專利名稱：聚合物結(jié)合的抗體癌癥治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥治療劑，其包括結(jié)合有多個(gè)抗腫瘤抗體的聚合物，以及所述治療劑在癌癥治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
下面對(duì)本發(fā)明背景的討論僅僅是被提供用來(lái)幫助讀者理解本發(fā)明，不意圖于描述或構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
單克隆抗體(MABs)已經(jīng)成為人類惡性淋巴瘤和其它癌癥的重要治療模式。針對(duì)CD20標(biāo)志物的抗體產(chǎn)品RITUXAN、ZEVALIN和BEXXAR，已經(jīng)得到美國(guó)FDA的批準(zhǔn)，用于淋巴瘤治療。這些試劑的應(yīng)用正在幫助腫瘤學(xué)家設(shè)計(jì)更加有效的方案。
CD20是一種非糖基化的33-37KD的磷蛋白，表達(dá)于＞95％的正常和贅生性B細(xì)胞上(1)。從發(fā)育的前B期到最終分化為漿細(xì)胞，CD20表達(dá)于細(xì)胞表面。單核細(xì)胞、靜息和活化的T細(xì)胞、裸細(xì)胞以及非淋巴細(xì)胞始終是CD20陰性的(2)。CD20的氨基酸序列提示，它由四個(gè)跨膜區(qū)組成，氨基和羧基末端均位于質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)(3)。目前認(rèn)為CD20起鈣離子通道的作用，用以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化(4)。
CD20以高表面密度在惡性淋巴瘤細(xì)胞上的表達(dá)為針對(duì)這種細(xì)胞表面靶標(biāo)開(kāi)發(fā)MAbs提供了理論基礎(chǔ)。此外，在抗體結(jié)合之后，CD20沒(méi)有顯示出內(nèi)化或調(diào)制的趨向(5)。
RITUXAN(通用名利妥昔單抗)是針對(duì)CD20的嵌合單克隆抗體。在臨床上，給予利妥昔單抗在25-50％的患者中誘導(dǎo)客觀治療反應(yīng)(6)。為了了解對(duì)利妥昔單抗的差異反應(yīng)，已努力研究了其抗腫瘤活性的潛在機(jī)制和每一機(jī)制的相對(duì)貢獻(xiàn)。已經(jīng)顯示，CD20和抗-CD20抗體如利妥昔單抗的連接激活與CD20非共價(jià)締合的酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，從而誘導(dǎo)磷脂酶C-γ(PLCγ)的酪氨酸磷酸化(7、8)。而且，已經(jīng)顯示，交聯(lián)CD20和抗-CD20二抗(例如，羊抗鼠抗體(GAM))，從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備中動(dòng)員出鈣離子(9)。有趣的是，不同的抗-CD20抗體對(duì)CD20的功能有不同的影響。例如，抗體IF5刺激B細(xì)胞周期從G0轉(zhuǎn)變?yōu)镚1(10)，而抗體B1抑制B細(xì)胞在促有絲分裂劑刺激后從細(xì)胞周期的G1期進(jìn)展到S/G2+M期(4)。已顯示，這些差異與抗CD20抗體將CD20抗原移位到去污劑不溶性脂微域的能力相關(guān)，所述脂微域通常被稱作“筏(rafts)”，在觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)或激活細(xì)胞溶解型補(bǔ)體中，這是必須的(11-14)。
Harjunpaa等人(15)和Manches等人(16)已經(jīng)報(bào)道，直接補(bǔ)體殺傷作用是利妥昔單抗給予的快速和有效的效應(yīng)物機(jī)制，但在近來(lái)，Weng和Levy(16)提出了不同的結(jié)果，表明利妥昔單抗的治療活性和補(bǔ)體防御分子CD55或CD59的表達(dá)水平不相關(guān)。因?yàn)檫@些結(jié)果，CDC在利妥昔單抗治療中的作用受到質(zhì)疑，并且在利妥昔單抗治療期間觀察到的補(bǔ)體消耗可能事實(shí)上反映了毒性而不是療效。
近來(lái)研究了用利妥昔單抗抗體或帶有FcR的巨噬細(xì)胞或浸潤(rùn)腫瘤的其它輔助細(xì)胞對(duì)CD20的交聯(lián)而引發(fā)的、導(dǎo)致凋亡和細(xì)胞死亡的細(xì)胞內(nèi)事件的作用(9、18、19)。臨床研究表明，表達(dá)FcγRIIIa的高親和力變體(158V同種異型)的患者對(duì)利妥昔單抗的反應(yīng)好于攜帶低親和力158F同種異型的那些患者(20)。作為一般機(jī)制，也已報(bào)道了B-細(xì)胞表面抗原和其它抗原，包括表面IgM(21、22)、獨(dú)特型(23)、CD19(24)、CD21(28)、CD22(9)和HER-2(28)以及主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類抗原(25)引起小鼠和人B細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和/或凋亡。與抗-IgM或抗-MHC II類分子抗體結(jié)合可以直接誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞凋亡，而抗-CD19、CD20和CD22抗體僅在包含與第二抗體(例如，羊抗鼠抗體或GAM)交聯(lián)的附加步驟時(shí)誘導(dǎo)凋亡(26)。在表達(dá)CD20的淋巴瘤細(xì)胞中，通過(guò)用EGTA或細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑Bapta AM進(jìn)行Ca2+螯合處理，用GAM抗體交聯(lián)對(duì)凋亡產(chǎn)生的誘導(dǎo)顯示出顯著的降低(9)。
發(fā)明概述 在一方面，本發(fā)明提供了由聚合物制成的癌癥治療劑，多個(gè)抗腫瘤細(xì)胞抗體與所述聚合物連接，所述抗體可以和腫瘤細(xì)胞抗原結(jié)合。癌癥治療劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或細(xì)胞死亡，癌癥治療劑的抗腫瘤細(xì)胞抗體與所述腫瘤細(xì)胞結(jié)合。該癌癥治療劑不是脂質(zhì)體或脂質(zhì)體的一部分。
如此處所用，“腫瘤細(xì)胞抗原(tumor cell antigen)”或“腫瘤抗原(tumorantigen)”是指在腫瘤細(xì)胞上存在的蛋白質(zhì)，以及在胎兒期的正常細(xì)胞上(癌胚抗原)、出生后在選擇的器官中存在，或在許多正常細(xì)胞上存在，但是較在腫瘤細(xì)胞上的濃度低得多的蛋白質(zhì)。腫瘤抗原也被稱為“腫瘤相關(guān)抗原”(TAA)。腫瘤抗原也包含本領(lǐng)域中所稱的腫瘤特異性抗原(TSA)(也稱作“腫瘤特異性移植抗原或TSTA)。TSA是指腫瘤細(xì)胞上存在而在非腫瘤細(xì)胞上不存在的蛋白質(zhì)。TSA通常在感染病毒使得細(xì)胞變得永生并且表達(dá)病毒抗原時(shí)出現(xiàn)。不由病毒誘導(dǎo)的TSAs可以是B細(xì)胞淋巴瘤上的免疫球蛋白的獨(dú)特型或T細(xì)胞淋巴瘤上的T細(xì)胞受體(TCR)。腫瘤相關(guān)抗原(TAA)比TSA更為普遍。
選擇用于本發(fā)明治療劑的抗體的一個(gè)特征是它們能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或細(xì)胞死亡。在一種實(shí)施方案中，抗體的特征是，當(dāng)其被直接施用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，并不實(shí)質(zhì)地誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞死亡，但是當(dāng)腫瘤細(xì)胞結(jié)合的抗體通過(guò)第二抗體被交聯(lián)時(shí)(例如，羊抗鼠抗體或GAM；參考文獻(xiàn)26)或通過(guò)加入帶有FcR的巨噬細(xì)胞被交聯(lián)時(shí)，誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞死亡(術(shù)語(yǔ)“交聯(lián)”用在涉及二抗的內(nèi)容中時(shí)，在本領(lǐng)域中也被稱作“超交聯(lián)(hyper-cross-linking)”)。CD19、CD20、CD21、CD22和HER-2的抗體是這種類型抗體的示例。這樣的抗體可以被稱作交聯(lián)依賴性腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)抗體。如此處所述，連接有這種抗體的聚合物與不與聚合物連接時(shí)的抗體相比，表現(xiàn)出增強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞死亡的能力。
因此，本發(fā)明提供了將抗腫瘤抗體轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y治療劑的方法，所述抗腫瘤抗體需要第二交聯(lián)(secondary cross-linking)來(lái)誘導(dǎo)該抗體引起的實(shí)質(zhì)性凋亡或細(xì)胞殺死，所述癌癥治療劑直接誘導(dǎo)凋亡和腫瘤細(xì)胞殺死。根據(jù)本方法，抗體如本文所公開(kāi)地被偶聯(lián)在聚合物上。
在另一種實(shí)施方案中，連接于聚合物的抗體的一個(gè)特征是，在直接與腫瘤細(xì)胞結(jié)合之后誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞死亡。這樣的抗體包含與表面IgM(21、22)，獨(dú)特型(23)和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類抗原(25)結(jié)合的那些抗體。MHC II類和獨(dú)特型可以被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)抗原。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物包括3個(gè)或更多個(gè)這樣的抗體。在一種實(shí)施方案中，聚合物包括至少5個(gè)抗體。在另一實(shí)施方案中，聚合物包括至少10個(gè)抗體。在又一實(shí)施方案中，聚合物包括至少25個(gè)抗體。在又一實(shí)施方案中，聚合物包括至少50個(gè)抗體。在又一實(shí)施方案中，聚合物包括至少100個(gè)抗體。在再一實(shí)施方案中，聚合物包括至少300個(gè)抗體，或者包括至少1000個(gè)抗體。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物包括3個(gè)或更多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。在一種實(shí)施方案中，聚合物包括至少5個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，聚合物包括至少10個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。在又一實(shí)施方案中，聚合物包括至少25個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。在又一實(shí)施方案中，聚合物包括至少50個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。在又一實(shí)施方案中，聚合物包括至少100個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。在再一實(shí)施方案中，聚合物包括至少300個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)，或者包括至少1000個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。
如此處所用，“聚合物”意味著天然發(fā)生的化合物或合成的化合物，其為由連接的一系列重復(fù)的簡(jiǎn)單單體組成的大分子。一個(gè)聚合物通常包含至少約50個(gè)單體。天然聚合物包含蛋白質(zhì)、糖類或核酸，以及非天然的水溶性生物相容聚合物。非天然聚合物包含水溶性聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇等。聚合物可以用功能基團(tuán)如羥基、氨基、硫醇和羧基取代。
在一種實(shí)施方案中，聚合物的大小是至少1,000道爾頓。在另一種實(shí)施方案中，聚合物的大小是至少2,000道爾頓。在又一種實(shí)施方案中，聚合物的大小是至少3,000道爾頓。在又一種實(shí)施方案中，聚合物的大小是至少4,000道爾頓。在又一種實(shí)施方案中，聚合物的大小是至少5,000道爾頓。在又一種實(shí)施方案中，聚合物的大小是至少6,000道爾頓。在又一種實(shí)施方案中，聚合物的大小是6,000至8,000道爾頓。在又一種實(shí)施方案中，聚合物在1Kd至30Kd之間。
在一種實(shí)施方案中，聚合物是同聚物。在另一種實(shí)施方案中，聚合物是雜聚物。在又一種實(shí)施方案中，聚合物選自葡聚糖、聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺類樹(shù)枝狀聚合物(PAPAM)，N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)的合成共聚物，和N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)。
在另一種實(shí)施方案中，聚合物是可溶性聚合物。在另一種實(shí)施方案中，聚合物是線性聚合物。在又一種實(shí)施方案中，聚合物是支化聚合物。在另一種實(shí)施方案中，聚合物是不可溶性的。
在一種實(shí)施方案中，結(jié)合于相同腫瘤抗原的抗體被偶聯(lián)在聚合物上。如果抗體是相同的，則聚合物對(duì)于偶聯(lián)物的抗體部分而言是同聚物。如果抗體是不同的，則聚合物對(duì)于偶聯(lián)物的抗體部分而言是雜聚物。
在另一種實(shí)施方案中，結(jié)合于相同腫瘤的不同表位的抗體被偶聯(lián)到聚合物上。在又一種實(shí)施方案中，結(jié)合于不同腫瘤抗原的抗體被偶聯(lián)到聚合物上。后兩種實(shí)施方案對(duì)于偶聯(lián)物的抗體部分而言是雜聚物。因此，聚合物偶聯(lián)物可以包括與其連接的兩種或更多種不同抗體。在這些實(shí)施方案的任意方案中，偶聯(lián)于聚合物的抗體的形式可以不同。因此，聚合物可以與完整抗體和/或抗體片段偶聯(lián)。而且，聚合物可以與多于一種類型的抗體片段偶聯(lián)。
在一種實(shí)施方案中，抗腫瘤抗體選自抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD22。在一種實(shí)施方案中，抗CD20抗體是利妥昔單抗。如此處所用，利妥昔單抗是來(lái)自轉(zhuǎn)染瘤的嵌合抗CD20抗體，所述轉(zhuǎn)染瘤包括抗CD20，在TCAE 8中，如在ATCC編號(hào)69119下保藏的(參見(jiàn)美國(guó)專利5,776,456)。在另一種實(shí)施方案中，腫瘤抗體選自抗肺、抗乳腺、抗結(jié)腸、抗卵巢、抗前列腺和抗肉瘤抗體。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的癌癥治療劑被用于癌癥治療。本發(fā)明的癌癥治療劑可以被用來(lái)降低個(gè)體的腫瘤體積或減慢個(gè)體的腫瘤生長(zhǎng)，包括給予有效量的試劑，其中所述試劑靶向于體內(nèi)腫瘤。
本發(fā)明的又一方面是降低或抑制遭受癌癥個(gè)體中的轉(zhuǎn)移(metastasis)發(fā)展的方法，包括給予有效量的癌癥治療劑，其中所述試劑在體內(nèi)靶向于轉(zhuǎn)移性細(xì)胞(metastatic cell)。
在上述治療方法中，對(duì)于治療特別適合的癌癥患者是與年齡匹配的正常個(gè)體相比，表現(xiàn)出降低水平的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性的患者。ADCC的程度可以如已述地進(jìn)行測(cè)定(24、25)。
在又一方面，提供了鑒定抗體的方法，與不和聚合物連接的抗體相比，在至少兩個(gè)這樣的抗體被連接于聚合物時(shí)，所述抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。該方法包括，將被期望進(jìn)行這樣的試驗(yàn)的候選抗體連接到不溶性顆粒，以及使連接有抗體的顆粒與腫瘤細(xì)胞接觸，所述腫瘤細(xì)胞表達(dá)該候選抗體能夠與之結(jié)合的抗原。合適的時(shí)間后，測(cè)定在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡程度。將該凋亡程度與另外一批相同腫瘤細(xì)胞中被誘導(dǎo)的凋亡程度相比較，所述另外一批腫瘤細(xì)胞是與未連接于任何顆粒的候選抗體接觸。在一種實(shí)施方案中，與未連接于任何顆粒的抗體相比，應(yīng)用連接有抗體的顆粒時(shí)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)的能力被測(cè)定為至少2倍的增加，更優(yōu)選地至少3倍。在另一實(shí)施方案中，顆粒是珠子。在又一實(shí)施方案中，珠子的直徑是約2至約5微米長(zhǎng)度之間。更優(yōu)選地，直徑是約3微米長(zhǎng)度。
如此處所用，“約”意味著加10％或減10％。如此處所用，“實(shí)質(zhì)地(substantially)”意味著10％或更多、更優(yōu)選地是20％或更多、更優(yōu)選地是30％或更多、更優(yōu)選地是40％或更多，以及更優(yōu)選地是50％或更多。


圖1A-1K顯示了在不同的已確立的B細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金病細(xì)胞系中，通過(guò)FACS分析得到的CD20表達(dá)情況。
圖2顯示了，在存在Lym-1抗體和對(duì)照IgG的情況下，懸浮培養(yǎng)物中的Raji細(xì)胞增殖。
圖3A-3G顯示了，與第二抗體超交聯(lián)和不與第二抗體超交聯(lián)的利妥昔單抗和Lym-1抗體(對(duì)于利妥昔單抗，第二抗體是羊抗人IgG“GAH”，對(duì)LYM-1，是羊抗鼠IgG“GAM”)對(duì)懸浮液中的Raji細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)。凋亡是通過(guò)膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)復(fù)染以及FACS分析評(píng)價(jià)的。使用對(duì)照IgG的Raji細(xì)胞染色被顯示，用于比較。
圖4A-4C顯示抗淋巴瘤抗體，LYM-1和利妥昔單抗，以及對(duì)照抗體(chTV-1)誘導(dǎo)的懸浮液中的Raji細(xì)胞中的DNA片段化。利用檢測(cè)BrdU的TUNEL分析產(chǎn)生了用FITC-標(biāo)記抗-BrdU抗體染色的DNA鏈斷裂，隨后進(jìn)行FACS分析。
圖5A-5B顯示了，用考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE(非還原條件)對(duì)聚合物抗體的分析。泳道分子量(MW)(分子量標(biāo)準(zhǔn)是123Kd和204Kd)；泳道a利妥昔單抗；泳道b葡聚糖-利妥昔單抗；泳道c葡聚糖-Lym-1；和泳道dLym-1。
圖6顯示了，對(duì)照IgG、利妥昔單抗、葡聚糖-利妥昔單抗、LYM-1和葡聚糖-LYM-1對(duì)Raji細(xì)胞懸浮液的凋亡誘導(dǎo)。凋亡是經(jīng)膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶染色以及FACS分析證實(shí)的。
圖7A-7B顯示了，靜脈給予三日后，利妥昔單抗和葡聚糖-利妥昔單抗在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。結(jié)果表示為百分注射劑量/克數(shù)(圖7A)和腫瘤/正常器官的比值(圖7B)。
圖8A-8B顯示了，靜脈給予三日后，LYM-1和葡聚糖-LYM-1在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。結(jié)果表示為百分注射劑量/克數(shù)(圖8A)和腫瘤/正常器官的比值(圖8B)。
圖9顯示了，在Raji異種移植物模型中，利妥昔單抗和葡聚糖-利妥昔單抗免疫療法。帶有0.5cm直徑皮下腫瘤的裸鼠被隔日處理3次(箭頭，1、3和5天)，通過(guò)靜脈給予對(duì)照IgG、利妥昔單抗或葡聚糖-利妥昔單抗偶聯(lián)物來(lái)實(shí)施。腫瘤體積在縱軸上表示，時(shí)間在橫軸上表示。天數(shù)1表示開(kāi)始處理的時(shí)間，這通常是腫瘤移植后14天。
圖10顯示了，在Raji異種移植物模型中，LYM-1和葡聚糖-LYM-1免疫療法。細(xì)節(jié)如圖9所述。
圖11A顯示了，對(duì)照IgG、利妥昔單抗、羊抗人IgG(″GAH″)和利妥昔單抗+GAH處理在Raji細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡。凋亡是通過(guò)膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶染色及FACS分析測(cè)定的。
圖11B1-B4顯示了，對(duì)與圖11A所述相同地處理的Raji細(xì)胞的TUNEL分析得到的凋亡情況。
圖12A顯示了，用Dynabeads、連接于Dynabeads的對(duì)照IgG和連接于Dynabeads的利妥昔單抗處理，在Raji細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡。凋亡是通過(guò)膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶染色及FACS分析測(cè)定的。
圖12B1-B3顯示了，對(duì)與圖12A所述相同地處理的Raji細(xì)胞的TUNEL分析得到的凋亡情況。
圖13A-13C顯示了，用多種抗體處理后5小時(shí)(左手圖)和24小時(shí)(右手圖)，Raji細(xì)胞中的胱天蛋白酶3活性。細(xì)胞用產(chǎn)熒光蛋白酶底物Phiphilux，(FL1-H)染色并用FACS評(píng)價(jià)。
圖14A-14B顯示了，靜脈給予三日后，利妥昔單抗、利妥昔單抗二聚體(二聚體)和葡聚糖-利妥昔單抗聚合物(聚合物)在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。結(jié)果表示為百分注射劑量/克數(shù)(圖14A)和腫瘤/正常器官比值(圖14B)。
圖15顯示了，利妥昔單抗、利妥昔單抗二聚體(二聚體)和葡聚糖-利妥昔單抗聚合物(聚合物)以及磷酸鹽緩沖液(PBS)在Raji異種移植物模型中的免疫療法。箭頭表示通過(guò)靜脈給予進(jìn)行的處理。
發(fā)明詳述 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了癌癥治療劑，其包括連接有抗腫瘤細(xì)胞抗體的聚合物。癌癥治療劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞死亡，其中癌癥治療劑的抗腫瘤細(xì)胞抗體結(jié)合到所述腫瘤細(xì)胞上。
如此處所用，“凋亡”是指細(xì)胞的生理性死亡或程序性死亡，由特定的形態(tài)學(xué)特征來(lái)表征，所述特征包括細(xì)胞和細(xì)胞核固縮、細(xì)胞質(zhì)空泡化，以及由于核小體內(nèi)DNA片段化而造成的濃縮染色質(zhì)在核膜周圍邊緣化并產(chǎn)生通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)的DNA梯(DNA ladders)。參見(jiàn)，例如，參考文獻(xiàn)27。對(duì)于寬范種類的癌癥，凋亡性細(xì)胞殺傷在用特定的抗癌劑處理之后發(fā)生。凋亡是免疫B細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，并且在惡性轉(zhuǎn)化后仍然有充分的功能。凋亡可以如本文所述和如以前所報(bào)道地(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利6,368,596)進(jìn)行測(cè)定。
利妥昔單抗抗體與CD20+淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合沒(méi)能誘導(dǎo)凋亡至顯著的程度(16)。為了增強(qiáng)凋亡，利妥昔單抗可以被超交聯(lián)，這是通過(guò)包含羊抗人/鼠IgG、加入帶有FcγR的細(xì)胞、或在體外將抗體固定在塑料上來(lái)實(shí)施的(16-19)。利妥昔單抗的超交聯(lián)使CD20重新分布到Triton X-不溶性細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)-加工中心(20、21)，隨后發(fā)生脂膜筏群集(lipid raft clustering)并反式激活Src-家族酪氨酸激酶如Lyn、Fyn和Lyc，這進(jìn)一步導(dǎo)致淋巴瘤細(xì)胞的凋亡(19、22-24)。
Ghetie等人(29)報(bào)道，與從藥房得到的單體制備物相比，利妥昔單抗的四價(jià)同型二聚體在人類惡性淋巴瘤細(xì)胞系中能夠誘導(dǎo)出更高的凋亡率。在這些研究中，觀察到的凋亡率與通過(guò)羊抗鼠超交聯(lián)獲得的凋亡率相當(dāng)，并且當(dāng)與化療劑如阿霉素聯(lián)合測(cè)試時(shí)，同型二聚體制備物產(chǎn)生明顯更好的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。
認(rèn)為抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，特別是Fc:FcR相互作用，是利妥昔單抗療法的主要效應(yīng)機(jī)制(25、26)。效應(yīng)細(xì)胞上的Fcγ受體似乎對(duì)抗CD20抗體在小鼠中的體內(nèi)活性負(fù)責(zé)，這通過(guò)應(yīng)用基因敲除小鼠模型被證實(shí)，在基因敲除模型中顯示，F(xiàn)c:FcR相互作用對(duì)于循環(huán)和滲出B淋巴細(xì)胞的耗盡是必需的(25)。目前的臨床研究集中于FCGR3A基因的二態(tài)性，所述基因編碼在殘基158處具有苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)的FcγRIIIa，它以不同的親和性(V＞F)與IgG1的低鉸鏈區(qū)特異地反應(yīng)(27-29)。觀察到純合FCGR3A-158V患者具有經(jīng)歷臨床反應(yīng)的更高概率，這支持了Fc:FcR相互作用的關(guān)鍵作用(27、29)。為了使ADCC有效，假定帶有Fc受體的細(xì)胞必須進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，以直接與其靶標(biāo)接觸。如果情況是這樣，則帶有Fc受體的細(xì)胞可以作為ADCC和超交聯(lián)誘導(dǎo)凋亡的媒介物起作用，以破壞腫瘤。因此，腫瘤相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞的缺乏可以解釋特定患者中的利妥昔單抗失效。應(yīng)用本發(fā)明的抗體聚合物對(duì)于ADCC能力降低的個(gè)體的治療性癌癥干預(yù)是有用的。
本發(fā)明的包括抗體如利妥昔單抗的癌癥治療劑代表了高價(jià)試劑，在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中，它都是比單體或二聚體制備物更有效的凋亡誘導(dǎo)物。由于其可溶性質(zhì)，聚合物連接的利妥昔單抗是已經(jīng)在CD20+Raji異種移植物中顯示出好的腫瘤靶向和治療潛能的臨床相關(guān)試劑。含有多個(gè)抗腫瘤抗體的可溶性聚合物提供了顯著改進(jìn)的基于抗體的免疫療法，特別是在具有低親和力FcγR同種異型的患者中。
抗腫瘤抗體可以用美國(guó)專利6,368,596中描述的氚標(biāo)記胸苷摻入試驗(yàn)來(lái)鑒定，所述抗體被表征為，當(dāng)不與第二抗體交聯(lián)(或與帶有Fc受體的巨噬細(xì)胞接觸)時(shí)，不能誘導(dǎo)實(shí)質(zhì)性的凋亡或細(xì)胞死亡。被表征為在二級(jí)誘導(dǎo)的交聯(lián)之后凋亡或細(xì)胞殺傷增強(qiáng)的抗腫瘤抗體包含抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD22和HER-2。在一種實(shí)施方案中，抗CD20抗體是利妥昔單抗。其它抗體包含針對(duì)多種癌中的任意癌的抗體，所述癌包含肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢、前列腺癌以及肉瘤。其它此類抗體在美國(guó)專利6,368,596中有所描述，或者可以通過(guò)本文公開(kāi)的方法容易地被鑒定。
CD19(也稱為B4抗原)是95Kd的B細(xì)胞標(biāo)志物，其通過(guò)抗-CD19抗體(例如，抗體FMC63)來(lái)檢測(cè)，包括這些抗體的嵌合形式。Zola等人，Immunol Cell Biol.69(Pt6)411-22(1991)；Pieterxz等人，Cancer Immunol Immunother.41(1)53-60(1995)。CD19是B譜系特異性的并且表達(dá)于早期B細(xì)胞前體、前-前-B細(xì)胞、前-B細(xì)胞、B細(xì)胞、中間B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞和一些漿細(xì)胞樣細(xì)胞。漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞是CD19陰性的。
CD21是補(bǔ)體片段C3d、C3dg或ic3D并且也是EBV的受體(約145Kd)。CD21也是CD23的配體并且參與IgE合成。抗CD21抗體已經(jīng)被描述。已報(bào)道，結(jié)合于B細(xì)胞的抗CD21抗體保護(hù)細(xì)胞免遭凋亡。Bonnefoy等人Eur.J.Immunol.23,969-972(1993)。
CD22是人類B淋巴細(xì)胞上表達(dá)的130Kd蛋白質(zhì)。CD22的人源化抗體(例如，Epratuzumab，Amgen，CA)已經(jīng)被描述。Carnahan等人，Clin Cancer Res.9(10Pt2)3982S-90S(2003)。正常T細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板是CD22陰性的。細(xì)胞系SB、Raji和NALM-1如CALLA-ALL一樣是陽(yáng)性的。CLL和NHL的表達(dá)型是可從弱陽(yáng)性到陰性變化的。PLL是明顯陽(yáng)性的，毛細(xì)胞白血病是非常強(qiáng)陽(yáng)性的。
原癌基因Her-2/neu(C-erbB2)已被定位在染色體17q并且編碼跨膜酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體。Her-2/neu基因的蛋白產(chǎn)物在25-30％的乳腺癌中被過(guò)表達(dá)，并且在約90-95％的這些情形中，增量調(diào)節(jié)是基因擴(kuò)增的直接結(jié)果。HER2的抗體可以阻斷腫瘤的增殖信號(hào)通路，這導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的抑制和腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。參見(jiàn)，例如，Clin.Cancer Res.81720-30(2002)；Brodowicz等人Br.J Cancer851764-70(2001)；Crombet-Ramos等人，Int.J.Cancer101567-75(2002)；Herbst等人，Expert Opin.Biol.Ther.1719-32(2001)。HER-2抗體在以前已被描述過(guò)(參見(jiàn)，美國(guó)專利6,054,561；5,169,774；4,938,948；4,753,894；6,387,371；6,399,063；6,627,196；6,821,515；6,719,971和美國(guó)專利6,800,738。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”是指可以從天然來(lái)源分離的、或應(yīng)用重組DNA技術(shù)從分離的cDNA產(chǎn)生的一條或多條多肽。如果一個(gè)蛋白質(zhì)包含多于一條多肽，則這些多肽通過(guò)共價(jià)和/或非共價(jià)力作為單個(gè)分子結(jié)合在一起(即，多聚體)。由多條多肽組成的蛋白質(zhì)的一個(gè)例子是含有重鏈和輕鏈的抗體。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)包含具有其它化學(xué)實(shí)體的蛋白質(zhì)如糖蛋白、蛋白聚糖、脂蛋白和類似物。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”一般指多脫氧核糖核苷酸(含2′-脫氧-D-核糖或其修飾形式)、多核糖核苷酸(含有D-核糖或其修飾形式)，也指作為嘌呤或嘧啶堿基或者修飾的嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷的任何其它類型的多核苷酸。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“純化的”在談及多肽(或蛋白質(zhì))時(shí)，并不要求絕對(duì)純凈。相反，它代表了這樣的提示，感興趣的多肽(例如抗體)處于分立的環(huán)境中，在該環(huán)境中，所述多肽相對(duì)于其它蛋白質(zhì)的豐度(以質(zhì)量為基礎(chǔ))大于在生物學(xué)樣品中的豐度?！胺至⒌沫h(huán)境”是指單一介質(zhì)，如單一溶液、單一凝膠、單一沉淀物等。純化的多肽可以通過(guò)許多方法獲得，包括，例如實(shí)驗(yàn)室合成、色譜法、制備電泳、離心、沉淀、親和純化等。一種或多種感興趣的“純化的”多肽優(yōu)選地為分立的環(huán)境中蛋白質(zhì)含量的至少10％。一種或多種“基本上純化的”多肽為分立的環(huán)境中蛋白質(zhì)含量的至少50％，更優(yōu)選地為分立的環(huán)境中蛋白質(zhì)含量的至少75％，更優(yōu)選地為分立的環(huán)境中蛋白質(zhì)含量的至少95％。可以用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)，用Hartree，Anal Biochem 48422-427(1972)描述的、對(duì)Lowry等人J.Biol.Chem.193265，1951中的方法的修改來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
可以用本發(fā)明方法治療的癌癥包含癌、肉瘤以及白血病和淋巴瘤以及其它類型的癌癥。癌包含肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌和類似癌癥。對(duì)于治療為優(yōu)選的癌癥是淋巴瘤。
偶聯(lián)有抗體的聚合物優(yōu)選地是可溶性聚合物。它優(yōu)選地是約1,000道爾頓或更大。聚合物可以是同聚物或雜聚物。聚合物可以選自葡聚糖、聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺類樹(shù)枝狀聚合物(PAPAM)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的合成共聚物(HPMA)和N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)，和類似物。參見(jiàn)Ulbrich等人(2002)Materials Structure 10(1)3。水溶性非抗原性聚合物可以如美國(guó)專利6,113,906中所述被應(yīng)用。水溶性聚合物載體可以是可生物降解的。聚合物可以是多肽。
聚合物的分子量可以從1,000至30,000。聚合物的大小優(yōu)選地是約6,000-8,000道爾頓或更小。
可以用本文描述的化學(xué)方法以及本領(lǐng)域中已知的其它化學(xué)方法將抗體偶聯(lián)于聚合物。連接化學(xué)術(shù)可以復(fù)制用于制備半抗原載體偶聯(lián)物或藥物載體偶聯(lián)物的化學(xué)策略，其中，抗體與半抗原或藥物類似，聚合物與載體類似。
多個(gè)肽或蛋白質(zhì)分子可以被連結(jié)到單個(gè)改性聚乙二醇(PEG)聚合物上，如Jones等人，Bioconjugate Chem.(2003)14，1067-76所述。具體地，聚乙二醇聚合物的一個(gè)末端或兩個(gè)末端被修飾，以使各自包含兩個(gè)、四個(gè)或八個(gè)氨基氧基團(tuán)。也公開(kāi)了連接四個(gè)改性PEG聚合物分子以便提供對(duì)四個(gè)肽或蛋白質(zhì)分子的連結(jié)的連接結(jié)構(gòu)。偶聯(lián)物是通過(guò)在PEG的氨基氧基團(tuán)和多肽的N-末端乙醛酸化區(qū)域之間形成肟鍵而制備的。Jones等人描述了β2GPI的B細(xì)胞表位的偶聯(lián)物，目的是誘導(dǎo)B細(xì)胞對(duì)β2GPI的耐受。相關(guān)的美國(guó)專利6,458,953描述了類似的化合物(帶有或不帶有PEG)，它們用作用于連結(jié)包括抗體在內(nèi)的生物分子的多價(jià)平臺(tái)。肽或蛋白質(zhì)可以通過(guò)多種鍵如硫醚鍵被連結(jié)到該平臺(tái)上。然而，偶聯(lián)于抗腫瘤細(xì)胞抗體的PEG聚合物的制備還沒(méi)有被描述過(guò)，所述抗體用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。也可以用5,670,132、5,234,903和5,234,903中描述的方法實(shí)施對(duì)抗體的PEG偶聯(lián)。
在用于進(jìn)行偶聯(lián)的抗體的屬性以及抗體與偶聯(lián)物的比例方面，本發(fā)明的聚合物偶聯(lián)物不同于以前已知的那些偶聯(lián)物。在以前的研究中，聚合物被偶聯(lián)于抗體，但比例是每個(gè)抗體帶有多于一個(gè)聚合物。與之不同，本發(fā)明的聚合物抗體偶聯(lián)物是每個(gè)聚合物帶有多于一個(gè)抗體。單個(gè)聚合物包括至少3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000或更多個(gè)抗體。在另一實(shí)施方案中，單個(gè)聚合物包括至少3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000或更多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”包含免疫球蛋白，免疫球蛋白是B細(xì)胞的產(chǎn)物及其變體，以及T細(xì)胞受體(TcR)，T細(xì)胞受體是T細(xì)胞產(chǎn)物及其變體。免疫球蛋白是包括一條或多條多肽的蛋白質(zhì)，所述多肽基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及各種免疫球蛋白可變區(qū)基因編碼。輕鏈被分類為κ鏈或λ鏈。重鏈被分類為γ鏈、μ鏈、α鏈、δ鏈或ε鏈，它們分別依次定義出免疫球蛋白的種類，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重鏈的亞類也是已知的。例如，人類的IgG重鏈可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類中的任意一類。
已知典型的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)單位包括四聚體。每一四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每一對(duì)多肽鏈具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的N末端限定出主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈。
抗體以全長(zhǎng)的完整抗體(二價(jià)體)存在，或者以經(jīng)各種肽酶或化學(xué)品消化產(chǎn)生的許多被很好地表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)的二硫鍵下游消化抗體，產(chǎn)生F(ab′)2，F(xiàn)(ab′)2是Fab的二聚體，F(xiàn)ab本身是通過(guò)二硫鍵連接于VH-CH1的輕鏈。F(ab′)2可以在溫和條件下被還原，鉸鏈區(qū)的二硫鍵斷裂，從而將F(ab′)2二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab′單體(單價(jià))。Fab′單體實(shí)質(zhì)上是帶有部分鉸鏈區(qū)的Fab片段(對(duì)于其它抗體片段的更詳細(xì)描述，參見(jiàn)Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993))。雖然多種抗體片段是根據(jù)完整抗體的消化來(lái)限定的，但技術(shù)人員將理解，多種抗體片段中的任意抗體片段可以通過(guò)化學(xué)方法從頭合成或通過(guò)重組DNA方法合成。因此，如此處所用，術(shù)語(yǔ)抗體也包含通過(guò)完整抗體的修飾或從頭合成產(chǎn)生的抗體片段或者應(yīng)用重組DNA方法得到的抗體和片段。
重組抗體可以是常規(guī)的全長(zhǎng)抗體、來(lái)自蛋白水解消化的已知抗體片段、獨(dú)特的抗體片段如Fv或單鏈Fv(scFv)、結(jié)構(gòu)域被刪除的抗體，和類似抗體。片段可以包括少至一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被刪除或突變的結(jié)構(gòu)域或多肽，而更廣泛的缺失也是可能的，如一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的缺失。
Fv抗體的大小是約50Kd，包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。單鏈Fv(″scFv″)多肽是共價(jià)連接的VH::VL雜二聚體，它可以由包含VH和VL編碼序列的核酸表達(dá)，VH和VL編碼序列或是直接連接或是經(jīng)肽編碼接頭連接。參見(jiàn)Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，855879-5883。許多結(jié)構(gòu)用于將抗體V區(qū)的天然聚集、但化學(xué)上被隔離的輕鏈和重鏈多肽鏈轉(zhuǎn)化為scFv分子，所述分子將折疊成與抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基本上相似的三維結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,091,513，5,132,405和4,956,778。
抗體可以是非人抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，后者包括人抗體序列和非人抗體序列。如本領(lǐng)域已知，嵌合抗體是通過(guò)交換非人抗體恒定區(qū)(重鏈、輕鏈或兩者)和人抗體恒定區(qū)制備的。參見(jiàn)，例如，授予Cabilly等人的美國(guó)專利4,816,567。從非人抗體如鼠抗體制備人源化抗體的方法也是公知的(參見(jiàn)，例如，授予Winter的美國(guó)專利5,565,332)。
抗體可以共價(jià)或非共價(jià)地連接于聚合物。如此處所用，“連接”意味著，在生理?xiàng)l件的pH、離子強(qiáng)度和滲透壓下，所述實(shí)體的大多數(shù)平衡地彼此相連。共價(jià)連接可以通過(guò)多種化學(xué)交聯(lián)劑中的任意交聯(lián)劑形成，包括例如，同型雙功能交聯(lián)劑或異型雙功能交聯(lián)劑，其中的許多是可以經(jīng)商業(yè)途徑得到的(參見(jiàn)，例如，PierceChemical Co.或Sigma Chemical Co.)。交聯(lián)可以通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的許多化學(xué)術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括例如，活化的聚乙二醇、醛、異氰酸鹽、馬來(lái)酰亞胺和類似物。從抗體制備二聚體和多聚體的進(jìn)一步描述提供在實(shí)施例中。
可以用重組表達(dá)方法，如本領(lǐng)域熟知的例如在原核或真核細(xì)胞中的重組表達(dá)方法制備抗體(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,116,943和6,331,415)。一般而言，可以將編碼抗體的核酸克隆入表達(dá)載體，用于高產(chǎn)量地表達(dá)編碼產(chǎn)物。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表達(dá)載體包含表達(dá)序列盒，編碼抗體的核酸被克隆入所述序列盒，與啟動(dòng)子和任選地增強(qiáng)子可操作地相連。表達(dá)序列盒也可以包含其它特征，如復(fù)制起點(diǎn)和/或染色體整合元件如反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs或腺相關(guān)病毒(AAV)ITRs。如果需要抗體分泌，則可以將編碼信號(hào)序列的DNA放在編碼成熟抗體氨基酸的核酸上游。可以將編碼用于協(xié)助隨后的純化(例如，組氨酸標(biāo)簽)或協(xié)助標(biāo)記抗體的、短的蛋白質(zhì)序列的DNA包含在抗體編碼核酸中或抗體編碼核酸的末端。
適于復(fù)制和支持抗體重組表達(dá)的細(xì)胞是本領(lǐng)域中熟知的?？梢杂锰囟ǖ谋磉_(dá)載體適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)這種細(xì)胞，并且可以使大量的含載體細(xì)胞生長(zhǎng)，用于接種大規(guī)模發(fā)酵罐，得到臨床應(yīng)用的足夠量的蛋白質(zhì)。這樣的細(xì)胞可以包含原核微生物如大腸桿菌，或多種其它真核細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、昆蟲(chóng)細(xì)胞，或類似細(xì)胞。在這些系統(tǒng)中表達(dá)外源基因的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
可以將本發(fā)明的癌癥治療劑用于在遭受癌癥的個(gè)體中的癌癥治療。因此，本發(fā)明的另一方面是降低個(gè)體中的腫瘤大小或減緩個(gè)體中腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括給予有效量的本發(fā)明組合物，其中所述癌癥治療劑定位于個(gè)體中的癌細(xì)胞。本發(fā)明的又一方面是降低或抑制遭受癌癥的個(gè)體中的轉(zhuǎn)移進(jìn)展的方法，包括給予有效量的本發(fā)明組合物，其中所述癌癥治療劑定位于個(gè)體中的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞。
可以通過(guò)耗盡或失活個(gè)體中的免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞，增加應(yīng)用本發(fā)明癌癥治療劑的治療有效性。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞”是指，直接或間接起作用，以抑制宿主對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的T細(xì)胞群。免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞可以是CD4+，CD25+，或這兩種標(biāo)志物均是陽(yáng)性。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“耗盡或失活(depleting or inactivating)”是指有效降低免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)抑制的方法。這樣的方法可以從個(gè)體去除(耗盡)細(xì)胞，或可以使細(xì)胞功能失活，所述的細(xì)胞功能導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答的抑制。耗盡或失活免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法無(wú)需僅限于此類細(xì)胞，而是可以作用于其它類型的免疫細(xì)胞。
免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞通過(guò)本領(lǐng)域熟知的多種方法中的任意方法被耗盡或失活。例如，可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或通過(guò)采用例如裝填有抗體的柱子或過(guò)濾器的免疫吸附細(xì)胞去除，將這樣的細(xì)胞從個(gè)體的循環(huán)中去除。這樣的柱子或過(guò)濾器含有特異于CD4抗原的抗體和/或特異于IL-2受體(例如CD25)的抗體。耗盡或失活免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞也可以通過(guò)給予個(gè)體抗CD4和/或抗CD25特異性抗體來(lái)實(shí)施?？梢杂靡环N或多種抗體，優(yōu)選地是人抗體或人源化抗體。例如，可以應(yīng)用與IL-2受體(CD25)的α亞基結(jié)合的人源化單克隆抗體Daclizumab或巴利昔單抗(basiliximab)(嵌合抗體)(均來(lái)自Novartis Pharma AG)。完全的人抗體HuMax-CD4，由GenMab制備?？笴D40配體也可以被用來(lái)耗盡或失活免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞。
耗盡或失活免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞的處理可以被重復(fù)。而且，不同的方法可以一起使用(免疫吸附細(xì)胞去除和體內(nèi)抗體給予)。為了耗盡或失活而被給予的抗T細(xì)胞抗體的量可以和移植領(lǐng)域中應(yīng)用的量類似。參見(jiàn)，例如，Meiser等人，Transplantation.(1994)27；58(4)419-23。
免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞可以在給予本發(fā)明的癌癥治療劑之前、期間和/或之后被耗盡或失活。免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞優(yōu)選地在給予本發(fā)明的癌癥治療劑之前被耗盡。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明用于癌癥治療的方法可以包括免疫細(xì)胞的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移，用以增強(qiáng)抗腫瘤免疫。這些方法優(yōu)選T細(xì)胞，其可以被離體活化，用以增強(qiáng)它們支持抗腫瘤免疫應(yīng)答作用的能力。被過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞可以用多種熟知試劑中的任意試劑被離體活化，包括，例如，暴露于IL-2和/或抗CD3抗體。離體活化也可以包含暴露于癌細(xì)胞疫苗。這樣的癌細(xì)胞疫苗可以是活的(但不復(fù)制)或被殺死的癌細(xì)胞，它們來(lái)自待治療的個(gè)體或完全來(lái)自其它癌癥。疫苗也可以是癌細(xì)胞提取物或來(lái)自癌細(xì)胞的純化的疫苗制備物。癌細(xì)胞疫苗是本領(lǐng)域熟知的，并且可以根據(jù)熟知的方法制備。
被過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞可以在給予本發(fā)明的癌癥靶向劑組合物之前、期間和/或之后被給予。被過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞優(yōu)選地在給予本發(fā)明的癌癥靶向劑組合物之后被給予。在這種治療形式中，患者接受多次T細(xì)胞輸注，所述T細(xì)胞是經(jīng)IL-2(62)或其它試劑如抗CD3+和抗CD28+抗體(63)離體刺激之后得到的。
在一些實(shí)施方案中，通過(guò)結(jié)合耗盡或失活免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞的方法和過(guò)繼性轉(zhuǎn)移免疫細(xì)胞的方法，可以使應(yīng)用本發(fā)明癌癥治療劑的療法的有效性得以增加。在這樣的實(shí)施方案中，有利的是，在耗盡或失活免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞的步驟之后進(jìn)行過(guò)繼性轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的癌癥治療劑可以以用藥學(xué)上可接受的載體配制的藥物或藥劑給予。因此，化合物可以用于藥劑或藥物組合物的配制。本發(fā)明的藥物組合物可以被配制為溶液或凍干粉末，用于腸道外給予?？梢酝ㄟ^(guò)在使用之前加入合適的稀釋劑或其它藥學(xué)上可接受的載體，對(duì)粉末進(jìn)行重構(gòu)。液體制劑可以是緩沖的、等張的水溶液。粉末也可以以干燥形式被噴霧。合適稀釋劑的例子是普通等張鹽溶液，標(biāo)準(zhǔn)的5％葡萄糖水溶液，或緩沖醋酸鈉或醋酸銨溶液。這樣的制劑特別適于腸道外給予，但也可以用于經(jīng)口給予或包含在計(jì)量吸入器或噴霧器中用于吸入?？赡苄枰尤胭x形劑如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯樹(shù)膠、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉、檸檬酸鈉和類似物。
可選地，化合物可以被包囊、壓片或制備于乳劑或糖漿中，用于經(jīng)口給予?？梢约尤胨帉W(xué)上可接受的固體或液體載體，以增強(qiáng)或穩(wěn)定組合物，或協(xié)助組合物的制備。固體載體包含淀粉、乳糖、二水合硫酸鈣、白土、硬脂酸鎂或硬脂酸、云母、果膠、阿拉伯樹(shù)膠、瓊脂或明膠。液體載體包含糖漿、花生油、橄欖油、鹽水和水。載體也可以包含緩釋物質(zhì)如單獨(dú)應(yīng)用或帶有蠟的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固體載體的量是變化的，但是優(yōu)選地，將為每劑量單位約20mg至約1g。藥物制備物按照制藥學(xué)常規(guī)技術(shù)制備，對(duì)于片劑形式，在需要時(shí)，涉及研磨、混合、顆?；蛪嚎s；或?qū)τ谟裁髂z膠囊形式，涉及研磨、混合和裝填。應(yīng)用液體載體時(shí)，制備物可以是糖漿、酏劑、乳劑或含水或非含水懸浮液。對(duì)于直腸給予，本發(fā)明的化合物可以和賦形劑如可可脂、甘油、明膠或聚乙二醇結(jié)合并模塑為栓劑。
可以將本發(fā)明的化合物配制為，包含其它醫(yī)學(xué)上有用的藥物或生物試劑?；衔镆部梢院陀糜诒景l(fā)明化合物所涉及的疾病或狀態(tài)的其它藥物或生物試劑的給予聯(lián)合應(yīng)用。例如，本發(fā)明的癌癥治療劑可以和其它凋亡誘導(dǎo)劑如放射線或化療劑(例如，阿霉素；參見(jiàn)美國(guó)專利6,090,365)聯(lián)合。
如此處所用，短語(yǔ)“有效量”是指提供足以對(duì)其接受者施加有益效果的足夠高濃度的劑量。對(duì)于任何特定對(duì)象而言，具體的治療有效劑量水平將取決于多種因素，包含被治療的疾病、疾病的嚴(yán)重程度、具體化合物的活性、給予路徑、化合物的清除率、治療的持續(xù)時(shí)間、與化合物聯(lián)合應(yīng)用或同時(shí)應(yīng)用的藥物、對(duì)象的年齡、體重、性別、飲食，和對(duì)象的一般健康狀態(tài)，和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及醫(yī)學(xué)科學(xué)中熟知的類似因素。在確定“治療有效量”中被考慮的各種一般事項(xiàng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，在例如Gilman等，eds.，Goodman And Gilman′sThe PharmacologicalBases of Therapeutics，8th ed.，Pergamon Press，1990；和Remington′s PharmaceuticalSciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990中有描述。劑量水平典型地落入約0.001至100mg/kg/日的范圍；通常應(yīng)用的水平是約0.05至10mg/kg日范圍?；衔锟梢员荒c道外給予，如血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或類似地給予。給予也可以是經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸、經(jīng)皮或通過(guò)氣霧劑吸入。化合物也可以作為丸劑給予，或緩慢輸注。
可以通過(guò)確定IC50從細(xì)胞培養(yǎng)物試驗(yàn)初步估計(jì)治療有效劑量。隨后，可以在動(dòng)物模型中配制劑量，用以達(dá)到一定的循環(huán)血漿濃度范圍，所述范圍包含如在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的IC50。可以用此類信息更加精確地確定人類中的有用劑量。血漿中的水平可以，例如，通過(guò)HPLC測(cè)定。確切制劑、給予路徑和劑量可以由各醫(yī)生根據(jù)患者的狀態(tài)進(jìn)行選擇。
下列實(shí)施例用來(lái)解釋本發(fā)明。這些實(shí)施例不意圖于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例 實(shí)施例1材料和方法 1.試劑 分子生物學(xué)試劑購(gòu)自New England BioLabs(Beverly，MA)或BoehringerMannheim(Indianapolis，IN)。免疫學(xué)試劑和交聯(lián)劑購(gòu)自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO)或Pierce Biotechnology(Rockford，IL)。已表征和透析(diaylyzed)的胎牛血清購(gòu)自Hyclone Laboratories(Logan，Utah)。碘-125和碘-131獲自DuPont/New England Nuclear(North Billerica，MA)。BALB/c鼠和無(wú)胸腺裸鼠購(gòu)自Harlan Sprague Dawley(San Diego，CA)。
2.抗體和細(xì)胞系 嵌合抗-HLA-Dr MAb(chLym-1)如上所述根據(jù)已公開(kāi)的結(jié)果制備(41)。IDEC Pharmaceuticals(San Diego，CA)開(kāi)發(fā)的嵌合抗-CD20 MAb(利妥昔單抗)獲自藥店。用于超交聯(lián)試驗(yàn)的羊抗人IgG(Fc特異性)購(gòu)自Caltag laboratories(Burlingame，CA)；用于免疫熒光顯微術(shù)研究的異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的羊抗鼠F(ab′)2購(gòu)自ICN-Cappel(Aurora，OH)，用于測(cè)定CD20表達(dá)的藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗-CD20抗體購(gòu)自BD Pharmingen(San Diego，CA)。
Raji細(xì)胞系(42)和其它北美和非洲伯基特淋巴瘤細(xì)胞系(B35M，DG-75，RAMOS，Chevallier)獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)(Rockville，MD)。Farage、Granda 519和L540淋巴瘤以及霍奇金病細(xì)胞系獲自DSMZ德國(guó)保藏中心(Braunschweig，Germany)。SU-DHL-4、SU-DHL-6、SU-DHL-10、SU-DHL-16和NU-DHL-1人B淋巴瘤細(xì)胞系如以前所述被開(kāi)發(fā)(43、44)。所有細(xì)胞系在RPMI 1640(Life Technologies，San Diego，CA)中生長(zhǎng)，RPMI1640中補(bǔ)充有10％特征胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logan，Utah)、1％谷氨酰胺和青霉素(100單位/mL)以及鏈霉素(100μg/mL)(Gemini Bio-Products，Woodland，CA，USA)抗生素，并且在潮濕的5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃，作為靜止懸浮培養(yǎng)物被培養(yǎng)。
3.抗體超交聯(lián) 將Raji細(xì)胞(2.5×104)在V-底96孔板中，在5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃溫育，96孔板中含有系列稀釋的Lym-1、chLym-1、利妥昔單抗或其它抗體。隨后用RPMI1640洗滌細(xì)胞2次，并將細(xì)胞分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。隨后將試驗(yàn)組細(xì)胞與25ug/ml羊抗人(GAH)IgG(對(duì)于嵌合Lym-1和利妥昔單抗MAbs)或羊抗鼠(GAM)IgG(對(duì)于鼠Lym-1)溫育，體積是100μl/孔。18小時(shí)之后，用膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI染色，如下所述地測(cè)定凋亡細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露情況。
4.利用免疫熒光顯微術(shù)進(jìn)行的交聯(lián)分析 通過(guò)免疫熒光顯微術(shù)觀察用不同抗體制備物處理的細(xì)胞表面上的抗原交聯(lián)程度和型式。對(duì)于這些研究，用每一抗體制備物20μg在37℃處理5×105Raji細(xì)胞，用稀釋于PBS中的2％多聚甲醛(Polysciencs，Inc.Warrington，PA；Cat.No.4018)室溫固定，隨后用PBS(1％BSA)洗滌2次。隨后用25μg GAM F(ab′)2(ICN-Cappel)溫育被固定的細(xì)胞，4℃ 30分鐘，隨后用PBS(1％BSA)洗滌2次。對(duì)于二抗羊抗鼠IgG F(ab′)2的超交聯(lián)研究，用20μg利妥昔單抗在37℃處理5×105Raji細(xì)胞1小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞2次，并與25μg GAM F(ab′)2溫育，4℃ 30分鐘。隨后用PBS(1％BSA)洗滌細(xì)胞2次，隨后用2％多聚甲醛在室溫固定細(xì)胞。然后用PBS洗滌細(xì)胞2次。最后，1,250×g 10分鐘，制備細(xì)胞旋轉(zhuǎn)沉降物(cytospin preparation)，將玻片在Vectorshield中用4′，6′-二氨基-2-吲哚苯(DAPI，Vector Laboratories，Burlingame，CA)固定，用于在相差熒光顯微鏡(Leitz Orthoplan，Wetzlar，Germany)下，用50×水浸透鏡進(jìn)行觀察。
5.胱天蛋白酶(caspase)3活性分析
使偶聯(lián)有2μg的利妥昔單抗單體、二聚體、聚合物以及利妥昔單抗和同種型對(duì)照抗體的Dynabeads與5×104Raji細(xì)胞溫育。5小時(shí)和24小時(shí)之后，用PBS洗滌細(xì)胞，在40μl的產(chǎn)熒光蛋白酶底物Phiphilux(OncoImmunin Inc.，MD)中重懸浮，并在30℃的水浴中溫育40分鐘。最后，將細(xì)胞重懸浮于制造商提供的培養(yǎng)基中，并立即用流式細(xì)胞術(shù)分析。
6.通過(guò)使用多功能交聯(lián)劑制備多聚體
多功能交聯(lián)劑是能夠形成多聚聚集體的水溶性試劑(表1)。交聯(lián)劑諸如戊二醛(45、46)、葡聚糖(47-49)和/或聚酰胺型胺類(PAPAM)樹(shù)枝狀聚合物(50-54)可以被用來(lái)制造Mabs的聚合物。
A.戊二醛是五碳二醛，作為交聯(lián)劑用于多種蛋白質(zhì)用途中?？贵w的親核基團(tuán)如巰基和氨基在一步反應(yīng)中被共價(jià)地加在醛基上，形成希夫堿(Schiff base)。簡(jiǎn)言之，使抗體(利妥昔單抗，1ml)在暗處以5mg/ml的濃度用200ml 8％戊二醛進(jìn)行透析，其中戊二醛溶于PBS(0.01M磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)，4℃透析16小時(shí)。隨后使活化的抗體用PBS(1L PBS，2次，持續(xù)幾小時(shí))進(jìn)行透析，以去除過(guò)量的戊二醛。剩下的活性戊二醛基團(tuán)在2小時(shí)溫育期間被0.2M賴氨酸-HCl(0.1ml)封閉。過(guò)量的賴氨酸通過(guò)用PBS透析而被去除。隨后，將交聯(lián)的偶聯(lián)物無(wú)菌過(guò)濾并進(jìn)一步進(jìn)行SDS-PAGE分析。
B.葡聚糖是平均分子量1至500k的葡萄糖聚合物。葡聚糖的鄰位羥基可以被氧化為醛基，隨后與氨基反應(yīng)形成希夫堿。
方法1多醛活化的葡聚糖(1∶1利妥昔單抗∶氧化葡聚糖)。葡聚糖與抗體的結(jié)合如以前所述通過(guò)應(yīng)用多醛活化的葡聚糖實(shí)施(47)。這可以成功地作為多功能交聯(lián)劑并與MAbs的伯胺反應(yīng)，形成希夫堿，希夫堿可以通過(guò)用硼氫化鈉還原進(jìn)一步得以穩(wěn)定。簡(jiǎn)言之，使葡聚糖(100mg，平均分子量6,000，F(xiàn)luka)和高碘酸鈉(120mg，Sigma-Aldrich)溶解在5ml的0.9％NaCl溶液中。暗處溫育過(guò)夜之后，使化合物通過(guò)預(yù)平衡的PD-10柱(Pharmacia)并用0.9％NaCl洗脫。純化的氧化葡聚糖于4℃保存，該混合物在暗處4℃可穩(wěn)定2周。同時(shí)，使1ml的純化利妥昔單抗(10mg/ml)通過(guò)預(yù)平衡的PD-10柱并用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.1)洗脫。用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.1)將洗脫的利妥昔單抗稀釋為4.2mg/ml，隨后與氧化葡聚糖混合，二者的摩爾比是1∶1。在暗處連續(xù)振蕩4小時(shí)后，用5mg硼氫化鈉(Sigma)還原反應(yīng)物1小時(shí)。最后，使1ml的葡聚糖-利妥昔單抗偶聯(lián)物通過(guò)預(yù)平衡的PD-10柱。根據(jù)抗體濃度，用UV-分光光度計(jì)測(cè)定此偶聯(lián)物的OD值。隨后，經(jīng)非還原SDS PAGE測(cè)定交聯(lián)效率。
方法2多醛活化的抗體。共價(jià)結(jié)合的一種不同方法利用了抗體的糖部分。這是在兩步反應(yīng)中，通過(guò)將葡聚糖-肼復(fù)合體偶聯(lián)于多醛活化的MAbs而實(shí)施的。簡(jiǎn)言之，將純化的多醛活化的葡萄糖(如上)與0.09g肼單鹽酸鹽混合并于室溫在暗處溫育30分鐘。將葡聚糖-肼衍生物和三甲胺硼烷復(fù)合物(TMAB，5mg)混合并在室溫下再溫育2小時(shí)。最后，使葡聚糖-肼衍生物通過(guò)預(yù)平衡的PD-10柱，該柱是用0.1M NaAc pH 5.5平衡。多醛活化的利妥昔單抗通過(guò)混合300μl的純化利妥昔單抗(10mg/ml)和1ml pH 7.5PBS中的高碘酸鈉(126mg)生成。室溫下連續(xù)振蕩90分鐘后，在PD-10柱上純化氧化的RITUXAMAB(7.14mg/ml，在PBS中)并與葡聚糖-肼復(fù)合體(82μl)在暗處室溫下混合18小時(shí)。用0.1M甘氨酸pH7.5(300μl)在2小時(shí)溫育期間封閉剩余的活化基團(tuán)。通過(guò)用PBS透析去除過(guò)量的甘氨酸，并將交聯(lián)的偶聯(lián)物無(wú)菌過(guò)濾，進(jìn)一步用SDS-PAGE進(jìn)行分析。
C.PAPAM是一類新的高度分支的球形聚合物，它是高度水溶性的并且具有大量的表面伯胺基團(tuán)(50-54)。PAPAM樹(shù)枝狀聚合物與抗體的偶聯(lián)是通過(guò)應(yīng)用不同代的樹(shù)枝狀聚合物實(shí)施的，可以在兩步反應(yīng)過(guò)程中成功制備。簡(jiǎn)言之，在表面擁有8至64個(gè)活性氨基的多代樹(shù)枝狀聚合物(G1至G4)(平均分子量是1.7至14.5k)被溶解在PBS中并與雜型雙功能交聯(lián)劑混合。將得到的聚合物偶聯(lián)物透析過(guò)夜，在Sephadex G-25上色譜純化，經(jīng)SDS/PAGE和HPLC分析，并進(jìn)一步表征以確定每一樹(shù)枝狀聚合物分子上的抗體分子數(shù)目。
表1.選擇的多功能交聯(lián)劑
7.單體和交聯(lián)制備物的體外評(píng)價(jià)
A.凋亡分析
i.膜聯(lián)蛋白V，PI染色。通過(guò)膜聯(lián)蛋白V，PI染色試驗(yàn)測(cè)定抗體偶聯(lián)物誘導(dǎo)的凋亡百分?jǐn)?shù)，該試驗(yàn)允許直接測(cè)定凋亡細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露情況和膜完整性的喪失。將系列稀釋(約2μg)的Lym-1、chLym-1和利妥昔單抗或包被了利妥昔單抗的Dynabeads(下文論述)加入到2.5×104Raji細(xì)胞，隨后37℃溫育18小時(shí)。為了超交聯(lián)，使200μl培養(yǎng)基中的5×104Raji細(xì)胞與2μg利妥昔單抗在37℃溫育1小時(shí)，隨后用PBS(1％BSA)洗滌細(xì)胞2次并與5μg GAH(Caltag)在37℃在5％CO2培養(yǎng)箱中溫育18小時(shí)。用制造商(Oncogene Research Product，Boston，MA，USA)提供的RAPID方案進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色。簡(jiǎn)言之，將培養(yǎng)基結(jié)合試劑加入細(xì)胞，隨后與FITC-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V溫育15分鐘。隨后將細(xì)胞懸浮在1x結(jié)合緩沖液中，在用流式細(xì)胞術(shù)(FACS-diva，Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)進(jìn)行樣品分析之前即刻，加入碘化丙啶(PI)，以區(qū)分早期(膜聯(lián)蛋白V+/PI-)和晚期(膜聯(lián)蛋白V+/PI+)凋亡細(xì)胞。
ii.TUNEL試驗(yàn)。此試驗(yàn)是用APO-DIRECT試劑盒(Phoenix Flow Systems，San Diego，CA，USA)進(jìn)行，以測(cè)定不同抗體制備物誘導(dǎo)的凋亡性DNA鏈斷裂。簡(jiǎn)言之，使5×105至1×106個(gè)Raji細(xì)胞與667ng/ml至66.7μg/ml的每種MAb于37℃在5％CO2培養(yǎng)箱中溫育18小時(shí)。為了超交聯(lián)研究，使5×105個(gè)Raji細(xì)胞與20μg利妥昔單抗在1.5mL中37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞2次并進(jìn)一步用50μgGAH(Caltag)在1.5mL中37℃在5％CO2培養(yǎng)箱中溫育18小時(shí)。將細(xì)胞在PBS中洗滌，在1％多聚甲醛中固定，在70％乙醇中進(jìn)行滲透性處理。將細(xì)胞在70％乙醇中于-20℃保存過(guò)夜。用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)將溴脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(BrdU)偶聯(lián)于DNA鏈斷裂處，隨后用熒光素標(biāo)記的抗-BrdU抗體對(duì)凋亡細(xì)胞染色，以便用于FACS分析。細(xì)胞中的總DNA通過(guò)用PI/RNase復(fù)染測(cè)定。對(duì)于每一樣品，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)10,000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。
8.CD20和HLA-Dr抗原表達(dá)的評(píng)價(jià)
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法，CD20和HLA-DR10抗原陽(yáng)性的幾種不同的人惡性淋巴瘤(Raji、RAMOS、DG-75、Farage、Granda 519、Chevallier、SU-DHL-4、SU-DHL-10、SU-DHL-16)和霍奇金病細(xì)胞系(L540)通過(guò)FACs分析被評(píng)價(jià)，以說(shuō)明這些抗原在淋巴瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平。
A.增殖分析。通過(guò)細(xì)胞增殖試驗(yàn)對(duì)所有抗原制備物進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于此試驗(yàn)，Raji細(xì)胞(7.5×104/孔)用67μg/ml的抗體培養(yǎng)，所述Raji細(xì)胞懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基(Life Technologies，Inc.，San Diego，CA)中，培養(yǎng)基中含有10％特征胎牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，UT)。應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，用臺(tái)盼蘭染料排斥法，在不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖。對(duì)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的四個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)并將其平均，得到數(shù)據(jù)點(diǎn)。
B.親和常數(shù)(Avidity Constants)的測(cè)定。采用以前描述的修定過(guò)的氯胺-T方法，用125I對(duì)純化的MAb制備物進(jìn)行放射性標(biāo)記(56)。通過(guò)傳統(tǒng)的固定Raji細(xì)胞放射免疫分析對(duì)放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的體外免疫反應(yīng)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)(55)。簡(jiǎn)言之，使每毫升含有106個(gè)細(xì)胞的Raji淋巴瘤細(xì)胞懸浮液與200μl PBS中的10至110ng的125I標(biāo)記抗體在室溫下溫育，同時(shí)持續(xù)混合。隨后用含1％牛血清白蛋白的PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的抗體，并用γ計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。隨后通過(guò)每管中剩余的細(xì)胞結(jié)合的放射活性(cpm)和放射性標(biāo)記抗體的比活性(cpm/ng)確定結(jié)合的抗體的量。用斯卡查德作圖分析(Scatchard plot analysis)得到斜率。用公式K＝-(斜率/n)計(jì)算平衡常數(shù)或親和常數(shù)Ka，其中n是抗體的價(jià)數(shù)(對(duì)于單體，n＝2；對(duì)于二聚體，n＝4；對(duì)于聚合物，n＝10)。
C.體外穩(wěn)定性。也如以前所述評(píng)價(jià)體外血清穩(wěn)定性(56)。簡(jiǎn)言之，使放射標(biāo)記的制備物在鼠和/或人血清中于37℃溫育48小時(shí)。三氯乙酸沉淀和離心之后，用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定蛋白結(jié)合的放射活性，目的是計(jì)算完整融和蛋白的百分?jǐn)?shù)。此外，如上所述對(duì)血清溫育之前和之后的放射性標(biāo)記MAbs的體外免疫反應(yīng)活性進(jìn)行測(cè)定。
9.交聯(lián)制備物的體內(nèi)評(píng)價(jià)
研究了能夠在體外誘導(dǎo)有效凋亡的那些制備物的體內(nèi)生物學(xué)活性，以確定它們的藥物動(dòng)力學(xué)清除率和生物分布。此外，研究了每一試劑在帶有Raji人淋巴瘤的裸鼠中的抗腫瘤活性，通過(guò)評(píng)價(jià)它們對(duì)腫瘤生長(zhǎng)(腫瘤大小，存活時(shí)間)和形態(tài)學(xué)的影響來(lái)實(shí)施。
A.藥物動(dòng)力學(xué)研究。用以前描述的修改過(guò)的氯胺-T方法制備125/131I-標(biāo)記的蛋白質(zhì)(41、56)。用6周齡BALB/c鼠來(lái)測(cè)定所有制備物的全身藥物動(dòng)力學(xué)清除(whole-body pharmacokinetic clearance)。將125I-標(biāo)記的蛋白質(zhì)(30-40μCi/小鼠)靜脈注射給予幾組小鼠(n＝5)，所述小鼠事先在飲水中給予碘化鉀1周，以封閉甲狀腺對(duì)放射性碘的攝取。用CRC-7 microdosimeter(Capintec，Inc.，Pittsburgh，PA)測(cè)定注射后即刻以及其后選擇的時(shí)間的全身活性。數(shù)據(jù)被分析，半衰期值如以前所述地被確定(41、57、58)。
B.生物分布研究。在帶有Raji腫瘤的裸鼠中進(jìn)行組織生物分布研究，以檢測(cè)選擇的每一制備的靶向能力。為了這些研究，用來(lái)自銫源的350拉德照射6周齡雌性無(wú)胸腺裸鼠，三日后，在左側(cè)腹皮下注射含有1×107Raji淋巴瘤細(xì)胞和1×106人胚胎成纖維飼細(xì)胞的0.2ml接種物。先前的照射對(duì)于減少裸鼠中存在的天然殺傷細(xì)胞是有必要的。人胚胎成纖維飼細(xì)胞提供VEGF和其它生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子促進(jìn)高腫瘤發(fā)生率(90％)。使腫瘤生長(zhǎng)10-15日，直至它們的直徑達(dá)到0.5cm。在每一組中(n＝5)，將含有30-40μCi的125I-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的0.1ml接種物靜脈注射給每只小鼠。在注射后3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(24、48和72小時(shí))，用過(guò)量戊巴比妥鈉處死動(dòng)物，移去組織，稱重，用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量。對(duì)每只小鼠，將數(shù)據(jù)表示為注射劑量/克數(shù)百分比(％ID/g)和腫瘤/器官比值(每克腫瘤的cpm/每克器官的cpm)。用魏克森秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon′s rank-sum test)測(cè)定顯著性水平。
C.療效研究對(duì)于這些研究，將選擇的制備物的抗腫瘤活性與未偶聯(lián)的Lym-1和RITUXAN的抗腫瘤活性相比較，以幫助評(píng)價(jià)哪種偶聯(lián)制備物在Raji淋巴瘤/裸鼠模型中最為有效。對(duì)于每一制備物，隔日給予幾組小鼠(n＝5)0.1ml的兩種劑量接種物(25和100μg)，給予3次，通過(guò)測(cè)徑器在三個(gè)尺度上的測(cè)量進(jìn)行腫瘤體積監(jiān)測(cè)，每周3次。測(cè)定相對(duì)于未處理的對(duì)照的腫瘤生長(zhǎng)的消退或抑制情況，用以說(shuō)明治療的效率。所有劑量都是同一技術(shù)人員給予的，以保持一致性。記錄動(dòng)物存活時(shí)間，并根據(jù)已建立的University Vivarium方案，將具有大于2cm直徑的腫瘤的那些鼠處死。用魏克森秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到P值。
實(shí)施例2結(jié)果
1.通過(guò)FACs得到的人惡性淋巴瘤細(xì)胞系上的CD20表達(dá)水平
用FACs分析霍奇金或非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系的CD20表達(dá)。這些研究的結(jié)果顯示在圖1A-1K中。具有均一高表達(dá)的細(xì)胞系包括Raji、Farage、SU-DHL-4、SU-DHL-16、Chevallier和Granda 519。發(fā)現(xiàn)RAMOS、DG75和SU-DHL-10具有兩種形式的表達(dá)水平，L540霍奇金氏病細(xì)胞系的CD20表達(dá)是陰性的。
2.抗-HLA-DR Lym-1對(duì)Raji淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響
將Raji細(xì)胞(7.5×104/孔)在存在67μg/ml的Lym-1或陰性對(duì)照IgG(chTV-1)的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，Raji細(xì)胞懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中(Life Technologies，Inc.，San Diego，CA)，培養(yǎng)基中含有10％特征胎牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，UT)。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖，通過(guò)臺(tái)盼蘭染料排斥確定細(xì)胞存活。在第3天時(shí)更新培養(yǎng)基和抗體。如圖2所示，與對(duì)照抗體相比較，發(fā)現(xiàn)Lym-1抑制Raji細(xì)胞增殖。
3.有和沒(méi)有超交聯(lián)時(shí)Lym-1和利妥昔單抗對(duì)Raji細(xì)胞的凋亡影響
A.膜聯(lián)蛋白V/PI染色。用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI復(fù)染分析每一MAb誘導(dǎo)凋亡的能力，所述分析分別檢測(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)在凋亡細(xì)胞上的暴露情況和細(xì)胞膜完整性的喪失。如圖3A-3G所示，Lym-1能夠以劑量依賴方式誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡(使用單劑量時(shí)呈現(xiàn)出的數(shù)據(jù))。在這些試驗(yàn)中，利妥昔單抗對(duì)凋亡的誘導(dǎo)幾乎沒(méi)有影響。然而，利妥昔單抗的超交聯(lián)顯著改進(jìn)了其誘導(dǎo)Rai細(xì)胞凋亡的能力，如圖3所示。用對(duì)照IgG染色的Raji細(xì)胞被顯示以進(jìn)行比較。
B.TUNEL試驗(yàn)。如圖4A-4C所示，TUNEL試驗(yàn)的FACs分析顯示出由Lym-1誘導(dǎo)的廣泛凋亡，但利妥昔單抗和chTv-1沒(méi)有誘導(dǎo)廣泛調(diào)亡。
4.聚合物結(jié)合的抗體對(duì)凋亡的誘導(dǎo)
RITUXAN和Lym-1被結(jié)合于葡聚糖，葡聚糖是一種可溶的、多分支的、剛性聚合物。對(duì)于這些研究，將葡聚糖(200mg，平均分子量是10,000 Sigma-Aldrich)和高碘酸鈉(240mg，Sigma，Aldrich)溶解在10ml的0.9％NaCl溶液中。暗處溫育過(guò)夜后，使混合物通過(guò)預(yù)平衡PD-10柱(Pharmacia)并用0.9％ NaCl洗脫。將純化的氧化葡聚糖于暗處4℃保存。同時(shí)，用碳酸氫鈉緩沖液(0.1M，pH 8.1)透析100μlLym-1(23.6mg/ml)、利妥昔單抗(10mg/ml)和無(wú)關(guān)的IgG(chTV-1，11.8mg/ml)過(guò)夜。將透析的Lym-1、利妥昔單抗和chTV-1與氧化葡聚糖以不同摩爾比混合(1∶1和1∶2)。暗處連續(xù)振蕩6小時(shí)后，用含有5mg硼氫化鈉(Sigma)的PBS還原反應(yīng)物。最后，用PBS透析每一葡聚糖-抗體偶聯(lián)物過(guò)夜。根據(jù)抗體的濃度測(cè)定每一偶聯(lián)物的OD值。隨后通過(guò)非還原SDS凝膠測(cè)定交聯(lián)效率(圖5A-5B)，其顯示，連接于葡聚糖聚合物之后，葡聚糖-Lym-1、葡聚糖-利妥昔單抗和葡聚糖-chTV-1(陰性對(duì)照)的分子量比非偶聯(lián)抗體顯著增加。
使Raji細(xì)胞與增加濃度的試劑在37℃于5％ CO2培養(yǎng)箱中溫育18小時(shí)。隨后用膜聯(lián)蛋白V/PI對(duì)每一樣品進(jìn)行染色，并使每一樣品經(jīng)歷FACs分析，如上所述。對(duì)于單一劑量，這些研究的結(jié)果顯示在下面的圖6中。用1∶1的偶聯(lián)比例，用667ng/ml濃度的葡聚糖-Lym-1，得到73％的凋亡。這些結(jié)果和圖3D-3F中所看到的用非偶聯(lián)的鼠Lym-1獲得的凋亡水平大致相同。特別地，當(dāng)濃度增加至6.7μg/ml時(shí)，得到100％凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。與之不同，葡聚糖-利妥昔單抗制備物顯示出對(duì)凋亡誘導(dǎo)的顯著改進(jìn)，從非偶聯(lián)利妥昔單抗(667ng/ml)的約13％至相同濃度的葡聚糖-利妥昔單抗的約30％(偶聯(lián)的比例是1∶2)。當(dāng)應(yīng)用更高濃度的葡聚糖-利妥昔單抗時(shí)(6.7μg/ml)，凋亡的誘導(dǎo)增加至52％。在這些試驗(yàn)中，葡聚糖-chTV-1陰性對(duì)照不誘導(dǎo)任何顯著水平的凋亡，這說(shuō)明這種現(xiàn)象是抗體相關(guān)的。這些結(jié)果說(shuō)明，結(jié)合于多分支剛性聚合物如葡聚糖的抗-CD20可以直接誘導(dǎo)凋亡。因此，聚合物/抗體偶聯(lián)物可以模仿通過(guò)加入對(duì)于抗-CD20誘導(dǎo)調(diào)亡為必需的第二GAM所產(chǎn)生的交聯(lián)事件。
5.葡聚糖-利妥昔單抗在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布
在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中進(jìn)行生物分布研究，以測(cè)定葡聚糖-利妥昔單抗聚合物靶向腫瘤和跳過(guò)非靶向的正常組織及器官的能力。如圖7A所示，相比相同劑量的單獨(dú)的利妥昔單抗，葡聚糖-利妥昔單抗在腫瘤中顯示出增強(qiáng)的攝取。顯著地，在脾和肺中僅觀察到攝取的輕度增加，這兩個(gè)部位具有活性網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，葡聚糖-利妥昔單抗聚合物在體內(nèi)是藥學(xué)上可行的，并且與非偶聯(lián)利妥昔單抗相比，腫瘤靶向性質(zhì)得到改進(jìn)。盡管不希望受限于任何理論，對(duì)葡聚糖-利妥昔單抗的增強(qiáng)的攝取可能歸因于更長(zhǎng)的血清半衰期，因?yàn)閷?duì)兩種試劑而言，觀察到的腫瘤/正常器官比值大約相同(圖7B)。
6.Lym-1和葡聚糖-Lym-1在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布
也用Lym-1和葡聚糖-Lym-1進(jìn)行了比較性生物分布研究。圖8A-8B中顯示的3日生物分布分析說(shuō)明，兩種試劑的攝取或分布幾乎沒(méi)有差異。
7.葡聚糖-RITUXAMAB在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的治療效應(yīng)的增強(qiáng)
進(jìn)行體內(nèi)研究，以確定葡聚糖-利妥昔單抗對(duì)凋亡誘導(dǎo)的增強(qiáng)是否也對(duì)裸鼠中已確立的異種移植Raji腫瘤產(chǎn)生改進(jìn)的治療效果。如圖9所示，應(yīng)用已述的3次劑量隔日給予的治療方案，在此腫瘤模型中，應(yīng)用葡聚糖-利妥昔單抗，清楚地看到臨床效應(yīng)的劑量依賴性增強(qiáng)。葡聚糖-利妥昔單抗引起的腫瘤減輕比相同蛋白質(zhì)劑量的單體利妥昔單抗更顯著。
8.Lym-1和葡聚糖-Lym-1免疫療法在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的治療效應(yīng)
圖10中顯示的用Lym-1和葡聚糖-Lym-1進(jìn)行的比較性研究證明，基于聚合物的制劑沒(méi)有改進(jìn)此抗體的臨床效應(yīng)，按照例如圖6中看到的體外研究，此抗體已經(jīng)顯示出對(duì)凋亡的明顯誘導(dǎo)。與對(duì)照處理鼠相比，天然Lym-1和聚合物-Lym-1均產(chǎn)生非常有效的腫瘤抑制。
結(jié)合于聚合物的抗-CD20(利妥昔單抗)顯示出對(duì)CD20陽(yáng)性人淋巴瘤細(xì)胞系的早期和晚期凋亡誘導(dǎo)的顯著增強(qiáng)，這類似于用超交聯(lián)方法所看到的結(jié)果。當(dāng)在體內(nèi)測(cè)試時(shí)，這種制劑變化使得抗-CD20能夠在模型中成為有效的試劑，在所述模型中，由于裸鼠的免疫缺陷狀態(tài)，ADCC是忽略的。這些結(jié)果說(shuō)明，如果抗體經(jīng)聚合物配制以多聚體的形式被提供，則凋亡的誘導(dǎo)可以成為經(jīng)CD20的腫瘤殺傷的重要機(jī)制。
實(shí)施例3.用同型雙功能交聯(lián)劑和異型雙功能交聯(lián)劑制備的抗體二聚體
1.同型雙功能交聯(lián)劑。這些交聯(lián)劑有兩個(gè)相同的活性基團(tuán)(表2)并且在一步反應(yīng)過(guò)程中被使用，以結(jié)合2個(gè)MAb分子(Park等，J.Biol.Chem.261205-210，1986；Browning等，J.Immunol.1431859-1867，1989)。同型雙功能交聯(lián)劑包括硫代-EGS和/或硫代-DST，它們用于結(jié)合兩個(gè)MAb分子，而不破壞抗體的S-S鍵并且不應(yīng)用苛刻的還原劑。硫代-DST是水溶性類似物，可用于在一步反應(yīng)中制備同型二聚體。這種交聯(lián)劑通過(guò)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯與MAbs的伯胺基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)酰胺鍵。硫代-EGS是水溶性類似物，能夠在一步反應(yīng)中通過(guò)形成共價(jià)酰胺鍵，經(jīng)伯胺基團(tuán)交聯(lián)MAbs。與DST相比，EGS具有降低空間位阻效應(yīng)的延伸的間隔臂。根據(jù)制造商(Pierce)的指導(dǎo)和根據(jù)以前描述的優(yōu)化方法(Khawli等人，Cancer Biother & Radiopharm.11203-215，1996；Sharifi等人，Q.J.Nucl.Med.42242-249，1998)，將所有的MAbs交聯(lián)起來(lái)。偶聯(lián)之后，將反應(yīng)混合物透析過(guò)夜并在Sephadex G-25上色譜純化。將不同級(jí)分濃縮、過(guò)濾，并進(jìn)一步通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和高壓蛋白色譜(HPLC)進(jìn)行分析，以確定純度和每一接頭的抗體分子數(shù)目。
2.異型雙功能交聯(lián)劑。這些交聯(lián)劑有兩個(gè)不同的活性基團(tuán)，其允許與蛋白質(zhì)的特定基團(tuán)相繼偶聯(lián)(表3)，這使得不需要的聚合和自偶聯(lián)最小化(Samoszuk等人，Antibody，Immunoconj.& Radiopharm.237-45，1989；Duncan等人，Anal.Biochem.13268-73，1983)。兩種異型雙功能交聯(lián)劑如硫代-SMCC和SATP被用于通過(guò)穩(wěn)定的硫醚鍵相繼結(jié)合于兩個(gè)MAbs。二聚體是在兩步反應(yīng)過(guò)程中形成的。a.SATP是可用于將受保護(hù)的SH基團(tuán)引入MAbs的試劑，并且為SH基團(tuán)提供了更大空間自由度。穩(wěn)定的共價(jià)酰胺鍵是根據(jù)制造商(Pierce)的指導(dǎo)由NHS酯和MAbs的伯胺的反應(yīng)形成的。脫保護(hù)以形成SH鍵是通過(guò)使用羥胺的脫乙?；饔猛瓿傻?不應(yīng)用還原劑)。b.硫代-SMCC是水溶性交聯(lián)劑類似物，由NHS酯和用限制空間位阻的間隔臂連接的馬來(lái)酰亞胺基組成。NHS酯與伯胺反應(yīng)，馬來(lái)酰亞胺與SH基團(tuán)反應(yīng)。NHS反應(yīng)首先根據(jù)制造商(Pierce)的指導(dǎo)和根據(jù)以前描述的優(yōu)化方法(Khawli等人，Cancer Biother & Radiopharm.11203-215，1996；Sharifi等人，Q.J.Nucl.Med.42242-249，1998)被實(shí)施，隨后除去過(guò)量的交聯(lián)劑，隨后加入帶有SH基團(tuán)的組分(MAb-SATP)，通過(guò)形成穩(wěn)定的硫醚鍵完成交聯(lián)。
將衍生的MAbs(MAb-SMCC和MAb-SATP)混合在一起并在室溫下溫育2-3小時(shí)。將最終的混合物透析并在Sephadex G-25柱上色譜純化。將不同級(jí)分濃縮、過(guò)濾，并進(jìn)一步通過(guò)SDS/PAGE和HPLC進(jìn)行分析，以確定純度和每一接頭的抗體分子數(shù)目。
實(shí)施例4.通過(guò)使用三功能交聯(lián)劑制備三聚體
三功能交聯(lián)劑是相對(duì)新的形式的偶聯(lián)劑，每一分子具有三個(gè)不同的活性基團(tuán)或配位基團(tuán)(表4)。交聯(lián)劑如硫代-TSAT和TMEA被用來(lái)結(jié)合三個(gè)MAb分子。
1.硫代-TSAT是新的三功能交聯(lián)劑，用于在一步反應(yīng)過(guò)程中制備三聚體。此交聯(lián)劑是水溶性類似物，經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯與MAbs的伯胺基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)酰胺鍵。2.TMEA是三功能交聯(lián)劑，可用于在兩步反應(yīng)中制備含SH蛋白的三聚復(fù)合體。異型雙功能接頭如SATP首先被用于將SH基團(tuán)引入MAb(如上所述)，隨后加入TMEA。交聯(lián)是通過(guò)馬來(lái)酰亞胺(在TMEA上)與SH基團(tuán)反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵而完成。
所有的三聚抗體都是根據(jù)制造商的指導(dǎo)(Pierce)制備的。偶聯(lián)之后，將反應(yīng)混合物透析過(guò)夜并在Sephadex G-25上色譜純化。如上所述將不同級(jí)分濃縮、過(guò)濾，并進(jìn)一步通過(guò)SDS/PAGE和HPLC進(jìn)行分析。
表2同型雙功能交聯(lián)劑(從商業(yè)來(lái)源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)

表3.異型雙功能交聯(lián)劑(從商業(yè)來(lái)源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)



表4.三功能交聯(lián)劑(從商業(yè)來(lái)源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)
實(shí)施例5.包被有利妥昔單抗的DynabeadsM-280的制備
按照制造商的方案，將利妥昔單抗包被在甲苯磺?；罨腄ynabeadsM-280(Dynal Biotech Inc.，Brown Deer，WI)上。簡(jiǎn)言之，用PBS洗滌7×108Dynabeads兩次，與500μl的200μg利妥昔單抗或同種型對(duì)照抗體溫育，同時(shí)持續(xù)旋轉(zhuǎn)，30℃，18-20小時(shí)。隨后用磁珠吸引器(Dynal Biotech Inc.，Brown Deer，WI)使Dynabeads沉積，通過(guò)用UV分光光度計(jì)(Ultraspec 2000，Pharmacia，Piscataway，NJ)測(cè)定280nm處的OD值，對(duì)上清液中的未偶聯(lián)的抗體進(jìn)行定量。偶聯(lián)于Dynabeads的抗體總量通過(guò)公式計(jì)算(總抗體-未偶聯(lián)的抗體＝珠子上的偶聯(lián)抗體)。用PBS和1％(w/v)BSA洗滌包被有抗體的Dynabeads 2次，隨后用端對(duì)端旋轉(zhuǎn)(end-to-end rotation)，用封閉溶液(0.2M Tris-HCl pH 8.5；0.1％BSA)處理自由甲苯磺?；鶊F(tuán)，37℃，3-4小時(shí)，用PBS(0.1％BSA，1％ Tween-20)洗滌兩次，隨后再用PBS(0.1％ BSA)洗滌兩次。最后，將偶聯(lián)有抗體的Dynabeads重懸浮于PBS(0.05％疊氮鈉)中并于4℃保存。使用前通過(guò)洗滌去除疊氮鈉。
實(shí)施例6.葡聚糖-利妥昔單抗聚合物的產(chǎn)生(1∶2.4利妥昔單抗∶氧化葡聚糖) 將100mg葡聚糖(平均分子量是6,000Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)和120mg高碘酸鈉(Sigma，St Louis，MO)溶解在5mL的0.9％NaCl溶液中并于暗處室溫下溫育18h。使混合物通過(guò)預(yù)平衡的PD-10柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，用0.9％NaCl洗脫，于暗處4℃保存。使2mL利妥昔單抗(10mg/mL)通過(guò)預(yù)平衡的PD-10柱并用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.1)(Sigma)洗脫。用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.1)將洗脫的利妥昔單抗稀釋為5mg/1ml，與480μg氧化葡聚糖以摩爾比1∶2.4(利妥昔單抗∶氧化葡聚糖)混合。暗處持續(xù)振蕩6小時(shí)后，用5mg硼氫化鈉(Sigma)還原反應(yīng)物1小時(shí)，隨后在PBS中透析。隨后使透析物通過(guò)0.22μm的非熱源性注射濾器(Costar，Coming，NY)，并應(yīng)用Pharmacia AKTA System(FPLC；(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)使葡聚糖利妥昔單抗混合物通過(guò)在PBS中預(yù)平衡的Superose 6柱，流速為0.5mL/分鐘，從而進(jìn)行分級(jí)分離。一般地，聚合物的駐留時(shí)間是約16分鐘。用Centricon YM-100(Millipore)進(jìn)一步濃縮聚合物級(jí)分，0.22μm過(guò)濾除菌，并通過(guò)SDS/PAGE進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)在非還原條件下通過(guò)SDS/PAGE進(jìn)行分析，濃縮膠是4％，分離膠是5％。通過(guò)考馬斯藍(lán)染色可見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶。
實(shí)施例7.利妥昔單抗同源二聚體的產(chǎn)生
用兩種異型雙功能交聯(lián)劑SATA(N-琥珀酰亞胺基S-乙?；虼?乙酸酯，(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和SMCC[琥珀酰亞胺基4-(馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯](Pierce)產(chǎn)生利妥昔單抗的同源二聚體(28、29)。
1.用SMCC衍生化處理。使?jié)舛葹?mg/mL的5mg利妥昔單抗與2.5μlSMCC(9.3mg/mL，溶于二甲基亞砜)室溫下溫育1小時(shí)，同時(shí)持續(xù)旋轉(zhuǎn)，SMCC/利妥昔單抗的摩爾比是4.5，其中利妥昔單抗溶于0.05M磷酸鹽緩沖液中，緩沖液中含有3mM Na2EDTA(PBE；pH 7.5)。在相同PBE緩沖液中在PD-10柱上通過(guò)層析純化偶聯(lián)的蛋白質(zhì)。
2.用SATA衍生化處理。使PBE緩沖液中濃度為5mg/mL的5mg利妥昔單抗與2.5μL SATA(5.8mg/mL，溶于二甲基亞砜)混合，于室溫下溫育1小時(shí)，SATA/利妥昔單抗的摩爾比是4.0。隨后通過(guò)在PD-10柱上的層析移去過(guò)量的SATA，用5mg的羥胺-HCl(Sigma)對(duì)純化的蛋白質(zhì)脫乙?；覝叵逻M(jìn)行5分鐘。通過(guò)在PD-10柱上的層析去除過(guò)量的羥胺-HCl。
3.利妥昔單抗同源二聚體形成和生理特征
將SMCC-和SATA-衍生蛋白質(zhì)混合在一起并溫育，室溫下持續(xù)旋轉(zhuǎn)1-2小時(shí)。將制備物在PBS中4℃透析過(guò)夜，通過(guò)0.22μm非熱源性過(guò)濾器(Costar，Coming，NY)過(guò)濾除菌，用上述Pharmacia AKTA在Superose 6柱(FPLC)上進(jìn)一步分級(jí)分離，流速是0.5mL/分鐘。
一般地，通過(guò)FPLC，聚合物顯示的駐留時(shí)間大約是16分鐘，而二聚體顯示的駐留時(shí)間大約是29分鐘。應(yīng)用Centricon YM-100(Millipore，Billerica，MA)使來(lái)自FPLC的蛋白質(zhì)級(jí)分進(jìn)一步濃縮，過(guò)濾滅菌，并用SDS/PAGE分析。通過(guò)非還原SDS-PAGE，對(duì)該二聚體制備物觀察到了預(yù)期的利妥昔單抗二聚體分子量。以鼠IgM作為標(biāo)準(zhǔn)(970kDa)，應(yīng)用2％瓊脂糖凝膠測(cè)定聚合物的大小。通過(guò)本方法，確認(rèn)一條帶是利妥昔單抗聚合物，其略高于IgM，所述IgM的分子量對(duì)應(yīng)于約5個(gè)免疫球蛋白分子。
實(shí)施例8.利妥昔單抗二聚體和利妥昔單抗聚合物(1∶2.4利妥昔單抗∶氧化葡聚糖)的比較結(jié)果
1.利妥昔單抗制備物的親和研究
進(jìn)行親和結(jié)合研究，其中使125I-標(biāo)記的利妥昔單抗制備物與Raji淋巴瘤細(xì)胞溫育，通過(guò)斯卡查德分析法(Scatchard analysis)用結(jié)合的放射活性計(jì)算親和常數(shù)(Ka)。應(yīng)用此方法，發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗聚合物的親和常數(shù)是3.16×108M-1，而單體和二聚體的親和常數(shù)分別是3.6×108M-1和2.09×108M-1。這些研究表明，利妥昔單抗聚合物和二聚體對(duì)抗原的結(jié)合親和性與利妥昔單抗本身相似，這有利于隨后在體外和體內(nèi)進(jìn)行直接比較。
2.利妥昔單抗制備物對(duì)凋亡的誘導(dǎo)
在37℃單獨(dú)應(yīng)用利妥昔單抗或應(yīng)用超交聯(lián)利妥昔單抗處理Raji淋巴瘤細(xì)胞18-20小時(shí)。凋亡的量通過(guò)膜聯(lián)蛋白V/PI染色(圖11A)和TUNEL試驗(yàn)(圖11B1-B4)測(cè)定。在本試驗(yàn)中，利妥昔單抗單體在Raji細(xì)胞中僅誘導(dǎo)最小水平的凋亡，膜聯(lián)蛋白分析中是約26％，TUNEL試驗(yàn)中是約2.99％。圖11B1-4中膜聯(lián)蛋白分析中的利妥昔單抗單體的背景凋亡高于圖6所示，差異可能是由于一段時(shí)間內(nèi)的分析誤差產(chǎn)生的。與之相比，GAH超交聯(lián)利妥昔單抗引起更高水平的凋亡(膜聯(lián)蛋白分析中是約50％，TUNEL分析中是約30.41％；圖11A和圖11B-14)。偶聯(lián)于甲苯磺?；罨腄ynabeads(直徑是2.8μm)的利妥昔單抗誘導(dǎo)出最佳的凋亡水平，所述水平通過(guò)膜聯(lián)蛋白V/PI染色和TUNEL試驗(yàn)檢測(cè)(分別是約96％和83.28％；圖12A和12B1-B3)。
用凋亡試驗(yàn)來(lái)分析利妥昔單抗聚合物和二聚體誘導(dǎo)凋亡的能力。TUNEL試驗(yàn)顯示，利妥昔單抗聚合物誘導(dǎo)57.8％的凋亡，而二聚體僅產(chǎn)生2.99％(結(jié)果未顯示)。
多種利妥昔單抗制備物的凋亡誘導(dǎo)量在10種不同細(xì)胞系中得以測(cè)試，所述細(xì)胞系包括10種CD20+細(xì)胞系和2種CD20-細(xì)胞系。結(jié)果顯示在表5中。
表5.利妥昔單抗單體、二聚體和聚合物制備物對(duì)CD20陽(yáng)性和陰性細(xì)胞系的凋亡誘導(dǎo)，通過(guò)膜聯(lián)蛋白V測(cè)定。


1平均熒光強(qiáng)度2非存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)
在CD20+細(xì)胞系中(Raji，B35M，Ramos，F(xiàn)arage，Granda 519和Chevallier)，與二聚體或單體處理的那些細(xì)胞相比，利妥昔單抗聚合物處理的細(xì)胞中的凋亡顯著增加。然而，不是所有利妥昔單抗聚合物處理的CD20+細(xì)胞都表現(xiàn)出顯著的凋亡。認(rèn)為這些淋巴瘤細(xì)胞系中的一些細(xì)胞可能具有不同的關(guān)聯(lián)于CD20連接的細(xì)胞內(nèi)途徑。在用不同利妥昔單抗制備物處理的任意CD20-細(xì)胞系中均沒(méi)有檢測(cè)到明顯凋亡，這很可能是由于抗體結(jié)合的缺乏。
3.免疫熒光顯微術(shù)研究
在用第二抗體FITC-偶聯(lián)的羊抗鼠F(ab′)2染色之前，使利妥昔單抗單體、二聚體和聚合物與Raji細(xì)胞溫育，隨后用2％多聚甲醛固定。此外，通過(guò)在用2％多聚甲醛固定之前，用利妥昔單抗和FITC-偶聯(lián)的羊抗鼠F(ab′)2先后處理細(xì)胞，研究超交聯(lián)的影響。結(jié)果表明，利妥昔單抗單體和二聚體處理產(chǎn)生環(huán)狀形式的免疫熒光，表明CD20平均分布在淋巴瘤細(xì)胞的表面。與之不同，發(fā)現(xiàn)用利妥昔單抗聚合物或利妥昔單抗+二抗處理的細(xì)胞有更加分離的極性染色型，這與CD20移動(dòng)和固定入脂膜筏一致。這些結(jié)果表明，CD20在脂膜筏中的群集和固定與凋亡誘導(dǎo)一致。
4.胱天蛋白酶3活化研究
如圖13A-13E所示，發(fā)現(xiàn)用利妥昔單抗單體或二聚體處理的Raji淋巴瘤細(xì)胞具基礎(chǔ)水平的胱天蛋白酶3活性，與對(duì)照相似。與之不同，用利妥昔單抗聚合物或包被了利妥昔單抗的Dynabeads處理的Raji淋巴瘤細(xì)胞顯示出明顯的胱天蛋白酶3活化。對(duì)于聚合物處理的細(xì)胞，胱天蛋白酶3活性在處理5小時(shí)后開(kāi)始升高，在24小時(shí)達(dá)到峰值。對(duì)于用包被了利妥昔單抗的Dynabeads處理的那些細(xì)胞，胱天蛋白酶3活性在處理5小時(shí)后達(dá)到峰值，在24小時(shí)下降。從這些試驗(yàn)中，似乎凋亡的早期誘導(dǎo)與胱天蛋白酶3的更強(qiáng)效活化相關(guān)，如在包被了利妥昔單抗的Dynabeads處理的樣品中所見(jiàn)。
5.藥物動(dòng)力學(xué)和生物分布研究
在BALB/c小鼠中進(jìn)行全身放射活性研究，以確立125I-標(biāo)記的利妥昔單抗單體、二聚體和聚合物之間的藥物動(dòng)力學(xué)特性差異。從這些研究中確定，125I-利妥昔單抗的T1/2是96小時(shí)(p＜0.01)，而二聚體和聚合物表現(xiàn)出更慢的總?cè)砬宄?，分別是120小時(shí)和144小時(shí)(p＜0.01)。延長(zhǎng)的清除與分子量增加有關(guān)。
對(duì)生物分布研究，對(duì)幾組帶有Raji的裸鼠靜脈注射125I-標(biāo)記的利妥昔單抗單體、二聚體或聚合物。三日后，處死小鼠，測(cè)定每一器官的放射性，計(jì)算百分注射劑量/克(％ID/g)和腫瘤/器官比值(每克腫瘤的cpm/每克器官的cpm)。如圖14A所示，所有三種利妥昔單抗制備物都有效地定位于Raji人淋巴瘤異種移植物，這產(chǎn)生了大致相似的腫瘤對(duì)正常器官比值(圖14B)。數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明了所有三種利妥昔單抗制備物的腫瘤靶向特異性，如觀察到的高腫瘤攝取所提示的。
6.免疫治療研究
如圖15所示，對(duì)已建立的Raji異種移植物的處理直至第10天腫瘤的大小可以觸知時(shí)才開(kāi)始。在接受利妥昔單抗單體或二聚體的這些組的小鼠中，腫瘤生長(zhǎng)或是不受影響或是比未處理的對(duì)照組中所見(jiàn)的略微緩慢。與之不同，接受利妥昔單抗聚合物的小鼠表現(xiàn)出明顯的腫瘤消退。腫瘤移植后28天，聚合物處理組的平均腫瘤體積是PBS處理對(duì)照組的腫瘤體積的＜30％(p＜0.01)?？紤]到所有這些制備物在此相同腫瘤模型中具有相當(dāng)?shù)挠H和常數(shù)和生物分布特性的事實(shí)，這些發(fā)現(xiàn)特別值得注意。
7.結(jié)論
利妥昔單抗對(duì)調(diào)亡的直接誘導(dǎo)是非常低效率的，除非抗體通過(guò)第二抗體被超交聯(lián)或被固定在塑料上(5-7和19)。與利妥昔單抗單體或二聚體相比，由每一葡聚糖分子至少5個(gè)免疫球蛋白組成的利妥昔單抗聚合物顯示了體外和體內(nèi)的效力。與單體或二聚體制備物相比，聚合物在結(jié)合后直接誘導(dǎo)CD20+人淋巴瘤細(xì)胞系的凋亡。此外，應(yīng)用單體和二聚體制備物幾乎沒(méi)有效果的劑量的聚合物時(shí)，利妥昔單抗聚合物在體內(nèi)對(duì)移植的Raji淋巴瘤要有效得多。值得注意的是，在帶有腫瘤的裸鼠中，所有三種抗體制備物對(duì)CD20具有基本相同的親和力，并且表現(xiàn)出相似的藥物動(dòng)力學(xué)特性和生物分布特性。
包被了利妥昔單抗的Dynabeads在Raji細(xì)胞中誘導(dǎo)最大水平的凋亡，其中＞90％的細(xì)胞顯示出凋亡。在體內(nèi)，Dynabead遞呈可能類似于帶有FcR的細(xì)胞。包被了抗體的Dynabeads提供了鑒定抗體的簡(jiǎn)單方法，其中通過(guò)帶有FcR的細(xì)胞遞呈而發(fā)生的凋亡誘導(dǎo)是重要的作用機(jī)制。
免疫熒光顯微術(shù)顯示，CD20抗原群集與利妥昔單抗抗體制劑的卓越的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)相關(guān)。因此，免疫熒光顯微術(shù)檢測(cè)的CD20抗原群集可以被用來(lái)預(yù)測(cè)能夠誘導(dǎo)凋亡的抗體制劑。
提出了幾種機(jī)制解釋動(dòng)物模型和人體中利妥昔單抗處理的有效性。ADCC在體內(nèi)起主要作用的觀念是目前流行的假說(shuō)，幾種出版物都陳述了經(jīng)FcRs的抗體遞呈的重要性(20、59、60)。在小鼠模型中，F(xiàn)cγRII對(duì)利妥昔單抗的治療效果有抑制作用(59)，但是一些研究產(chǎn)生了對(duì)立的結(jié)果(61)。具體而言，用FcγRII轉(zhuǎn)染的小鼠成纖維Ltk-細(xì)胞仍然促進(jìn)信號(hào)誘導(dǎo)的凋亡(6)。在本文的結(jié)果中，利妥昔單抗聚合物制備物在抑制Raji淋巴瘤體內(nèi)生長(zhǎng)中的有效性說(shuō)明，凋亡是治療淋巴瘤的有力機(jī)制。應(yīng)用包被了利妥昔單抗的Dynabeads和聚合物時(shí)，看到了胱天蛋白酶3的誘導(dǎo)，而應(yīng)用利妥昔單抗單體和二聚體時(shí)，僅觀察到基礎(chǔ)水平的胱天蛋白酶活性。更高和更有效的凋亡誘導(dǎo)與胱天蛋白酶3更早和更多的活性增加有關(guān)。
總之，除了二聚體抗體制備物外，用多聚形式的抗-CD20抗體，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)凋亡誘導(dǎo)對(duì)淋巴瘤的有效治療。合適的凋亡誘導(dǎo)抗-CD20制備物的體外篩選可以用第二抗體、帶有FcR的細(xì)胞或包被了利妥昔單抗的Dynabeads來(lái)檢驗(yàn)。在體內(nèi)，超交聯(lián)似乎需要帶有FcR的細(xì)胞的遞呈(59)。然而，如本文所述制備的抗-CD20聚合物制備物似乎避免了對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的需求。因此，抗-CD20聚合物可以特別用于具有低FcR表型和對(duì)利妥昔單抗單一療法無(wú)反應(yīng)的淋巴瘤患者(62)。
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本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明完全可以進(jìn)行調(diào)整以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)并獲得所提及的以及固有的結(jié)果和優(yōu)勢(shì)。本文中描述的實(shí)施例，代表了優(yōu)選的實(shí)施方案，是示范性的，而不意圖成為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。其中的修改和其它用途對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。這些修改包含在本發(fā)明的精神之內(nèi)并且被本發(fā)明的范圍限定。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可以對(duì)公開(kāi)的實(shí)施方案作各種置換和修改，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
本說(shuō)明書(shū)中提及的所有專利和出版物指出了本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的水平。所有專利和出版物通過(guò)參考并入本文至這樣的程度，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物都表示為明確地分別并入本文，作為參考。
本文中例證性地描述的發(fā)明可以在缺少本文中未具體公開(kāi)的任一元素或許多元素、限定或許多限定的情況下適宜地實(shí)施。因此，例如，在此處的任何情況下，術(shù)語(yǔ)“包括”、“基本上由…組成”和“由…組成”可以替換為其它兩個(gè)術(shù)語(yǔ)中的任一個(gè)。已被使用的術(shù)語(yǔ)和表述，是被用作描述性術(shù)語(yǔ)，而不是限定性的，并且本發(fā)明的意圖不是在使用這些術(shù)語(yǔ)和表述時(shí)排除顯示和描述的特征或其部分的等同物，應(yīng)認(rèn)識(shí)到在要求保護(hù)的發(fā)明范圍內(nèi)各種修改是可能的。因此，應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案和可選的特征被具體地公開(kāi)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本文公開(kāi)的概念進(jìn)行修改和變化，而這些修改和變化被認(rèn)為包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如所附權(quán)利要求所限定的。
其它實(shí)施方案在權(quán)利要求中列出。
權(quán)利要求
1.癌癥治療劑，其包括連接有多個(gè)抗腫瘤細(xì)胞抗體的聚合物，其中所述抗體可以結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞抗原并且誘導(dǎo)所述腫瘤細(xì)胞的凋亡或細(xì)胞死亡。
2.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體在不與聚合物連接時(shí)的特征是，不會(huì)實(shí)質(zhì)性地誘導(dǎo)所述腫瘤細(xì)胞的凋亡或細(xì)胞死亡。
3.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體在不與聚合物連接時(shí)的特征是，誘導(dǎo)所述腫瘤細(xì)胞的凋亡或細(xì)胞死亡。
4.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體結(jié)合于相同的腫瘤抗原。
5.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體結(jié)合于相同腫瘤抗原的多于一個(gè)表位。
6.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體結(jié)合于多于一種腫瘤抗原。
7.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中至少一個(gè)抗體是二價(jià)抗體。
8.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中至少一個(gè)抗體是單價(jià)抗體。
9.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中至少一個(gè)抗體是抗體片段。
10.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD21抗體和抗CD22抗體。
11.權(quán)利要求10所述的癌癥治療劑，其中所述癌癥治療劑包括抗體中的任意兩種或更多種，所述抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD21抗體和抗CD22抗體。
12.權(quán)利要求11所述的癌癥治療劑，其中所述抗體是抗HER-2。
13.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述癌癥治療劑包括至少5個(gè)抗體。
14.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述癌癥治療劑包括至少10個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。
15.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述腫瘤是淋巴瘤或白血病。
16.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物的大小是至少1,000道爾頓。
17.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物的大小是在6000-8000道爾頓之間。
18.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是同聚物。
19.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是雜聚物。
20.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物選自葡聚糖、聚(乙二醇)(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺類樹(shù)枝狀聚合物(PAPAM)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的合成共聚物(HPMA)，和N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)。
21.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是可溶性聚合物。
22.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是線性聚合物。
23.權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是支化聚合物。
24.降低個(gè)體中的腫瘤體積或抑制個(gè)體中癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述癌癥治療劑結(jié)合于個(gè)體中的所述腫瘤或癌細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述腫瘤或所述癌細(xì)胞是淋巴瘤或白血病。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述個(gè)體表現(xiàn)出降低水平的抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)性細(xì)胞毒性。
27.減輕或抑制患癌癥個(gè)體中轉(zhuǎn)移性癌發(fā)展的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述個(gè)體具有表達(dá)腫瘤細(xì)胞抗原的癌細(xì)胞，所述癌癥治療劑中的抗體可以結(jié)合于所述腫瘤細(xì)胞抗原。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述腫瘤或所述癌細(xì)胞是淋巴瘤或白血病。
29.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述個(gè)體表現(xiàn)出降低水平的抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)性細(xì)胞毒性。
30.鑒定抗體的方法，相比未連接于聚合物的抗體，所述抗體在至少兩個(gè)這種抗體被連接于聚合物時(shí)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力增強(qiáng)，所述方法包括a)將期望進(jìn)行這種試驗(yàn)的候選抗體連接于不溶性顆粒并使所述連接有抗體的顆粒與腫瘤細(xì)胞接觸，所述腫瘤細(xì)胞表達(dá)所述候選抗體能夠結(jié)合的抗原；和b)步驟a)之后，確定所述腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡的程度，并將其與在另外一批相同腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡程度相比較，所述另外一批相同腫瘤細(xì)胞與未連接于顆粒的所述候選抗體接觸。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力增強(qiáng)是，使用連接有抗體的顆粒比未連接于顆粒的抗體相比，有至少2倍的增加。
32.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述不溶性顆粒是直徑為約2至約5微米長(zhǎng)度的珠子。
全文摘要
描述了包括聚合物的癌癥治療劑，三個(gè)或更多個(gè)抗腫瘤細(xì)胞抗體與所述聚合物相連接。優(yōu)選大小為6－8Kd之間的可溶性聚合物。聚合物上的抗體可以和腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞抗原結(jié)合并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡。聚合物可以被連接于針對(duì)相同腫瘤抗原的不同抗體或針對(duì)不同腫瘤抗原的不同抗體。也描述了用該癌癥治療劑治療患有癌癥的個(gè)體的方法。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1925871SQ200580006321
公開(kāi)日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月27日
發(fā)明者A·L·愛(ài)潑斯坦, L·A·赫里 申請(qǐng)人:南加州大學(xué)