax，分析物反應(yīng)的最大量。表2顯示源自下列雜交瘤：VK9、2C2以及3D7的抗GloboH抗體的親和力和動力學(xué)數(shù)據(jù)。3D7抗體和2C2抗體具有比VK9抗體較高的結(jié)合親和力。表2、針對抗GloboH抗體的動力學(xué)資料雜交瘤KD(M)kon(1/Ms)koff(1/s)RmaxChi2VK91.436E-72.994E+44.298E-368.38.483D77.854E-92.760E+52.168E-3203.50.65142C27.631E-92.810E+52.144E-3187.40.542實例3：抗GloboH抗體的親和力分析下列抗GloboH抗體可針對EC50及細胞結(jié)合的百分比作測試：GloboH-VK9mAb、GloboH-1E1mAb、GloboH-2C2mAb、GloboH-2F8mAb、GloboH-3D7mAb、GloboH-7A11mAb。步驟：針對EC50的ELISA親和力：孔在冰上每孔涂以0.2μg的GloboH-腦酰胺。阻斷之后，介于6.2ng/ml至51200ng/ml的測試抗體被添加至所述孔中。在室溫下培養(yǎng)1小時之后，過量的抗體通過洗滌3次移除。山羊抗-小鼠IgG-HRP(1:533)被添加。顏色顯影以490nm于盤式分析儀定量。EC50通過Prism5.0軟件測定。針對細胞與抗體的結(jié)合百分比的FACS：依每試管50μlFACS緩沖液以200，000細胞的總數(shù)來準備癌細胞株。指定的抗體被添加以達到1μg/ml的最后濃度。在輕柔震蕩后，試管被放置在冰上且培養(yǎng)大約1hr。在以FACS緩沖液洗滌之后，抗小鼠IgG-PE在FACS緩沖液中被添加以達到4μg/ml的最后濃度。在輕柔震蕩后，試管被放置在冰上并培養(yǎng)大約30分。在以FACS緩沖液洗滌之后，測試的細胞在200μl的FACS緩沖液中再懸浮。執(zhí)行流動式細胞測量術(shù)之后，細胞結(jié)合的百分比可通過WinMDI軟件來分析。在直方圖中，二級抗體的培養(yǎng)僅被使用以界定背景(M1)以及結(jié)合(M2)區(qū)?；趦H作為背景(M1)的二級抗體設(shè)置，指定抗體的結(jié)合區(qū)(M2)的百分比被測定。在乳癌細胞株(MCF-7)、肺癌細胞株(LLC1)以及胰腺癌細胞株(HPAC)中，結(jié)合至GloboH的抗體可使用熒光活化細胞分類(fluorescenceactivatedcellsorting，F(xiàn)ACS)分析來評估。結(jié)果：表3總結(jié)GloboH-2C2mAb、GloboH-2F8mAb、GloboH-3D7mAb、GloboH-7A11mAb、以及GloboH-1E1mAb的EC50數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示GloboH-2C2mAb、GloboH-2F8mAb、GloboH-3D7mAb、以及GloboH-7A11mAb在中和GloboH抗原中相比于GloboH-VK9mAb更為有效。FACS分析顯示GloboH-2C2mAb以及GloboH-3D7mAb在乳癌細胞株中，相比于GloboHVK9mAb而言針對GloboH抗原具有更高的結(jié)合親和力。此外，GloboH-2C2mAb和GloboH-3D7mAb在胰腺癌細胞株(HPAC)中，相比于GloboHVK9mAb而言針對GloboH抗原具有更高的結(jié)合親和力。此外，GloboH-1E1mAb、GloboH-2C2mAb、GloboH-3D7mAb以及GloboH-7A11mAb在肺癌細胞株(LLC1)中，相比于GloboHVK9mAb而言針對GloboH抗原具有更高的結(jié)合親和力。表3、抗GloboH抗體的EC50和結(jié)合親和力EC50值是中和掉GloboH的50％的抗體濃度。實例4：抗GloboH抗體的體內(nèi)抗腫瘤評估以人類胰腺癌(HPAC)異種移植的體重33g的裸鼠被隨機分成下列6個實驗組：針對腫瘤體積觀察小鼠29天期間，且結(jié)果被記錄并總結(jié)在第1圖中。結(jié)果：在第29天，腫瘤體積以下列順序減少：VK9＝3D7<2C2組別。在2C2組別中的腫瘤體積相比于控制組顯著地減少(P<0.05)。實例5：抗GloboH抗體的體內(nèi)抗腫瘤評估以人類乳癌(MCF7)異種移植的體重27g的裸鼠被隨機分成下列5個實驗組：針對腫瘤體積觀察小鼠18天的期間，且結(jié)果被記錄并總結(jié)在第2圖中。結(jié)果：如在第2圖顯示的，在第15天之后，與控制組相比腫瘤體積于下列組別中減少：2C2(4mg/kg)>2C2(0.4mg/kg)。從第8天開始，在2C2(4mg/kg)中的腫瘤體積相比于控制組顯著地減少(P<0.05)。實例6：抗GloboH抗體的交互反應(yīng)執(zhí)行抗GloboH抗體(GloboH2C2、7A11、3D7、2F8、1E1mAb以及GloboHVk9)的體外交互評估。步驟：GlycoDx盒(GlycoDxcartridges)加入620μL的洗滌緩沖液、100μL的稀釋抗GloboH抗體、100μL的阻斷緩沖液、120μL的共軛緩沖液、以及120μL的基質(zhì)緩沖液。盒以CCD分析儀偵測，且數(shù)據(jù)輸出至Excel電子表格以進一步分析。結(jié)果：如在第3A圖中顯示的，GloboH2C2mAb結(jié)合至GloboH，且顯示對其他糖類抗原的交互反應(yīng)，諸如Lewis抗原(sLex以及sLea)和S15-S27抗原(參見表4的糖類抗原的列表)。GloboH7A11mAb結(jié)合至GloboH并且顯示對其他糖類抗原的交互反應(yīng)，諸如Lewis抗原(sLex以及sLea)以及S15-S17、S19-S22抗原(見第3B圖)。GloboH3D7mAb結(jié)合至GloboH，且顯示對其他糖類抗原的交互反應(yīng)，諸如Lewis抗原(sLex、sLea、以及Ley)以及S15-S22抗原(見第3C圖)。GloboH2F8mAb結(jié)合至GloboH并且顯示對其他糖類抗原的交互反應(yīng)，諸如Lewis抗原(sLex及sLea)以及S15、S17以及S21抗原(見第3D圖)。GloboH1E1mAb結(jié)合至GloboH且顯示對其他糖類抗原的交互反應(yīng)，諸如Lewis抗原(sLex)以及S16、S17和S20-S22抗原(見第3E圖)。相比之下，GloboHVK9mAb僅結(jié)合至GloboH且不顯示對其他糖類抗原的交互反應(yīng)(見第3F圖)。表4、在第3A圖至第3C圖中的糖類抗原的列表實例7：抗GloboH抗體的結(jié)合親和力執(zhí)行下列抗GloboH人源化抗體的體外評估。表5列出源自雜交瘤2C2的人源化抗體的重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)的氨基酸序列。表5、2C2人源化抗體的氨基酸序列通過ELISA方法測定的結(jié)合親和力的結(jié)果被列在表6-9中。表6：具嵌合輕鏈和人源化重鏈的抗體的結(jié)合親和力這些結(jié)果顯示重鏈的FW2中位置9的氨基酸替換(從G到A)使抗體的結(jié)合親和力從0.4降低到0.17。表7：具人源化輕鏈和人源化重鏈的抗體的結(jié)合親和力輕鏈重鏈親和力ELISA(光學(xué)密度)輕鏈2重鏈20.42輕鏈2-22重鏈20.08輕鏈2-23重鏈20.09表8：具人源化輕鏈和人源化重鏈的抗體的結(jié)合親和力輕鏈重鏈親和力ELISA(光學(xué)密度)輕鏈2重鏈2-210.53輕鏈2-22重鏈2-210.08輕鏈2-23重鏈2-210.12表9：具人源化輕鏈和人源化重鏈的抗體的結(jié)合親和力輕鏈重鏈親和力ELISA(光學(xué)密度)輕鏈2重鏈2-220.32輕鏈2-22重鏈2-220.07輕鏈2-23重鏈2-220.08這些結(jié)果顯示在輕鏈的FW2的位置12的氨基酸替換(從P至L)使結(jié)合親和力從0.32-0.53減少到0.07-0.08，且在輕鏈的FW2的位置13的氨基酸替換(從W到L)使結(jié)合親和力從0.32-0.53減少至0.08-0.12。誠然本發(fā)明的具體態(tài)樣已經(jīng)被敘述和描繪，這樣的態(tài)樣可被認為僅是本發(fā)明的描述而非作為本發(fā)明的限制，如根據(jù)附錄的權(quán)利要求書所解釋的。所有在本說明書中引用的公開文獻和專利申請于所有目的通過引用而整體并入本文中，如同每一個別公開文獻或?qū)＠暾埍惶囟ǖ睾蛡€別地指定以于所有目的上通過引用而整體并入。雖然上述發(fā)明已為了清楚理解的目的而以描述和舉例的方式進行部分細節(jié)的描述，然而顯而易見的是，對所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的技術(shù)人員而言根據(jù)此發(fā)明教示可在不悖離所附權(quán)利要求書的精神或范疇下進行一些變化和修飾。序列表清單：SEQIDNo.1-90當前第1頁1 2 3