專利名稱：：抑制dr6結(jié)合app的dr6抗體及其在治療神經(jīng)學(xué)病癥中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：中有用的DR6拮抗劑組合物，所述DR6拮抗劑例如抑制DR6與其關(guān)聯(lián)配體APP之間的結(jié)合。在任選的實(shí)施方案中，使用DR6拮抗劑(諸如DR6受體抗體、DR6受體變體、DR6受體免疫粘附素或APP抗體)來(lái)治療神經(jīng)學(xué)病癥(包括阿耳茨海默氏病的治療)。
背景技術(shù)：
：本領(lǐng)域已經(jīng)鑒定了屬于肺瘤壞死因子(TNF)超家族的多種配體和受體。在這些配體中有腫瘤壞死因子-a("TNF-a，，)、腫瘤壞死因子-(3("TNF-(3"或"淋巴毒素-a")、淋巴毒素-|3("LT-p，，)、CD30配體、CD27配體、CD40配體、OX-40配體、4-lBB配體、LIGHT、Apo-l配體(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配體(也稱作TWEAK)、APRIL、OPG配體(也稱作RANK配體、ODF或TRANCE)和TALL-1(也稱作BlyS、BAFF或THANK)(參見例如Ashkenazi,NatureReview,2:420-430(2002);AshkenaziandDixit,Science,281:1305-1308(1998);AshkenaziandDixit,Curr.Opin.CellBiol"11:255-260(2000);Golstein,Curr.Biol"7:750-753(1997);Wallach,CytokineReference,AcademicPress,2000,pages377-411;Locksley等,Cell,104:487-501(2001);GrussandDower，Blood,85:3378-3404(1995);Schmid等，Proc.Natl.Acad.Sci.,83:1881(1986);Dealtry等，Eur.J.Immunol"17:689(1987);Pitti等，J.Biol.Chem.，271:12687-12690(1996);Wiley等，Immunity,3:673-682(1995);Browning等，Cell,72:847-856(1993);Armitage等，Nature,357:80-82(1992);WO97/01633,公開于1997年1月16日；WO97/25428，公開于1997年7月17日；Marsters等,Curr.Biol"8:525-528(1998);Chicheportiche等,Biol.Chem.，272:32401-32410(1997);Hahne等,J.Exp.Med"188:1185-1190(1998);WO98/28426,公開于1998年7月2日；WO98/46751，公開于1998年10月22日；WO98/18921,公開于1998年5月7日;Moore等,Science,285:260-263(1999);Shu等，J.LeukocyteBiol"65:680(1999);Schneider等，J.Exp.Med"189:1747-1756(1999);Mukhopadhyay等,J.Biol.Chem.，274:15978-15981(1999))。由這些TNF家族配體介導(dǎo)的多種細(xì)胞應(yīng)答的誘發(fā)通常是通過(guò)它們與特定細(xì)胞受體結(jié)合而開始的。在迄今為止已經(jīng)鑒定的TNF受體超家族成員中包括TNFR1、TNFR2、p75-NGFR、TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas(也稱作Apo-l或CD95)、DR4(也稱作TRAIL-R1)、DR5(也稱作Apo-2或TRAIL-R2)、DR6(也稱作TR9，在文獻(xiàn)中也稱作TNF受體超家族成員21或TNFRSF21)、DcRl、DcR2、護(hù)骨蛋白(OPG)、RANK和Apo-3(也稱作DR3或TRAMP)(參見例如Ashkenazi，NatureReviews,2:420-430(2002);AshkenaziandDixit,Science,281:1305-1308(1998);AshkenaziandDixit,Curr.Opin.CellBiol"11:255-260(2000);Golstein,Curr.Biol"7:750-753(1997》Wallach,CytokineReference,AcademicPress,2000,pages377-411;Locksley等，Cell,104:487-501(2001);GrussandDower,Blood,85:3378-3404(1995);Hohman等，J.Biol.Chem.,264:14927-14934(1989);Brockhaus等，Proc.Natl.Acad,Sci.,87:3127-3131(1990);EP417,563，公開于1991年3月20日；Loetscher等，Cell,61:351(1990);Schall等,Cell,61:361(1990);Smith等,Science,248:1019-1023(1990);Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，88:2830-2834(1991);Goodwin等，Mol.Cell.Biol"11:3020-3026(1991);Stamenkovic等，EMBOJ"8:1403-1410(1989);Mallett等，EMBOJ.,9:1063-1068(1990);Anderson等，Nature,390:175-179(1997);Chicheportiche等，J.Biol.Chem.,272:32401-32410(1997);Pan等，Science,276:111-113(1997);Pan等,Science,277:815-818(1997);Sheridan等，Science,277:818-821(1997);Degli-Esposti等，J.Exp.Med"186:1165-1170(1997);Marsters等，Curr.Biol"7:1003-1006(1997);Tsuda等,BBRC，234:137-142(1997);Nocentini等,Proc.Natl.Acad.Sci.,94:6216-6221(1997);vonBulow等,Science,278:138-141(1997);Johnson等，Cell，47:545-554(1986);Radeke等，Nature,325:593-597(1987);Pan等，F(xiàn)EBSLett.,431:351-356(1998))。大多數(shù)這些TNF受體家族成員共享細(xì)胞表面受體的典型結(jié)構(gòu)，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，而其它成員則天然發(fā)現(xiàn)是缺少跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的可溶性蛋白質(zhì)。典型TNFR的胞外部分包含從NH2-末端起始的多個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)的重復(fù)氨基酸序列樣式。關(guān)于TNF受體和配體家族的綜述一4義參見例如Wallach,CytokineReference,AcademicPress,2000，頁(yè)377-411;Locksley等，Cell,104:487-501(2001);Ware,Cytokine&GrowthFactorReviews,14:181-184(2003);Liu等,Immunity,15(1):23-34(2001);及Bossen等，JBiolChem.281(20):13964-71(2006)。稱作DR6受體(在文獻(xiàn)中也稱作"TR9，，；在文獻(xiàn)中也稱作TNF受體超家族成員21或TNFRSF21)的TNFR家族成員已經(jīng)被描述為I型跨膜受體，其具有四個(gè)胞外富含半胱氨酸的基序和一個(gè)胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(Pan等，F(xiàn)EBSLett.,431:351-356(1998);還可參見美國(guó)專利6,358,508;6,667,390;6,919,078;6,949,358)。已經(jīng)報(bào)道了DR6在某些轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致凋亡及NF-kB和JNK二者的活化(Pan等，F(xiàn)EBSLetters,431:351-356(1998))。在DR6缺陷小鼠模型中，T細(xì)胞在JNK活化方面受到實(shí)質(zhì)性損傷，而且在用蛋白質(zhì)抗原攻擊DR6(-A)小鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們的T細(xì)胞過(guò)度增殖并展現(xiàn)出通向Th2應(yīng)答的深刻極化(而Thl分化沒有受到同等影響)(Zhao等，J.Exp.Med"194:1441-1448(2001))。還報(bào)道了在體外對(duì)DR6的靶向破壞導(dǎo)致增強(qiáng)的T輔助細(xì)胞2(Th2)分化(Zhao等，見上文)。DR6拮抗劑或拮抗劑在調(diào)控B細(xì)胞介導(dǎo)的疾患中的各種用途記載于2005年3月31日公布的US2005/0069540。DR6受體可能在調(diào)節(jié)OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中的氣道炎癥中發(fā)揮作用(Venkataraman等，Immunol.Lett.,106:42-47(2006))。使用髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG(35-55))誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型，發(fā)現(xiàn)與野生型(WT)同窩出生者相比，DR6-A小鼠對(duì)CNS疾病的發(fā)作和進(jìn)展二者高度有抗性。如此，DR6可能牽涉調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的誘導(dǎo)和進(jìn)展中的白細(xì)胞浸潤(rùn)和功能(Schmidt等，J.Immunol.,175:2286-2292(2005》。雖然已經(jīng)鑒定了多個(gè)TNF配體和受體家族成員具有各式各樣的生物學(xué)活性和特性，但是很少的此類配體和受體有報(bào)道牽涉神經(jīng)學(xué)相關(guān)功能。例如，2004年8月26日公布的WO2004/071528記載了在鼠模型中抑制CD95(Fas)配體/受體復(fù)合物來(lái)治療脊髓損傷。發(fā)明概述在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供了分離的死亡受體6("DR6")拮抗劑。本文中所公開的拮抗劑的某些實(shí)施方案抑制或阻斷DR6與一種或多種其關(guān)聯(lián)配體之間的相互作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中所公開的DR6拮抗劑抑制或阻斷DR6與其關(guān)聯(lián)配體淀粉狀蛋白前體蛋白("APF，)之間的相互作用。DR6拮抗劑的實(shí)施方案可包括抗體，諸如DR6或APP抗體。此類DR6拮抗性抗體可以是例如單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、或人抗體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，DR6拮抗劑可包括抗DR6抗體，其結(jié)合DR6胞外結(jié)構(gòu)域多肽或其片段，且任選可結(jié)合包含圖lA氨基酸l-349或42-349的DR6多肽?；蛘?，DR6拮抗劑可包括抗APP抗體，其結(jié)合APP多肽，且任選的是可結(jié)合包含圖1B(SEQIDNO:6)氨基酸66-81的APP多肽。DR6拮抗劑還包括DR6免疫粘附素、DR6變體、DR6片段、其共價(jià)修飾形式、或其融合蛋白，以及小分子拮抗劑。舉例而言，DR6拮抗劑可包括PEG化DR6或融合至異源序列(諸如表位標(biāo)簽、抗體片段(諸如人Fc)、或亮氨酸拉鏈)的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域形式DR6。本發(fā)明的例示性實(shí)施方案還包括抑制或阻斷DR6對(duì)APP的結(jié)合的方法，包括在DR6對(duì)APP的結(jié)合受到抑制的條件下將DR6多肽和/或APP多肽暴露于一種或多種DR6拮抗劑。在此類方法中所使用的典型DR6拮抗劑包括結(jié)合DR6或APP的抗體，以及可溶性DR6多肽。任選的是，通過(guò)觀察抑制DR6與APP之間的結(jié)合的能力來(lái)選擇這些方法中所使用的DR6拮抗劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，使用此類方法來(lái)例如在體外組織培養(yǎng)中抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和/或增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或存活。所述方法涵蓋使用單一類型的DR6拮抗劑分子或兩種或更多類型的DR6拮抗劑的組合。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了用于增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中的神經(jīng)元細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或再生或存活的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的DR6拮抗劑。在任選的實(shí)施方案中，DR6拮抗劑的施用在所述哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)并阻斷神經(jīng)元細(xì)胞或組織的細(xì)胞死亡和變性(degeneration)。神經(jīng)元細(xì)胞或組織可包括例如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、連合神經(jīng)元、軸突、小膠質(zhì)、和/或少突膠質(zhì)細(xì)胞。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，此類方法中所使用的DR6拮抗劑可包括結(jié)合APP并抑制其結(jié)合DR6的能力的抗體。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，此類方法中所使用的DR6拮抗劑可包括結(jié)合DR6并抑制其結(jié)合APP的能力的抗體?；蛘?，DR6拮抗劑可包括DR6免疫粘附素、連接至非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物(其選自下組聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯)的DR6多肽、或DR6多肽變體。所述方法中所采用的DR6免疫粘附素可包含融合至免疫球蛋白Fc區(qū)的可溶性DR6受體。另外，本發(fā)明的DR6拮抗劑可包括小分子。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了用于治療神經(jīng)學(xué)病癥的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的DR6拮抗劑。在任選的實(shí)施方案中，所述方法包括治療哺乳動(dòng)物中的阿耳茨海默氏病。此類方法中所使用的DR6拮抗劑可包括結(jié)合APP并抑制其結(jié)合DR6的能力的的抗體。DR6拮抗劑還可包括DR6抗體?；蛘?，DR6拮抗劑可包括DR6免疫粘附素、連接至非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物(其選自下組聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯)的DR6多肽、DR6抗體或DR6變體。性DR6受體。所述方法中所采用的抗DR6抗體可結(jié)合包含圖lA氨基酸l-349或42-349的DR6受體。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括用于診斷患有神經(jīng)學(xué)病癥的或?qū)ι窠?jīng)學(xué)病癥易感的患者的方法，包括自所述患者獲取樣品并對(duì)所述樣品測(cè)試具有與SEQIDNO:1之DR6多肽序列不同的多肽序列的DR6多肽變體的存在。典型的是，在此類方法中，所述多肽變體被鑒定為具有與對(duì)SEQIDNO:1之DR6多肽序列觀察到的親和力不同的對(duì)APP多肽的親和力。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了用于鑒定抑制DR6對(duì)APP的結(jié)合的感興趣分子的方法。此類方法可包括在存在或不存在感興趣分子的情況中組合DR6和APP;然后檢測(cè)在存在所述感興趣分子的情況中對(duì)DR6結(jié)合APP的抑制。任選的是，使用在細(xì)胞表面上表達(dá)DR6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)施此類方法；并進(jìn)一步包括檢測(cè)對(duì)DR6活化或信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步包括通過(guò)此類方法鑒定的分子。任選的是，感興趣分子是結(jié)合APP的抗體、結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了能夠特異性結(jié)合APP配體、DR6受體和/或能夠調(diào)控與DR6和/或其配體和/或共受體(co-receptor)有關(guān)的生物學(xué)活性、且在各種神經(jīng)學(xué)病癥的治療中有用的抗體。在具體的實(shí)施方案中，提供了特異性結(jié)合DR6多肽的胞外結(jié)構(gòu)域序列的抗體(在下文實(shí)施例中有進(jìn)一步描述)。進(jìn)行了進(jìn)一步選擇的。任選的是，抗體是單克隆抗體。任選的是，單克隆抗體包括由分別以編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的雜交瘤分泌的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗體。還提供了結(jié)合與分別以ATCC編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7單克隆抗體所結(jié)合表位相同的表位的抗體。一方面，本發(fā)明關(guān)注顯示至少與抗體3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7相同的對(duì)DR6的親和力和/或展現(xiàn)出至少與抗體3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7相同的生物學(xué)活性和/或效力的抗DR6抗體，包括3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗體。在其它具體的實(shí)施方案中，提供了生成單克隆抗體3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7且分別以編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的雜交瘤細(xì)胞系，及由分別以編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的雜交瘤分泌的單克隆抗體3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7。還提供了分離的抗DR6單克隆抗體，包括結(jié)合DR6多肽且竟?fàn)幮砸种朴煞謩e以ATCC編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的雜交瘤生成的單克隆抗體結(jié)合所述DR6多肽的抗體。還提供了嵌合的或人源化的抗DR6抗體，其特異性結(jié)合DR6多肽且包含(a)自由分別以編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC雜交瘤分泌的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗體衍生的序列。任選的是，此類抗體可包含自3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗體衍生的重鏈、輕鏈或可變區(qū)。又一方面，本發(fā)明關(guān)注編碼本文抗DR6抗體或抗體片段的分離的核酸分子、包含此類核酸分子的載體、包含此類核酸分子的宿主細(xì)胞、和用于生產(chǎn)本文抗體和抗體片段的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本文中所定義的DR6拮抗劑和載體的組合物。載體可以是藥學(xué)可接受載體，而且組合物可進(jìn)一步包含別的藥劑。另一方面，本發(fā)明關(guān)注制品，其包括容器和裝在所述容器內(nèi)的組合物，其中所述組合物包含本發(fā)明的DR6拮抗劑。制品可進(jìn)一步包括關(guān)于在體外或在體內(nèi)使用DR6拮抗劑的說(shuō)明。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述i兌明關(guān)注神經(jīng)學(xué)病癥的治療。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明的實(shí)施方案包括試劑盒，其包括第一容器、所述容器上的標(biāo)簽、和裝在所述容器內(nèi)的組合物。在此類試劑盒中，所述組合物包含有效治療至少一種類型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中的凋亡的DR6拮抗劑，所述容器上的所述標(biāo)簽或包括在所述容器中的包裝插頁(yè)指示所述組合物可用于抑制至少一種類型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中的凋亡。任選的是，試劑盒包括別的部件(dement)，諸如裝有藥學(xué)可接受緩沖劑的第二容器；和/或關(guān)于使用所述DR6拮抗劑來(lái)抑制至少一種類型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中的凋亡的說(shuō)明。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本文所述DR6拮抗劑和組合物用于制備或制造藥物的用途，所述藥物用于治療哺乳動(dòng)物中的神經(jīng)學(xué)病癥，包括用于治療阿耳茨海默氏病。附圖簡(jiǎn)述圖1A顯示了人DR6cDNA的核苷酸序列(圖1A-1，SEQIDNO:2)、其推導(dǎo)氨基酸序列(圖lA-2，SEQIDNO:l)以及其結(jié)構(gòu)域體系結(jié)構(gòu)的示意圖(圖lA-3)。在DR6示意圖中，指示了結(jié)構(gòu)域邊界，包括推定的信號(hào)肽、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基序、3夸膜結(jié)構(gòu)域和死亡結(jié)構(gòu)域。在此示意圖中，指示了推定的信號(hào)肽、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域基序、跨膜結(jié)構(gòu)域、和死亡結(jié)構(gòu)域的推定結(jié)構(gòu)域邊界。圖1B顯示了人淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的695同等型的cDNA的核苷酸序列(圖1B-1，SEQIDNO:5)及其推導(dǎo)氨基酸序列(圖1B-2,SEQIDNO:6)。圖1C顯示了人淀粉狀蛋白前體蛋白的751同等型的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。圖1D顯示了人淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的770同等型的cDNA的核苷酸序列(圖1D-1，SEQIDNO:8)及其推導(dǎo)氨基酸序列(圖lD-2，SEQIDNO:9)。參見例如UniProtKB/Swiss-prot條目P05067及相關(guān)公開內(nèi)容，包括分別涉及同等型IDP05067-l、同等型IDP05067-4和同等型IDP05067-8的(http:〃expasy.org/unipro戲5067)。圖2A顯示了在發(fā)育階段E10.5-E12.5,DR6在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中強(qiáng)表達(dá)，包括脊髓的運(yùn)動(dòng)和連合神經(jīng)元及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。圖2B顯示了在軸突和細(xì)胞主體上表達(dá)的DR6蛋白。圖2C顯示了在分化中的神經(jīng)元中表達(dá)的DR6mRNA。圖3顯示了背側(cè)脊髓外植體存活測(cè)定法中軸突變性和神經(jīng)元細(xì)胞死亡的示意圖；指示了通過(guò)電穿孔將RNA干擾siRNA劑與表達(dá)GFP的質(zhì)粒一起導(dǎo)入胚胎連合神經(jīng)元中。圖4A圖示了在背側(cè)脊髓存活測(cè)定法中小干擾RNA對(duì)DR6表達(dá)的抑制阻斷連合軸突變性并阻止神經(jīng)元細(xì)胞死亡。圖4B顯示了RNAi抗性DR6cDNA挽救被DR6siRNA所阻斷的變性表型。圖5顯示了在背側(cè)脊髓存活測(cè)定法中拮抗性DR6抗體幫助阻斷軸突變性和神經(jīng)元細(xì)胞死亡。圖6提供了神經(jīng)元的機(jī)制示意圖和照片，顯示了在外植體存活測(cè)定法中由c-JunN-末端激酶(JNK)的藥理學(xué)抑制作用引起的DR6下游胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的下調(diào)阻止軸突變性和神經(jīng)元細(xì)月包死亡。圖7顯示了在離體(exvivo)全胚胎培養(yǎng)物中拮抗性DR6抗體對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)和中間神經(jīng)元的存活的神經(jīng)保護(hù)性效果。圖8提供了用經(jīng)過(guò)切割的胱天蛋白酶-3抗體免疫染色的E15.5脊髓頸段切片的照片，以顯示DR6的丟失導(dǎo)致DR6缺無(wú)胚胎的脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的降低。圖9A顯示了來(lái)自表達(dá)經(jīng)過(guò)切割的胱天蛋白酶-3的E15.5DR6KO胚胎的神經(jīng)元細(xì)胞的定量，其展示DR6缺無(wú)胚胎中的神經(jīng)元細(xì)胞死亡與DR6+/-同窩出生者對(duì)照(DR6雜合)相比降低大約50%。圖9B提供了細(xì)胞的照片，顯示了DR6是運(yùn)動(dòng)軸突變性所需要的，正如在存在和不存在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)因子的情況中正常和DR6敲除小鼠的比較所證實(shí)的。圖9C提供了細(xì)胞的照片，顯示了損傷誘發(fā)的軸突變性在DR6敲除'J、鼠中被延遲了。圖IOA提供了神經(jīng)元的照片，顯示了抗DR6抗體抑制各種營(yíng)養(yǎng)因子被剝了來(lái)自連合、感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中凋亡細(xì)胞主體的TUNEL染色顯〗象的進(jìn)一步照片數(shù)據(jù)，其顯示了抗DR6抗體抑制各式各樣的營(yíng)養(yǎng)因子被剝奪的神經(jīng)元的變性。圖11A提供了連合神經(jīng)元的照片，顯示了DR6-Fc能延遲連合軸突變性。圖11B提供了感覺神經(jīng)元的照片，顯示了DR6-Fc能延遲由NGF供應(yīng)斷絕誘發(fā)的感覺軸突變性。圖12A提供了神經(jīng)元的照片，使用DR6-AP顯示了軸突上的DR6結(jié)合位點(diǎn)。圖12B提供了在存在和不存在NGF的情況中的神經(jīng)元的照片，顯示了在NGF剝奪后DR6配體結(jié)合位點(diǎn)自軸突丟失。圖12C提供了處于發(fā)育階段E12.5的BAX缺無(wú)感覺軸突的研究的照片，顯示了P-分泌酶(BACE)抑制劑能阻斷NGF供應(yīng)斷絕后DR6-AP結(jié)合位點(diǎn)自感覺軸突的消失。圖13A提供了自多種Westem印跡規(guī)程得到的數(shù)據(jù)的照片，其中用DR6-AP(左上)或抗N-APP抗體(右上)探查來(lái)自神經(jīng)元細(xì)胞的多肽，以及如下的多肽(1)因其結(jié)合DR6的能力而選擇的；和然后的(2)用抗N-APP抗體探查的(下面的，"DR6-ECD下拉")。此數(shù)據(jù)將淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)鑒定為DR6胞外域結(jié)合配體。圖13B提供了自多種印跡實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)的照片，其容許顯現(xiàn)用DR6-AP探查的軸突條件化培養(yǎng)基中的DR6配體(包括APP多肽)。此印跡數(shù)據(jù)鑒定了許多APP多肽，包括位于35kDa的N-末端APP以及C99-APP和C83/C89APP多肽。圖14A提供了神經(jīng)元的照片，顯示了APP胞外域在NGF剝奪后不久脫落。圖14B提供了細(xì)胞的照片，顯示了DR6胞外域結(jié)合培養(yǎng)細(xì)胞所生成的APP。圖14C提供了細(xì)胞的照片，顯示了DR6是感覺軸突上的N-APP主要受體，而且APP結(jié)合位點(diǎn)在DR6缺無(wú)小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中被顯著消減。圖14D提供了細(xì)胞的照片，顯示了DR6功能阻斷性抗體破壞DR6胞外域與N-APP之間的相互作用。圖15A提供了神經(jīng)元的照片，顯示了在連合軸突測(cè)定法中針對(duì)N-末端APP的多克隆抗體阻斷軸突變性。圖15B提供了神經(jīng)元的照片，顯示了診斷N-末端APP的多克隆抗體以及22C11抗APP單克隆抗體抑制由NGF消除誘導(dǎo)的局部軸突變性。圖15C提供了神經(jīng)元的照片，顯示了添加N-APP能挽救被卩-分泌酶(BACE)活性的抑制作用所阻斷的軸突變性。圖15D提供了神經(jīng)元的照片，顯示了通過(guò)RNAi實(shí)現(xiàn)的APP消除使神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)N-APP誘導(dǎo)的死亡敏化。圖16A提供了神經(jīng)元的照片，顯示了DR6功能是N-APP誘導(dǎo)的軸突變性所需要的，但不是A(3觸發(fā)的變性所需要的。圖16B提供了神經(jīng)元的照片，顯示了功能阻斷性DR6抗體未能阻斷Ap觸發(fā)的軸突變性。圖17A提供了神經(jīng)元的照片，顯示了對(duì)JNK和上游胱天蛋白酶-8的抑制延遲了軸突變性，但是下游胱天蛋白酶-3則不然。圖17B提供了來(lái)自E12.5外植體培養(yǎng)物的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的照片，顯示了胱天蛋白酶-3在細(xì)胞主體中發(fā)揮功能，而胱天蛋白酶-6在軸突中發(fā)揮功能。圖17C提供了感覺神經(jīng)元的照片，顯示了雖然胱天蛋白酶-3不是軸突變性所需要的，但是BAX是所需要的。圖17D提供了連合神經(jīng)元的照片，顯示了胱天蛋白酶-3在細(xì)胞主體中發(fā)揮功能，而胱天蛋白酶-6在軸突中發(fā)揮功能。發(fā)明詳述本文中描述或提到的技術(shù)和規(guī)程一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且通常利用常規(guī)方法得以采用，諸如例如廣泛應(yīng)用的分子克隆方法，記載于Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N,Y。適當(dāng)時(shí)，牽涉使用市售試劑盒和試劑的規(guī)程一般依照制造商規(guī)定的方案和/或參數(shù)進(jìn)行，除非另有說(shuō)明。在描述本發(fā)明的方法和測(cè)定法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)?、?gòu)建物和試劑，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解本文中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體實(shí)施方案，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，只有所附權(quán)利要求才對(duì)本發(fā)明范圍進(jìn)行了限制。必須注意的是，在用于本文及所附權(quán)利要求時(shí)，單數(shù)形式"一個(gè)/種"、"該"和"所述"等包括復(fù)數(shù)所指物，除非另有明確規(guī)定。如此，例如，提到"一處遺傳改變"包括多處此類改變，提到"一種探針"包括一種或多種探針及其本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的等效物，諸如此類。說(shuō)明書和相關(guān)權(quán)利要求中所述所有數(shù)值(例如氨基酸22-81、l-354等)理解為以術(shù)語(yǔ)"約，，修飾。將本文中提到的所有出版物收入本文作為參考，以披露和描述與所引用出版物有關(guān)的方法和/或材料。引用本文中所引用的出版物是因?yàn)樗鼈兪窃诒旧暾?qǐng)的提交日之前公開的。本文中的任何文字都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明的發(fā)明人沒有資格憑借更早的優(yōu)先權(quán)日或在先發(fā)明日而早于所述出版物。此外，實(shí)際發(fā)表日可能與所顯示的有所不同，需要獨(dú)立查證。I.定義術(shù)語(yǔ)"淀粉狀蛋白前體蛋白"或"APP，，包括由APP前mRNA所編碼的多種多肽同等型(isoform)，例如圖1B-1D分別所示APP695、APP751和App770同等型(自APP前mRNA的可變剪接轉(zhuǎn)錄物翻譯得到的同等型)，以及APP同等型的翻譯后加工部分。正如本領(lǐng)域已知的，自APP基因轉(zhuǎn)錄得到的APP前mRNA經(jīng)歷外顯子可變剪接以產(chǎn)生多種同等型(參見例如Sandbrink等，AnnNYAcad.Sci.777:281-287(1996);及與PubMedNCBI蛋白編號(hào)P05067有關(guān)的信息)。此可變外顯子剪接產(chǎn)生695、751、和770個(gè)氨基酸的三種主要同等型(參見例如Kang等，Nature325:733-736(1987);Kitaguchi等，Nature331:530-532(1988);Ponte等，Nature331:525-527(1988);及Tanzi等，Nature331:528-532(1988))。這些同等型中的兩種(App75,和APP"o)包含56個(gè)殘基的插入物，其與Kunitz家族的絲氨酸蛋白酶抑制物(KPI)高度同源且遍在表達(dá)。相反，缺乏KPI基序的較短同等型APP695主要在神經(jīng)系統(tǒng)中(例如在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中)表達(dá)，而且為此常常稱作"神經(jīng)元APP，，(參見例如Tanzi等，Science235:880-884(1988);Neve等，Neuron1:669-677(1988);及Haas等，J.Ne畫ci11:3783-3793(1991))。APP各同等型(包括695、751和770)經(jīng)歷重大翻譯后加工事件(參見例如Esch等，1990Science248:1122-1124;Sisodia等,1990Science248:492-495)。例如，每一種這些同等型受到多種分泌酶和/或分泌酶復(fù)合物的切割，該事件產(chǎn)生APP片段，包括包含APP胞外域的N-末端分泌多肽(sAPPot和sAPP(3)。由a-分泌酶或(3-分泌酶進(jìn)行的切割分別導(dǎo)致可溶性N-末端APP多肽sAPPot和sAPP(3的產(chǎn)生和胞外釋放，及相應(yīng)膜錨定的C-末端片段C83和C99的保留。，分泌酶對(duì)C83的后續(xù)加工產(chǎn)生P3多肽。這是主要的分泌途徑，而且是不產(chǎn)生淀粉狀蛋白的?；蛘?，早老蛋白/呆蛋白介導(dǎo)的Y-分泌酶對(duì)C99的加工釋放淀粉狀蛋白(3多肽、淀粉狀蛋白+40(AP40)和淀粉狀蛋白-l342(Ap42),即淀粉狀蛋白斑塊的主要成分，及細(xì)胞毒性C-末端片段Y-CTF(50)、Y-CTF(57)和，CTF(59)。有證據(jù)提示每種切割事件的相對(duì)重要性取決于細(xì)胞類型。例如，非神經(jīng)元細(xì)胞優(yōu)先由a-分泌酶途徑加工APP,其在A(3序列內(nèi)切割A(yù)PP，由此排除A(3的形成(參見例如Esch等，1990Science248:1122-1124;Sisodia等，1990Science248:492-495)。相反，神經(jīng)元細(xì)胞由p-分泌酶途徑加工APP695的大得多的部分，這通過(guò)至少兩種酶類別的聯(lián)合活性產(chǎn)生完整A(3。在神經(jīng)元細(xì)胞中，P-分泌酶在A卩結(jié)構(gòu)域的氨基末端切割A(yù)PP695,釋放一種不同的N-末端片段(sAPP(3)。另夕卜，Y-分泌酶在羧基末端的另一位點(diǎn)切割A(yù)PP,產(chǎn)生長(zhǎng)40個(gè)(A卩40)或42個(gè)(A卩42)氨基酸的A卩種類(參見例如Seubert等，1993Nature361:260-263;Suzuki等，1994Science264:1336-1340;及Turner等，1996J.Biol.Chem.271:8966-8970)。術(shù)語(yǔ)"APP"、"APP蛋白"和"APP多肽"在用于本文時(shí)涵蓋天然APP序列和APP變體及其加工片段。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋在多種哺乳動(dòng)物(包括人)中表達(dá)APP。APP可以是內(nèi)源表達(dá)的，正如在多種人組織譜系中所天然發(fā)生的，或者可以是通過(guò)重組或合成方法而表達(dá)的。"天然序列APP，，包括與衍生自自然界的APP具有相同氨基酸序列的多肽(例如695、751和770同等型及其加工部分)。如此，天然序列APP可具有來(lái)自任何哺乳動(dòng)物(包括人)的天然存在APP的氨基酸序列。此類天然序列APP可以從自然界分離，或者可通過(guò)重組或合成手段生成。術(shù)語(yǔ)"天然序列APP"明確涵蓋天然存在的加工和/或分泌形式的(例如包含例如胞外結(jié)構(gòu)域序列的可溶形式)、天然存在變體形式(例如可變剪接和/或蛋白水解加工形式)和天然存在等位變體。APP變體可包括天然序列APP的片段或刪除突變體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中有用的APP多肽包括那些上文和如下非限制性例子中所描述的?？梢赃x擇這些例示形式，用于本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，APP多肽包含全長(zhǎng)APP同等型，諸如圖1B-1D所示APP695和/或APP75!和/或APP"o同等型。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，APP多肽包含APP的翻譯后加工形式，例如經(jīng)歷了分泌酶(諸如a-分泌酶、p-分泌酶或y-分泌酶)切割的APP多肽(例如可溶性N-末端片段，諸如sAPPa或sAPP卩)。在本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案中，可以選擇APP多肽，以包含一個(gè)或多個(gè)特定結(jié)構(gòu)域，諸如N-末端胞外域(參見例如Quast等，F(xiàn)ASEBJ.2003;17(12):1739-41)、肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見例如Rossjohn等，NatStructBiol.1999Apr;6(4):327-31)、銅II型(參見例如Hesse等，F(xiàn)EBSLetters349(1):109-116(1994))或Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域(參見例如Ponte等,Nature;331(6156):525-7(1988))。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，APP多肽包含觀察到包含受到本文中所公開的DR6拮抗劑(諸如抗體或DR6免疫粘附素)識(shí)別的表位的序列，例如APP695的氨基酸22-81，一種包含單克隆抗體22C11所結(jié)合的表位的序歹'J(參見例如Hilbich等，JournalofBiologicalChemistry,268(35):26571-26577(1993))。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，APP多肽不包含一種或多種特定結(jié)構(gòu)域或序列，例如不包含某些N-末端或C-末端氨基酸的APP多肽(例如實(shí)施例12中公開的人重組N-APP多肽)、不包含Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的APP肽(例如APP^)、或不包含阿耳茨海默氏病卩淀粉狀蛋白(A(3)序列的APP多肽(例如sAPPp，一種不包含A卩4o和/或A卩42序列的多肽)(參見例如Bond等，J.StructBiol.2003Feb;141(2):156-70)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的實(shí)施方案中所使用的APP多肽包含一種或多種結(jié)構(gòu)域或序列但不包含其它結(jié)構(gòu)域或序列，例如包含N-末端胞外域(或至少其觀察到受到DR6拮抗劑(諸如單克隆抗體22C11)結(jié)合的部分)但不包含一個(gè)或多個(gè)分泌酶切割位點(diǎn)C端的結(jié)構(gòu)域或序列(諸如a(3淀粉狀蛋白(A(3)序列)的APP多肽(例如sAPPa或sAPP(3)。術(shù)語(yǔ)"胞外結(jié)構(gòu)域"、"胞外域"或"ECD"指APP基本上不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形式?？扇苄訣CD通常將具有少于1%的所述跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選將具有少于0.5。/。的所述結(jié)構(gòu)域?？梢岳斫?，為本發(fā)明多肽鑒定的任何跨膜結(jié)構(gòu)域是依照本領(lǐng)域常規(guī)用于鑒定該種類型疏水結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)而鑒定的?？缒そY(jié)構(gòu)域的精確邊界可以變化，但最有可能的是最初鑒定的結(jié)構(gòu)域任一末端不超過(guò)約5個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ECD將由多肽不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的(而且不是膜結(jié)合的)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域序列組成。術(shù)語(yǔ)"APP變體"意指如下文所定義的、與具有圖1B-1D所示氨基酸序列的人APP具有至少約80。/。，優(yōu)選至少約85%、86%、87%、88%、89%，更優(yōu)選至少約90%、91%、92%、93%、94%,最優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98。/。或99。/()氨基酸序列同一性的APP多肽，或其可溶性片段，或其可溶性胞外結(jié)構(gòu)域。此類變體包括例如在圖1B-lD全長(zhǎng)或成熟序列的N-或C-末端添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的APP多肽或者在多肽的內(nèi)部序列或結(jié)構(gòu)域中插入或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的APP多肽，包括來(lái)自其它物種的變體，但排除天然序列APP多肽。"DR6"或"DR6受體"包括本領(lǐng)域所指的其多核苷酸和多肽序列如圖1A-1至lA-2所示的受體。Pan等人記載了稱作"DR6"或"TR9"的TNF受體家族成員的多核苷酸和多肽序列(Pan等，F(xiàn)EBSLett.,431:351-356(1"8);還可參見美國(guó)專利6,358,508;6,667,390;6，919，078;6,949,358)。人DR6受體是655個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(見圖lA-2)，其具有推定的信號(hào)序列(氨基酸1-41)、胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸42-349)、跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸350-369)、接著是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸370-655)。術(shù)語(yǔ)"DR6受體"在用于本文時(shí)涵蓋天然序列受體和受體變體。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋在多種哺乳動(dòng)物(包括人)中表達(dá)的DR6受體。DR6受體可以是內(nèi)源表達(dá)的，正如在多種人組織譜系中所發(fā)生的，或者可以是通過(guò)重組或合成方法而表達(dá)的。"天然序列DR6受體"包括與衍生自自然界的DR6受體具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列DR6受體可具有來(lái)自任何哺乳動(dòng)物(包括人)的天然存在DR6受體的氨基酸序列。此類天然序列DR6受體可以從自然界分離，或者可通過(guò)重組或合成手段生成。術(shù)語(yǔ)"天然序列DR6受體"明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的受體(例如包含例如胞外結(jié)構(gòu)域序列的可溶形式)、天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體。受體變體可包括天然序列DR6受體的片段或刪除突變體。術(shù)語(yǔ)"胞外結(jié)構(gòu)域"、"胞外域，，或"ECD，，指DR6受體基本上不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形式?？扇苄訣CD通常將具有少于1。/。的所述if夸膜結(jié)構(gòu)域和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選將具有少于0.5。/。的所述結(jié)構(gòu)域。可以理解，為本發(fā)明多肽鑒定的任何跨膜結(jié)構(gòu)域是依照本領(lǐng)域常規(guī)用于鑒定該種類型疏水結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)而鑒定的?？缒そY(jié)構(gòu)域的精確邊界可以變化，但最有可能的是最初鑒定的結(jié)構(gòu)域任一末端不超過(guò)約5個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ECD將由多肽不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的(而且不是膜結(jié)合的)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域序列組成。術(shù)語(yǔ)"DR6變體，，意指如下文所定義的，與具有圖1A所示推導(dǎo)氨基酸序列的人DR6具有至少約80。/。，優(yōu)選至少約85%、86%、87。/。、88%、89%，更優(yōu)選至少約90%、91%、92%、93%、94%，最優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98。/o或99。/。氨基酸序列同一性的DR6多肽，或其可溶性片段，或其可溶性胞外結(jié)構(gòu)域。此類變體包括例如在圖1A全長(zhǎng)或成熟序列的N-或C-末端添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的DR6多肽或者在多肽的內(nèi)部序列或結(jié)構(gòu)域中插入或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的DR6多肽，包括來(lái)自其它物種的變體，但排除天然序列DR6多肽。任選的是，DR6變體包括包含圖lA氨基酸l-349或42-349及至多10處保守氨基酸替代的可溶形式DR6受體。優(yōu)選的是，此類變體起DR6拮抗劑的作用，如下文所定義的。術(shù)語(yǔ)"DR6拮抗劑"以最廣義使用，包括任何在體外、原位、在體內(nèi)或回體(exvivo)部分或完全阻斷、抑制、或中和DR6受體結(jié)合其關(guān)聯(lián)配體(優(yōu)選其關(guān)聯(lián)配體APP)，或者激活神經(jīng)元細(xì)胞或組織中的一種或多種胞內(nèi)信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑之能力的分子。舉例而言，DR6拮抗劑可部分或完全阻斷、抑制、或中和DR6受體激活導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞或組織中凋亡或細(xì)胞死亡的神經(jīng)元細(xì)胞或組織中一種或多種胞內(nèi)信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力。DR6拮抗劑可通過(guò)多種機(jī)制來(lái)起部分或完全阻斷、抑制、或中和DR6的作用，包括但不限于通過(guò)阻斷、抑制、或中和關(guān)聯(lián)配體對(duì)DR6的結(jié)合、DR6與其關(guān)聯(lián)配體(例如APP)間復(fù)合物的形成、DR6受體的寡聚化、DR6受體與異源共同受體間復(fù)合物的形成、關(guān)聯(lián)配體對(duì)DR6受體/異源共同受體復(fù)合物的結(jié)合、或DR6受體、異源共同受體、及其關(guān)聯(lián)配體間復(fù)合物的形成。DR6拮抗劑可以以直接或間接方式發(fā)揮功能。本發(fā)明所涵蓋的DR6拮抗劑包括但不限于APP抗體、DR6抗體、免疫粘附素、DR6免疫粘附素、DR6融合蛋白、共價(jià)修飾形式DR6、DR6變體及其融合蛋白、或高級(jí)寡聚物形式DR6(二聚體、聚集體)、或同聚物或異聚物形式DR6、小分子(諸如JNK信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的藥理學(xué)抑制物，包括JunN-末端激酶JNK活性的小分子和肽抑制物)、在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中在JNK上游發(fā)揮功能的蛋白激酶MLK和MKK活性的藥理學(xué)抑制物、JNK結(jié)合支架蛋白JIP-1的藥理學(xué)抑制物、JNK結(jié)合其底物(諸如c-Jun或AP-l轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物)的藥理學(xué)抑制物、JNK介導(dǎo)的其底物(諸如JNK結(jié)合域(JBD)肽)和/或JNK的底物結(jié)合域的磷酸化的藥理學(xué)抑制物和/或包含JNK底物磷酸化位點(diǎn)的肽抑制物、阻斷ATP結(jié)合JNK的小分子、和阻斷底物結(jié)合JNK的小分子。為了測(cè)定DR6拮抗劑是否部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體激活神經(jīng)元細(xì)胞或組織中的一種或多種胞內(nèi)信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力，可實(shí)施測(cè)定法來(lái)評(píng)估DR6拮抗劑對(duì)例如各種神經(jīng)元細(xì)胞或組織的影響(如實(shí)施例中所述)，以及在中風(fēng)/腦缺血的體內(nèi)模型、神經(jīng)變性性疾病的體內(nèi)模型(諸如帕金森氏病的小鼠模型、阿耳茨海默氏病的小鼠模型、肌萎縮性側(cè)索硬化ALS的小鼠模型、脊髓性肌萎縮SMA的小鼠模型、局灶性和整體性腦缺血的小鼠/大鼠模型(例如常見的頸動(dòng)脈閉塞模型或大腦中動(dòng)脈閉塞模型)中、或在離體(exvivo)全胚胎培養(yǎng)物中?？梢砸砸阎捏w外或體內(nèi)測(cè)定格式來(lái)實(shí)施各種測(cè)定法，諸如下文描述的或如本領(lǐng)域已知的和文獻(xiàn)中記載的(參見例如McGowan等，TRENDSinGenetics,22:281-289(2006);Fleming等，NeuroRx,2:495-503(2005);Wong等，NatureNeuroscience,5:633-639(2002))。用于測(cè)定DR6拮抗劑是否部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體激活神經(jīng)元細(xì)胞或組織中一種或多種胞內(nèi)信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力的測(cè)定法的一個(gè)實(shí)施方案包括在存在或不存在DR6拮抗劑或潛在DR6拮抗劑(即感興趣分子)的情況中將DR6和APP組合，然后在存在此DR6拮抗劑或潛在DR6拮抗劑的情況中檢測(cè)對(duì)DR6結(jié)合APP的抑制。"核酸，，意圖包括任何DNA或RNA，例如組織樣品中存在的染色體、線粒體、病毒和/或細(xì)菌核酸。術(shù)語(yǔ)"核酸"涵蓋雙鏈核酸分子的兩條鏈或其中之一，包括完整核酸分子的任何片段或部分。"基因，，意指在編碼或轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)或調(diào)控其它基因表達(dá)方面具有功能性作用的任何核酸序列或其部分?；蚩梢酝耆韶?fù)責(zé)編碼功能性蛋白質(zhì)的核酸組成，或者只有部分核酸負(fù)責(zé)編碼或表達(dá)蛋白質(zhì)。核酸序列可以在基因的外顯子、內(nèi)含子、起始或終止區(qū)、啟動(dòng)子序列、其它調(diào)控序列或獨(dú)特鄰近區(qū)中包含遺傳異常。術(shù)語(yǔ)"氨基酸，，指所有天然存在的L-a-氨基酸。此定義意圖包括正亮氨酸、鳥氨酸和高半胱氨酸。氨基酸通過(guò)單字母或三字母標(biāo)示鑒別AspD天冬氨酸lieI異亮氨酸ThrT蘇氨酸LeuL亮氨酸SerS絲氨酸TyrY酪氨酸GluE谷氨酸PheF苯丙氨酸ProP脯氨酸HisH組氨酸GlyG甘氨酸LysK賴氨酸AlaA丙氨酸ArgR精氨酸CysC半胱氨酸TipW色氨酸ValV纈氨酸GinQ谷氨酰胺MetM曱硫氨酸AsnN天冬酰胺在附圖中，可采用某些其它單字母或三字母標(biāo)示來(lái)指向和鑒定序列中給定位置處的兩種或多種氨基酸或核苦酸。"分離的"，在用于描述本文中所公開的各種肽或蛋白質(zhì)時(shí)，意指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的肽或蛋白質(zhì)。肽或蛋白質(zhì)的天然環(huán)境的污染性成分指通常會(huì)干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將肽或蛋白質(zhì)純化至(1)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(2)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的非還原性或還原性條件下的SDS-PAGE,達(dá)到同質(zhì)，或(3)根據(jù)質(zhì)譜或肽作圖技術(shù)，達(dá)到同質(zhì)。既然肽或蛋白質(zhì)的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的物質(zhì)包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位肽或蛋白質(zhì)。然而，分離的肽或蛋白質(zhì)通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。關(guān)于本文中所鑒定的序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分，候選序列中與參考序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行序列對(duì)比以測(cè)定百分比氨基酸序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定測(cè)量序列對(duì)比的適宜參數(shù)，包括指派對(duì)所比較的全長(zhǎng)序列獲得最大對(duì)比所需的算法。為了本發(fā)明，可使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2來(lái)獲得百分比氨基酸序列同一性值，ALIGN-2程序由Genentech公司編寫，其源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國(guó)版權(quán)局(USCopyrightOffice,Washington,DC，20559),并以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087注冊(cè)。公眾可通過(guò)Genentech公司(SouthSanFrancisco,CA)得到ALIGN-2程序。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性，，可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易的確定，而且通常根據(jù)探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。一般而言，較長(zhǎng)的探針要求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時(shí)變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同一性程度越高，可使用的相對(duì)溫度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對(duì)溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋，參見Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers(1995)。"高嚴(yán)格性條件"，如本文中所定義的，通過(guò)如下各項(xiàng)定義(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行清洗；0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基>5克酸鈉，于50。C;(2)在雜交過(guò)程中采用變性劑；50%(v/v)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，于42。C;或(3)采用50%甲酰胺，5xSSC(0.75MNaCl,0.075M檸檬酸鈉)，50mM石粦酸鈉(pH6.8),0.1%焦磷酸鈉，5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精DNA(50|ag/ml)，0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苷，于42。C，及于42。C在0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%曱酰胺中于55。C清洗，接著于55。C在含EDTA的0.1xSSC中進(jìn)行高嚴(yán)格性清洗。"中等嚴(yán)格條件，，可以如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborPress(1989)中所述鑒定，包括于37。C在含20%曱酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),5xDenhardt氏溶液，10°/。硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育過(guò)夜，接著于約37-50。C在lxSSC中清洗濾膜。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到如何在必要時(shí)調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。術(shù)語(yǔ)"引物，，指與互補(bǔ)RNA或DNA靶多核苷酸雜交并充當(dāng)通過(guò)核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用從單核普酸逐步合成多核苷酸的起點(diǎn)(如例如聚合酶鏈反應(yīng)中所發(fā)生的)的寡核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)"控制序列"指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)、和增強(qiáng)子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連才妄的"。例如，若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretoryleader)的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的，，意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必相鄰。連接可以通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)處的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。若沒有此類位點(diǎn)，則依照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"在用于本文時(shí)指與試劑諸如核酸探針或抗體直接或間接偶聯(lián)或融合，以便于檢測(cè)它所偶聯(lián)或融合的試劑的化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身可^r測(cè)的(例如^L射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可^r測(cè)的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"免疫粘附素"指將異源蛋白質(zhì)("粘附素")的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定域的效應(yīng)器功能聯(lián)合起來(lái)的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括不同于抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(即是"異源"的)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以從任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-l和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。"DR6受體抗體"、"DR6抗體"、或"抗DR6抗體"以廣義使用，指結(jié)合至少一種形式DR6受體(優(yōu)選人DR6受體，諸如圖1A所示DR6序列)或其胞外結(jié)構(gòu)域序列的抗體。任選的是，DR6抗體與異源序列或分子融合或連接。優(yōu)選的是，異源序列允許或幫助抗體形成更高等級(jí)或寡聚復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)"抗DR6抗體"及其語(yǔ)法等同物具體涵蓋下文實(shí)施例部分中所描述的DR6單克隆抗體。任選的是，DR6抗體結(jié)合DR6受體但不與任何其它肺瘤壞死因子家族受體(例如DR4、DR5、TNFR1、TNFR2、Fas)結(jié)合或發(fā)生交叉反應(yīng)。任選的是，根據(jù)BIAcore結(jié)合測(cè)定法的測(cè)量，本發(fā)明的DR6抗體在約0.067iiM到約0.(B3iiM的濃度范圍內(nèi)結(jié)合DR6受體。術(shù)語(yǔ)"抗APP抗體"、"APP抗體"及語(yǔ)法等同物以廣義使用，指結(jié)合至少一種形式APP(優(yōu)選人APP，諸如本文具體所述APP多肽同等型)的抗體。優(yōu)選的是，APP抗體是DR6拮抗性抗體。例如，在本文中所公開的用于生成和/或鑒定DR6拮抗劑的方法中，可以使用APP和/或其一部分的一種或多種同等型作為免疫原來(lái)免疫動(dòng)物(例如小鼠，作為生成單克隆抗體的過(guò)程的一部分)和/或作為探針來(lái)篩選化合物文庫(kù)(例如重組抗體庫(kù))。在本發(fā)明的實(shí)施方案中有用的典型APP多肽包括如下非限制性例子。可以選擇這些例示形式，用于本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，APP多肽包含全長(zhǎng)APP同等型，諸如圖l所示APP695和/或APP75,和/或APP77o同等型。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，APP多肽包含APP的翻譯后加工形式，例如經(jīng)歷了分泌酶(諸如a-分泌酶、p-分泌酶或y-分泌酶)切割的APP多肽(例如可溶性N-末端片段，諸如sAPPa或sAPP(3)。在本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案中，可以選擇APP多肽，以包含一個(gè)或多個(gè)特定結(jié)構(gòu)域，諸如N-末端胞外域(參見例如Quast等，F(xiàn)ASEBJ.2003;17(12):1739-41)、肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見例如Rossjohn等，NatStructBiol.1999Apr;6(4):327-31)、銅II型(參見例如Hesse等，F(xiàn)EBSLetters349(1):109-116(1994))或Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域(參見例如Ponte等，Nature;331(6156):525-7(1988))。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，APP多肽包含觀察到包含受到本文中所公開的DR6拮抗劑(諸如抗體或DR6免疫粘附素)識(shí)別的表位的序列，例如APP695的氨基酸22-81，一種包含單克隆抗體22C11所結(jié)合的表位的序列(參見例如Hilbich等，JournalofBiologicalChemistry,268(35):26571-26577(1993))。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，APP多肽不包含一種或多種特定結(jié)構(gòu)域或序列，例如不包含某些N-末端或C-末端氨基酸的APP多肽(例如實(shí)施例12中公開的人重組N-APP多肽)、不包含Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的APP多肽(例如APP695)、或不包含阿耳茨海默氏病(3淀粉狀蛋白(AP)序列的APP多肽(例如sAPP卩，一種不包含A卩40和/或A卩42序列的多肽)(參見例如Bond等,J.StructBiol.2003Feb;141(2):156-70)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的實(shí)施方案中所使用的APP多肽包含一種或多種結(jié)構(gòu)域或序列但不包含其它結(jié)構(gòu)域或序列，例如包含N-末端胞外域(或至少其觀察到受到DR6拮抗劑(諸如單克隆抗體22C11)結(jié)合的部分)但不包含一個(gè)或多個(gè)分泌酶切割位點(diǎn)C端的結(jié)構(gòu)域或序列(諸如a(3淀粉狀蛋白(A卩)序歹ll)的APP多狀(例如sAPPa或sAPPp)。4壬選的是，抗APP抗體會(huì)抑制APP多肽對(duì)DR6的結(jié)合，而且會(huì)在10iig/ml至50iag/ml的濃度結(jié)合至APP多肽，如本文中所描述的和/或如定量的基于細(xì)胞的結(jié)合測(cè)定法中所測(cè)量的。術(shù)語(yǔ)"抗體，，在本文中以最廣義使用，明確覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab'》和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。"天然抗體，，指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構(gòu)成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變域(VH)，接著是多個(gè)恒定域。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變域(VO,而另一端是一個(gè)恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。術(shù)語(yǔ)"可變的"指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)的三個(gè)區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR,它們大多釆取P-折疊片構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成P-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等，S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab"片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個(gè)剩余的"Fc"片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab')2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原。"Fv，，是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，每個(gè)可變域的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在VH-Vt二聚體表面上限定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)一起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或是只包含對(duì)抗原特異性的三個(gè)CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在成對(duì)Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來(lái)自任何脊推動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(人)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體可歸入不同的類。完整抗體有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的抗體對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作a、S、s、y和P。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和Vi結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，F(xiàn)v多肽在VH與VL結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)一步包含多肽接頭，其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pliickthun，于《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，第113巻，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，NewYork,第269-315頁(yè)，1994。術(shù)語(yǔ)"雙抗體"指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-ViJ中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(vo。通過(guò)使用過(guò)短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載于例如EP404,097;WO93/11161;Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)。此外，與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)在于它們是由雜交瘤培養(yǎng)物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)"單克隆"指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定方法來(lái)生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)首次由Kohler等(1975)Nature256:495記載的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可以通過(guò)重組DNA方法來(lái)制備(參見例如美國(guó)專利No.4,816,567)。"單克隆抗體，，也可以使用例如Clackson等(1991)Nature352:624-628及Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)分離。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利No.4,816,567;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如舊大陸猴類(OldWorldMonkey),諸如狒狒、恒河猴或獼猴)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的"靈長(zhǎng)類化"抗體(美國(guó)專利No.5,693,780)。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指以最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈可變域中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變域中的殘基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,(1991))和/或那些來(lái)自"高變環(huán)"的殘基(例如輕鏈可變域中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變域中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk，J,Mol.Biol.196:901-917(1987))。"框架區(qū)"或"FR"殘基指可變域中那些除此處定義的高變區(qū)殘基以外的殘基。"結(jié)合"目的抗原的抗體指能夠以足夠親和力和/或親合力結(jié)合該抗原，使為了本發(fā)明，"免疫療法，，指用抗體治療哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人類患者)的方法，其中抗體可以是未偶聯(lián)的或"棵露的"抗體，或者抗體可以偶聯(lián)或融合有異源分子或試劑，諸如一種或多種細(xì)胞毒劑，由此產(chǎn)生"免疫偶聯(lián)物"。"分離的，，抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(l)4艮據(jù)Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95%，最優(yōu)選重量超過(guò)99%,(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。術(shù)語(yǔ)"帶標(biāo)簽的"在用于本文時(shí)指包含抗體或多肽且其與"標(biāo)簽多肽"融合的嵌合分子。標(biāo)簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對(duì)其的抗體或者提供一些其它功能諸如寡聚的能力(例如具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的肽所發(fā)生的)，但又足夠短使得其不干擾所述抗體或多肽的活性。標(biāo)簽多肽優(yōu)選還是相當(dāng)獨(dú)特的，使得標(biāo)簽特異性抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽通常具有至少6個(gè)氨基酸殘基，通常約8個(gè)到約50個(gè)氨基酸殘基之間(優(yōu)選約10個(gè)到約20個(gè)殘基之間)。術(shù)語(yǔ)"Fc受體，，或"FcR"用于描述能結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是能結(jié)合IgG抗體的FcR(丫受體)，包括FcyRI、FcyRII、和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFcyRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Dagron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見RavetchandKinet,A畫.Rev.Immunol.9:457-492(1991》Capel等，Imm腦methods4:25-34(1994);及deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-341(1995)。術(shù)語(yǔ)"FcR"在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來(lái)將會(huì)鑒定的。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，其負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。FcR在本文中包括多態(tài)性，諸如編碼FcYRIIIa的基因中導(dǎo)致位于受體能結(jié)合IgGl的區(qū)域中第158位氨基酸或?yàn)楸奖彼?F)或?yàn)槔i氨酸(V)的遺傳二態(tài)性。純合纈氨酸FcyRIIIa(FqdlIa-158V)已經(jīng)在體外顯示出相對(duì)于純合苯丙氨酸FcyRIIIa(FcyRIIIa-158F)或雜合(FcYlIIa-158F/V)受體具有更高的對(duì)人IgGl的親和力且介導(dǎo)升高的ADCC。術(shù)語(yǔ)"多元醇，，在用于本文時(shí)泛指多輕基醇化合物。多元醇可以是例如任何水溶性聚(亞烷基氧化物)聚合物，而且可具有線性鏈或分支鏈。優(yōu)選的多元醇包括那些在一個(gè)或多個(gè)羥基位置用化學(xué)基團(tuán)諸如具有1至4個(gè)碳的烷基取代的多元醇。典型的是，多元醇是聚(亞烷基二醇)，優(yōu)選聚(乙二醇)(PEG)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，其它多元醇諸如聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中關(guān)于PEG描述的偶聯(lián)技術(shù)得以采用。多元醇包括本領(lǐng)域眾所周知的那些類型以及可公開獲得的那些類型，諸如從商業(yè)來(lái)源獲得，諸如Nektar⑧乂^司。術(shù)語(yǔ)"偶聯(lián)"(conjugate)在本文中依照其最廣泛的定義使用，指接合或連接到一起。若分子像接合在一起時(shí)那樣起作用或運(yùn)作，則它們是"偶聯(lián)"的。表述"有效量"指藥劑(例如DR6拮抗劑等)有效預(yù)防、緩解或治療所討論病癥或疾患的量。本發(fā)明的DR6拮抗劑在減緩或終止變性性神經(jīng)學(xué)病癥的進(jìn)展中或者在增強(qiáng)受損神經(jīng)元細(xì)胞或組織的修復(fù)和幫助恢復(fù)正確神經(jīng)功能中會(huì)是有用的。術(shù)語(yǔ)"處理"、"治療"和"療法"在用于本文時(shí)指治療性處理、預(yù)防性處理、和防范性處理。連續(xù)治療或施用指以至少每天一次為基礎(chǔ)、期間沒有中斷一天或多天的處理。間歇治療或施用或者間歇方式的治療或施用指本質(zhì)上并非連續(xù)而是循環(huán)的處理。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"病癥"一般指任何會(huì)受益于本文所述DR6拮抗劑治療的疾患。這包括慢性和急性病癥，以及那些使哺乳動(dòng)物傾向于所討論病癥的病理狀況。"神經(jīng)元細(xì)胞或組織"一般指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、中間神經(jīng)元(包括但不限于連合神經(jīng)元)、感覺神經(jīng)元(包括但不限于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元)、黑質(zhì)的多巴胺(DA)神經(jīng)元、紋狀體DA神經(jīng)元、皮層神經(jīng)元、腦干神經(jīng)元、脊髓中間神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元(包括但不限于海馬的CA1錐體神經(jīng)元)、和前腦神經(jīng)元。術(shù)語(yǔ)神經(jīng)元細(xì)胞或組織在本文中意圖指由細(xì)胞體、軸突和樹突組成的神經(jīng)元細(xì)胞，以及指可形成此類神經(jīng)元細(xì)胞一部分的軸突或樹突。"神經(jīng)學(xué)病癥，，在本文中用于指包括神經(jīng)變性性疾患、以中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙或以神經(jīng)元細(xì)胞或組織的壞死和/或凋亡為特征的神經(jīng)元細(xì)胞或組織損害損傷、及與營(yíng)養(yǎng)因子剝奪有關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷在內(nèi)的疾患。神經(jīng)變性性疾病的例子包括家族性和散發(fā)性肌萎縮性側(cè)索硬化(分別為FALS和ALS)、家族性和散發(fā)性帕金森氏病、亨庭頓氏病(亨廷頓舞蹈癥)、家族性和散發(fā)性阿耳茨海默氏病、脊髓性肌萎縮(SMA)、視神經(jīng)病(opticalneuropathies)(諸如青光眼或牽涉視網(wǎng)膜變性、糖尿病神經(jīng)病變、或黃斑變性的伴生疾病(associateddisease))、由于內(nèi)耳感覺細(xì)胞或神經(jīng)元變性引起的聽力損失、癲癇、貝耳氏麻痹(Bell，spalsy)、與染色體17連鎖的伴有帕金森綜合征(parkinsonism)的額顳癡呆(FTDP-17)、多發(fā)性硬化、彌漫性大腦皮層萎縮、Lewy小體癡呆、皮克病(Pickdisease)、三核苦酸重復(fù)病(trinucleotiderepeatdisease)、朊病毒病癥(priondisorder),和夏德二氏綜合征(Shy-Dragersyndrome)。神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷可源自危及神經(jīng)元細(xì)胞或組織的存活或正確功能的多種不同原因，包括但不限于源自例如限制(暫時(shí)地或永久地)血流的缺血狀況的急性和非急性損傷，就像在整體性和局灶性腦缺血(中風(fēng))中那樣；對(duì)例如大腦組織或脊髓的切口或切傷；神經(jīng)元組織中的損害或斑塊(placques);對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活所需要的營(yíng)養(yǎng)因子的剝奪；暴露于神經(jīng)毒素，-渚如^f匕療劑；以及偶發(fā)的其它疾病4犬態(tài)(incidentaltootherdiseasestates)i者如慢性代謝病諸如糖尿病或腎功能不全。"受試者，，或"患者"指需要治療的任何單個(gè)受試者，包括人。還意圖作為受試者包括的有參加臨床研究試驗(yàn)而沒有顯示出任何疾病臨床征候的任何受試者、參加流行病學(xué)研究的受試者、或作為對(duì)照的受試者。術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"在用于本文時(shí)指歸入哺乳類的任何哺乳動(dòng)物，包括人、牛、馬、犬、和貓。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物指人。II.本發(fā)明的例示性方法和材料先前的研究檢驗(yàn)了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞死亡現(xiàn)象(Hamburger等，LNe畫sci.,1:60-71(1981);Oppenheim,Ann.Rev.Neurosci.,14:453-501(1991);O，Leary等，J.Neu腦i.,6:3692-3705(1986);Henderson等，Nature,363:266-270(1993);Yuen等，BrainDev.,18:362-368(1996))。認(rèn)為神經(jīng)元細(xì)胞的死亡在多種神經(jīng)學(xué)病癥(諸如家族性和散發(fā)性肌萎縮性側(cè)索硬化(分別為FALS和ALS)、家族性和散發(fā)性帕金森氏病、亨庭頓氏病、家族性和散發(fā)性阿耳茨海默氏病和脊髓性肌萎縮(SMA))的形成和/或進(jìn)展中發(fā)揮作用(Price等，Science,282:1079-1083(1998))。申請(qǐng)人出人意料地發(fā)現(xiàn)DR6(TNFR家族的一個(gè)成員)在胚胎和成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(包括大腦皮層、海馬、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和脊髓的中間神經(jīng)元)中高度表達(dá)。如下文實(shí)施例中所述，申請(qǐng)人進(jìn)行了多種實(shí)驗(yàn)測(cè)定法來(lái)檢驗(yàn)DR6作為神經(jīng)元細(xì)胞存活或死亡的調(diào)節(jié)物可能發(fā)揮的作用。連合神經(jīng)元的存活依賴來(lái)自其中間耙物之一(脊髓的底板)的營(yíng)養(yǎng)支持。在體外外植體培養(yǎng)物中，申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)通過(guò)RNA干擾來(lái)抑制DR6表達(dá)阻斷連合神經(jīng)元的軸突變性。還在背側(cè)脊髓存活測(cè)定法中測(cè)試了抗DR6單克隆抗體，確定了通過(guò)DR6特異性抗體3F4.4.8、4B6.9.7、和1E5.5.7抑制DR6受體信號(hào)傳導(dǎo)阻止體外外植體培養(yǎng)物中連合神經(jīng)元的軸突變性。已經(jīng)在文獻(xiàn)中報(bào)道了DR6經(jīng)JNK的活化來(lái)發(fā)信號(hào)(Pan等，見上文1998;Zhao等，見上文2001)。因而，為了調(diào)查DR6-JNK信號(hào)傳導(dǎo)在軸突變性中的作用，進(jìn)行了背側(cè)脊髓存活測(cè)定法，其中用肽抑制劑L-JNK-I阻斷連合神經(jīng)元中的JNK信號(hào)傳導(dǎo)途徑。此JNK信號(hào)傳導(dǎo)抑制部分阻斷背側(cè)脊髓存活測(cè)定法中的軸突變性。如此，認(rèn)為DR6至少部分經(jīng)JNK途徑發(fā)出軸突變性過(guò)程信號(hào)。為了更好地理解發(fā)育過(guò)程中DR6在神經(jīng)元細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)中的作用，在全胚培養(yǎng)系統(tǒng)中用抗DR6抗體阻斷DR6信號(hào)傳導(dǎo)。驚人的是，某些DR6特異性抗體對(duì)DR6信號(hào)傳導(dǎo)的抑制在此系統(tǒng)中針對(duì)天然發(fā)生的發(fā)育性細(xì)胞死亡保護(hù)脊髓神經(jīng)元。因此，DR6拮抗劑(諸如DR6拮抗性抗體)可用于降#^神經(jīng)學(xué)病癥(諸如神經(jīng)變性性病癥，例如ALS、SMA、阿耳茨海默氏病、和帕金森氏病、FTDP-17、亨庭頓氏病)和中風(fēng)中發(fā)生的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。為了檢驗(yàn)DR6在體內(nèi)是否真正地發(fā)揮促凋亡受體的功能，申請(qǐng)人分析了處于發(fā)育階段E15.5的DR6敲除胚的表型。與DR6作為神經(jīng)元細(xì)胞存活的負(fù)調(diào)節(jié)物的作用一致，在DR6缺失脊髓和背4艮神經(jīng)節(jié)中檢測(cè)到與DR6雜合同窩出生者對(duì)照相比神經(jīng)元細(xì)胞死亡降低大約40。/。至50%。申請(qǐng)人還出人意料地發(fā)現(xiàn)淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)是DR6受體的關(guān)聯(lián)配體，而且APP發(fā)揮經(jīng)DR6受體觸發(fā)軸突變性的功能。先前假設(shè)淀粉狀蛋白前體蛋白在阿耳茨海默氏病中發(fā)揮一些盡管沒有完全了解的作用(Selkoe,J.Biol,Chem.271:18295(1996);Scheuner;等,NatureMed.2:864(1996);Goate,等，Nature349:704(1991》。認(rèn)為DR6拮抗劑在治療各種神經(jīng)學(xué)病癥中會(huì)是尤其有用的。本發(fā)明因而提供了DR6拮抗劑組合物和用于在哺乳動(dòng)物中抑制、阻斷和中和DR6活性的方法，包括施用有效量的DR6拮抗劑。優(yōu)選的是，所采用的DR6拮抗劑量會(huì)是有效阻斷軸突變性和神經(jīng)元細(xì)胞死亡的量。這可以依照例如下文和實(shí)施例中所描述的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。素、包含DR6和/或APP的融合蛋白、DR6和/或APP的共價(jià)修飾形式、DR6和/或APP變體、其融合蛋白、及DR6和/或APP抗體。本文中描述了可用于生成拮抗劑的多種技術(shù)。例如，描述了用于制備DR6和APP多肽的方法和技術(shù)。還描述了DR6和APP多肽的進(jìn)一步修飾、及針對(duì)DR6和APP的抗體。本文中所公開的方法具有許多實(shí)施方案。本發(fā)明提供了抑制DR6結(jié)合APP的方法，包括在DR6對(duì)APP的結(jié)合受到抑制的條件下將DR6多肽和/或APP多肽暴露于一種或多種DR6拮抗劑。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案提供了抑制對(duì)包含SEQIDNO:1氨基酸1-655的DR6多肽和包含SEQIDNO:6氨基酸66-81的APP多肽(例如sAPPP)的結(jié)合的方法，該方法包括將DR6多肽和APP多肽與結(jié)合DR6或APP的分離的拮抗劑組合，其中所述分離的拮抗劑選自結(jié)合APP的抗體、結(jié)合DR6的抗體和包含SEQIDNO:l氨基酸l-354的可溶性DR6多肽中的至少一種；且所述分離的拮抗劑是根據(jù)其抑制DR6和APP結(jié)合的能力選擇的；使得DR6對(duì)APP的結(jié)合受到抑制。任選的是，在此類方法中，一種或多種DR6拮抗劑選自結(jié)合DR6的抗體(例如竟?fàn)幮砸种朴煞謩e以ATCC編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7單克隆抗體的結(jié)合的結(jié)合DR6的抗體)、包含SEQIDNO:1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽(例如DR6免疫粘附素)、或結(jié)合APP的抗體(例如單克隆抗體22C11)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，DR6拮抗劑是連接至一種或多種選自下組的非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物的結(jié)合DR6的抗體、結(jié)合APP的抗體或可溶性DR6多肽聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。在這些方法的任選實(shí)施方案中，DR6多肽是在一種或多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如連合神經(jīng)元細(xì)胞、感覺神經(jīng)元細(xì)胞或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞)的細(xì)胞表面上表達(dá)的，而且所述一種或多種DR6拮抗劑的結(jié)合抑制DR6活化或信號(hào)傳導(dǎo)。在本發(fā)明的一個(gè)此類實(shí)施方案中，所述方法是在體外實(shí)施的，用以抑制一種或多種表達(dá)DR6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的凋亡，v夂人而增強(qiáng)組織培養(yǎng)物中神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或再生和/或存活。舉例而言，此類DR6拮抗劑作為組織培養(yǎng)基(例如那些設(shè)計(jì)用于繁殖神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的)的體外添加劑是有用的。具體而言，正如本領(lǐng)域已知的，某些神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的繁殖可能由于此類細(xì)胞經(jīng)歷凋亡的傾向而成問(wèn)題。例如，有些神經(jīng)元培養(yǎng)物在缺乏外源因子(諸如神經(jīng)生長(zhǎng)因子)時(shí)死亡。本文中所提供的公開內(nèi)容顯示了DR6拮抗劑可用于此類神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物以增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或再生和/或存活，例如以與此類培養(yǎng)物中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的使用類似的方式。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以在患有神經(jīng)學(xué)疾患或病癥的哺乳動(dòng)物中體內(nèi)實(shí)施抑制DR6結(jié)合APP的方法。任選的是，神經(jīng)學(xué)疾患或病癥是肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏病、亨庭頓氏病或阿耳茨海默氏病?；蛘?，神經(jīng)學(xué)疾患或病癥包括源自中風(fēng)、對(duì)大腦或脊髓組織的創(chuàng)傷、或神經(jīng)元組織中的損害的神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷。本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供了治療患有神經(jīng)學(xué)疾患或病癥的哺乳動(dòng)物的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的一種或多種DR6拮抗劑。典型的是，在此類方法中，一種或多種DR6拮抗劑選自結(jié)合DR6的抗體、包含SEQIDNO:1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽、和結(jié)合APP的抗體。在本發(fā)明的任選實(shí)施方案中，神經(jīng)學(xué)疾患或病癥是肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏病、亨庭頓氏病或阿耳茨海默氏病?；蛘?，神經(jīng)學(xué)疾患或病癥包括源自中風(fēng)、對(duì)大腦或脊髓組織的創(chuàng)傷、或神經(jīng)元組織中的損害的神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用一種或多種別的治療劑。在本發(fā)明的某些例示性實(shí)施方案中，所述一種或多種別的治療劑選自NGF、凋亡抑制劑、EGFR抑制劑、P-分泌酶抑制劑、Y-分泌酶抑制劑、膽石咸酯酶抑制劑、抗AI3抗體和NMDA受體拮抗劑。任選的是，所述一種或多種DR6拮抗劑和/或別的治療劑是經(jīng)注射、輸注或灌注施用于哺乳動(dòng)物的。本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供了鑒定抑制DR6結(jié)合APP的感興趣分子的方法，該方法包括在存在或不存在感興趣分子的情況中組合DR6和APP，然后檢測(cè)在存在所述感興趣分子的情況中對(duì)DR6結(jié)合APP的抑制。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案提供了確定某組合物是否調(diào)控包含SEQIDNO:l氨基酸l-655(和任選的SEQIDNO:1氨基酸1-354)的DR6多肽和包含SEQIDNO:6氨基酸66-81的APP多肽(例如APP奶、sAPPot或sAPP(3)之間結(jié)合的方法，該方法包括將組合物與DR6和APP組合，然后將存在該組合物時(shí)的DR6和APP之間的合物是否調(diào)控DR6和APP之間的結(jié)合。任選的是，此類方法中的結(jié)合差異通過(guò)表面等離振子共振(SPR)技術(shù)(例如可自BiacoreLifeSciences獲得的)來(lái)測(cè)量。本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步包括依照這些方法鑒定的感興趣分子。本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括診斷患有神經(jīng)學(xué)病癥的或?qū)ι窠?jīng)學(xué)病癥易感的患者的方法，包括自所述患者獲取樣品并對(duì)所述樣品測(cè)試具有與SEQIDNO:1之DR6多肽序列不同的多肽序列的DR6多肽變體的存在。任選的是，該方法進(jìn)一步包括鑒定所述多肽變體是否具有與對(duì)SEQIDNO:1之DR6多肽序列觀察到的親和力不同的對(duì)APP多肽的親和力。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案包括確定哺乳動(dòng)物中是否存在包含SEQIDNO:1氨基酸1-655的DR6多肽變體的方法，該方法包括將哺乳動(dòng)物中所表達(dá)的DR6多肽的序列與SEQIDNO:1進(jìn)行比較，由此確定該哺乳動(dòng)物中是否存在DR6多肽變體。這些方法的某些實(shí)施方案可包括進(jìn)一步的步驟，即鑒定觀察到在哺乳動(dòng)物中存在的多肽變體是否是APP結(jié)合變體，其中APP結(jié)合變體表征為所具有的對(duì)包含SEQIDNO:6氨基酸66-81的淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)多肽(例如APP695、sAPPot或sAPPp)的結(jié)合親和力不同于包含SEQIDNO:1的DR6多肽對(duì)包含SEQIDNO:6氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合親和力。任選的是，此類方法中結(jié)合親和力的差異是通過(guò)表面等離振子共振(SPR)技術(shù)(例如可自BiacoreLifeSciences獲得的)測(cè)量的。這些方法的有些實(shí)施方案可包括選擇具有在肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏病、亨庭頓氏病或阿耳茨海默氏病中觀察到的癥狀或疾患的患者個(gè)體的步驟。在本文所述全長(zhǎng)天然序列DR6和APP多肽之外，可制備DR6和/或APP多肽變體。DR6和/或APP變體可通過(guò)將適宜核苷酸變化引入編碼DNA和/或通過(guò)期望多肽的合成來(lái)制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，氨基酸變化可能改變DR6和/或APP多肽的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置或者改變膜錨定特征。本文所述DR6和/或APP多肽中的變異可以例如4吏用關(guān)于保守和非保守突變的任何技術(shù)和指導(dǎo)方針來(lái)產(chǎn)生，例如美國(guó)專利No.5,364，934中所提出的。變異可以是一個(gè)或多個(gè)編碼多肽的密碼子的替代、刪除或插入，其導(dǎo)致與天然序列多肽相比氨基酸序列中的變化。任選地，變異是通過(guò)在DR6和/或APP多肽的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中用任何其它氨基酸替代至少一個(gè)氨基酸實(shí)現(xiàn)的。確定哪個(gè)氨基酸殘基可以被插入、替代或刪除而不會(huì)不利地影響期望活性的指導(dǎo)可以通過(guò)比較DR6多肽的序列與同源的已知蛋白質(zhì)分子的序列，并使高度同源性的區(qū)域中產(chǎn)生的氨基酸序列變化的數(shù)目最小化而發(fā)現(xiàn)。氨基酸替代可以是用另一個(gè)具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸替代一個(gè)氨基酸的結(jié)果，諸如用絲氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。任選地，插入或刪除可以在大約1至5個(gè)氨基酸的范圍中?？梢匀缦麓_定容許的變異，即在序列中系統(tǒng)地產(chǎn)生氨基酸的插入、刪除或替代，并對(duì)所得的變體測(cè)試DR6和/或APP拮抗活性。本文中提供了DR6和/或APP多肽片段。此類片段可以是在N端或C端截短的，或者可以缺少內(nèi)部殘基，例如在與全長(zhǎng)天然蛋白相比時(shí)。某些片段缺少對(duì)于DR6多肽的期望生物學(xué)活性不是至關(guān)重要的氨基酸殘基。DR6和/或APP多肽可以通過(guò)許多常規(guī)技術(shù)中的任一種來(lái)制備?？梢曰瘜W(xué)合成期望的肽片段。備選的方法牽涉通過(guò)酶促消化生成多肽片段，例如通過(guò)用已知在由特定氨基酸殘基限定的位點(diǎn)處切割蛋白質(zhì)的酶處理蛋白質(zhì)，或通過(guò)用合適的限制酶消化DNA并分離期望片段來(lái)實(shí)現(xiàn)。另一種合適的技術(shù)牽涉分離并擴(kuò)增編碼期望多肽片段的DNA片段，其通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)現(xiàn)。在PCR中的5，和3，引物上采用限定DNA片段的期望端的寡核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，下表中優(yōu)選替代的標(biāo)題下顯示了感興趣的保守替代。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性變化，那么可導(dǎo)入表中稱為"例示替代"的更實(shí)質(zhì)變化，或如下文參照氨基酸分類進(jìn)一步所述，并篩選產(chǎn)物。表<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>對(duì)DR6和/或APP多肽的功能或免疫學(xué)身份的實(shí)質(zhì)性修飾可通過(guò)選擇對(duì)維持以下方面的效果差異顯著的替代來(lái)實(shí)現(xiàn)(a)替代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為(折疊)片層或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在殘基可如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性、親水性的cys、ser、thr;(3)酸性的asp、glu;(4)石成性的asn、gln、his、lys、arg;(5)影響鏈取向的殘基gly、pro;及(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守替代需要用這些類別之一的成員替換另一個(gè)類別的。還可以將此類替代殘基引入保守替代位點(diǎn)中，或更優(yōu)選地，引入剩余(非保守的)位點(diǎn)中。變異可以使用本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)產(chǎn)生，諸如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變、丙氨酸掃描、及PCR誘變?？梢詫?duì)所克隆的DNA實(shí)施定點(diǎn)誘變[Carter等，Nucl.AcidsRes"13:4331(1986);Zoller等，Nucl.AcidsRes"10:6487(1987)]、盒式誘變[Wdls等，Gene,34:315(1985)]、限制性選擇誘變[Wells等,Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA，317:415(1986)]或其它已知的技術(shù)以生成DR6多肽變體DNA。還可以采用掃描氨基酸分析以沿著連續(xù)的序列鑒定一個(gè)或多個(gè)氨基酸。相對(duì)較小的、中性氨基酸是優(yōu)選的掃描氨基酸之一。此類氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、及半胱氨酸。丙氨酸通常是此組中優(yōu)選的掃描氨基酸，因?yàn)槠湎顺鯬-碳外的側(cè)鏈，且不太可能改變變體的主鏈構(gòu)象[Cunningham和Wells，Science,244:1081-1085(1989)]。通常還優(yōu)選丙氨酸，因?yàn)槠涫亲畛Ｒ姷陌被?。進(jìn)一步地，其在掩蔽位置和暴露位置兩者中被頻繁發(fā)現(xiàn)[Creighton,TheProteins,(W.H.Freeman&Co.，N.Y);Chothia，J.Mol.Biol.,150:1(1976)]。若丙氨酸替代不能產(chǎn)生足夠量的變體，則可以使用電子等排(isoteric)氨基酸。不涉及維持DR6和/或APP多肽的正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基一般也可以用絲氨酸替代以改善分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反地，可以將半胱氨酸鍵添加至DR6和/或APP多肽以改善其穩(wěn)定性。本文中所公開的發(fā)明的各實(shí)施方案適用于極其廣泛的APP多肽。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，APP是圖1B-1D所示全長(zhǎng)695、750或770APP同等型(isoform)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，APP包含具有胞外域且自翻譯后加工事件生成的APP的N端部分(例如sAPPa或sAPP卩)。任選的是，例如，APP可包括695、750或770APP同等型之一的可溶形式，其源自分泌酶的切割作用，例如神經(jīng)元APP695的可溶形式，其源自(3-分泌酶的切割作用。在一個(gè)具體的例示性實(shí)施方案中，APP包含APP695的氨基酸20-591(參見例如Jin等，J.Ne扁ci.,14(9):5461-5470(1994))。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，APP包括具有受到單克隆抗體22C11(例如可得自ChemiconInternationalInc.,Temecula，CA，U.S.A.)識(shí)別的表位的多肽。任選的是，APP包含APP695的殘基66-81,即包含22Cll表位的區(qū)域(參見例如Hilbrich,J.B.C.巻268,期35:26571-26577(1993))。以下描述主要涉及通過(guò)培養(yǎng)經(jīng)包含DR6多肽編碼核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)生成DR6和/或APP多肽。當(dāng)然，可以采用備選方法(其在本領(lǐng)域是公知的)來(lái)制備DR6和/或APP多肽。例如，合適的氨基酸序列或其部分可以通過(guò)使用固相技術(shù)的直接肽合成來(lái)生成[參見例如Stewart等，Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,CA(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.，85:2149-2154(1963)]。體外蛋白質(zhì)合成可以使用手動(dòng)技術(shù)或通過(guò)自動(dòng)化來(lái)實(shí)施?？梢詫?shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成，例如使用AppliedBiosystems肽合成儀(FosterCity,CA)使用制造商的說(shuō)明書來(lái)實(shí)現(xiàn)。DR6和/或APP多肽的各個(gè)和/或APP多肽。所描述的方法和技術(shù)類似地適用于DR6和/或APP變體、修飾形式的DR6和/或APP、及DR6和/或APP抗體的生產(chǎn)。編碼DR6和/或APP多肽的DNA的分離可以自cDNA文庫(kù)獲得編碼DR6和/或APP多肽的DNA，該cDNA文庫(kù)是從認(rèn)為擁有DR6和/或APP多肽mRNA并以可檢測(cè)水平表達(dá)它的組織中制備的。因而，人DR6和/或APP多肽DNA可以方便地獲自從人組織中制備的cDNA文庫(kù)。編碼DR6和/或APP多肽的基因還可以獲自基因組文庫(kù)或通過(guò)已知的合成規(guī)程(例如自動(dòng)化核酸合成)獲得?？梢杂迷O(shè)計(jì)的探針(諸如至少約20-80個(gè)堿基的寡核苷酸)篩選文庫(kù)以鑒定感興趣基因或由其編碼的蛋白質(zhì)。用所選擇的探針篩選cDNA或基因組文庫(kù)可以使用標(biāo)準(zhǔn)頭見程(諸如記載于Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中的)來(lái)進(jìn)行。分離編碼DR6多肽的基因的備選方法是使用PCR方法[Sambrook等，見上文；Dieffenbach等，PCRPrimer:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)]。篩選cDNA文庫(kù)的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。選作探針的寡核苷酸序列應(yīng)當(dāng)有足夠的長(zhǎng)度，并且是足夠明確的以使得假陽(yáng)性降至最低。寡核苷酸優(yōu)選是標(biāo)記的，使得其可以在與正在被篩選的文庫(kù)中的DNA雜交后被檢出。標(biāo)記的方法在本領(lǐng)域是公知的，并包括使用放射性標(biāo)記物(像"P-標(biāo)記的ATP)、生物素化或酶標(biāo)記。雜交條件(包括中等嚴(yán)格性和高度嚴(yán)格性)在Sambrook等，見上文中有提供。此類文庫(kù)篩選方法中鑒定的序列可以與公共數(shù)據(jù)庫(kù)(諸如GenBank)或其它私有序列數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)且可獲得的其它已知序列相比較和比對(duì)。分子的規(guī)定區(qū)域內(nèi)或整個(gè)全長(zhǎng)序列的序列同一性(或是在氨基酸水平或是在核苷酸水平)可以使用本領(lǐng)域已知的及本文所述的方法來(lái)測(cè)定?？梢匀缦芦@得具有蛋白質(zhì)編碼序列的核酸，即使用本文首次公開的推理氨基酸序列，并在需要時(shí)如Sambrook等，見上文所述的那樣使用常規(guī)引物延伸規(guī)程來(lái)篩選選擇的cDNA或基因組文庫(kù)以檢測(cè)前體，并處理可能還沒有逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的mRNA中間體。宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化將宿主細(xì)胞用本文所述用于DR6和/或APP多肽生成的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改良的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。技術(shù)人員無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可以選擇培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)基、溫度、pH等。一般而言，用于使細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力最大化的原理、方案、及實(shí)踐技術(shù)可參見MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach,M.Butler,編(IRLPress,1991)和Sambrook等，見上文。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法對(duì)于普通技術(shù)人員是已知的，例如，CaCl2、CaP04、脂質(zhì)體介導(dǎo)的和電穿孔。才艮據(jù)使用的宿主細(xì)胞，使用對(duì)于此類細(xì)胞適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)實(shí)施轉(zhuǎn)化。采用氯化鈣的鈣處理(如記載于Sambrook等，見上文的)或電穿孔一般用于原核生物。根癌土壤桿菌(^gra^"en'wwfwme/ac/era)感染用于某些檔:物細(xì)月包的轉(zhuǎn)化，如Shaw等，Gene，23:315(1983)和1989年6月29日公布的WO89/05859所記載的。對(duì)于沒有此類細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以采用Graham和vanderEb,Virology,52:456-457(1978)的磷酸鈣沉淀方法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的一般性方面已經(jīng)記載于美國(guó)專利No.4,399,216。典型地，依照VanSolingen等，J.Bact.,130:946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)的方法來(lái)實(shí)施向酵母中的轉(zhuǎn)化。然而，還可以使用用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法，諸如通過(guò)核顯微注射、電穿孔、與完整細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、或聚陽(yáng)離子，例如Polybrene、多鳥氨酸。對(duì)于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)，參見Keown等，MethodsinEnzymology,185:527-537(1990)和Mansour等，Nature,336:348-352(1988)。適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、或高等真核細(xì)胞。合適的原核生物包括但不限于真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性的或革蘭氏陽(yáng)性的生物體，例如腸桿菌科，諸如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌林是公眾可獲得的，諸如大腸桿菌KU菌林MM294(ATCC31,446);大腸桿菌X1776(ATCC31,537);大腸桿菌菌株W3110(ATCC27,325)及K5772(ATCC53,635)。其它合適的原核宿主細(xì)胞包括腸桿菌科(五"&ra6ac^7》ceae)，諸如埃希氏菌屬C&c/zen'c/H'G)(例如大腸桿菌或大腸埃希氏桿菌CE.co//))、腸桿菌屬(五"/erak^er)、歐文氏菌屬C&iWw'a)、克雷伯氏菌屬(A7eZwW/a)、變形菌屬(尸ra&ws)、沙門氏菌屬(5Wmo"e〃a)(例如鼠傷寒沙門氏菌OSa/mowe〃a(yp//miWww))、沙雷氏菌屬(Serra"a)(例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serra""及志賀氏菌屬0S72/geZ/a)、以及芽孢桿菌屬(萬(wàn)a"7//)(諸如枯草芽孢桿菌(及wto7/"和地衣芽孢桿菌(及//c/^w/onw'力(例如1989年4月12曰公開的DD266,710中所披露的地衣芽孢桿菌41P))、假單胞菌屬CP^wcfowo"os)(諸如銅綠假單胞菌CP"erag/mwa))、及鏈霉菌屬OS^印tom少c")。這些例子是例示性的而非限制性的。菌抹W3110是一種特別的優(yōu)選宿主或親本宿主，因?yàn)槠涫枪┲亟MDNA產(chǎn)物發(fā)酵用的常用宿主菌抹。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修飾菌抹W3110以在編碼宿主內(nèi)源性蛋白質(zhì)的基因中產(chǎn)生遺傳突變，此類宿主的例子包括大腸桿菌W3110菌林1A2(其具有完整基因型to"vO;大腸桿菌W3110菌抹9E4(其具有完整基因型to^p&3);大腸桿菌W3110菌抹27C7(ATCC55,244)(其具有完整基因型to"^p&3p/zW￡75f^gF-/ac」M9owprfew/);大腸桿菌W3110菌抹37D6(其具有完整基因型towJp/zoJ￡75f^gF-/ac_;/<59t/egi5om/7>&7//vG);大腸桿菌W3110菌林40B4(其是含非卡那霉素抗性&gP刪除突變的菌抹37D6);及具有1990年8月7日公告的美國(guó)專利No.4,946,783所披露的突變型周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌菌抹?；蛘?，體外克隆方法(例如PCR或其它核酸聚合酶反應(yīng))是合適的。在原核生物之外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)是適于DR6多肽編碼載體的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母或啤酒糖酵母(S"cc/zaram;/c^cev/w'ae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(iSc/z/zcwacc/wramycas/簡(jiǎn)6e)(Beach和Nurse,Nature,290:140[1981];1985年5月2日公布的EP139,383);克魯維氏酵母屬(尺/w^yveram少c^)宿主(美國(guó)專利No.4,943,529;Fleer等，Bio/Technology,9:968-975(1991))，諸如例如乳克魯維氏酵母(K/ac泡)(MW98-8C,CBS683,CBS4574;Louvencourt等，J.Bacteriol.,154(2):737-742[1983])、脆壁克魯維氏酵母(AT./ra^fo)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維氏酵母(K6w/gan'cw力(ATCC16,045)、威克曼氏克魯維氏酵母(尺w/c&ram")(ATCC24,178)、尺.m/故(ATCC56,500)、果蠅克魯維氏酵母(K(i簡(jiǎn)op/n7ar應(yīng))(ATCC36,906);VandenBerg等,Bio/Technology,8:135(1990))、耐熱克魯維氏酵母(尺Aermoto/erara)、及馬克斯克魯維氏酵母(《.marx/朋w);亞羅酵母屬OwrovWa)(EP402,226);巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/z/"(EP183,070;Sreekrishna等，J,BasicMicrobiol"28:265-278[1988]);假絲酵母屬(Ca"AWa);瑞氏木霉(7Hc/zo6ferwareas/a)(EP244,234);粗糙脈孢霉(7VeMrasporacrawa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76:5259-5263[1979]);許旺氏酵母屬(Sc/wa"m'ow少cas)，諸如西方許旺氏酵母(5"c/wfl"m'cw^c^occ/(afewtoto)(1990年10月31日公布的EP394,538);及絲狀真菌，諸如例如脈孢霉菌(7Vewmspora)、青霉屬CPew'c////ww)、彎頸霉屬(7b/y/70c/a(iz'訓(xùn))(1991年1月10曰公布的WO91/00357),及曲霉屬(^y/erg/〃w力宿主,i者^(guò)口才勾巢曲霉(Aw.t/w/am1)(Balance等,Biochem.Biophys.Res.Commun"112:284-289[1983];Tilburn等,Gene,26:205-221[1983];Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470-1474[1984])及黑曲霉(Am(Kelly和Hynes,EMBOJ.，4:475-479[1985])。曱基營(yíng)養(yǎng)型酵母在本文中是合適的，并包括但不限于選自下列屬的、能夠在曱醇上生長(zhǎng)的酵母漢遜氏酵母屬(//a"化"w/a)、假絲酵母屬、克勒克氏酵母屬(《/oecfera)、畢赤氏酵母屬(尸/c/n'a)、糖酵母屬OS^cc/zarawycas)、球擬酵母屬(ronz/opwX)、及紅酵母屬(i^o^foton//a)。這類酵母例示性的特定種類的列表可參見C.Anthony,TheBiochemistryofMethylotrophs，269(1982)。適于表達(dá)糖基化DR6和/或APP多肽的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無(wú)脊推動(dòng)物細(xì)胞的例子包括昆蟲細(xì)胞(諸如果蠅S2及夜蛾(Spodoptera)Sf9),以及植物細(xì)胞，諸如棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽牛花、番茄、及煙草的細(xì)胞培養(yǎng)物。已經(jīng)鑒定出很多桿狀病毒林和變體及相應(yīng)的來(lái)自下組宿主的許可性昆蟲宿主細(xì)月包，諸如草地夜蛾(Spocfo/^ra戶wg^erab)(毛蟲)、埃及伊蟲丈04etfesaegy;^')(蚊子)、白紋伊蚊(v4W^a/6o/^"w力(蚊子)、黑腹果蠅(Z>asop/7z7awe/a"ogos&r)(果繩)，及家蠶(5owZ)awoW)。用于轉(zhuǎn)染的多種病毒抹是公眾可獲得的(例如苜蓿尺蠖04wtogra//^ca/z/orm'ca)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5抹)，并且此類病毒可以用作依照本發(fā)明的本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。然而，興趣最大的是脊推動(dòng)物細(xì)胞，而且使培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的脊推動(dòng)物細(xì)胞增殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎系(293細(xì)胞或?yàn)榱嗽趹腋∨囵B(yǎng)中生長(zhǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，Graham等，J.GenVirol.36:59(1977));幼年倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCL10);中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CVlATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138,ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(HepG2，HB8065);小鼠乳房肺瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細(xì)胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)月包；及人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。將宿主細(xì)胞用上文所述供DR6和/或APP多肽生成用的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改良的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可復(fù)制載體的選擇和使用可以將編碼DR6和/或APP多肽的核酸(例如cDNA或基因組DNA)插入供克隆(DNA的擴(kuò)增)用的或供表達(dá)用的可復(fù)制載體中。多種載體是公眾可獲得的。載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒、病毒顆粒、或噬菌體形式。合適的核酸序列可以通過(guò)多種規(guī)程而插入載體中。一般而言，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入合適的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)中。載體構(gòu)件一般包括但不限于以下一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、及轉(zhuǎn)錄終止序列。含有一種或多種這些構(gòu)件的合適載體的構(gòu)建采用對(duì)于技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。DR6和/或APP不僅可以直接重組生成，而且還可以作為含異源多肽(其可以是在成熟蛋白或多肽的N端的信號(hào)序列或具有特定切割位點(diǎn)的其它多肽)的融合多肽而重組合成。一般而言，信號(hào)序列可以是載體的構(gòu)件，或者其可以是插入載體中的DR6和/或APP多肽編碼DNA的一部分。信號(hào)序列可以是原核信號(hào)序列，其選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩(wěn)定的腸毒素II前導(dǎo)序列。對(duì)于酵母分泌，信號(hào)序列可以是例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a-因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a-因子前導(dǎo)序列，后者記載于美國(guó)專利No.5,010,182)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母(C.a/6/ca"力葡糖淀粉酶前導(dǎo)(1990年4月4日公布的EP362,179)、或1990年11月15曰公布的WO90/13646所記載的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以使用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列來(lái)指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌，諸如來(lái)自相同或相關(guān)物種的分泌性多肽的信號(hào)序列，以及病毒分泌前導(dǎo)序列。表達(dá)載體和克隆載體都含有使得載體能夠在一種或多種所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。用于多種細(xì)菌、酵母、和病毒的此類序列是公知的。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適用于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2(i質(zhì)粒起點(diǎn)適用于酵母，而各種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體是有用的。表達(dá)和克隆載體典型地會(huì)包含選擇基因(也稱為選擇標(biāo)志)。典型的選擇基因編碼下述蛋白質(zhì)，其(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤、或四環(huán)素)的抗性，(b)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺陷，或(c)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)4定營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的例子是那些使得有能力攝取DR6和/或APP多肽編碼核酸的細(xì)胞得以鑒定的選擇標(biāo)志，諸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR時(shí)，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是DHFR活性缺陷的CHO細(xì)胞系，其制備和增殖如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)所述的。適合酵母中使用的選擇基因是酵母質(zhì)粒YRp7中存在的^p7基因[Stinchcomb等，Nature,282:39(1979);Kingsman等，Gene，7:141(1979);Tschemper等,Gene,10:157(1980)]。trpl基因提供了供缺乏在色氨酸中生長(zhǎng)能力的酵母突變型菌林(例如ATCCNo.44076或PEP4-1[Jones,Genetics,85:12(1977)])用的選擇標(biāo)志。表達(dá)和克隆載體通常包含與DR6和/或APP多肽編碼核酸序列可操作連接的啟動(dòng)子以指導(dǎo)mRNA合成。多種潛在宿主細(xì)胞所識(shí)別的啟動(dòng)子是公知的。適于與原核宿主一起使用的啟動(dòng)子包括P-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)[Chang等，Nature,275:615(1978);Goeddel等，Nature,281:544(1979)]、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)[Goeddel，NucleicAcidsRes"8:4057(1980);EP36,776]、及雜合啟動(dòng)子，諸如tac啟動(dòng)子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]。細(xì)菌系統(tǒng)中使用的啟動(dòng)子還會(huì)包含與編碼DR6和/或APP多肽的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。適于與酵母宿主一起使用的啟動(dòng)序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子[Hitzeman等，J.Biol.Chem.,255:2073(1980)]或其它糖酵解酶(諸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、及葡糖激酶)的啟動(dòng)子[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7:149(1968);Holland,Biochemistry,17:4900(1978)]。其它酵母啟動(dòng)子(其是具有額外優(yōu)勢(shì)即轉(zhuǎn)錄受生長(zhǎng)條件控制的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)是下組蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子區(qū)醇脫氬酶2、異細(xì)胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。適于在酵母表達(dá)中使用的載體和啟動(dòng)子在EP73,657中有進(jìn)一步的描述。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中來(lái)自載體的DR6和/或APP多肽轉(zhuǎn)錄受到如下啟動(dòng)子控制，例如自病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK2,211,504)、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒及猿病毒40(SV40))基因組、異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子)、及自熱休克啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子，倘若此類啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。高等真核生物轉(zhuǎn)錄編碼DR6和/或APP多肽的DNA可以通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體中而得以增加。增強(qiáng)子是對(duì)啟動(dòng)子起作用而增加其轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA元件，通常為約10-300bp。目前已知許多來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白、及胰島素)的增強(qiáng)子序列。典型地，然而，會(huì)使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括復(fù)制起點(diǎn)的晚期側(cè)上的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)的晚期側(cè)上的多瘤病毒增強(qiáng)子、及腺病毒增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以在DR6和/或APP多肽編碼序列的5，或3，位置剪接入載體中，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子5，的位點(diǎn)。真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人、或來(lái)自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)中使用的表達(dá)載體還會(huì)包含轉(zhuǎn)錄終止及使mRNA穩(wěn)定所必需的序列。此類序列通?？色@自真核生物的或病毒的DNA或cDNA的5，非翻譯區(qū)，偶爾地3，非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含作為編碼DR6多肽的mRNA的非翻譯部分中的多腺苷酸化片段轉(zhuǎn)錄的核苷酸區(qū)段。適于改編后在重組脊推動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中合成DR6和/或APP多肽的其它方法、載體和宿主細(xì)胞記載于Gething等，Nature,293:620-625(1981);Mantei等,Nature,281:40-46(1979);EP117,060;及EP117,058。培養(yǎng)宿主細(xì)胞用于生成本發(fā)明的DR6和/或APP多肽的宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商品化的培養(yǎng)基(諸如Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基((DMEM)Sigma))適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，Ham等，Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980),美國(guó)專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國(guó)專利Re.30,985中所述的任何培養(yǎng)基可以用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。任何這些培養(yǎng)基可以在需要時(shí)補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白、或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽類(諸如氯化鈉、鈣、鎂、及磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍中的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)、及葡萄糖或等同能源。還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的適當(dāng)濃度的任何其它必需的補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件(諸如溫度、pH等)就是那些先前與選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞一起使用的，而且對(duì)于普通技術(shù)人員是顯而易見的。檢測(cè)基因擴(kuò)增/表達(dá)基于本文所提供的序列，基因擴(kuò)增和/或表達(dá)可以在樣品中直接測(cè)量，例如使用適當(dāng)標(biāo)記的探針通過(guò)常規(guī)Southern印跡、Northern印跡(用以定量mRNA的轉(zhuǎn)錄)[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:52015205(1980)]、斑點(diǎn)印跡(DNA分析)、或原位雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘撸梢圆捎媚茏R(shí)別特定雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、及DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體。繼而可以標(biāo)記抗體，并可以實(shí)施測(cè)定法，其中雙鏈體結(jié)合至表面，使得在表面上形成雙鏈體后，可以檢出雙鏈體所結(jié)合的抗體的存在?；蛘?，基因表達(dá)可以通過(guò)免疫學(xué)方法(諸如細(xì)胞或組織切片的免疫組織化學(xué)染色和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的測(cè)定法)來(lái)測(cè)量以直接定量基因產(chǎn)物的表達(dá)。對(duì)于免疫組織化學(xué)染色和/或體液測(cè)定法有用的抗體可以是單克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳動(dòng)物中制備。方便地，抗體可以針對(duì)天然序列DR6多肽或針對(duì)基于本文所提供DR6序列的合成肽或針對(duì)與DR6DNA融合且編碼特定抗體表位的外源序列而制備。DR6多肽的純化可以從培養(yǎng)基或從宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中回收各種形式的DR6和/或APP多肽。若是膜結(jié)合的，則可以使用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或通過(guò)酶促切割而將其從所述膜中釋放。DR6多肽的表達(dá)中所采用的細(xì)胞可以通過(guò)多種物理或化學(xué)手段(諸如冷凍-融化循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎、或細(xì)胞溶胞劑)來(lái)破壞。可能希望從重組細(xì)胞蛋白或多肽中純化DR6和/或APP多肽。如下規(guī)程是合適的純化規(guī)程的例示通過(guò)在離子交換柱上分級(jí)；乙醇沉淀；反相HPLC;硅土上或陽(yáng)離子交換樹脂(諸如DEAE)上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE;硫酸銨沉淀；使用例如SephadexG-75的凝膠過(guò)濾；蛋白ASepharose柱以除去污染物，諸如IgG;及金屬螯合柱以結(jié)合加表位標(biāo)簽形式的DR6和/或APP多肽?？梢圆捎玫鞍踪|(zhì)純化的多種方法，而且此類方法在本領(lǐng)域中是已知的，并i己載于例長(zhǎng)口Deutscher,MethodsinEnzymology,182(1990);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag，NewYork(1982)。戶斤選擇的純化步驟會(huì)取決于例如所使用的生成方法和所生成的特定DR6多肽的性質(zhì)。本發(fā)明的方法中可以采用可溶形式的DR6和/或APP作為DR6拮抗劑。此類可溶形式的DR6和/或APP可以包含修飾，如下文所述(諸如通過(guò)與免疫球蛋白、表位標(biāo)簽或亮氨酸拉鏈融合)。進(jìn)一步設(shè)想了將免疫粘附素分子用于本文中的方法。DR6和/或APP免疫粘附素可包含各種形式的DR6和/或APP，諸如全長(zhǎng)多肽以及可溶、胞外結(jié)構(gòu)域形式的DR6和/或APP或其片段。在具體的實(shí)施方案中，所述分子可包含DR6多肽與免疫球蛋白或其特定區(qū)域的融合物。對(duì)于二價(jià)形式的免疫粘附素，此類融合物可以是與IgG分子Fc區(qū)的融合物。Ig融合物優(yōu)選包含用可溶形式的(跨膜結(jié)構(gòu)域刪除或滅活的)多肽代替Ig分子內(nèi)至少一個(gè)可變區(qū)的替代。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的鉸鏈、CH2和CH3，或者鉸鏈、CH1、CH2和CH3區(qū)。關(guān)于免疫球蛋白融合物的生成還可參見美國(guó)專利第5，428，130號(hào)，1995年6月27日公告及Chamow等，TIBTECH，14:52-60(1996)。一種任選的免疫粘附素設(shè)計(jì)是將粘附素(例如DR6和/或APP胞外域)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)進(jìn)行組合。通常，在制備本發(fā)明的免疫粘附素時(shí)，將編碼粘附素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸融合在編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列N-末端的核酸的C-末端側(cè)，然而N-末端融合物也是可能的。通常，在此類融合物中，所編碼的嵌合多肽將至少保留有功能活性的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還可以對(duì)恒定區(qū)Fc部分的C-末端進(jìn)行融合，或者緊挨著重鏈CHi或輕鏈對(duì)應(yīng)區(qū)的N-末端進(jìn)行。進(jìn)行融合的精確位點(diǎn)不是至關(guān)重要的；具體位點(diǎn)是眾所周知的，而且可以進(jìn)行選擇以優(yōu)化免疫粘附素的生物學(xué)活性、分泌或結(jié)合特征。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將粘附素序列融合在免疫球蛋白G,(IgGDFc區(qū)的N-末端。有可能將整個(gè)重鏈恒定區(qū)與粘附素序列融合。然而，更優(yōu)選的是，在融合中使用在鉸鏈區(qū)中緊挨著在化學(xué)上定義IgGFc的木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)(即殘基216,以重鏈恒定區(qū)的第一個(gè)殘基為114)或其它免疫球蛋白的類似位點(diǎn)上游開始的序列。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將粘附素氨基酸序列與IgG重鏈的(a)鉸鏈區(qū)、CH2和CH3，或者(b)CH!、鉸鏈、CH#CH3結(jié)構(gòu)i或融合。對(duì)于雙特異性免疫粘附素，將免疫粘附素裝配成多聚體，特別是異二聚體或異四聚體。通常，這些裝配好的免疫球蛋白將具有已知的單元結(jié)構(gòu)。基本的四鏈結(jié)構(gòu)單元就是IgG、IgD和IgE存在的形式。四鏈單元在更高分子量的免疫球蛋白中重復(fù)；IgM通常作為通過(guò)二硫鍵保持在一起的四個(gè)基本單元的五聚體存在。IgA球蛋白及偶爾的IgG球蛋白也可以以多聚體的形式存在于血清中。在多聚體的情況中，四個(gè)單元可以是各自相同的或不同的。下面示意性的列舉了在本文范圍內(nèi)的各種例示性的裝配好的免疫粘附素(a)ACL-ACL;(b)AC"ACh,ACl-ACh,ACl-VhCh,或VlCl-ACh);(c)ACl匿ACh-(ACl-ACh,ACl-VhCh，VlCl-ACh,或VlCl-VhCh)(d)ACL-VHCH-(ACH,ACl-VhCh,或VlCl-ACh);(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH,或VlCl-ACh);及(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2，其中各個(gè)A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；Vl是免疫球蛋白輕鏈可變域；Vh是免疫球蛋白重鏈可變域；Cl是免疫球蛋白輕鏈恒定域；Ch是免疫球蛋白重鏈恒定域；n是大于l的整數(shù)；Y代表共價(jià)交聯(lián)劑的殘基。為簡(jiǎn)短起見，上述結(jié)構(gòu)只顯示了關(guān)鍵特征；它們沒有標(biāo)明免疫球蛋白的連接(J)或其它結(jié)構(gòu)域，也沒有顯示二硫鍵。然而，若結(jié)合活性需要此類結(jié)構(gòu)域，則構(gòu)建時(shí)它們應(yīng)當(dāng)存在于它們?cè)诿庖咔虻鞍追肿又兴紦?jù)的通常位置?；蛘?，可以將粘附素序列插入免疫球蛋白重鏈與輕鏈序列之間，從而得到包含嵌合重鏈的免疫球蛋白。在這個(gè)實(shí)施方案中，將粘附素序列融合在免疫球蛋白每個(gè)臂中的免疫球蛋白重鏈的3，端，或是在鉸鏈與CH2結(jié)構(gòu)域之間，或是在CH2與CH3結(jié)構(gòu)域之間。類似的構(gòu)建物已報(bào)道于Hoogenboom等，Mol.Immunol"28:1027-1037(1991)。盡管本發(fā)明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白輕鏈，然而免疫球蛋白輕鏈可以與粘附素-免疫球蛋白重鏈融合多肽共價(jià)結(jié)合的形式存在，或是以直接與粘附素融合的形式存在。在前一種情況中，通常將編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA與編碼粘附素-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達(dá)。在分泌后，雜合重鏈與輕鏈將共價(jià)結(jié)合以提供包含二個(gè)二硫4建相連的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。適于制備此類結(jié)構(gòu)的方法披露于例如美國(guó)專利第4，816，567號(hào)，公告于1989年3月28日。最方便的是通過(guò)將編碼粘附素部分的cDNA序列與免疫球蛋白cDNA序列以符合讀碼框的形式融合來(lái)構(gòu)建免疫粘附素。然而，也可以使用與基因組免疫球蛋白片段的融合(參見例如Aruffo等，Cell,61:1303-1313(1990);和Stamenkovic等，Cell,66:1133-1144(1991))。后一種類型的融合要求存在Ig調(diào)控序列以供表達(dá)。編碼IgG重鏈恒文庫(kù)分離，通過(guò)雜交或者通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。將編碼免疫粘附素的"粘附素"和免疫球蛋白部分的cDNA串聯(lián)插入在所選宿主細(xì)胞中高效表達(dá)的質(zhì)粒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DR6拮抗劑可以通過(guò)以美國(guó)專利Nos.4,640,835;4,496,689;4，301，144;4,670,417;4,791,192或4,179，337中所列方式將受體多肽與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯，或者其它類似分子諸如聚谷氨酸酯/鹽(polyglutamate)連接而共價(jià)修飾。此類PEG化形式可使用本領(lǐng)域已知技術(shù)來(lái)制備。本發(fā)明還設(shè)想了亮氨酸拉鏈形式的這些分子。"亮氨酸拉鏈，，是本領(lǐng)域中用于指增強(qiáng)、促進(jìn)或驅(qū)動(dòng)其融合配偶體(例如亮氨酸拉鏈與之融合或連接的序列或分子)二聚化或三聚化的富含亮氨酸序列的術(shù)語(yǔ)。本領(lǐng)域已經(jīng)記載了多種亮氨酸拉鏈多肽。參見例如Landschulz等，Science,240:1759(1988);美國(guó)專利5,716,805;WO94/10308;Hoppe等,FEBSLetters,344:1991(1994);Maniatis等，Nature,341:24(1989)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，亮氨酸拉鏈序列可以融合在DR6分子的5'或3'端。本發(fā)明的DR6和/或APP多肽還可以以如下方式修飾，即通過(guò)將多肽與另一種異源多肽或氨基酸序列融合而形成嵌合分子。優(yōu)選的是，所述異源多肽或氨基酸序列的作用是使嵌合分子寡聚化。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類嵌合分子包括DR6和/或APP多肽與標(biāo)簽多肽的融合，所述標(biāo)簽多肽提供了抗標(biāo)簽抗體可選擇性結(jié)合的表位。通常將表位標(biāo)簽置于多肽的氨基或羧基末端。此類表位標(biāo)記形式的多肽的存在情況可使用針對(duì)標(biāo)簽多肽的抗體來(lái)檢測(cè)。還有，表位標(biāo)簽的提供使得多肽易于使用抗標(biāo)簽抗體或結(jié)合表位標(biāo)簽的其它類型親和機(jī)制通過(guò)親和純化進(jìn)行純化。多種標(biāo)簽多肽及其相應(yīng)的抗體是本領(lǐng)域眾所周知的。例子包括聚組氨酸(poly-his)或聚組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)簽；流感HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988));c-myc標(biāo)簽及其抗體8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Evan等,MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985));及單純皰滲病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體(Paborsky等，ProteinEngineering,3(6):547-553(1990》。其它標(biāo)簽多肽包括Flag肽(Hopp等，BioTechnology,6:1204-1210(I988));KT3表位肽(Martin等，Science,255:192-194(1992));a-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991》；及T7基因10蛋白肽標(biāo)簽(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990》?？笵R6和抗APP抗體本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供了DR6和/或APP抗體。例示性抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的和異源偶聯(lián)的抗體。這些抗DR6和/或APP抗體優(yōu)選是DR6拮抗性抗體。多克隆抗體本發(fā)明的抗體可包括多克隆抗體。用于制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。多克隆抗體可在哺乳動(dòng)物中生成，例如通過(guò)一次或多次注射免疫劑和根據(jù)需要的佐劑。通常，免疫劑和/或佐劑將通過(guò)多次皮下或腹膜內(nèi)注射而注射到哺乳動(dòng)物中。免疫劑可包括DR6和/或APP多肽(例如DR6和/或APPECD)或其融合蛋白。將免疫劑與已知在所免疫哺乳動(dòng)物中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的。此類免疫原性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于匙孔!戚血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑?？刹捎玫淖魟┑睦影ǜナ贤耆魟┖蚆PL-TDM佐劑(單磷?；|(zhì)A、合成的海藻糖二白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。免疫方案可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)做出選擇。然后可以對(duì)哺乳動(dòng)物采血，并對(duì)血清測(cè)定DR6和/或APP抗體滴度。根據(jù)需要，可對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滴度升高或達(dá)到穩(wěn)定的高濃度(plateau)。單克隆抗體或者，本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可使用雜交瘤法制備，諸如KohlerandMilstein,Nature256:495(1975)所述。在雜交瘤法中，小特異性結(jié)合免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘撸梢栽隗w外免疫淋巴細(xì)胞。免疫劑將通常包括DR6和/或APP多肽(例如DR6和/或APPECD)或其融合蛋白，諸如DR6ECD-IgG和/或APPsAPP-IgG融合蛋白。通常，若希望為人起源的細(xì)胞，則使用外周血淋巴細(xì)胞("PBL，，)，或者，若希望為非人哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑，諸如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合以形成雜交瘤纟田月包(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress(1986),pp.59-103)。永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類、牛和人起源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的永生化細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷("HAT培養(yǎng)基，，)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是那些高效融合、支持選定的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定地高水平地表達(dá)抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞系。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是鼠源骨髓瘤系，可從例如索爾克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiege,California,USA)和美國(guó)典型培養(yǎng)物寸呆藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia,USA)獲得。此類鼠骨髓瘤細(xì)胞系的一個(gè)例子是P3X63Ag8U.1(ATCCCRL1580)。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和'J、鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker，Inc.,NewYork(1987)pp.51-63)。然后可對(duì)雜交瘤細(xì)胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基測(cè)定針對(duì)DR6和/或APP的單克隆抗體的存在。優(yōu)選的是，通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。此類技術(shù)和測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)例^口MunsonandPollard,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析或通過(guò)BiaCore分析來(lái)測(cè)定。在鑒定得到期望的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過(guò)有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding,見上文)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘?，雜交瘤細(xì)胞可在哺乳動(dòng)物中作為腹水進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。可通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基或腹水分開或純化。單克隆抗體還可通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)生成，諸如美國(guó)專利4，816，567中所述。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)流程分離和測(cè)序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是此類DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。還可以修飾DNA，例如通過(guò)替代，即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源鼠源序列(Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851(1984))，或者通過(guò)共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列。可以以該方式制備具有本文中抗DR6單克隆抗體的結(jié)合特異性的"嵌合"或"雜合"抗體。通常用此類非免疫球蛋白多肽替代本發(fā)明抗體的恒定域，或者用它們替代本發(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，其包含對(duì)DR6具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)不同抗原具有特異性的另一抗原結(jié)合位點(diǎn)。嵌合或雜合抗體也可在體外使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)的已知方法來(lái)制備，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可使用二硫鍵交換反應(yīng)或通過(guò)形成硫醚鍵來(lái)構(gòu)建免疫毒素。適于此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酯/鹽(iminothiolate)和4-巰基丁酰亞胺酸曱酉旨(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。也可以生成單鏈Fv片段，諸如Iliades等，F(xiàn)EBSLetters,409:437-441(1997)中所述。此類單鏈片段使用各種接頭的偶聯(lián)記載于Kortt等，ProteinEngineering,10:423-433(1997)。本領(lǐng)域知道用于重組生產(chǎn)和操作抗體的多種技術(shù)。下文更為詳細(xì)的描述了熟練技術(shù)人員通常使用的此類技術(shù)的例示性例子。人源化抗體通常，人源化抗體中引入了一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作"輸入，，殘基，它們通常取自"輸入，，可變區(qū)。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-327(1988);Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988))，即用嚙齒類CDR或CDR序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此，此類"人源化"抗體是嵌合抗體，其中基本上少于整個(gè)人可變區(qū)用來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來(lái)自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。重要的是，抗體在人源化后保持對(duì)抗原的高親和力及其它有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，依照一種優(yōu)選的方法，通過(guò)使用親本和人源化序抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉?？色@得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從共有和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力提高。一般而言，CDR殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。人抗體人單克隆抗體可通過(guò)雜交瘤方法生成。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系已有描述，例如Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63，MarcelDekker，Inc.,NewYork(1987)。現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫時(shí)生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移整套人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊時(shí)生成人抗體。參見例如Jakobovits等，Ato/.爿cw/.6W.90:2551-255(1993);Jakobovits等，A^wre362:255-258(1993)。Mendez等人(NatureGenetics15:146-156(1997))進(jìn)一步改進(jìn)了技術(shù)，生成了稱為"XenomouseII"(異種移植物小鼠)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，它在受到抗原攻擊時(shí)生成高親和力的完全人的抗體。這是如上所述通過(guò)將數(shù)百萬(wàn)堿基的人重鏈和輕鏈基因座種系整合到內(nèi)源Jh區(qū)段有刪除的小鼠中而實(shí)現(xiàn)的。Xenomouse11攜帶1,020kb的人重鏈基因座，包含大約66神Vh基因、完整的Dh和Jh區(qū)、及三種不同的恒定區(qū)(p、S和5C),還攜帶800kb人k基因座，包含32種Vic^因、Jk區(qū)段和Cic^因。這些小鼠中生成的抗體在所有方面與在人體中看到的極其相似，包括基因重排、裝配和全集。由于內(nèi)源jh區(qū)段的刪除防止了鼠基因座的基因重排，因此人抗體較之內(nèi)源抗體優(yōu)先表達(dá)?；蛘?，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，A^wre348:552-553(1990))可用于在體外從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變區(qū)(V)基因全集生成人抗體和抗體片段。依照這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合讀碼框的方式克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行；有關(guān)綜述參見例如Johnson，KevinS.andChiswell，DavidJ.,C鮮eW爭(zhēng)."/ow5^w"磨/B油gy3:564-571(1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來(lái)源可用于噬菌體展示。Clackson等，A^w352:624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機(jī)組合文庫(kù)中分離得到大量不同的抗D惡唑酮抗體?？杀举|(zhì)上遵循Marks等，/Mo/.所o/.222:581-597(1991)或Griffith等，五M50J12:725-734(1993)所述技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集和分離針對(duì)大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。在天然免疫應(yīng)答中，抗體基因以高比率積累突變(體細(xì)胞高變)。導(dǎo)入的有些變化將賦予更高親和力，展示高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞在隨后的抗原攻擊過(guò)程中優(yōu)先復(fù)制和分化。這種天然過(guò)程可通過(guò)采用稱為"鏈改組"的技術(shù)來(lái)模擬(Marks等，Bio/Techno1.10:779-783(1992))。在這種方法中，通過(guò)噬菌體展示得到的"初始"人抗體的親和力可通過(guò)用從未免疫供體得到的V結(jié)構(gòu)域基因天然存在的變體(全集)相繼替換重鏈和輕鏈V區(qū)基因而提高。此技術(shù)得以生成親和力在nM范圍中的抗體和抗體片段。Waterhouse等，Nucl.AcidsRes.21:2265-2266(1993)記載了用于構(gòu)建非常大的噬菌體全集(也稱為"所有文庫(kù)的母庫(kù)"(themother-of-alllibraries))的策略。基因改組也可用于從嚙齒類抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始嚙齒類抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為"表位印記"(epitopeimprinting),通過(guò)噬菌體展示技術(shù)得到的嚙齒類抗體的重鏈或輕鏈V結(jié)構(gòu)域基因用人V結(jié)構(gòu)域基因全集替換，產(chǎn)生嚙齒類-人嵌合物。對(duì)抗原進(jìn)行的選擇導(dǎo)致能夠恢復(fù)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人可變區(qū)的分離，即表位決定(印記，imprint)配偶體的選擇。在重復(fù)該過(guò)程以替換剩余嚙齒類V結(jié)構(gòu)域時(shí)，得到人抗體(參見PCT專利申請(qǐng)WO93/06213,公開于1993年4月l日)。與傳統(tǒng)的通過(guò)CDR移植進(jìn)行的嚙齒類抗體的人源化不同，此技術(shù)提供完全人的抗體，它們不含嚙齒類起源的框架或CDR殘基。正如下文詳細(xì)討論的，本發(fā)明的抗體可任選包括抗體單體、抗體二聚體、以及抗體的多價(jià)形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)并使用本文中的DR6和/或APP抗體來(lái)構(gòu)建此類二聚體或多價(jià)形式。用于制備單價(jià)抗體的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾重鏈的重組表達(dá)。重鏈通常在Fc區(qū)中的任意點(diǎn)截短以防止重鏈交聯(lián)?；蛘?，相關(guān)半胱氨酸殘基用另一種氨基酸殘基替代或刪除以防止交聯(lián)。雙特異性抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆，優(yōu)選人或人源化抗體。在本案中，一種結(jié)合特異性是對(duì)DR6受體，另一種是對(duì)任何其它抗原，優(yōu)選對(duì)另一種受體或受體亞基。用于生成雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生成基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種重鏈具有不同的特異性(MillsteinandCuello,Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨才幾分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成十種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)率低。1993年5月13日^^開的WO93/08829及Traunecker等，EMBO10:3655-3659(1991)中披露了類似的流程。依照一種不同的且更優(yōu)選的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH,)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比率沒有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個(gè)表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于1994年3月3日公開的PCR申請(qǐng)WO94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如Suresh等，^fe^oA&五，,/ogy121:210(1986)。異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩種共價(jià)連接的抗體構(gòu)成。此類抗體建議例如用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利4,676,980)及用于治療HIV感染(PCT申請(qǐng)WO91/00360和WO92/200373;EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可使用任何方便的交聯(lián)方法來(lái)生成。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，連同許多交聯(lián)技術(shù)一起披露于美國(guó)專利4,676,980?？贵w片段在某些實(shí)施方案中，抗DR6和/或APP抗體(包括鼠的、人的和人源化的抗體，及抗體變體)是抗體片段。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過(guò)蛋白水解消化完整抗體來(lái)衍生這些片段(參見例如Morimoto等，J所oc/zem,M"/zoA24:107-117(1992);Brennan等，5We"ce229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carter等,所o/rec/mo/ogv10:163-167(1992))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)(ab')2片段是使用亮氨酸拉鏈GCN4形成的，以促進(jìn)F(ab')2分子的裝配。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離Fv、Fab或F(ab')2片段。用于生成抗體片段的多種技術(shù)對(duì)熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。例如，可使用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化。木瓜蛋白酶消化的例子記載于94年12月22日公開的WO94/29348和美國(guó)專利4,342,566。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作Fab片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個(gè)殘余Fc片段。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab')2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原?？贵w消化中產(chǎn)生的Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH0。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CH,結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)?？贵w的糖基化變體抗體在其恒定區(qū)中的保守位置發(fā)生糖基化(JefferisandLund，Chem.Immunol.65:111-128(1997);WrightandMorrison,TibTECH15:26-32(1997))。免疫球蛋白的寡糖側(cè)鏈影響蛋白質(zhì)的功能(Boyd等，Mol.Immunol.32:1311-1318(1996);WittweandHoward,Biochem.29:4175-4180(1990))，及糖蛋白各部分間的分子內(nèi)相互作用，它可影響糖蛋白的構(gòu)象和所呈現(xiàn)的三維表面(HefferisandLund,supra;"WyssandAMagner,CurrentOpin.Biotech.7:409-416(1996))。寡糖還可用來(lái)使給定糖蛋白靶向基于特定識(shí)別結(jié)構(gòu)的某些分子。例如，已有報(bào)道，在無(wú)半乳糖基化IgG中，寡糖模塊從CH2之間的空間"伸出"，末端N-乙酰葡糖胺殘基得以結(jié)合甘露糖結(jié)合蛋白(Malhotra等,NatureMed.1:237-243(1995))。用糖肽酶除去中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中所生成的CAMPATH-1H(—種識(shí)別人淋巴細(xì)胞CDw52抗原的重組人源化鼠單克隆IgGl抗體)上的寡糖導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(CMCL)完全降低(Boyd等，Mol.Immunol.32:1311-1318(1996)),而用神經(jīng)氨酸酶選4奪性消除唾液酸殘基不導(dǎo)致DMCL的喪失。還有報(bào)道，抗體的糖基化影響抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。具體而言，有報(bào)道說(shuō)，其中P(l,4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶ni(GnTin)(催化等分GlcNAc形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)的表達(dá)受四環(huán)素調(diào)控的CHO細(xì)胞具有改良的ADCC活性(Umana等，MatureBiotech.17:176-180(1999))。抗體的糖基化變體指其中抗體的糖基化樣式發(fā)生改變的變體。改變意味著刪除抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊，向抗體中添加一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊，改變糖基化(糖基化樣式)的組成、糖基化的程度、等。糖基化變體可以通過(guò)例如在編碼抗體的核酸序列中消除、改變和/或添加一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來(lái)制備?？贵w的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。如此，多肽中這兩種三肽序列任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。所述改變還可通過(guò)向初始抗體的序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。還可以在不改變&出核苷酸序列的前提下改變抗體的糖基化(包括糖基化樣式)。糖基化很大程度上取決于用于表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞。由于用于表達(dá)作為潛在治療劑的重組糖蛋白例如抗體的細(xì)胞類型很少是天然細(xì)胞，因此可預(yù)期抗體的糖基化樣式將有顯著變異(參見例如Hse等，J.Biol.Chem.272:9062-9070(1997))。在宿主細(xì)胞的選擇之外，在抗體的重組生成過(guò)程中影響糖基化的因素包括生長(zhǎng)模式、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)密度、氧供氧用(oxygenation),pH、純化方案、諸如此類。已經(jīng)提出多種方法用于改變?cè)谔囟ㄋ拗魃矬w中實(shí)現(xiàn)的糖基化樣式，包括導(dǎo)入或過(guò)表達(dá)涉及寡糖生成的某些酶(美國(guó)專利261和5.278，299)。糖基化或某些類型的糖基化可從糖蛋白中酶促清除，例如使用內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)。另外，可對(duì)重組宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改組，例如使其在加工某些類型的多糖方面缺陷。這些和類似的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的?？贵w的糖基化結(jié)構(gòu)可通過(guò)碳水化合物分析的常規(guī)技術(shù)容易的分析，包括凝集素層析、NMR、質(zhì)譜、HPLC、GPC、單糖成分分析、序貫酶促消化和HPAEC-PAD，它利用高pH陰離子交換層析根據(jù)電荷來(lái)分離寡糖。為分析目的釋放寡糖的方法也是知道的，包括但不限于酶促處理(常常使用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)切-|3-半乳糖苷酶進(jìn)行)、使用強(qiáng)堿環(huán)境的消除以釋放主要是O-連接結(jié)構(gòu)、及使用無(wú)水肼的化學(xué)方法以釋放N-和O-連接寡糖二者。例示性抗體如下文實(shí)施例中所述，已經(jīng)鑒定了許多抗DR6單克隆抗體。在任選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的DR6抗體將具有與本文中明確公開的任何抗DR6和/或APP抗體相同的生物學(xué)特征。術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)特征"用于指單克隆抗體的體外和/或體內(nèi)活性或特性，諸如特異性結(jié)合DR6或者阻斷、抑制或中和DR6活化的能力。DR6和/或APP抗體的特性和活性在下文實(shí)施例中有進(jìn)一步描述。任選的是，本發(fā)明的單克隆抗體將具有與下文實(shí)施例中具體表征的任何抗體相同的生物學(xué)特征，和/或與這些抗體結(jié)合相同表位。這可通過(guò)進(jìn)行多種測(cè)定法來(lái)測(cè)定，諸如本文和實(shí)施例中所述。例如，為了測(cè)定某單克隆抗體是否具有與本文中明確提到的DR6和/或APP抗體相同的特異性，可在竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定法中比較其活性。另外，特定抗DR6和/或APP抗體所結(jié)合的表位可通過(guò)DR6和/或APP和所討論抗體間復(fù)合物的結(jié)晶學(xué)研究來(lái)測(cè)定。如本文所述，DR6和/或APP抗體將優(yōu)選擁有期望的DR6拮抗活性。此類DR6抗體可包括但不限于嵌合的、人源化的、人的和親和力成熟的抗體。如上所述，DR6和/或APP抗體可使用多種技術(shù)構(gòu)建或改組以實(shí)現(xiàn)這些期望活性或特性。本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括這樣的本文中所<^開的抗DR6受體和/或APP配體抗體，它與選自下組的一種或多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物相連聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯(polyoxyalkylene)。任選的是，本文中所公開的抗DR6受體和/或APP配體抗體是糖基化的或者未糖基化的。本發(fā)明的抗體包括"交聯(lián)"DR6和/或APP抗體。術(shù)語(yǔ)"交聯(lián)"在用于本文時(shí)指至少兩個(gè)IgG分子結(jié)合到一起以形成一個(gè)(或單一)分子。DR6和/或APP抗體可使用多種連接分子來(lái)交聯(lián)，優(yōu)選的是，DR6和/或APP抗體是使用抗IgG分子、補(bǔ)體、化學(xué)修飾或分子工程而交聯(lián)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，一旦抗體結(jié)合細(xì)胞表面膜，補(bǔ)體對(duì)抗體分子具有相對(duì)較高的親和力。因此，認(rèn)為補(bǔ)體可作為交聯(lián)分子用于連接細(xì)胞表面膜所結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)抗DR6抗體。本發(fā)明還提供了編碼本文所述DR6和/或APP抗體的分離核酸、包含所述核酸的載體和宿主細(xì)胞、及用于生成所述抗體的重組技術(shù)。為了重組生成抗體，分離編碼它的核酸，并插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。可以使用常規(guī)流程容易地分離編碼抗體的DNA并測(cè)序(例如使用能夠與編碼抗體的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？梢垣@得許多載體。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。本文中的方法包括用于生成嵌合的和重組的抗DR6和/或APP抗體的方法，包括如下步驟提供包含編碼抗DR6和/或APP抗體輕鏈或重鏈(或者輕鏈和重鏈二者)的DNA序列的載體；用所述載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；并在足以生成重組抗DR6和/或APP抗體產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。DR6拮抗劑的配制劑在制備本文中的典型配制劑時(shí)，注意到所采用成分的推薦品質(zhì)或"等級(jí)"將取決于配制劑的最終用途。對(duì)于治療用途，各種成分優(yōu)選是容許作為藥用產(chǎn)品添加劑的等級(jí)的(諸如"GRAS，，)。在某些實(shí)施方案中，提供了包含DR6拮抗劑及一種或多種賦形劑的組合物，所述賦形劑提供足夠離子強(qiáng)度以提高DR6拮抗劑的溶解性和/或穩(wěn)定性，其中該組合物的pH為6(或大約6)至9(或大約9)。DR6桔抗劑可以通過(guò)任何合適方法來(lái)制備以實(shí)現(xiàn)期望的蛋白質(zhì)純度，例如依照上文方法。在某些實(shí)施方案中，DR6拮抗劑在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)或通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備。DR6拮抗劑在配制劑中的濃度可以根據(jù)例如配制劑的計(jì)劃用途而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)就可以決定DR6拮抗劑的期望濃度。配制劑中提供足夠離子強(qiáng)度以提高DR6拮抗劑的溶解性和/或穩(wěn)定性的一種或多種賦形劑任選是多離子(polyionic;)有機(jī)或無(wú)機(jī)酸、天冬氨酸(鹽)/(酯)、硫酸鈉、琥珀酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉、CaptisolTM、Tris、精氨酸鹽或其它氨基酸、糖和多元醇諸如海藻糖和蔗糖。優(yōu)選的是，配制劑中提供足夠離子強(qiáng)度的一種或多種賦形劑是鹽?？刹捎玫柠}包括但不限于鈉鹽和精氨酸鹽。所采用鹽的類型和鹽的濃度優(yōu)選使得配制劑具有相對(duì)較高的離子強(qiáng)度，使得配制劑中的DR6拮抗劑是穩(wěn)定的。任選的是，鹽在配制劑中存在的濃度為約20mM至約0.5M。組合物的pH優(yōu)選為6(或大約6)至9(或大約9)，更優(yōu)選大約6.5至大約8.5,甚至更優(yōu)選大約7至大約7.5。在此實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，組合物還將包含緩沖劑以至少維持組合物的pH為大約6至大約8?？刹捎玫木彌_劑的例子包括但不限于Tris、HEPES和組氨酸。在采用Tris時(shí)，任選將pH調(diào)至大約7至8.5。在采用Hepes或組氨酸時(shí)，任選將pH調(diào)至大約6.5至7。任選的是，緩沖劑在配制劑中的使用濃度為大約5mM至大約50mM。特別是對(duì)于液體配制劑(或重建的凍干配制劑)，可能希望在組合物中包含一種或多種表面活性劑。此類表面活性劑可以包括例如非離子表面活性劑，像TWEENtm或PLURONICStm(例如聚山梨醇酯或poloxamer)。優(yōu)選的是，表面活性劑包括聚山梨醇酯20("TWEEN20")。表面活性劑的使用濃度任選為大約0.005%至大約0.2%。含各種其它賦形劑或成分。任選的是，供腸胃外施用的配制劑可以包含藥劑學(xué)或腸胃外可接受的載體，即在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者無(wú)毒且與配制劑的其它組分相容的載體。任選的是，載體是腸胃外載體，諸如與接受者的血液等滲的溶液。此類載體媒介的例子包括水、鹽水或緩沖溶液，諸如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。各種任選的藥劑學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑進(jìn)一步記載于/em/"gtow's尸/2armacew"ca/5Wewc^s,16thedition,Osol,A.ed.(1980)。本文中的配制劑還可含有一種或多種防腐劑。例子包括氯化十八烷基二曱基節(jié)基銨、氯化己烷雙胺、苯扎氯銨(氯化烷千基二曱基銨的混合物，其中烷基為長(zhǎng)鏈化合物)和苯索氯銨。其它類型的防腐劑包括芳香醇、對(duì)羥基苯曱酸烷基酯諸如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯、和間曱酚?？寡趸瘎┌箟难岷蜁趿虬彼?；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；丁醇；對(duì)羥基苯曱酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；或聚乙二醇(PEG)。本發(fā)明的組合物可包括液體配制劑(液體溶液或液體懸浮液)和凍干配制劑，以及懸浮液配制劑。如果是液體，最終配制劑優(yōu)選冷凍貯存于520。C?；蛘?，可凍干該配制劑并作為與注射用水重建的粉劑提供，該粉劑任選可貯存于2-30。C。用于治療性施用的配制劑必須是無(wú)菌的。通過(guò)無(wú)菌濾膜(例如0.2微米濾膜)過(guò)濾可輕易實(shí)現(xiàn)滅菌。通常將治療用組合物置于具有滅菌存取口的容器中，例如具有可用皮下注射針頭刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或藥瓶。作為水溶液或用于重建的凍干配制劑，通常將組合物存儲(chǔ)在單個(gè)單位或多劑量容器中，例如密封的安瓿或藥瓶。該容器可以是本領(lǐng)域可獲得的任何容器，并用常規(guī)方法填充。任選的是，該配制劑可裝入注射筆裝置(或裝入筆裝置的藥筒)，諸如那些本領(lǐng)域可獲得的裝置(參見例如美國(guó)專利5,370,629),它們適合配制劑的治療性投遞。例如，可使用注射用水重建凍干的DR6拮抗劑配制劑來(lái)制備注射液。使用DR6拮抗劑的療法本發(fā)明的DR6拮抗劑具有多種效用。DR6拮抗劑在神經(jīng)學(xué)病癥的診斷和治療中是有用的。哺乳動(dòng)物中本文所述各種病理學(xué)疾患的診斷可以由熟練從業(yè)人員來(lái)進(jìn)行。診斷技術(shù)是本領(lǐng)域可獲得，其容許例如哺乳動(dòng)物中各種神經(jīng)學(xué)病癥的診斷或纟企測(cè)。通過(guò)本發(fā)明治療的神經(jīng)學(xué)病癥包括家族性和散發(fā)性肌萎縮性側(cè)索硬化(分別為FALS和ALS)、家族性和M性帕金森氏病、亨庭頓氏病、家族性和散發(fā)性阿耳茨海默氏病和脊髓性肌萎縮(SMA)(Price等，見上文)。這些疾病中許多以成年中期發(fā)作為典型，且導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)特定神經(jīng)元亞群的快速變性(degeneration)，最終導(dǎo)致過(guò)早死亡。肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)是最常診斷出的漸進(jìn)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病。該病以皮層、腦干和脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性為特征(Siddique等，J.NeuralTransm.Suppl"49:219-233(1997);Siddique等，Neurology,47:(4Suppl2):S27-34;discussionS34-5(1996);Rosen等，Nature,362:59-62(1993);Gurney等，Science.264:1772-17751994》。帕金森氏病(震顫麻痹)是常見的神經(jīng)變性性病癥，其通常出現(xiàn)于生命中期至晚期。家族性和散發(fā)性病例有發(fā)生，盡管家族性病例只占所觀察到的病例的1-2%?；颊叱３＞哂猩窠?jīng)細(xì)胞損失及腦干藍(lán)斑和黑質(zhì)中的反應(yīng)性神經(jīng)月交質(zhì)瘤病(reactivegliosis)和Lewy小體(Lewybodies)。作為一類，黑質(zhì)纟丈狀體多巴胺能神經(jīng)元似乎是最受影響的(Uhl等，Neurology,35:1215-1218(1985);Levine等，TrendsNeu薩i.,27:691-697(2004);Fleming等，NeuroRx,2:495-503(2005))。近端脊髓性肌萎縮(SMA)是常見的人類常染色體隱性神經(jīng)變性性疾病，典型地以脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失和四肢和軀干肌肉萎縮為特征(Monani等,Hum.Mol.Genet.,9:2451-2457(2000);Monani等，J.CellBiol.,160:41-52(2003))。它以10,000個(gè)體中1例的頻率發(fā)生，而且是嬰兒死亡的最常見遺傳原因。根據(jù)發(fā)作的年齡和疾病表型的嚴(yán)重性，近端SMA分為I型(重度)、II型(中度)、和III型(輕度)SMA。該病的所有三種形式都是由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元基因OS層/)的端粒存活的突變或喪失(Monani等，見上文,2000;Monani等,見上文，2003))。已經(jīng)在許多神經(jīng)變性性疾病中報(bào)道了神經(jīng)元細(xì)胞損失，包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、和脊髓性肌萎縮(SMA)。任選的是，患者中阿耳茨海默氏病的診斷可基于第四版《精神障礙的診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》(DiagnosticandStatisticalManualofMentaldisorders,DSM-IV-TR)的標(biāo)準(zhǔn)(參見例如美國(guó)精神病學(xué)會(huì)精神障礙的診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四片反〈'f"i丁文本(AmericanPsychiatricAssociation.Diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders,4thEdition-textrevised).Washington,DC:2000)。簡(jiǎn)言之，DSM-IV-TR標(biāo)準(zhǔn)包括(A)形成多種認(rèn)知缺陷，其表現(xiàn)為記憶受損和以下一項(xiàng)或多項(xiàng)二者(l)失語(yǔ)；(2)失用；(3)失認(rèn)；或(4)執(zhí)行機(jī)能紊亂；(B)該認(rèn)知缺陷呈現(xiàn)自先前的機(jī)能下降且引起社會(huì)或職業(yè)機(jī)能的顯著損害；(C)病程以逐漸發(fā)作和持續(xù)下降為特征；(D)該認(rèn)知缺陷不是由于其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)的、系統(tǒng)性的、或物質(zhì)誘導(dǎo)的引起記憶和認(rèn)知漸進(jìn)性缺陷的疾患；和(E)該紊亂不能由其它精神病學(xué)病癥更好的解釋。可做出阿耳茨海默氏病診斷的備選標(biāo)準(zhǔn)包括那些基于國(guó)家神經(jīng)病學(xué)和交流障礙和中風(fēng)學(xué)會(huì)-阿耳茨海默氏病和相關(guān)病癥學(xué)會(huì)(NationalInstituteofNeurologicalandCommunicativeDisordersandStroke-Alzheimer'sDiseaseandRelatedDisorderAssociation,NINDS-ADRDA)工作組關(guān)于阿耳茨海默氏病的標(biāo)準(zhǔn)(參見例如McKhann等,Neurology1984;34:939-944)。簡(jiǎn)言之，NINCDS-ADRDA關(guān)于可能的阿耳茨海默氏病的標(biāo)準(zhǔn)包括伴有非典型性發(fā)作、表現(xiàn)(presentation)、或進(jìn)展且沒有已知病因的癡呆綜合征，其中認(rèn)為任何能夠引起癡呆的共同發(fā)病的疾病(co-morbiddisease)不是原因。NINCDS-ADRDA關(guān)于可能的阿耳茨海默氏病的標(biāo)準(zhǔn)包括通過(guò)臨床和神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)確定的癡呆，且牽涉(a)兩個(gè)或更多個(gè)認(rèn)識(shí)領(lǐng)域(包括記憶)的漸進(jìn)性缺陷；(b)在40和90歲之間發(fā)作；和(c)不存在能夠引起癡呆綜合征包括儋妄的系統(tǒng)性的或其它的腦病。NINCDS-ADRDA關(guān)于確診的阿耳茨海默氏病的標(biāo)準(zhǔn)包括達(dá)到關(guān)于可能的阿耳茨海默氏病的標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)尸檢或活檢具有阿耳茨海默氏病的組織病理學(xué)證據(jù)。修訂后的NINDS-ADRDA診斷標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)在Dubois等，TheLancetNeurology,Volume6,Issue8,August2007,Pages734-746中提出。正如下文簡(jiǎn)要概述的，為了達(dá)到這種關(guān)于可能的阿耳茨海默氏病的標(biāo)準(zhǔn)，患病個(gè)體必須滿足標(biāo)準(zhǔn)A(核心臨床標(biāo)準(zhǔn))和B、C、D、或E中記錄的至少一項(xiàng)或多項(xiàng)支持性生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)。在此語(yǔ)境中，標(biāo)準(zhǔn)A以存在早期的和顯著的事件記憶缺陷為特征，該缺陷包括以下特征(1)患者或知情人報(bào)告了超過(guò)6個(gè)月里逐漸的和漸進(jìn)的記憶功能變化；(2)測(cè)驗(yàn)中顯著受損的事件記憶的客觀證據(jù)這一般由在提示或認(rèn)識(shí)測(cè)驗(yàn)中和在先前已經(jīng)控制了信息的有效編碼后沒有顯著改善或沒有恢復(fù)正常的回憶缺陷所構(gòu)成；(3)AD發(fā)作時(shí)或隨著AD發(fā)展，事件記憶缺陷可以是與其它認(rèn)知變化隔離的(isolated)或聯(lián)合的(associated)。標(biāo)準(zhǔn)B以存在居中顳葉萎縮為特征，表現(xiàn)為例如MRI及使用視覺評(píng)分(visualscoring)的定性評(píng)級(jí)(qualitativeratings)(參比完善表征的正常年齡標(biāo)準(zhǔn)的群體)和感興趣區(qū)域的定量容量測(cè)定(quantitativevolumetry)(參比完善表征的正常年齡標(biāo)準(zhǔn)的群體)證明了海馬、內(nèi)嗅皮質(zhì)、杏仁核的體積損失。標(biāo)準(zhǔn)C以異常腦脊髓液生物標(biāo)志物為特征，例如淀粉狀蛋白PM2濃度低、總T濃度升高、或磷酸-T濃度升高、或三者的組合。標(biāo)準(zhǔn)C以使用PET的功能性神經(jīng)影像的特定樣式為特征，例如雙側(cè)顳頂區(qū)中葡萄糖代謝降低。標(biāo)準(zhǔn)C以近親屬中證明AD常染色體顯性突變?yōu)樘卣?。若存在以下各?xiàng)，則認(rèn)為AD確診(1)根據(jù)NIA-Reagan關(guān)于AD死后診斷的標(biāo)準(zhǔn)的要求，疾病的臨床和組織病理學(xué)(腦活檢或尸檢)兩種證據(jù)；標(biāo)準(zhǔn)必須存在(參見例如NeurobiolAging1997;18:S1-S2);和(2)AD的臨床和遺傳兩種證據(jù)(染色體l、14、或21上的突變)；標(biāo)準(zhǔn)必須存在。在本發(fā)明的方法中，DR6拮抗劑優(yōu)選在載體，優(yōu)選藥學(xué)可接受載體中施用于哺乳動(dòng)物。合適的載體及其配制劑記載于《Remington'sPharmaceuticalSciences》中，第16版，1980,MackPublishingCo.，Osol等人編。典型的是，在配制劑中使用適宜量的藥學(xué)可接受鹽使得配制劑等滲。載體的例子包括鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。溶液的pH優(yōu)選約5至約8，更優(yōu)選約7至約7.5。其它載體包括持續(xù)釋放制劑，諸如含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜、脂質(zhì)體或微膠嚢。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，根據(jù)例如施用路徑和所施用DR6拮抗劑的濃度，某些載體可能是更優(yōu)選的。DR6拮抗劑可通過(guò)注射(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、門靜脈內(nèi)(intraportal))、口服施用于哺乳動(dòng)物，或者通過(guò)確保以有效形式投遞至血流的其它方法諸如灌注。DR6拮抗劑還可通過(guò)隔離灌注(isolatedperfUsion)技術(shù)(諸如隔離組織灌注)，或通過(guò)鞘內(nèi)、眼內(nèi)，或腰推穿刺來(lái)施用，以發(fā)揮局部治療效果。不易穿過(guò)血腦屏障的DR6拮抗劑可直接給予，例如大腦內(nèi)，或進(jìn)入脊髓空間(spinalcordspace)或其它方式，其會(huì)將它們運(yùn)輸穿過(guò)屏障。施用DR6拮抗劑的有效劑量和時(shí)間表可憑經(jīng)驗(yàn)確定，做出此類決定在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，必須施用的DR6拮抗劑劑量將取決于例如將接受拮抗劑的哺乳動(dòng)物、施用路徑、所用拮抗劑的具體類型及施用于哺乳動(dòng)物的其它藥物。選擇適宜劑量的指導(dǎo)見例如關(guān)于抗體治療性用途的文南史,i"列i口《HandbookofMonoclonalAntibodies》,Ferrone等人纟扁，NogesPublications,ParkRidge，NJ,1985，第22章，第303-357頁(yè)；Smith等，AntibodiesinHumanDiagnosisandTherapy,Haber等,eds.，RavenPress,NewYork(1977)pp.365-389。DR6抗體單獨(dú)使用的典型日劑量可在每天約lpg/kg體重至多達(dá)100mg/kg體重的范圍內(nèi)或更多，這取決于上述因素。DR6拮抗劑也可以與一種或多種其它治療劑聯(lián)合施用于哺乳動(dòng)物。此類其它治療劑的例子包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑，例如結(jié)合或以其它方式與EGFR直接相互作用且阻止或降低其信號(hào)傳導(dǎo)活性的化合物，諸如Tarceva，抗體，像C225(也稱作西妥昔單抗(cetuximab)和Erbitux⑧(ImCloneSystemsInc.))，完全人的ABX國(guó)EGF(panitumumab，AbgenixInc.),以及稱作El.l、E2.4、E2,5、E6.2、E6.4、E2.ll、E6.3和E7.6.3的及US6'235,883中記載的完全人的抗體；MDX-447(MedarexInc),以及EGFR小分子抑制劑，諸如US5616582,US5457105,US5475001,US5654307,US5679683,US6084095,US6265410,US6455534,US6521620,US6596726,US6713484,US5770599,US6140332,US5866572,US6399602,US6344459,US6602863,US6391874,W09814451,WO9850038,WO9909016,WO9924037,US6344455,US5760041,US6002008,US5747498中記載的化合物；具體的小分子EGFR抑制劑包括OSI-774(CP-358774,erlotinib,OSIPharmaceuticals);PD183805(CI1033,2-丙烯酰胺(propenamide),N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-嗎啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-,二鹽酸鹽，PfizerInc.);Iressa(ZD1839,吉非替尼(gefitinib),4-(3，-氯-4，-氟苯胺基)-7-曱氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca);ZM105180((6-氨基-4-(3-曱基苯基-氨基)-會(huì)唑啉，Zeneca);BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(l-曱基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，BoehringerIngelheim);PKI-166((R)-4隱[4-[(l-苯基乙基)氨基]畫lH陽(yáng)吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羥基苯基)-4-[(l-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺(butynamide));和EKB-569(>^-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二曱基氨基)-2-丁烯酰胺(butenamide))?？刹捎玫钠渌委焺┌ǖ蛲鲆种苿?，特別是胞內(nèi)凋亡抑制劑，例如胱天蛋白酶抑制劑，諸如胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、或胱天蛋白酶-8抑制劑，Bid抑制劑，Bax抑制劑或其任意組合。合適的抑制劑的例子一般有胱天蛋白酶抑制劑，二肽抑制劑，氨基曱酸酯抑制劑，取代的天冬氨酸縮醛，雜環(huán)二羰酰胺(heterocyclyldicarbamides)，p奎啉-(二肽、三肽、四肽)書亍生物，取的2-氨基苯酰胺胱天蛋白酶抑制劑，取代的a-羥酸胱天蛋白酶抑制劑，亞硝基化的抑制作用；CASP-1;CASP-3:蛋白質(zhì)抑制劑，反義分子，煙酰(nicotinyl)-天冬氨酰-酮，y-酮酸二肽衍生物，CASP-8:反義分子，相互作用蛋白CASP-9，CASP2:反義分子；CASP-6:反義分子；CASP-7:反義分子；和CASP-12抑制劑。其它例子有線粒體抑制劑，諸如Bcl-2調(diào)控因子；衍生自Bad的Bcl-2突變型肽、Bad、BH3相互作用結(jié)構(gòu)死亡激動(dòng)劑、Bax抑制蛋白及BLIC基因和基因產(chǎn)物。凋亡的其它合適胞內(nèi)調(diào)控劑有CASP9/Apaf-1結(jié)合的拮抗劑、Apaf-l表達(dá)的反義調(diào)控劑、用于抑制凋亡的肽、包含單純皰滲病毒R1亞基的抗凋亡組合物、MEKK1及其片段、存活蛋白(Survivin)的調(diào)控劑、凋亡抑制劑的調(diào)控劑、和HIAP2。此類藥劑的其它例子包括抑制線粒體釋;^文細(xì)胞色素c并阻斷胱天蛋白酶-3mRNA上調(diào)的米諾環(huán)素(Minocycline)(NeuroapoptosisLaboratory),作為p53抑制劑的Pifithrinalpha(UIC)、作為JNK途徑抑制劑的CEP-1346(CephalonInc.)、抑制促凋亡GAPDH信號(hào)傳導(dǎo)的TCH346(Novartis)、作為泛胱天蛋白酶抑制劑的IDN6556(IdunPharmaceuticals)、作為胱天蛋白酶-3抑制劑的AZQs(AstraZeneca)、作為胱天蛋白酶-l/4抑制劑的HMR-3480(AventisPharma)、和溶解血塊(溶對(duì)全藥)的Activase/TPA(Genentech》除了DR6拮抗劑之外可以施用的其它合適藥劑包括膽石威酯酶抑制劑(諸如多奈口底齊(Donepezil)、力口蘭他壽文(Galantamine)、利伐斯的明(Rivastigmine)、他克林(Tacrine))、NMDA受體拮抗劑(諸如美金岡'J(Memantine))、A卩聚集抑制劑、抗氧化劑、y-分泌酶調(diào)控劑、NGF模擬物或NGF基因療法、PPARy激動(dòng)劑、HMG-CoA還原酶抑制劑(他汀類藥物(statins))、安帕金(ampakines)、4丐通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、糖原合酶激酶抑制劑、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、蟲是蕈義咸受體;敫動(dòng)劑(muscarinicreceptoragonists)、煙石咸受體調(diào)4空齊寸(nicotinicreceptormodulators)、主動(dòng)的iy皮動(dòng)的A卩免疫4妄種、石粦酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑和抗Ap抗體(參見例如WO2007/062852;WO2007/064972;WO2003/040183;WO1999/06066;WO2006/081171;WO1993/21526;EP0276723B1;WO2005/028511;WO2005/082939)。DR6拮抗劑可以與一種或多種其它治療劑順序或同時(shí)施用。DR6拮抗劑和治療劑的量取決于例如所用藥物的類型、所治療的病理學(xué)疾患、及施用的時(shí)間表和路徑，但是通常低于各自單獨(dú)使用時(shí)的量。對(duì)哺乳動(dòng)物施用DR6拮抗劑后，可以以熟練從業(yè)人員眾所周知的多種方式監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物的生理學(xué)狀況。來(lái)檢驗(yàn)。多種眾所周知的測(cè)定法和動(dòng)物模型可用于測(cè)試候選治療劑的功效。此類模型的體內(nèi)本質(zhì)使得它們特別能預(yù)報(bào)在人類患者中的響應(yīng)。各種神經(jīng)變性性疾患的動(dòng)物模型和用'于檢驗(yàn)與這些神經(jīng)變性模型有關(guān)的病理過(guò)程(例如在存在和不存在DR6拮抗劑時(shí))的有關(guān)技術(shù)在下文實(shí)施例14中討論。各種神經(jīng)學(xué)病癥的動(dòng)物模型包括非重組的和重組的(轉(zhuǎn)基因的)動(dòng)物。非重組動(dòng)物模型包括例如嚙齒類(例如鼠)模型。此類模型可通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如皮下注射、尾靜脈注射、脾植入、腹膜內(nèi)植入、和腎嚢下植入)將細(xì)胞導(dǎo)入同基因小鼠中來(lái)生成。體內(nèi)模型包括中風(fēng)/腦缺血模型、神經(jīng)變性性疾病的體內(nèi)模型，諸如帕金森氏病的小鼠模型；阿耳茨海默氏病的小鼠模型；肌萎縮性側(cè)索硬化ALS的小鼠模型；脊髓性肌萎縮SMA的小鼠模型；局灶性和整體性腦缺血的小鼠/大鼠才莫型，例如常見的頸動(dòng)脈閉塞模型或大腦中動(dòng)脈閉塞模型；或在離體(exv/vo)全胚胎培養(yǎng)物中?？梢砸砸阎捏w外或體內(nèi)測(cè)定格式來(lái)實(shí)施各種測(cè)定法，諸如下文描述的或如本領(lǐng)域已知的和文獻(xiàn)中記載的(參見例如McGowan等，TRENDSinGenetics,22:281-289(2006);Fleming等，NeuroRx,2:495-503(2005);Wong等，NatureNe畫cience,5:633-639(2002》。各種此類動(dòng)物模型也可以自商業(yè)銷售商獲得，諸如JacksonLaboratory(參見http:〃iaxmice.jax,org)。許多本領(lǐng)域已知的動(dòng)物模型可用于檢驗(yàn)本文中所公開的DR6拮抗劑對(duì)神經(jīng)學(xué)病癥(諸如AD)的活性(參見例如Rakover等，NeurodegenerDis.2007;4(5):392-402;Mouri等，F(xiàn)ASEBJ.2007Jul;21(9):2135-48;Minkeviciene等,JPharmacolExpTher.2004Nov;311(2):677-82;及Yuede等，BehavPharmacol.2007Sep;18(5-6):347-63))。例如，本文中所公開的DR6拮抗劑對(duì)小鼠認(rèn)知功能的效果可使用目標(biāo)識(shí)別測(cè)驗(yàn)(objectrecognitiontests)來(lái)檢驗(yàn)(參見例如Ennaceur等，Behav.BrainRes.1988;31:47-59)。本文中所公開的DR6拮抗劑對(duì)例如腦炎癥的活性可以在小鼠中檢驗(yàn)，通過(guò)例如設(shè)計(jì)用于測(cè)量炎癥標(biāo)志物(諸如IL-l(3和TNF-a)和抗炎細(xì)胞因子IL-10在小鼠血漿級(jí)分中水平的ELISA方案以及組織化學(xué)分析(參見例如Rakover等，NeurodegenerDis.2007;4(5):392-402)。本文中所公開的DR6拮抗劑對(duì)人類中神經(jīng)學(xué)病癥(諸如阿耳茨海默氏病(AD))的效果可以例如通過(guò)i人知結(jié)果測(cè)量(cognitiveoutcomemeasure)連同整體評(píng)價(jià)(globalassessment)的使用來(lái)4企-驗(yàn)(參見例如LeberP:GuidelinesfortheClinicalEvaluationofAntidementiaDrugs,1stdraft,Rockville,MD,USFoodandDrugAdministration,1990)。對(duì)神經(jīng)學(xué)病癥(諸如AD)的效果可以例如使用單組或多組標(biāo)準(zhǔn)來(lái)檢驗(yàn)。例如，歐洲藥品評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)(EuropeanMedicineEvaluationAgency,EMEA)引入了與功能和整體二者活性中認(rèn)知和穩(wěn)定方面預(yù)定改善程度對(duì)應(yīng)的響應(yīng)者(responders)的定義(參見例如EuropeanMedicineEvaluationAgency(EMEA):NoteforGuidelinesonMedicinalProductsintheTreatmentofAlzheimer'sDisease.London,EMEA,1997)。本領(lǐng)域知道許多可單獨(dú)地或與組合地用于評(píng)估患者對(duì)藥劑響應(yīng)的特定的、已建立的測(cè)試(參見例如VanDyke等，AMJGeriatr.Psychiatry14:5(2006)。例如可使用嚴(yán)重病損組(SevereImpairmentBattery,SIB)來(lái)評(píng)估對(duì)藥劑的響應(yīng)，這是一種用于測(cè)量患有更嚴(yán)重AD的患者中認(rèn)知變化的測(cè)試(參見例如Schmitt等，AlzheimerDisAssocDisord1997;ll(suppl2):51-56)。也可以使用19項(xiàng)阿耳茨海默氏病合作研究-日常生活活動(dòng)清單(19-itemAlzheimer'sDiseaseCooperativeStudy—ActivitiesofDailyLivinginventory,ADCSADL19)來(lái)測(cè)量對(duì)藥劑的響應(yīng)，這是測(cè)量實(shí)行日常生活活動(dòng)的獨(dú)立性水平的19項(xiàng)清單，為晚期癡呆設(shè)計(jì)并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證(參見例如Galasko等，JIntNeuropsycholSoc2005;11:446-453)。也可以使用基于臨床醫(yī)師訪談的變化印象加護(hù)理員輸入(Clinician'sInterview-BasedImpressionofChangePlusCaregiverInput,CIBIC-Plus)來(lái)觀'J量對(duì)藥劑的響應(yīng)，這是基于與患者和護(hù)理員二者的結(jié)構(gòu)化訪談的七點(diǎn)整體變化i平纟及(參見仿Ji口Schneider等，AlzheimerDisAssocDisord1997;ll(suppl2):22-32)。也可以使用神經(jīng)精神病學(xué)清單(NeuropsychiatryInventory,NPI)來(lái)測(cè)量對(duì)藥劑的響應(yīng)，其基于護(hù)理員訪談來(lái)評(píng)估12項(xiàng)行為癥狀的頻率和嚴(yán)重性(參見例如Cummings等，Neurology1994;44:2308-2314)。多種膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊(Donepezil)、加蘭他敏(Galantamine)、利伐斯的明(Rivastigmine)和他克林(Tacrine))以及美金剛(Memantine)(—種已知的N-曱基-D-天冬氨酸鹽/酯(NMDA)受體拮抗劑)已經(jīng)收到管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于阿耳茨海默氏病的治療(參見例如Roberson等，Science314:781-784(2006))。在膽堿酯酶抑制劑在輕度至中度嚴(yán)重性AD患者中的臨床試驗(yàn)中，治療應(yīng)答的普通定義牽涉六個(gè)月里阿耳茨海默氏病評(píng)估量表-認(rèn)知子表(Alzheimer'sDiseaseAssessmentScale-CognitiveSubscale，ADAS-cog)上至)、四點(diǎn)的改善(參見例如Winblad等，IntJGeriatrPsychiatry2001;16:653-666;CummingsJ.，AmJGeriatrPsychiatry2003;11:131-145;及Lanctot等，CMAJ2003;169:557-564)。還已經(jīng)將這些結(jié)果與分別將疾病過(guò)程倒退6個(gè)月或l年進(jìn)4亍了比舉交(參見l列i口Doraiswamy等,AlzheimerDisAssocDisord(2001)15:174-183)。在美金剛的臨床試驗(yàn)中，已經(jīng)將治療響應(yīng)者預(yù)定為在整體能力方面顯示沒有衰退且在功能或認(rèn)知任一能力方面均顯示沒有衰退的患者(參見例如Reisberg等，N.Engl.J.Med.2003;348:1333-1341)。美金剛在服用穩(wěn)定劑量膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊的患者中的另一項(xiàng)試驗(yàn)將美金剛表征為展現(xiàn)出在結(jié)果測(cè)量方面勝過(guò)安慰劑的益處，包括相對(duì)于嚴(yán)重病損組(SevereImpairmentBattery,SIB)和改良19項(xiàng)AD認(rèn)知研究-日常生活活動(dòng)清單(modified19-itemADCooperativeStudy-ActivitiesofDailyLivingInventory,ADCS-ADL19)、基于臨床醫(yī)師訪談的變化印象加護(hù)理員意見(Clinician'sInterview-BasedImpressionofChangePlusCaregiverInput,CIBIC-Plus)、神經(jīng)精神病學(xué)清單(NeuropsychiatryInventory,NPI)、和老年病學(xué)患者行為評(píng)級(jí)量表(BehavioralRatingScaleforGeriatricPatients,BGPCareDependencySubscale)的基線的變化(參見例如Tariot等，JAMA2004;291:317-324)。通過(guò)在多種SIB、ADCS-ADL19、CIBIC-Plus和NPI結(jié)果測(cè)量間產(chǎn)生癥狀的改善和穩(wěn)定二者，美金剛已經(jīng)進(jìn)一步表征為有效(參見例如vanDyck等，AMJGeriatr.Psychiatry14:5(2006))。DR6拮抗劑的診斷應(yīng)用(ADEOAD)指通常在生命早期(定義為在65歲之前，通常介于20-65歲之間)侵襲的罕見形式阿耳茨海默氏病，其可以是以常染色體顯性方式遺傳的。關(guān)于淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)、早老蛋白l(PSEN1)、和早老蛋白2(PSEN2)基因的研究提供了這些基因中的突變負(fù)責(zé)大多數(shù)ADEOAD觀察病例的證據(jù)(參見例如Raux等，JournalofMedicalGenetics2005;42:793-795)。然而，此類癥狀的許多觀察病例仍然沒有得到解釋。本文中所呈現(xiàn)的資料提示死亡受體6的多肽和/或多核苷酸變體可能負(fù)責(zé)FAD和/或其它神經(jīng)學(xué)病癥的一些病例。本發(fā)明的實(shí)施方案包括測(cè)定個(gè)體中是否存在包含SEQIDNO:1的死亡受體6(DR6)多肽的多肽變體的方法，該方法包括比較個(gè)體中存在的DR6多肽的序列與SEQIDNO:l，以確定該個(gè)體中是否存在DR6的多肽變體。在此類方法中任選的是，該患者患有或懷疑患有FAD和/或其它神經(jīng)學(xué)病癥。在此語(yǔ)境中，可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的多種手段來(lái)分析患者樣品中的DR6多肽和/或多核苦酸(例如用以鑒定DR6的天然存在變體)，包括但不限于臨床樣品和細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)分析、原位雜交、RT-PCR分析、Western印跡分析、及組織陣列分析。用于評(píng)估DR6基因(例如DR65，和3，調(diào)節(jié)序列、內(nèi)含子、外顯子等等)和DR6基因產(chǎn)物(例如DR6mRNA、DR6多肽等等)的序列的典型方案可見于例如Ausubel等編，2007,CurrentProtocolsInMolecularBiology,單元2(Northern印跡)、單元4(Southern印跡)、單元15(免疫印跡)和單元18(PCR分析)。在此類分析的一個(gè)例示性實(shí)施方案中，自患有神經(jīng)學(xué)病癥或懷疑患有神經(jīng)學(xué)病癥的患者獲取神經(jīng)元細(xì)胞，從而可以通過(guò)諸如免疫測(cè)定法、Northem印跡列(參見例如Lane等，Laryngoscope.2002;112(7Pt1):1183-9;及Silani等，AmyotrophLateralSclerOtherMotorNeuronDisord.200;2Suppl1:S69-76)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)免疫測(cè)定法諸如Westem印跡分析來(lái)分析自患者神經(jīng)元細(xì)胞(其可以任選在體外培養(yǎng)中傳代)得到的DR6多肽(參見例如Pettermann等，JNeurosci.(10):3624-3632(1988))?；蛘?，可以通過(guò)例如自患者神經(jīng)元細(xì)胞提取的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析來(lái)分析DR6基因的部分或整個(gè)編碼區(qū)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，自神經(jīng)元細(xì)胞以外的細(xì)胞獲取DR6基因組序列，例如成纖維細(xì)胞或外周血白細(xì)胞，然后分析以確定這些基因組序列是否編碼DR6的多肽變體和/或包含DR6的多核苷酸變體(包括5，和3，調(diào)節(jié)序列變體，例如影響DR6在細(xì)胞中表達(dá)水平的)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，此類分析可以仿效淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)、早老蛋白1(PSEN1)、和早老蛋白2(PSEN2)基因的分析(參見例如Nagasaka等，ProcNatlAcadSciUSA.2005;102(41):14854-9;處inckh等，Neurogenetics.2005;6(2):85畫9)。用于鑒定DR6拮抗劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的實(shí)施方案包括鑒定抑制DR6結(jié)合APP的感興趣分子的方法，該方法包括在存在或不存在感興趣分子的情況中組合DR6和APP，然后在存在所述感興趣分子的情況中檢測(cè)對(duì)DR6結(jié)合APP的抑制。具體而言，使用本文中所提供的公開內(nèi)容，能鑒定例如與DR6和/或APP相互作用并抑制DR6與APP之間相互作用的蛋白質(zhì)、小分子和其它分子。在此方法的一個(gè)例示性實(shí)施方案中，可以將DR6固定化在基質(zhì)上。然后可以在存在和不存在感興趣分子的情況中觀察游離APP(例如用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記的APP，所述可檢測(cè)標(biāo)志物諸如顯色標(biāo)志物、熒光標(biāo)簽、》i:射性標(biāo)記物、》茲標(biāo)簽、或酶促反應(yīng)產(chǎn)物等)結(jié)合固定化DR6的能力。然后可以使用APP對(duì)DR6的結(jié)合的降低(例如經(jīng)由可檢測(cè)標(biāo)志物的水平和/或位置的變化觀察到的)來(lái)鑒定分子為抑制APP結(jié)合DR6的能力。在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，可以將APP固定化在基質(zhì)上，以在存在和不存在感興趣分子的情況中檢測(cè)APP結(jié)合游離DR6(例如用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記的DR6)的能力。任選的是，在此類實(shí)施方案中，感興趣分子可以是抗體。本文中所提供的公開內(nèi)容容許本領(lǐng)域中用于表征多肽(諸如DR6和APP)之間結(jié)合的多種方案來(lái)鑒定抑制DR6和APP之間結(jié)合相互作用的分子。本發(fā)明的此類實(shí)施方案包括那些采用ELISA測(cè)定法(例如竟?fàn)幮曰蛉髦问紼LISA測(cè)定法，如美國(guó)專利No.6,855,508;6,113,897;和7，241,803中所披露的)、》文射免疫測(cè)定法(例如Ausubel等編，CurrentProtocolsInMolecularBiology,2007單元10.24中所4皮露的)、Western印跡測(cè)定法(例如如Pettermann等，JNeurosci.(10):36M-3632(1988)和下文實(shí)施例10中所披露的)、免疫組織學(xué)測(cè)定法(例如如下文實(shí)施例10中所披露的)、IAsys分析和CM-5(BIAcore)傳感器芯片分析(參見例如美國(guó)專利No.6，720,156和7，101,851)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，鑒定抑制DR6對(duì)APP結(jié)合的感興趣分子的方法使用蛋白質(zhì)微陣列。蛋白質(zhì)微陣列通常使用于限定位置在表面上固定化的感興趣蛋白質(zhì)分子(例如DR6和/或APP)，而且已經(jīng)用于鑒定小分子結(jié)合蛋白(參見例如Wilson等，Curr.OpinioninChemicalBiology2001,6，81-85;及Zhu，H"等，Science2001，293,1201-2105)。試劑盒和制品在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，提供了包含對(duì)于治療神經(jīng)學(xué)病癥有用的物質(zhì)的制品和試劑盒。所述制品包括帶有標(biāo)簽的容器。合適的容器包括例如瓶、管形瓶、和試管。所述容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料，而且優(yōu)選是經(jīng)過(guò)滅菌的。所述容器裝有有效治療神經(jīng)學(xué)病癥(包括阿耳茨海默氏病)的活性劑。組合物中的活性劑是DR6拮抗劑，而且優(yōu)選包括抗DR6單克隆抗體或抗APP單克隆抗體。容器上的標(biāo)簽指明該組合物用于治療神經(jīng)學(xué)病癥，而且還可指明體內(nèi)或體外用途的指導(dǎo)，諸如上文所描述的那些。制品或試劑盒任選進(jìn)一步包括包裝插頁(yè)，其指通常包括在治療用產(chǎn)品商業(yè)包裝中的說(shuō)明，它包含有關(guān)此類治療用產(chǎn)品使用的適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、禁忌、要與所包裝產(chǎn)品聯(lián)合的其它治療性產(chǎn)品、和/或警告信息等。本發(fā)明的試劑盒包括上文所述容器和第二容器，其中裝有緩沖劑。它可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場(chǎng)出發(fā)需要的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針和注射器。實(shí)施例通過(guò)下文實(shí)施例進(jìn)一步描述和例示了本發(fā)明的各個(gè)方面，這些實(shí)施例無(wú)一旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:胚胎和成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的DR6表達(dá)進(jìn)行了鼠胚胎組織中TNF受體超家族表達(dá)樣式的RNA原位篩選。更具體的說(shuō)，使用mRNALocator試劑盒(Ambion,產(chǎn)品目錄號(hào)1803)遵照制造商的方案實(shí)施原位雜交實(shí)驗(yàn)。使用如下DR6cDNA—級(jí)序列來(lái)生成用于這些實(shí)驗(yàn)的核糖核酸探針TGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACCTACTGGCGG.(SEQIDNO:3)使用Maxiscript試劑盒(Ambion,產(chǎn)品目錄號(hào)1308)依照制造商的方案進(jìn)行核糖核酸探針的體外合成。如圖2A中所示，在處于E10至E12階段(已知發(fā)生神經(jīng)元細(xì)胞死亡的階段)的發(fā)育中的脊髓和背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)DR6幾乎由已分化的神經(jīng)元專門表達(dá)，而非增殖中的先祖。如圖2B中所述，DR6蛋白在神經(jīng)元的細(xì)胞主體和軸突二者上表達(dá)。在圖2B中，上面的兩幅圖顯示了來(lái)自正常小鼠的神經(jīng)元，顯現(xiàn)DR6(左)或?qū)φ盏鞍?右)。下面的兩幅圖相應(yīng)地顯示了來(lái)自DR6敲除小鼠的神經(jīng)元，顯現(xiàn)DR6(左)或?qū)φ盏鞍?右)。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。為了顯現(xiàn)如例如圖2B中所顯示的感覺軸突上的DR6蛋白表達(dá)，在Genentech使用人重組DR6作為免疫原生成DR6特異性小鼠單克隆抗體(見下文實(shí)施例3)。通過(guò)免疫熒光對(duì)這些抗體進(jìn)一步篩選它們識(shí)別在細(xì)胞表面上表達(dá)的全長(zhǎng)小鼠和人DR6的能力。一種稱作"RA.3"(也稱為"3F4.8.8"單抗，且在下文實(shí)施例3和實(shí)施例7中有進(jìn)一步描述)的此類抗體與人和小鼠DR6多肽二者起交叉反應(yīng)，并被用于顯現(xiàn)如圖2B中所顯示的軸突上的DR6表達(dá)。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方案實(shí)施免疫熒光染色規(guī)程(Nikolaev等，2003，Cell,112(1),29-40)。為了顯現(xiàn)軸突上的DR6表達(dá)，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。如圖2C中所示，DR6mRNA由分化中的神經(jīng)元表達(dá)。在圖2C中，由左至右，三幅照片分別顯示了來(lái)自處于發(fā)育階段E10.5、E11.5和E12.5的正常小鼠的神經(jīng)元的腦部掃描。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。為了顯現(xiàn)發(fā)育中的小鼠胚胎中的DR6mRNA表達(dá)，對(duì)在E10.5-E12.5小鼠胚胎的胸軸水平釆集的20微米組織橫切片實(shí)施使用DR63'UTR特異性的放射性標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行的原位mRNA雜交(ISH)。使用mRNALocator原位雜交試劑盒依照制造商的方案如mRNALocatori兌明手冊(cè)(AmbionInc.,產(chǎn)品目錄號(hào)1803)中所概述的那樣實(shí)施ISH實(shí)驗(yàn)。在體外翻譯反應(yīng)中使用MAXIscript試劑盒依照制造商的說(shuō)明手冊(cè)(AmbionInc.,產(chǎn)品目錄號(hào)1308-1326)生成與小鼠DR63'UTR的反義序列對(duì)應(yīng)的放射性標(biāo)記的mRNA探針。將Kodaki文射自顯影乳液(Kodak)施加于帶有胚胎組織橫切片的載玻片來(lái)顯現(xiàn)DR6mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。在暗視野中在Axioplan-2成像Zeiss顯樣i4竟上4吏用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。用于生成這些實(shí)驗(yàn)中的核糖核酸探針的DR6cDNA的一級(jí)序列如下ACCTACTGGCGG(SEQIDNO:3)進(jìn)一步分析使用Allen腦圖冊(cè)(http:〃www.brainatlas.org/aba/;Allen腦圖冊(cè)是公眾可獲得的科學(xué)資源，其提供了小鼠腦中大約20,000種基因的表達(dá)地圖)揭示了DR6在成年腦的大腦皮層中高表達(dá)。DR6mRNA在例如皮層神經(jīng)元、海馬CA1-CA4錐體神經(jīng)元和齒狀回中表達(dá)。DR6蛋白在成年皮層和海馬中的神經(jīng)元細(xì)胞主體中表達(dá)。這種表達(dá)樣式提供了證據(jù)來(lái)證明，在其在發(fā)育中的左右之外，DR6還在與神經(jīng)元細(xì)胞損失有關(guān)的神經(jīng)變性性疾病的*中發(fā)揮功能。實(shí)施例2:RNA干擾對(duì)DR6表達(dá)的抑制阻止外植體培養(yǎng)物中連合神經(jīng)元的軸突變性連合神經(jīng)元是一組在發(fā)育階段E9.5至E11.5之間在背側(cè)脊髓中產(chǎn)生的長(zhǎng)投射的脊髓中間神經(jīng)元。認(rèn)為連合神經(jīng)元的存活依賴于來(lái)自它們的中間靶物之一即脊髓底板的營(yíng)養(yǎng)支持。這種依賴性發(fā)生在一個(gè)持續(xù)數(shù)天的時(shí)間段期間，那時(shí)它們的軸突沿底板延伸，之后它們形成另外的營(yíng)養(yǎng)要求。神經(jīng)元對(duì)順便地衍生自它們的中間軸突靶物的營(yíng)養(yǎng)支持的依賴性提供了快速消除錯(cuò)誤投射的神經(jīng)元的機(jī)制，這可能有助于防止在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中形成異常神經(jīng)元回路(Wang等，Nature,401:765-769(1999))。為了檢驗(yàn)DR6在連合神經(jīng)元的軸突變性和程序性細(xì)胞死亡中的功能性作用，進(jìn)行了基于RNAi的背側(cè)脊髓存活測(cè)定法(Kennedy等，^U，78:425-435(1994);Wang等，見上文,1999)(見圖3)。將E13大鼠或E11.5小鼠胚胎置于L15培養(yǎng)基(Gibco)中，并將siRNA(IDT)與綠色熒光蛋白("GFF，)編碼質(zhì)粒一起注射入神經(jīng)管中。然后通過(guò)電穿孔將siRNA和質(zhì)粒投遞至背側(cè)祖細(xì)胞。解剖出背側(cè)脊髓外植體，包埋入3D-膠原凝膠基質(zhì)中，并在含重組導(dǎo)蛋白(netrin)-l(R&DPharmaceuticals)和5%馬血清(Sigma)的Opti-MEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)中于37。C在5。/oC02環(huán)境中培養(yǎng)。在16小時(shí)內(nèi)，作為對(duì)化學(xué)引誘物導(dǎo)蛋白-l的應(yīng)答，連合神經(jīng)元自外植體長(zhǎng)出，進(jìn)入膠原基質(zhì)凝膠中(Kennedy等，見上文,1994)。通過(guò)使用倒置顯微鏡的觀察，通過(guò)GFP焚光顯現(xiàn)連合軸突。'如圖4A中所示，在缺乏衍生自底板的營(yíng)養(yǎng)因子支持的情況中培養(yǎng)48小時(shí)后，連合神經(jīng)元經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡且它們的軸突變性(還可參見Wang等,見上文，1999)。當(dāng)連合神經(jīng)元中的DR6表達(dá)被DR6特異性siRNA分子下調(diào)時(shí)，這樣的軸突變性被顯著阻斷(見圖4，下面的小圖)。在使用非耙向siRNA分子進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到這種對(duì)軸突變性的抑制。這些數(shù)據(jù)提示DR6是在來(lái)自連合神經(jīng)元的中間靶物即脊髓底板的營(yíng)養(yǎng)支持?jǐn)嘟^時(shí)連合神經(jīng)元的軸突變性所需要的重要的促凋亡受體。如圖4B中所示，RNAi抗性DR6cDNA4免才丈了被DR6siRNA阻斷的變性表型。在圖4B中，由左至右，上面的四幅照片顯示了在存在以下各項(xiàng)時(shí)的神經(jīng)元(1)對(duì)照RNAi;(2)暴露于DR6siRNA弁3的野生型DR6;(3)暴露于DR6siRNA弁2的錯(cuò)配DR6;和(4)暴露于DR6siRNA弁3的錯(cuò)配DR6。下面的兩幅小圖顯示了以下各項(xiàng)的》文射自顯影照片(1)在存在對(duì)照siRNA、siRNA#2、和siRNA弁3時(shí)的野生型DR6mRNA;和(2)在存在對(duì)照siRNA、siRNA#2、和siRNA#3時(shí)的錯(cuò)配DR6mRNA。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。為了調(diào)查DR6受體在連合神經(jīng)元的軸突變性和程序性細(xì)胞死亡中的生理學(xué)作用，依照本領(lǐng)域已知方案實(shí)施了背側(cè)脊髓存活測(cè)定法(Kennedy等，￡^1,78:425-435(1994);Wang等，Nature,401:765-769(1999))(數(shù)據(jù)顯示在圖4B中)。將E13大鼠胚胎置于L15培養(yǎng)基(Gibco)中，并將如下siRNA構(gòu)建體(圖4B)注射入它們的神經(jīng)管中對(duì)照非粑向的、或靶向的DR6siRNA#2、或靶向的DR6siRNA#3(IDT)以及野生型的或錯(cuò)配的DR6cDNA和GFP編碼質(zhì)粒。將DR6cDNA和GFPcDNA亞克隆入可自BCCM/LMBP購(gòu)得的pCAGGS載體骨架中。然后通過(guò)電穿孔將siRNA和質(zhì)粒投遞至背側(cè)祖細(xì)胞。然后解剖出背側(cè)脊髓外植體，包埋入3D膠原凝膠基質(zhì)中，并在含重組導(dǎo)蛋白-l和5。/。馬血清(Sigma)的Opti-MEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)中于37。C在5。/。C02環(huán)境中培養(yǎng)。在16小時(shí)內(nèi)，作為對(duì)化學(xué)引誘物導(dǎo)蛋白-l的應(yīng)答，連合神經(jīng)元自外植體長(zhǎng)出，進(jìn)入膠原基質(zhì)凝膠中(Kennedy等，78:425-435(1994))。通過(guò)使用倒置顯微鏡的觀察，通過(guò)GFP熒光顯現(xiàn)連合軸突。在缺乏衍生自底板的營(yíng)養(yǎng)因子支持的情況中培養(yǎng)48小時(shí)后，連合神經(jīng)元經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡且它們的軸突變性fWang等，Nature,401:765-769(1999))(圖4B)。然而，軸突變性程序能被耙向DR6特異性siRNA弁3的導(dǎo)入所阻斷(圖4B)。DR特異性siRNA弁3的特異性的、上扭(on-target)效應(yīng)在挽救實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步證實(shí)，其中siRNAW抗性錯(cuò)配DR6cDNA構(gòu)建體與DR6siRNA#3—起的過(guò)表達(dá)恢復(fù)了軸突變性表型(圖4B)。所呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)了DR6受體功能是在自它們的中間靶物即脊髓底板收回時(shí)連合神經(jīng)元的軸突變性和死亡所需要的。上文所述測(cè)定法中所使用的DR6siRNAs#2和#3(有義鏈)及與DR6siRNA#3序列互補(bǔ)的DR6cDNA錯(cuò)配片段的序列如下大鼠DR6siRNA#25，-AAUCUGUUGAGUUCAUGCCUU畫3，(SEQIDNO:11)大鼠DR6siRNA#35，-CAAUAGGUCAGGAAGAUGGCU陽(yáng)3，(SEQIDNO:12)與DR6siRNA#3序歹'J互補(bǔ)的大鼠DR6cDNA錯(cuò)酉己片段5，-GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG-3，(SEQIDNO:13)實(shí)施例3:抗DR6抗體對(duì)DR6受體信號(hào)傳導(dǎo)的抑制阻止外植體培養(yǎng)物中連合神經(jīng)元的軸突變性使用抗DR6抗體進(jìn)行了背側(cè)脊髓存活測(cè)定法(如上文實(shí)施例2中所描述的)。采用顯微鏡觀察(使用GFP的綠色熒光通道)來(lái)顯現(xiàn)連合軸突。依照本領(lǐng)域已知方案實(shí)施背側(cè)脊髓存活測(cè)定法(Kennedy等，￡^11,78:425-435(1994);Wang等，Nature,401:765-769(1999)),帶有上文實(shí)施例2中所概述的修改。將GFP表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建體(將GFPcDNA亞克隆入可自BCCM/LMBP購(gòu)得的pCAGGS載體骨架)注射入E13大鼠胚胎的神經(jīng)管中。然后通過(guò)電穿孔將GFP表達(dá)質(zhì)粒投遞至背側(cè)祖細(xì)胞。鋪板后24小時(shí)以40ug/ml將抗DR6阻斷性抗體或?qū)φ照Ｐ∈驣gG添加至連合外植體。鋪板后48小時(shí)如下文所概述的那樣拍攝連合外植體的照片。為了顯現(xiàn)表達(dá)GFP的連合軸突，在Axiovert200Zeiss倒置顯微鏡上(在GFP的綠色熒光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImaging用于此實(shí)驗(yàn)的抗DR6抗體如下生成。使用融合有Fc的人DR6胞外結(jié)構(gòu)域序歹iJ(hDR6-ECD-Fc)作為免疫原來(lái)生成抗DR6小鼠單克隆抗體。所使用的hDR6-ECD-Fc免疫原的序列如下KPGTKETDNVCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPSSTYVPKGMQGPHHRHILKLLPSMEATGGEKSSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDINEHLPWMIPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDN0:4)使用先前描述的方案生成融合多肽(Ashkenazi等，CurrOpinImmunol.,9(2):195-200(1997);Haak-Frendscho等，JImmunol.,152(3):1347-53(1994))。通過(guò)大約8周時(shí)間段里注射100ulhDR6-ECD-Fc免疫原(lmg/動(dòng)物)給9周齡Balb/c小鼠免疫。然后將所有經(jīng)免疫小鼠的淋巴結(jié)(11xl0^田胞/ml，5ml)與PU.1骨髓瘤細(xì)胞(來(lái)自ATCC的鼠骨髓瘤細(xì)胞)(5xl0^田胞/ml，5ml)融合。將細(xì)胞以2xl(^細(xì)胞/ml分配入4塊板中。使用捕捉ELISA對(duì)雜交瘤篩選對(duì)上文所述hDR6-ECD-Fc多肽的特異性結(jié)合。將板用50ul2ug/ml山羊抗人IgGFc特異性(Cappel產(chǎn)品目錄號(hào)55071)于4。C包被過(guò)夜。將板用PBS加Brij清洗3次，并將板用200ul2%BSA于室溫封閉1小時(shí)。然后將板用PBS加Brij清洗3次。隨后，將板與100ul/孔的0.4ug/ml免疫粘附素一起在搖床上溫育l小時(shí)。然后將板用PBS加Brij清洗3次。將100ul一抗添加至孔，并在搖床上溫育l小時(shí)。再次將板用PBS加Brij清洗3次。100ull:1000綿羊抗小鼠IgGHRP(不與人交叉，Cappel產(chǎn)品目錄號(hào)55569)抗體1小時(shí)。將板用PBS加Brij清洗3次。添加50ul底物(TMBMicrowell過(guò)氧化物酶KPL#50-76-05)并將板溫育5分鐘。用50ul/孔終止液(KPI^50-85-05)終止反應(yīng)。讀取450nm處的吸光度。所使用的測(cè)定緩沖液含有PBS、5%BSA、和0.05°/0Tween20。然后通過(guò)有限稀釋(含10%HCF、10%FCS的SCDME培養(yǎng)基)克隆在捕捉ELISA測(cè)定法中測(cè)試對(duì)hDR6-ECD-Fc多肽的結(jié)合為陽(yáng)性的雜交瘤。IO天后，取出板并通過(guò)上文所述捕捉ELISA測(cè)定有一個(gè)集落的孔。然后對(duì)多種選定的單克隆抗體測(cè)試同種型，并顯示為IgGl同種型。然后在背側(cè)脊髓存活測(cè)定法中對(duì)鑒別為"3B11.7.7"、"3F4.4.8"、"4B6.9.7"、和"1E5.5.7，，的四種抗DR6單抗測(cè)試它們阻斷軸突變性的能力。驚人的是，這些抗DR6單抗中的某些(3F4.4.8、4B6.9.7、和1E5.5.7)能夠部分地抑制由培養(yǎng)中48小時(shí)的營(yíng)養(yǎng)剝奪誘導(dǎo)的連合神經(jīng)元的軸突變性(見圖5)。認(rèn)為此類抗體可能促進(jìn)神經(jīng)元存活，例如通過(guò)阻斷推定的DR6配體與DR6受體之間的相互作用或通過(guò)抑制配體依賴性DR6信號(hào)傳導(dǎo)。3B11.7.7DR6抗體在誘導(dǎo)軸突變性中具有略孩i的刺激效應(yīng)。實(shí)施例4:JunN末端激酶(JNKI)的特異性肽抑制劑對(duì)DR6受體信號(hào)傳導(dǎo)的抑制DR6受體據(jù)報(bào)道通過(guò)JNK的活化來(lái)發(fā)信號(hào)，而且觀察到JNK活性在DR6缺無(wú)小鼠模型中受損(Pan等，F(xiàn)EBSLett.,431:351-356(1998);Zhao等，JournalofExperimentalMedicine,巻194，1441-1441,2001))。為了檢驗(yàn)DR6-JNK信號(hào)傳導(dǎo)在軸突變性中的作用，實(shí)施了背側(cè)脊髓存活測(cè)定法(如上文實(shí)施例2中所描述的)，只是通過(guò)使用lpM濃度的肽抑制劑L-JNK-I((丄)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20;Calbiochem)阻斷連合神經(jīng)元中的JNK信號(hào)傳導(dǎo)途徑。測(cè)試了作為對(duì)照的DMSO(SIGMA)和正常小鼠IgG。如圖6中所示，這種對(duì)JNK信號(hào)傳導(dǎo)的抑制在背側(cè)脊髓存活測(cè)定法中部分地阻斷軸突變性。這些數(shù)據(jù)提示DR6至少部分地通過(guò)JNK途徑發(fā)出軸突變性過(guò)程的信號(hào)。實(shí)施例5:抗DR6抗體對(duì)DR6受體信號(hào)傳導(dǎo)的抑制阻止小鼠胚胎脊髄中的神經(jīng)元細(xì)胞死亡進(jìn)行了測(cè)定法，其中在全胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)中用抗DR6單抗阻斷DR6信號(hào)傳導(dǎo)。下文所述此系統(tǒng)容許小鼠全胚胎在管形瓶中在體外培養(yǎng)2天，自發(fā)育階段E9.5至E11.5。自子宮解剖出E9.5胚胎，卵黃嚢附著于胚胎，并且在100%大鼠血清(Harlan)中第一天在65。/。氧氣環(huán)境中和第二天在95。/。氧氣中培養(yǎng)于37°C。以10ug/ml終濃度在測(cè)定法中添加抗DR6單抗(上文實(shí)施例中所述)，并以10ug/ml濃度使用正常小鼠IgG抗體作為對(duì)照。通過(guò)使用識(shí)別經(jīng)過(guò)切割的胱天蛋白酶-3的抗體(針對(duì)經(jīng)過(guò)切割的胱天蛋白酶-3的抗體，購(gòu)自R&DSystems)進(jìn)行的免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)和顯微鏡檢術(shù)觀察凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示于圖7。驚人的是，在此系統(tǒng)中抗DR6單抗3F4.4.8、4B6.9.7、和1E5.5.7對(duì)DR6的抑制針對(duì)天然發(fā)生的發(fā)育性細(xì)胞死亡保護(hù)脊髓神經(jīng)元。實(shí)施例6:DR6缺無(wú)小鼠中降低的神經(jīng)元細(xì)胞死亡分析了處于發(fā)育階段E15.5的DR6敲除胚胎(Zhao等，JournalofExperimentalMedicine,Vol.194，1441-1441，2001)的表型。經(jīng)過(guò)切割的胱天蛋白酶3是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志物，而且為了檢驗(yàn)胚胎脊髓中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的程度，使用經(jīng)過(guò)切割的胱天蛋白酶3的免疫染色(針對(duì)經(jīng)過(guò)切割的小鼠胱天蛋白酶-3的抗體，購(gòu)自R&DSystems)。還檢驗(yàn)了作為對(duì)照的DR6雜合同窩出生者。將低聚甲醛(PFA)固定的胚胎組織切片在封閉液(2%熱滅活的山羊血清(Sigma)/PBS(Gibco)/0.1%Triton(Sigma))中封閉l小時(shí)并與一抗(l:500稀釋的針對(duì)經(jīng)過(guò)切割的小鼠胱天蛋白酶-3的抗體，購(gòu)自R&DSystems)—起在封閉液中于4。C溫育過(guò)夜。將切片用封閉液于室溫歷時(shí)1小時(shí)清洗3次，并與二抗(l:500稀釋的山羊抗家兔Alexa488，MolecularProbes，Invitrogen)—起于室溫溫育l小時(shí)。然后將切片用封閉液于室溫清洗l小時(shí)并通過(guò)綠色通道中的免疫熒光顯現(xiàn)。對(duì)每個(gè)胚胎每個(gè)脊髓切片的胱天蛋白酶3陽(yáng)性核的數(shù)目定量(見圖8和9A)。在DR6缺無(wú)小鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中檢測(cè)到與DR6雜合同窩出生者對(duì)照相比神經(jīng)元細(xì)胞死亡降低大約40-50%(圖8和9A)。因而，認(rèn)為在體內(nèi)DR6信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。如圖9B中所示，DR6是運(yùn)動(dòng)軸突變性所需要的，正如DR6缺無(wú)小鼠所證實(shí)的。在存在和不存在腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3(NT-3)(BDNF和NT-3得自Chemicon)的情況中分析來(lái)自處于發(fā)育階段E13.5的DR6敲除胚胎(Zhao等，JournalofExperimentalMedicine,巻194,1441-1441，2001)以及正常胚胎的腹側(cè)脊髓外植體(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)。在圖9B中，左上小圖顯示了在存在BDNF和NT-3的情況中的來(lái)自正常小鼠的腹側(cè)脊髓外植體，而左下小圖顯示了在存在BDNF和NT-3的情況中的來(lái)自DR6敲除(KO)小鼠的腹側(cè)脊髓外植體。類似的，右上小圖顯示了在不存在這些生長(zhǎng)因子的情況中的來(lái)自正常小鼠的腹側(cè)脊髓外植體，而右下小圖顯示了在不存在BDNF和NT-3的情況中的來(lái)自DR6敲除(K0)小鼠的腹側(cè)脊髓外植體。用于生成此圖9B中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如Henderson等,Nature,363:266-270(1993)中所述的那樣但有少許修改實(shí)施運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元腹側(cè)脊髓存活測(cè)定法。使用經(jīng)酒精處理的剪子解剖出DR6雜合或DR6缺無(wú)小鼠E13.5胚胎并置于溫?zé)岬腖15培養(yǎng)基(Gibco)中。使用同一剪子和鑷子，打開胚胎的腹區(qū)，取出器官，切掉肋，并解剖出整個(gè)脊髓，然后用鑷子除去周圍的腦脊膜組織。除去頂板，獲得了開書型脊髓制備物(openbookprepofspinalcord)。分離包括MMC和LMC運(yùn)動(dòng)柱的脊髓腹側(cè)一半并小心地切掉剩余的底板組織。用在L15中包被過(guò)的黃色槍頭(tip)將腹側(cè)脊髓轉(zhuǎn)移至裝有L15+5%FBS(Sigma)血清的新小盤，用于使用鴒針頭進(jìn)一步切成外植體。給經(jīng)PDL/層粘連蛋白包被的8孔載玻片(Becton,DickinsonandCompany)裝填500ul每孔Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen)加均為50ng/ml的重組BDNF和NT-3(Chemicon),加B-27補(bǔ)充物X50(Invitrogen);加青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺X100(產(chǎn)品目錄號(hào)10378-016;Gibco)加葡萄糖X100。將切好的腹側(cè)脊髓外植體置于每個(gè)孔中(每個(gè)孔2-3個(gè)外植體)并在37。C溫箱中放置48小時(shí)以生長(zhǎng)。2天后，如下實(shí)施營(yíng)養(yǎng)因子剝奪取走舊的培養(yǎng)基，并將孔用Neurobasal培養(yǎng)基(不含營(yíng)養(yǎng)因子)溫和地清洗2次。添加預(yù)溫?zé)岬腘eurobasal培養(yǎng)基/B-27(Invitrogen)(如上文所述制備，不含營(yíng)養(yǎng)因子)加20ug/ml的抗BDNF和抗NT3阻斷性抗體(Genentech，Inc.)。然后將帶有外植體的栽玻片于37。C再溫育24-48小時(shí)。2天后，將外植體在PBS中的4%PFA中固定，用Net凝膠(Nikolaev等，2003:Cell,112(1),29-40)中的0.2%Triton于0。C透化10分鐘，并用Net凝膠清洗2次。為了封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，將載玻片在含1%BSA的PBS中于4。C溫育過(guò)夜。為了顯現(xiàn)變性中的運(yùn)動(dòng)軸突，次日實(shí)施用抗p75NTR特異性抗體(l:500稀釋，Chemicon)進(jìn)行的免疫染色(1:500稀釋的一抗于4。C在1。/。BSA/PBS中過(guò)夜，1:500稀釋的二抗于室溫1小時(shí))。取下孔，并使用Fluoromount-G來(lái)將蓋玻片裝在載玻片上。為了顯現(xiàn)表達(dá)p75NTR的運(yùn)動(dòng)軸突，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。如圖9C中所公開的數(shù)據(jù)所示，由損傷誘導(dǎo)的變性在DR6敲除d、鼠中得到延遲。在圖9C中，由左至右，上面的四幅小圖分別顯示了來(lái)自正常小鼠的神經(jīng)元在存在神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的情況中；及損傷后4、8或16小時(shí)。在圖9C中，由左至右，下面的4幅小圖分別顯示了來(lái)自DR6KO小鼠的神經(jīng)元在存在外源神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的情況中；及損傷后4、8或16小時(shí)。如下實(shí)施如圖9C中所示的體外感覺軸突損害測(cè)定法。解剖出DR6雜合或DR6缺無(wú)小鼠E12.5胚胎并置于溫?zé)岬腖15培養(yǎng)基(Gibco)中。使用同一剪子和鑷子，打開胚胎的腹區(qū)，取出器官，切掉肋，并用鑷子解剖出附著于脊髓的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。然后用在L15中包被過(guò)的黃色槍頭將DRG轉(zhuǎn)移至裝有L15+5%FBS(Sigma)血清的新的小盤，用于使用鴒針頭進(jìn)一步切成1/4DRG外植體。給經(jīng)PDL/層粘連蛋白預(yù)包被的8孔載玻片(Becton，DickinsonandCompany)裝填500ul每孔Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen)加50ng/mlNGF(RocheMolecularBiochemicals)，力口B畫27補(bǔ)充物X50(Invitrogen);力。青霉素畫鏈霉素-谷氨酰胺X100;加葡萄糖X100。將切好的DRG外植體置于每個(gè)孔中(每個(gè)孑L2-3個(gè)DRG外植體)并在37。C溫箱中放置48小時(shí)以生長(zhǎng)。2天后，如下實(shí)施軸突損害測(cè)定法通過(guò)用微型刀(FineScienceTools)在DRG外植體的正上方和正下方給感覺軸突做兩平行切口來(lái)誘發(fā)損傷。DRG外植體左邊和右邊的沒有切過(guò)的軸突充當(dāng)內(nèi)源無(wú)損害對(duì)照。將帶有切過(guò)的DRG外植體的載玻片在損傷后0、4、8、16和24小時(shí)在PBS中的4。/。PFA中固定，用Net凝膠(Nikolaev等，2003，Cell，112(1),29-40)中的0.2%Triton于0。C透化10分鐘，并用Net凝膠清洗2次。為了封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，將載玻片在PBS中的1。/。BSA中于4。C溫育過(guò)夜。為了顯現(xiàn)變性中的感覺軸突，次日實(shí)施用神經(jīng)元III類P-微管蛋白(TUJ1)特異性抗體(l:500稀釋，Covance)的免疫染色(l:500稀釋的一抗于4。C在l。/。BSA/PBS中過(guò)夜，1:500稀釋的二抗于室溫1小時(shí))。取下孔，并使用Fluoromount-G來(lái)給載玻片安裝蓋玻片。為了顯現(xiàn)用免疫焚光標(biāo)記的感覺軸突，在Axioplan畫2成像Zeiss顯孩支4竟上4吏用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。實(shí)施例7:抗DR6抗體拮抗劑抑制神經(jīng)元變性如圖10A中所示，抗DR6抗體抑制各式各樣被剝奪了營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)元的變性(在軸突變性測(cè)定法中)。在圖10A中，由左至右，前面的兩組上下兩幅照片顯示了來(lái)自連合神經(jīng)元的數(shù)據(jù)。在這前面的四幅照片中，上面的兩幅照片顯示了在分別存在對(duì)照IgG和RA.5DR6抗體的情況中的連合神經(jīng)元，而下面的兩幅照片顯示了在分別存在RA.lDR6抗體和RA.3DR6抗體的情況中的連合神經(jīng)元。圖IOA中中間的兩組上下兩幅照片顯示了來(lái)自感覺神經(jīng)元的數(shù)據(jù)。在這中間的四幅照片中，上面的兩幅照片分別顯示了在存在和不存在NGF的情況中的感覺神經(jīng)元，而下面的兩幅照片顯示了在不存在NGF但分別存在RA.lDR6抗體和RA.3DR6抗體的情況中的感覺神經(jīng)元。圖10A右側(cè)的兩組上下兩幅照片顯示了來(lái)自運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)據(jù)。在右邊這四幅照片中，上面的兩幅照片分別顯示了在存在和不存在生長(zhǎng)因子的情況中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，而下面的兩幅照片顯示了在不存在生長(zhǎng)因子但分別存在RA.lDR6抗體和RA.3DR6抗體的情況中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。小鼠單克隆RA.1-RA.5DR6抗體是如上文實(shí)施例3中所述通過(guò)用DR6胞外域免疫小鼠而生成的。在此實(shí)施例和附圖中稱作"RA.1"和"RA.3"抗體的DR6抗體分別是實(shí)施例3中所描述的"1E5.5.7"和"3F4.4.8"抗體(例如簡(jiǎn)單地使用備選命名來(lái)指稱)。類似的，在此實(shí)施例和附圖中述及的"RA.5"抗體是實(shí)施例3中所描述的"3B11.7.7"抗體(例如已經(jīng)使用備選命名來(lái)指稱)。如上文所述實(shí)施例2和實(shí)施例6中的那樣但有如下修改地實(shí)施感覺、運(yùn)動(dòng)、和連合外植體培養(yǎng)。對(duì)于連合外植體存活測(cè)定法，在鋪板后24小時(shí)以20ug/ml終濃度將DR6抗體RA，l或RA.3、或者對(duì)照IgG添加至連合外植體培養(yǎng)物(圖10A)。對(duì)于感覺外植體培養(yǎng)物，在鋪板后48小時(shí)實(shí)施NGF剝奪測(cè)定法。在鋪板后48小時(shí)以20ug/ml終濃度將不含NGF但含NGF阻斷性抗體(Genentech,Inc.)以及所示DR6抗體(RA.1或RA.3)或?qū)φ誌gG的新鮮Neurobasal培養(yǎng)基添加至感覺外植體培養(yǎng)物(圖10A)。對(duì)于運(yùn)動(dòng)外植體培養(yǎng)物，在鋪板后48小時(shí)實(shí)施營(yíng)養(yǎng)因子剝奪測(cè)定法。在鋪板后48小時(shí)以20ug/ml營(yíng)養(yǎng)因子的功能的單抗，Genentech,Inc.)以及所示DR6抗體(RA.1或RA.3)或?qū)φ誌gG的新鮮Neurobasal培養(yǎng)基添加至感覺外植體培養(yǎng)物(圖10A)。為了顯現(xiàn)通過(guò)免疫熒光染色用抗TUJ1(Covance)和抗p75NTR(Chemicon/Millipore)抗體標(biāo)記的感覺和運(yùn)動(dòng)軸突，在Axioplan國(guó)2成像Zeiss顯微鏡上使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。為了顯現(xiàn)表達(dá)GFP的連合軸突，在Axiovert200Zeiss倒置顯微鏡上(在GFP的綠色熒光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。如圖IOB中所示，抗DR6抗體抑制各式各樣-陂剝奪了營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)元的變性(在經(jīng)TUNEL染色的凋亡中細(xì)胞主體的測(cè)定法中)。在圖10B中，自左邊開始，兩組上下兩幅顯示了來(lái)自連合神經(jīng)元的數(shù)據(jù)。在這前面的四幅照片中，上面的兩幅照片顯示了在分別存在對(duì)照IgG和RA.5DR6抗體的情況中的連合神經(jīng)元，而下面的兩幅照片顯示了在分別存在RA.lDR6抗體和RA.3DR6抗體的情況中的連合神經(jīng)元。圖10B中中間兩組上下兩幅照片顯示了來(lái)自感覺神經(jīng)元的數(shù)據(jù)。在這中間的四幅照片中，上面的兩幅照片分別顯示了在存在和不存在NGF的情況中的感覺神經(jīng)元，而下面的兩幅照片顯示了在不存在NGF但分別存在RA.lDR6抗體和RA.3DR6抗體的情況中的感覺神經(jīng)元。圖10B右側(cè)的兩組上下兩幅照片顯示了來(lái)自運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)據(jù)。在這些右邊的四幅照片中，上面的兩幅照片分別顯示了在存在和不存在生長(zhǎng)因子的情況中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，而下面的兩幅照片顯示了在不存在生長(zhǎng)因子但分別存在RA.lDR6抗體和RA.3DR6抗體的情況中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。圖10中的公開內(nèi)容提示配體在DR6在軸突變性中的功能中可能發(fā)揮重要作用。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如上所述，小鼠單克隆RA.1-RA.5DR6抗體是如上文實(shí)施例3中所述通過(guò)用DR6胞外域免疫小鼠而生成的。如上文所述實(shí)施例2和實(shí)施例6中的那樣但有如下概述的修改地實(shí)施感覺、運(yùn)動(dòng)、和連合外植體培養(yǎng)。對(duì)于連合外植體存活測(cè)定法，如上文實(shí)施例3中所述，在鋪板后24小時(shí)以20ug/ml終濃度分別將DR6抗體RA.1和RA.3、抗體RA.5(或者稱作"1B11.7.7"，Genentech，Inc.)、或?qū)φ誌gG(Genentech，Inc.)添加至連合外植體培養(yǎng)物(圖10B，左邊)。對(duì)于感覺外植體培養(yǎng)物，在鋪板后48小時(shí)實(shí)施NGF剝奪測(cè)定法。在鋪板后48小時(shí)以20ug/ml終濃度將不含NGF但含NGF阻斷性抗體(Genentech，Inc.)以及DR6抗體RA.1或RA.3、或?qū)φ誌gG(Genentech,Inc.)的新鮮Neurobasal培養(yǎng)基添加至感覺外植體培養(yǎng)物(圖10B，中間)。對(duì)于運(yùn)動(dòng)外植體培養(yǎng)物，在鋪板后48小時(shí)實(shí)施營(yíng)養(yǎng)因子剝奪測(cè)定法。在鋪板后48小時(shí)以20ug/ml終濃度子的功能的單抗，Genentech,Inc.)以及RA.1或RA.3、或?qū)φ誌gG(Genentech，Inc.)的新鮮Neurobasal培養(yǎng)基添加至感覺外植體培養(yǎng)物(圖10B，右邊)。將外植體在4。/。PFA/PBS中固定并為在單細(xì)胞水平檢測(cè)凋亡進(jìn)行加工，所述檢測(cè)基于使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)ll684795910,Roche)依照制造商的說(shuō)明手冊(cè)(Roche)標(biāo)記DNA鏈斷裂(TUNNEL技術(shù))。通過(guò)熒光顯微術(shù)分析連合感覺和運(yùn)動(dòng)外植體培養(yǎng)物的細(xì)胞主體中的凋亡(圖10B)。為了顯現(xiàn)熒光標(biāo)記的TUNNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞主體，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上(在紅色熒光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SPl(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。實(shí)施例8:DR6免疫粘附素拮抗劑抑制神經(jīng)元變性如圖11A中所示，hDR6-ECD-Fc延遲連合軸突變性。上文實(shí)施例3中描述了此測(cè)定法中所使用的hDR6-ECD-Fc免疫粘附素蛋白。在圖11A中，由左至右，第一幅照片提供了顯示48小時(shí)時(shí)的連合軸突變性的對(duì)照。第二幅照片顯示了在存在30ug/mlhDR6-ECD-Fc的情況中48小時(shí)時(shí)的連合軸突變性。第三幅照片顯示了在存在10ug/mlhDR6-ECD-Fc的情況中48小時(shí)時(shí)的連合軸突變性。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如上文實(shí)施例2-6中所述制備連合外植體培養(yǎng)物和實(shí)施存活測(cè)定法。上文實(shí)施例3中描述了此測(cè)定法中所使用的hDR6-ECD-Fc免疫粘附素。為了顯現(xiàn)GFP標(biāo)記的連合軸突，在Axiovert200Zeiss倒置顯微鏡上(在GFP的綠色熒光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SPl(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。如圖11B中所示，hDR6-ECD-Fc延遲由神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)斷絕誘發(fā)的感覺軸突變性。在圖11B中，由左至右，上面的三幅照片分別顯示了在O、6三幅照片分別顯示了在0、6和24小時(shí)時(shí)的在存在DR6-Fc構(gòu)建體的情況中被剝奪了NGF的感覺神經(jīng)元。圖11中所提供的公開內(nèi)容提供了進(jìn)一步提示，即配體可能在DR6在軸突變性中的功能中發(fā)揮重要作用。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。為了檢驗(yàn)配體是否是DR6在感覺軸突變性中的功能所需要的，如下實(shí)施感覺軸突生長(zhǎng)和變性的隔室化培養(yǎng)分析。使用Campenot神經(jīng)細(xì)胞室系統(tǒng)在不同隔室(不同的流體環(huán)境)中分隔神經(jīng)元突出(軸突)與細(xì)胞主體，這與神經(jīng)元細(xì)胞主體在神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)位置中并投射它們的軸突至另一位置的遠(yuǎn)端靶物類似。該測(cè)定法如Campenot(Campenot等，.JNeurosci.11(4):1126-39(1991))最初記載的那樣但有如下修改的實(shí)施。簡(jiǎn)言之，將35mm組織培養(yǎng)盤用PDL/層粘連蛋白包被并用釘耙(TylerResearch)刮擦以產(chǎn)生軌跡，如例如Campenot等，見上文的圖1和圖4中所示。將一滴培養(yǎng)基(含B27補(bǔ)充物、25ng/mlNGF、和4g/L曱基纖維素的Neurobasal培養(yǎng)基)置于經(jīng)過(guò)刮擦的底層上。將Teflon分隔器(TylerResearch)安置在硅脂上并將少量硅脂放置于中央槽的口部。將衍生自E12.5小鼠DRG的經(jīng)解離的感覺神經(jīng)元懸浮在曱基纖維素增稠的培養(yǎng)基中并加載入配有22號(hào)針頭的一次性使用無(wú)菌注射器中。在解剖顯微鏡下將此細(xì)胞懸浮液注射入每個(gè)隔室化盤的中央槽中。讓神經(jīng)元沉降過(guò)夜。給盤的外周(細(xì)胞主體隔室)和內(nèi)部軸突隔室裝填含曱基纖維素的培養(yǎng)基。在體外，在3-5天內(nèi)，軸突開始進(jìn)入左邊和右邊的隔室，如例如Campenot等，見上文的圖l和圖4中所示。為了觸發(fā)局部軸突變性，用含NGF阻斷性抗體(抗NGF,Genentech，Inc.，20ug/ml)的Neurobasal培養(yǎng)基替代軸突隔室的含NGF的培養(yǎng)基。NGF剝奪后O小時(shí)、6小時(shí)、或24-48小時(shí)，將感覺神經(jīng)元在4%PFA中于室溫固定30分鐘并為用軸突標(biāo)志物TUJ-1(Covance,l:500稀釋)進(jìn)行的免疫熒光染色進(jìn)行加工以通過(guò)焚光顯微術(shù)顯現(xiàn)變性中的軸突(圖11B)(如上文實(shí)施例7所述)。為了顯現(xiàn)Campenot室的軸突隔室中免疫熒光標(biāo)記的感覺軸突，在Axioplan-2成像Zeiss顯樣i4霓上"f吏用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。為了檢驗(yàn)配體是否是DR6在由NGF斷絕觸發(fā)的軸突變性程序中的功能所需要的，在Campenot室的軸突隔室中包括30ug/mlhDR6-ECD-Fc免疫粘附素蛋白(上文實(shí)施例3中所述)或30ug/ml對(duì)照Fc(Genentech,Inc.)以及抗NGF處理。NGF剝奪后0-24小時(shí)，將Campenot室中的軸突用4。/oPFA/PBS固定并通過(guò)使用TUJ-1(1:500，Covance)/偶聯(lián)有熒光基團(tuán)Alexa488的二抗(MolecularProbes,BD)進(jìn)行的免疫熒光染色來(lái)顯現(xiàn)(圖11B)。NGF剝奪觸發(fā)了軸突變性的驚人樣式，如圖11B中所示。重要的是，hDR6-ECD-Fc免疫粘附素蛋白的添加延遲此系統(tǒng)中軸突變性的發(fā)生(圖11B，下面的小圖)。因而，這些數(shù)據(jù)提示可溶性配體可能是DR6受體在通過(guò)消除生長(zhǎng)因子誘發(fā)的局部軸突變性中的功能所需要的。實(shí)施例9:NGF剝奪后DR6配體結(jié)合位點(diǎn)自軸突脫落如圖12A和12B中所示，使用DR6-AP構(gòu)建體來(lái)顯現(xiàn)感覺軸突上的DR6結(jié)合位點(diǎn)。在圖12A中，由左至右，上面的兩幅照片分別以低和高放大倍數(shù)顯示了使用DR6-AP構(gòu)建體以顯現(xiàn)在存在NGF的情況中處于發(fā)育階段E12.5的感覺軸突48小時(shí)時(shí)這些軸突上DR6結(jié)合位點(diǎn)的顯像，而下面的兩幅照片分別以低和高放大倍數(shù)顯示了使用AP對(duì)照構(gòu)建體的感覺軸突的顯像。如圖12B中所示，DR6配體結(jié)合位點(diǎn)在NGF剝奪后自感覺軸突丟失。在圖12B中，由左至右，上面的兩幅照片顯示了感覺軸突上DR6結(jié)合位點(diǎn)的顯像，其中第一幅照片顯示了在存在NGF和BAX抑制劑的情況中的感覺神經(jīng)元，而第二幅照片顯示了在存在NGF的情況中的Bax缺無(wú)的感覺神經(jīng)元。下面的兩幅照片分別顯示了在不存在NGF但存在BAX抑制劑的情況中的感覺神經(jīng)元及在不存在NGF的情況中的Bax缺無(wú)的感覺神經(jīng)元。在存在和不存在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的情況中在運(yùn)動(dòng)軸突中觀察到等同的結(jié)果。用于生成圖12A和12B中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。使用pRK5-AP克隆載體(參見例如Yan等，NatureImmunology1，37-41(2000)),通過(guò)將小鼠DR6胞外域融合至人胚胎堿性磷酸酶來(lái)生成DR6-AP構(gòu)建體(DR6-AP)。PRK5親本克隆載體可自Becton,DickinsonandCompany,Pharmingendivision獲得。用于生成DR6-AP融合蛋白的鼠DR6胞外域序列如下GTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCT麗SLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCVVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPE畫ESHDVPSSTYEP(SEQIDNO:14)Bax缺無(wú)小鼠系(Bax-Rl)先前已有記載(Deckwerth等，Neuron,巻17，401-411,1996),而且得自JacksonLaboratories。以10uM使用BAX抑制肽來(lái)阻斷神經(jīng)元細(xì)胞死亡(Bax-V5，TocrisInc)。為了生成小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白(DRbv6-AP)，使用FuGene轉(zhuǎn)染試劑(Roche)依照制造商的方案用15ugDR6-AP融合表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染在DMEM/10%FBS(Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的COS-l細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，將COS-l細(xì)胞培養(yǎng)基換成OPTI-MEM(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集并過(guò)濾含有DR6-AP蛋白的COS-l細(xì)胞條件化培養(yǎng)基。如下定量培養(yǎng)基中DR6-AP蛋白的量將100ul2XAP緩沖液(通過(guò)將100mg對(duì)硝基苯基磷酸鹽(Sigma)和15ul1MMgCl2添加至15ml2M二乙醇胺pH9.8來(lái)制備)與等體積的經(jīng)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞條件化培養(yǎng)基或來(lái)自未轉(zhuǎn)染COS-l細(xì)胞的對(duì)照條件化培養(yǎng)基混合。在12-15分鐘里對(duì)反應(yīng)的顏色顯色，此時(shí)O.D.在線性范圍內(nèi)(0.1-1)。然后通過(guò)添加800ul蒸餾水來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)體積，并測(cè)量405nm吸光度波長(zhǎng)處的O.D.。以nM計(jì)的濃度依照如下公式計(jì)算(用于100ul):C(M)=O.D.X100X(60/顯色時(shí)間)/30。為了原位DR6-AP感覺軸突結(jié)合測(cè)定法，在含50ng/mlNGF(Roche)的如上文實(shí)施例7-8中所概述的Neurobasal培養(yǎng)基/B27(Invitrogen)中培養(yǎng)野生型的或Bax缺無(wú)的感覺外植體。鋪板后2天，DRG外植體或是不處理或是如上文實(shí)施例7-8中所述剝奪NGF。添加Bax抑制肽，如圖12B所示(10uM,Bax-V5，Tocris)。NGF剝奪后12小時(shí)，將DRG外植體用結(jié)合緩沖液(HBSS,Gibco產(chǎn)品目錄號(hào)14175-095,含0.2%BSA,0.1%NaN3,5mMCaCl2,lmMMgCl2,20mMHEPES，pH-7.0)清洗2次。然后實(shí)施AP結(jié)合測(cè)定法，即制備DR6-AP條件化培養(yǎng)基和結(jié)合緩沖液(或?qū)φ誂P條件化培養(yǎng)基和結(jié)合緩沖液)的l:l混合物，將其直接施加至8孔培養(yǎng)載玻片(Becton,DickinsonandCompany)中的DRG外植體并于室溫溫育90分鐘。溫育后，通過(guò)將DRG外植體用結(jié)合緩沖液漂洗5次來(lái)洗掉未結(jié)合的DR6-AP蛋白。然后將DRG外植體用PBS中稀釋的3.7%曱醛于室溫固定12分鐘。通過(guò)將DRG外植體用HBS緩沖液(20mMHEPESpH=7.0，150mMNaCl)漂洗3次來(lái)除去剩余的曱醛。通過(guò)在HBS緩沖液中于65。C熱滅活30分鐘來(lái)阻斷內(nèi)源AP活性。然后將DRG外植體在AP反應(yīng)緩沖液(100mMTRISpH=9.5，100mMNaCl,50mMMgCl2)中漂洗3次。然后通過(guò)在含1/50(以體積計(jì))NBT/BCIP原液(Roche,產(chǎn)品目錄號(hào)1681451)的AP反應(yīng)緩沖液中對(duì)DRG外植體上的顏色著色斑于室溫顯色過(guò)夜來(lái)顯現(xiàn)結(jié)合至感覺軸突的DR6-AP融合蛋白(圖12A和12B)。在平行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，將來(lái)自經(jīng)AP轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基用于AP軸突結(jié)合測(cè)定法(圖12A,下面的小圖)。如圖12B中所示，DR6-AP結(jié)合位點(diǎn)在NGF剝奪后自感覺軸突表面丟失，提示DR6配體在營(yíng)養(yǎng)剝奪后被釋放入軸突條件化培養(yǎng)基中。如圖12C中所示，處于發(fā)育階段E12.5的BAX缺無(wú)感覺軸突的研究顯示了13-分泌酶(BACE)抑制劑能阻斷NGF斷絕后DR6-AP結(jié)合位點(diǎn)自感覺軸突消失。在圖12C中，由左至右，上面的三幅照片顯示了在分別存在DMSO對(duì)照、OM99-2(BACE-I抑制劑)和TAP1(a-分泌酶-I抑制劑)的情況中的這些神經(jīng)元。下面的照片顯示了在存在NGF的情況中的這些神經(jīng)元。上文描述了用于生成此數(shù)據(jù)的小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。Bax缺無(wú)小鼠系(Bax-Rl)先前已有記載(Deckwerth等，Neuron,巻17,401-411,1996)，而且得自JacksonLaboratories。如上文關(guān)于圖12A和12B所述的那樣實(shí)施DRG外植體培養(yǎng)和DR6-AP軸突結(jié)合測(cè)定法。在此測(cè)定法中以lum終濃度使用BACE抑制劑(InSolutionOM99-2,Calbiochem/Merck)。在此測(cè)定法中以10uM終濃度使用a-分泌酶抑制劑TAPI(TAPI-l,Calbiochem)。為了顯現(xiàn)DR6-AP陽(yáng)性感Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝亮視野照片。實(shí)施例10:淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)ADR6的關(guān)聯(lián)配體如圖13中所示，發(fā)現(xiàn)N-APP是DR6胞外域相關(guān)配體。在圖13A中，由左至右，前兩幅印跡提供了來(lái)自使用DR6-AP構(gòu)建體進(jìn)行的研究的數(shù)據(jù)，以探查在存在和不存在生長(zhǎng)因子的情況中(及在存在Bax抑制劑的情況中)自感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元得到的蛋白質(zhì)。在這些印跡中，在剝奪了生長(zhǎng)因子(及在存在Bax抑制劑的情況中)的感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中都觀察到APP多肽(包括在大約35kDA處的強(qiáng)條帶)。圖13A的中央印跡顯示了用自剝奪了生長(zhǎng)因子的感覺神經(jīng)元得到的多肽的抗N-APP抗體4罙針相應(yīng)地觀察到APP多肽(包括在大約35kDA處的強(qiáng)條帶)。l:100稀釋用于Westem印跡實(shí)驗(yàn)的多克隆抗N-APP抗體得自ThermoScientific(產(chǎn)品目錄號(hào)RB-90"-Pl)。以10uM使用Bax抑制肽P5(TocrisBiosciences,產(chǎn)品目錄號(hào)1786，細(xì)胞通透性的Bax線粒體轉(zhuǎn)位合成肽抑制劑)。圖13A右邊的印跡中所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了APP是DR6胞外域相關(guān)配體的觀察結(jié)果。在NGF剝奪的條件下自Campenot室軸突隔室收集感覺軸突條件化培養(yǎng)基，并使用一般性下拉方案(generalpull-downprotocol)(例如Nikolaev等，2004,BBRC,323,1216-1222)自感覺軸突條件化培養(yǎng)基純化DR6-ECD胞外域相關(guān)因子。將偶聯(lián)有DR6-ECD-His胞外域(下文所述構(gòu)建體)的NiNTA珠(Sigma)與50ml感覺軸突條件化培養(yǎng)基在如下條件下一起溫育150mMNaCl,0.2%NP-40(Calbiochem),IXPBS緩沖液，于4。C過(guò)夜。然后將偶聯(lián)有DR6-ECD-His胞外域的NiNTA珠(Sigma)用10倍過(guò)量的結(jié)合緩沖液(150mMNaCl，0.2%NP-40(Calbiochem),在1XPBS緩沖液中)清洗5次，并用IXSDS樣品加載緩沖液(Invitrogen)洗脫DR6-ECD結(jié)合蛋白復(fù)合物，然后將其經(jīng)凝膠電泳分開并用抗N-APP抗體探查。來(lái)自此DR6-ECD下拉實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)相應(yīng)地鑒定了APP多肽(包括在35kDA處的強(qiáng)條帶)。依照先前記載的方案(Pettmann等，1988,J.Neurosci.,8(10):3624-3632)對(duì)軸突條件化培養(yǎng)基實(shí)施DR6-AP印跡測(cè)定法。用于Western印跡實(shí)驗(yàn)的多克隆抗N-APP抗體得自ThermoScientific(產(chǎn)品目錄號(hào)RB-9023-Pl)。所使用的小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白如上文實(shí)施例9中所描述的。表達(dá)小鼠重組DR6-ECD-His，隨后自CHO細(xì)胞培養(yǎng)物純化。鼠DR6-ECD-His的氨基酸序列如下:VVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPE固ESHDVPSSTYEPHHHHH(SEQIDNO:15)圖13B通過(guò)DR6印跡顯示了軸突條件化培養(yǎng)基中的DR6配體的另一個(gè)顯像。此印跡數(shù)據(jù)鑒定了許多APP多肽，包括在35kDa處的N-末端APP以及C99-APP和C83/C89APP多肽。依照先前記載的方案(Pettmann等，1988,J.Neurosci.,8(10):3624-3632)對(duì)軸突條件化培養(yǎng)基實(shí)施DR6-AP印跡測(cè)定法。如上文實(shí)施例8中所述生成小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。表達(dá)小鼠DR6-ECD-His,隨后自CHO細(xì)胞培養(yǎng)物純化。DR6-ECD-His的氨基酸序列見下文。用于Western印跡實(shí)驗(yàn)的多克隆抗N-APP抗體得自ThermoScientific(產(chǎn)品目錄號(hào)RB-90M-P1)。為了顯現(xiàn)膜系留的APPC-末端片段(CTF)C99-APP和C83/C89-APP，使用識(shí)別A卩中央部分內(nèi)的表位的4G8抗體(單克隆4G8，1:500，Covance)對(duì)軸突溶胞物實(shí)施Western印跡分析。圖14A提供的照片顯示了NGF剝奪后不久發(fā)生APP胞外域的脫落。在圖14A中，在存在為了阻斷軸突變性而添加的Bax抑制劑的情況中，將處于生長(zhǎng)因子消除后不同時(shí)間的神經(jīng)元用N-APP多克隆抗體染色。由左至右，這些照片顯示了O小時(shí)以及NGF消除(及添加抗NGF抗體)后3、6、12和24小時(shí)時(shí)的軸突變性。用于在APP軸突脫落實(shí)驗(yàn)中顯現(xiàn)表面APP表達(dá)的多克隆抗N-APP抗體得自ThermoScientific(產(chǎn)品目錄號(hào)RB-9023-Pl)。如上文實(shí)施例6和7中所述的那樣實(shí)施感覺外植體培養(yǎng)。如上文實(shí)施例7中所述的那樣但有如下修改地實(shí)施NGF剝奪測(cè)定法。在NGF剝奪后的指定時(shí)間間隔(0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、和24小時(shí))后將DRG外植體培養(yǎng)物在4。/c)PFA/PBS中固定。為了顯現(xiàn)表面APP表達(dá)，如實(shí)施例6和7中所述的那樣但沒有Triton透化處理地為免疫焚光染色加工DRG外植體，其中使用上文所述抗N-APP—抗。為了顯現(xiàn)感覺軸突上的表面APP表達(dá)(用抗N-APP抗體免疫熒光標(biāo)記，ThermoScientific(產(chǎn)品目錄號(hào)RB-9023-Pl)),在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上(在紅色焚光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/20b6)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。圖14B提供的照片顯示了DR6胞外域結(jié)合培養(yǎng)細(xì)胞所表達(dá)的APP。在圖14B中，由左至右，上面的兩幅照片顯示了分別用DR6-APP(具有DR6胞外域)探查的對(duì)照Cos細(xì)胞和表達(dá)APP的細(xì)胞。下面的兩幅照片顯示了用DR6-AP探查的p75NTR受體和DR6受體表達(dá)細(xì)胞。DR6胞外域不結(jié)合p75NTR或DR6受體表達(dá)細(xì)胞。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。為了測(cè)試APP是否直接與DR6胞外域相互作用，實(shí)施了基于細(xì)胞的AP結(jié)合測(cè)定法(圖14B)。為了生成DR6胞外域-AP融合蛋白(DR6-AP)，使用FuGene轉(zhuǎn)染試劑(Roche)依照制造商的方案用15ugDR6-AP融合表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染在DMEM/10。/。FBS(Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的COS-l細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，將COS-l細(xì)胞培養(yǎng)基換成OPTI-MEM(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集并過(guò)濾含有DR6-AP蛋白的COS-l細(xì)胞條件化培養(yǎng)基。依照如下規(guī)程定量培養(yǎng)基中DR6-AP蛋白的量。將100ul2XAP緩沖液(通過(guò)將100mg對(duì)硝基苯基磷酸鹽(Sigma)和15ul1MMgCl2添加至15ml2M二乙醇胺pH9.8來(lái)制備)與等體積的經(jīng)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞條件化培養(yǎng)基或來(lái)自未轉(zhuǎn)染COS-l細(xì)胞的對(duì)照條件化培養(yǎng)基混合。在12-15分鐘里對(duì)反應(yīng)的顏色顯色，此時(shí)O.D.在線性范圍內(nèi)(0.1-1)。然后通過(guò)添加800ul蒸餾水來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)體積，并測(cè)量405nm吸光度波長(zhǎng)處的O,D.。以nM計(jì)的濃度依照如下公式計(jì)算(用于100ul):C(nM)=O.D.X100X(60/顯色時(shí)間)/30。為了APPAP結(jié)合測(cè)定法，使用FuGene轉(zhuǎn)染試劑(Roche)依照制造商的方案每孔用2ugAPP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染在6孔培養(yǎng)盤中在DMEM/10。/。FBS(Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的COS-l細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后2天，將細(xì)胞用結(jié)合緩沖液(HBSS，Gibco產(chǎn)品目錄號(hào)14175-095,含0.2%BSA,0.1%NaN3，5mMCaCl2,lmMMgCl2,20mMHEPES，pI^7.0)清洗兩次。然后實(shí)施AP結(jié)合測(cè)定法，即制備DR6-AP條件化培養(yǎng)基和結(jié)合緩沖液的1:1混合物，將其直接應(yīng)用至過(guò)表達(dá)APP的COS-1細(xì)胞并于室溫溫育90分鐘。溫育后，通過(guò)將COS-l細(xì)胞用結(jié)合緩沖液漂洗5次來(lái)洗掉未結(jié)合的DR6-AP蛋白。然后將細(xì)胞用在PBS中稀釋的3.7。/o曱醛于室溫固定12分鐘。通過(guò)將細(xì)胞用HBS緩沖液(20mMHEPESpH=7.0,150mMNaCl)漂洗3次來(lái)除去剩余的曱醛。通過(guò)在HBS緩沖液中于65。C熱滅活30分鐘來(lái)阻斷內(nèi)源AP活性。然后將COS-1細(xì)胞在AP反應(yīng)緩沖液(1OOmMTRISpH=9.5,100mMNaCl，50mMMgCl2)中漂洗3次。然后通過(guò)在含1/50(以體積計(jì))NBT/BCIP原液(Roche,產(chǎn)品目錄號(hào)1681451)的AP結(jié)合緩沖液中對(duì)COS-l細(xì)胞上的顏色反應(yīng)于室溫顯色過(guò)夜來(lái)顯現(xiàn)DR6-AP融合蛋白對(duì)跨膜APP的結(jié)合(圖14B)。在平行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，將來(lái)自未轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基用于AP結(jié)合測(cè)定法。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下在COS-1細(xì)胞中表達(dá)的跨膜p75NTR和DR6受體不顯示對(duì)DR6-AP融合蛋白的特異性結(jié)合(圖14B)，指示DR6胞外域與APP之間的相互作用是特異性的。圖14C提供的照片顯示了DR6是感覺軸突上的N-APP的主要受體，而且APP結(jié)合位點(diǎn)在DR6缺無(wú)小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中顯著消減。在圖14C中，由左至右，上面的三幅照片顯示了分別用AP對(duì)照、N-APP-AP、和Sema3A-AP探查的自DR6+/-(het)小鼠得到的神經(jīng)元。下面的三幅照片相應(yīng)地顯示了分別用AP對(duì)照、N-APP-AP、和Sema3A-AP探查的自DR6-A(KO)小鼠得到的神經(jīng)元。用于生成圖14C中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如上文實(shí)施例9中所述生成小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。如先前所記載的那樣(Feiner等，1997，Neuron,巻19,539-545)生成小鼠Sema3A胞外域-AP(Sema3A-AP)融合蛋白。DR6缺無(wú)小鼠系(DR6.KO)先前已有記載(Zhao等，JournalofExperimentalMedicine,巻194,1441-1441,2001)。如上文實(shí)施例9關(guān)于圖12A和12B所述實(shí)施DRG外植體培養(yǎng)和DR6-AP軸突結(jié)合測(cè)定法。圖14D提供的照片顯示了拮抗性DR6抗體破壞DR6胞外域與神經(jīng)元APP之間的相互作用。在這些研究中，將N-APP添加至表達(dá)DR6的神經(jīng)元細(xì)胞，然后用抗N-APP抗體顯現(xiàn)。由左至右，前四幅照片顯示了在分別存在以下各項(xiàng)的情況中N-APP結(jié)合神經(jīng)元表面上的DR6的能力對(duì)照IgG;RA.4抗DR6抗體；RA.3抗DR6抗體；和RA.1抗DR6抗體。最右邊的照片顯示了使用對(duì)照IgG的細(xì)胞上DR6的染色。用于生成此圖中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如先前所記載的那樣(Okada等，Nature,2006,巻444，369-373)但有以下修改地實(shí)施用于獲得圖14D中所顯示的數(shù)據(jù)的基于細(xì)胞的配體結(jié)合測(cè)定法。為了生成N-末端生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域APP-His融合蛋白(N-APP-His)，使用FuGene轉(zhuǎn)染試劑(Roche)依照制造商的方案用15ugN-APP-His融合表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染在DMEM/10。/。FBS(Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的COS-l細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，將COS-l細(xì)胞培養(yǎng)基換成OPTI-MEM(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集并過(guò)濾含有N-APP-His蛋白的COS-1細(xì)胞條件化培養(yǎng)基。通過(guò)Western印跡分析用上文所述抗N-APP抗體測(cè)定N-APP-His濃度。此結(jié)合測(cè)定法中所使用的人N-APP-His的氨基酸序列如下LHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDHHHHHH(SEQIDNO:10)然后實(shí)施N-APP-His結(jié)合測(cè)定法，即制備N-APP-His條件化培養(yǎng)基與結(jié)合緩沖液的1:1混合物，將其直接施加至過(guò)表達(dá)DR6受體的COS-l細(xì)胞并于室溫溫育90分鐘。如所示的那樣，與N-APP-His條件化培養(yǎng)基和結(jié)合緩沖液一起個(gè)別地以20ug/ml添加DR6單抗RA.1、RA.3或RA.4(上文實(shí)施例3和7所述)。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中與N-APP-His條件化培養(yǎng)基和結(jié)合緩沖液一起以20ug/ml添加正常小鼠IgG(GenentechInc)。通過(guò)免疫熒光染色用抗N-APP抗體(ThermoScientific產(chǎn)品目錄號(hào)RB-9023-Pl)依照如實(shí)施例6和7的方案所述的已知方案(Okada等，Nature,2006,巻444,369-373)來(lái)顯現(xiàn)N-APP對(duì)表達(dá)DR6受體的細(xì)胞的結(jié)合。為了顯現(xiàn)結(jié)合至細(xì)胞表面上DR6受體的N-APP蛋白(用抗N-APP抗體免疫熒光標(biāo)記的，ThermoScientific(產(chǎn)品目錄號(hào)RB-9023-Pl))，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上(在紅色熒光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SPl(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。實(shí)施例11:淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)活化DR6來(lái)誘導(dǎo)軸突變性圖15A提供的照片顯示了針對(duì)N-末端APP的多克隆抗體在連合軸突測(cè)定法中阻斷軸突變性。由左至右，圖15A中的照片顯示了在分別存在以下各項(xiàng)的情況中的連合軸突變性對(duì)照IgG;30ug/ml抗NAPP抗體；和l.lug/ml抗NAPP抗體。用于生成圖15A中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如實(shí)施例2的方案和圖4B中所生成的數(shù)據(jù)中所述用所示數(shù)量的多克隆抗N-APP抗體(ThermoScientific產(chǎn)品目錄號(hào)RB-9023-Pl，經(jīng)過(guò)大量透析的)或?qū)φ誌gG(家兔IgG，R&DSystems)實(shí)施連合外植體存活測(cè)定法。為了顯現(xiàn)GFP標(biāo)記的連合軸突，在Axiovert200Zeiss倒置顯微鏡上(在GFP的綠色熒光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SPl(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。圖15B提供的照片顯示了N-末端APP抗體抑制由NGF消除誘發(fā)的感覺軸突變性。由左至右，圖15B上面的三幅照片分別顯示了在存在NGF和以下各項(xiàng)的情況中的感覺軸突對(duì)照抗體；抗APP單克隆抗體22C11;和抗APP多克隆抗體。下面的三幅照片相應(yīng)地分別顯示了在不存在NGF(以及抗NGF抗體)和以下各項(xiàng)的情況中的感覺軸突對(duì)照抗體；抗APP單克隆抗體22C11;和抗APP多克隆抗體。用于生成此圖15B中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如上文實(shí)施例8中所述在Campenot室中實(shí)施NGF剝奪測(cè)定法。此測(cè)定法中所使用的針對(duì)N-末端APP的抗體是多克隆抗N-APP抗體(ThermoScientific產(chǎn)品目錄號(hào)RB-9023-P1,經(jīng)過(guò)大量透析的)或22C11單克隆抗體(22C11,Chemicon，經(jīng)過(guò)大量透析的)。添加正常IgG(家兔IgG,R&DSystems)作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。如實(shí)施例l、7和8中所述用TUJ1抗體(1:500，Covance)實(shí)施感覺軸突的免疫熒光標(biāo)記。為了顯現(xiàn)Campenot室的軸突隔室中的免疫熒光標(biāo)記的感覺軸突，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。圖15C提供的照片顯示了添加N-APP能挽救通過(guò)對(duì)(3-分泌酶(BACE)活性的抑制而阻斷的軸突變性。由左至右，圖15C上面的三幅照片顯示了在分別存在以下各項(xiàng)的情況中觀察到的神經(jīng)元(在不存在NGF的情況中培養(yǎng)的)和軸突變性DMSO對(duì)照、BACE抑制劑、和N-APP(及BACE-I)。圖15C下面存在NGF的情況中培養(yǎng)的)DMSO對(duì)照、BACE抑制劑、和N-APP(及BACE-I)。用于生成此圖15C中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如上文實(shí)施例8中所述在Campenot室中實(shí)施NGF剝奪測(cè)定法。此測(cè)定法中所使用的人重組N-APP氨基酸19-306購(gòu)自Novus(NovusBiologicals,產(chǎn)品目錄號(hào)H00000351-P01)。在NGF剝奪時(shí)，與BACE抑制劑(1uM終濃度，InSolutionOM99-2,Calbiochem/Merck)—起以3ug/ml添加N-APP。在此測(cè)定法中以1uM終濃度使用BACE抑制劑(InSolutionOM99-2,Calbiochem/Merck)。如實(shí)施例1、7和8中所述用TUJ1抗體(1:500，Covance)實(shí)施感覺軸突的免疫熒光標(biāo)記。為了顯現(xiàn)Campenot室軸突隔室中的免疫熒光標(biāo)記的感覺軸突，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0,0SP1((BO0(^)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。圖15D提供的照片顯示了RNAi對(duì)APP的消除使在存在BACE抑制劑的情況中的神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)N-APP誘發(fā)的細(xì)胞死亡敏化。在圖15D中，由左至右，上面的三幅照片顯示了在存在對(duì)照RNAi的情況中培養(yǎng)的神經(jīng)元。這些上面的照片顯示了分別與3ug/mlN-APP或O.lug/mlN-APP—起培養(yǎng)的對(duì)照以及神經(jīng)元。下面的三幅照片顯示了在存在APPRNAi的情況中培養(yǎng)的神經(jīng)元。這些下面的照片顯示了與3ug/mlN-APP或O.lug/mlN-APP—起培養(yǎng)的對(duì)照以及神經(jīng)元。用于生成此圖15D中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如實(shí)施例2中所述實(shí)施連合外植體培養(yǎng)物中的APPRNAi。此測(cè)定法中所使用的人重組N-APP氨基酸19-306購(gòu)自Novus(NovusBiologicals,產(chǎn)品目錄號(hào)H00000351-P01)。在此測(cè)定法中依照制造商的方案使用預(yù)設(shè)計(jì)的大鼠特異性APPON-TARGETplussiRNA集合以下調(diào)E13大鼠連合外植體中的APP表達(dá)(APPON-TARGETplussiRNA集合，GeneID:54226,產(chǎn)品目錄號(hào)088191,DharmaconInc.)。為了顯現(xiàn)GFP標(biāo)記的和RFP標(biāo)記的連合軸突(如實(shí)施例2和7中所述)，在Axiovert200Zeiss倒置顯微鏡上(在GFP的綠色焚光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。實(shí)施例12:DR6是APP誘發(fā)的軸突變性所需要的但不^Ap觸發(fā)的變性所需要的如圖16A中所述，DR6活化是N-APP誘發(fā)的軸突變性所需要的。在圖16A中，由左至右，上面的三幅照片顯示了自0116+/-(1^0小鼠獲得的神經(jīng)元。第一幅的照片顯示了未暴露于A卩或N-APP的對(duì)照神經(jīng)元，第二幅照片顯示了暴露于A卩的神經(jīng)元，而第三幅照片顯示了暴露于N-APP的神經(jīng)元。下面的三幅照片顯示了自DR6-/-(KO)小鼠獲得的神經(jīng)元。由左至右，下面的第一幅照片顯示了未暴露于A卩或N-APP的對(duì)照神經(jīng)元，第二幅照片顯示了暴露于A(3的神經(jīng)元，而第三幅照片顯示了暴露于N-APP的神經(jīng)元。用于生成此圖16A中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如實(shí)施例2中所述實(shí)施連合外植體培養(yǎng)和存活測(cè)定法。DR6缺無(wú)小鼠系(DR6,KO)先前已有記載(Zhao等，JournalofExperimentalMedicine,巻194,1441-1441,2001)。此測(cè)定法中所使用的人重組N-APP氨基酸19-306購(gòu)自Novus(NovusBiologicals，產(chǎn)品目錄號(hào)H00000351-P01)。此測(cè)定法中所使用的重組人p淀粉狀蛋白氨基酸1-42購(gòu)自Chemicon(超純的人A卩1-42,產(chǎn)品目錄號(hào)AG912，Chemicon)。鋪板后24小時(shí)與BACE抑制劑一起以3ug/ml將N-APP添加至連合外植體。鋪板后24小時(shí)與BACE抑制劑一起以3uM將重組人p淀粉狀蛋白氨基酸l-42添加至連合外植體。在此測(cè)定法中以1uM終濃度使用BACE抑制劑(InSolutionOM99-2,Calbiochem/Merck)。將連合外植體與指定量的N-APP或A卩一起再溫育24小時(shí)。在連合外植體鋪板后48小時(shí)收集數(shù)據(jù)。為了顯現(xiàn)連合軸突，在Axiovert200Zeiss倒置顯微鏡上(inthebrightfield)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。如圖16B所示，拮抗性DR6抗體未能阻斷由A卩觸發(fā)的軸突變性。在圖16B中，由左至右，上面的三幅照片顯示了對(duì)照神經(jīng)元、在存在BACE-I的情況中的神經(jīng)元、和在存在BACE-I和A卩的情況中的神經(jīng)元。在圖16B中，下面的兩幅照片顯示了在存在BACE-I、A卩和抗DR6抗體RA.1的情況中的神經(jīng)元，然后是在存在BACE-I、A卩和抗DR6抗體RA.3的情況中的神經(jīng)元。用于生成此圖16B中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如實(shí)施例2中所述實(shí)施連合外植體培養(yǎng)和存活測(cè)定法。此測(cè)定法中所使用的重組人(3淀粉狀蛋白氨基酸l-42購(gòu)自Chemicon(超純的人A卩1-42，產(chǎn)品目錄號(hào)AG912,Calbiochem/Merck)。在鋪板后24小時(shí)與BACE抑制劑和指定的抗DR6單抗(40ug/ml)—起以3uM將重組人(3淀粉狀蛋白氨基酸l-42添加至連合外植體。在此測(cè)定法中以luM終濃度使用BACE抑制劑(InSolutionOM99-2,Calbiochem/Merck)。將連合外植體與指定量的A卩一起再溫育24小時(shí)。在連合外植體鋪板后48小時(shí)收集數(shù)據(jù)。小鼠單克隆RA.1-RA.5DR6抗體是如上文實(shí)施例3中所述通過(guò)用DR6胞外域免疫小鼠而生成的。如上所述，在本文中稱作RA.1和RA.3抗體的DR6抗體分別是"1E5.5.7"和"3F4.4.8"，即實(shí)施例3中所描述的DR6抗體。為了顯現(xiàn)GFP標(biāo)記的連合軸突，在Axiovert200Zeiss倒置顯微鏡上(inthegreenfluorescencechannelforGFP)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。實(shí)施例13:胞內(nèi)DR6信號(hào)傳導(dǎo)胱天蛋白酶是程序性細(xì)胞死亡途徑中的重要因子(參見例如Gmtter等，CurrOpinStructBiol.10(6):649畫55(2000);Kuida等,Nature384(6607):368畫72(1996);及Finn等，JNeurosci.20(4):1333-41(2000)),而且有些胱天蛋白酶與神經(jīng)變性性疾病(包括亨庭頓氏病和AD)中的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)(參見例如Wellington等，JNeurosci.22(18):7862-72(2002);Graham等，Cell125(6):1179-91(2006);Guo等,AmJPathol.(2):523-31(2004);及Ho雨itz等，JNeurosci.24(36):7895-902(2004》。圖17A顯示了培養(yǎng)5天然后暴露于各種不同培養(yǎng)條件達(dá)24小時(shí)的感覺神經(jīng)元的照片。如圖17A中所示，通過(guò)對(duì)JNK和上游胱天蛋白酶-8但非下游胱天蛋白酶-3的抑制延遲了軸突變性。在圖17A中，左邊的兩幅照片以遞減的次序顯示了分別暴露于NGF和抗NGF抗體的感覺神經(jīng)元。在圖17A中，右邊的四幅照片以遞減的次序顯示了分別暴露于抗NGF抗體和JNK抑制劑；抗NGF抗體和胱天蛋白酶-8抑制劑；抗NGF抗體和BAX抑制劑；及抗NGF抗體和胱天蛋白酶-3抑制劑的感覺神經(jīng)元。用于生成此圖17A中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如上文實(shí)施例8中所述在Campenot室中實(shí)施NGF剝奪測(cè)定法。在此測(cè)定法中以luM終濃度使用小分子JNK抑制劑SP600125，(產(chǎn)品目錄號(hào)1496，TocrisBioscience)。在此測(cè)定法中以10uM使用胱天蛋白酶-3抑制劑Z-DEVD-FMK(Z-DEVD-FMK,產(chǎn)品目錄號(hào)264155,Calbiochem)。在此測(cè)定法中以10uM使用胱天蛋白酶-8抑制劑Z-IETD-FMK(Z-IETD-FMK，產(chǎn)品目錄號(hào)FMK007，R&DSystems)。以10uM使用BAX抑制肽來(lái)阻斷神經(jīng)元細(xì)胞死亡(Bax-V5，TocrisInc)。Bax缺無(wú)小鼠系(Bax-Rl)先前已有記載(Deckwerth等，Neuron,巻17,401-411，1996)，而且得自JacksonLab。如實(shí)施例1、7和8中所述用TUJl抗體(l:500，Covance)實(shí)施感覺軸突的免疫熒光標(biāo)記。為了顯現(xiàn)Campenot室的軸突隔室中的免疫熒光標(biāo)記的感覺軸突，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SPl(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。圖17B提供了來(lái)自E12.5運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元外植體培養(yǎng)物的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的照片，顯示了胱天蛋白酶-3在細(xì)胞主體中發(fā)揮功能，而胱天蛋白酶-6在軸突中發(fā)揮功能。在圖17B中，由左至右，四幅照片顯示了分別與以下各項(xiàng)一起培養(yǎng)的神經(jīng)元(1)生長(zhǎng)因子；(2)沒有生長(zhǎng)因子且不存在胱天蛋白酶抑制劑(對(duì)照)；(3)沒有生長(zhǎng)因子但存在胱天蛋白酶-3抑制劑；和(4)沒有生長(zhǎng)因子但存在胱天蛋白酶-6抑制劑。用于生成此圖17B中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。在此測(cè)定法中以10uM使用胱天蛋白酶-3抑制劑Z-DEVD-FMK(Z-DEVD-FMK，產(chǎn)品目錄號(hào)264155，Calbiochem)。在此測(cè)定法中以1OuM使用胱天蛋白酶-6抑制劑Z-VEID畫FMK(Z-VEID畫FMK，產(chǎn)品目錄號(hào)550379,Becton,DickinsonandCompanyPHARMINGENDivision)。如上文實(shí)施例6中所述實(shí)施運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元腹側(cè)脊髓存活測(cè)定法。如實(shí)施例l、7和8中所述用TUJ1抗體(1:500,Covance)實(shí)施運(yùn)動(dòng)軸突的免疫熒光標(biāo)記。為了顯現(xiàn)免疫熒光標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)軸突，在Axioplan畫2成像Zeiss顯微鏡上使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1((B〃0(^)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。圖17C提供了培養(yǎng)5天然后暴露于各種不同培養(yǎng)條件達(dá)24小時(shí)的感覺神經(jīng)元的照片。圖17C中的數(shù)據(jù)顯示了雖然胱天蛋白酶-3似乎不是軸突變性所需要的，但是BAX是。在圖17C中，由左至右，上面的四幅照片分別顯示了與NGF—起培養(yǎng)，然后是在存在抗NGF抗體的情況中(即NGF剝奪)培養(yǎng)16、24和48小時(shí)的BAX+/+神經(jīng)元。下面的四幅照片相應(yīng)地分別顯示了與NGF—起培養(yǎng)，然后是與抗NGF抗體一起培養(yǎng)16、24和48小時(shí)的BAX-/-神經(jīng)元。用于生成此圖17C中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如上文實(shí)施例8中所述在Campenot室中實(shí)施NGF剝奪測(cè)定法。Bax缺無(wú)小鼠系(Bax-Rl)先前已有記載(Deckwerth等，Neuron,巻17,401-411,1996)，而且得自JacksonLab。在NGF剝奪測(cè)定法中在Campenot室的軸突隔室中使用NGF抗體(單克隆功能阻斷性抗NGF弁911,Genentech,20ug/ml)。如實(shí)施例l、7和8中所述詢TUJ1抗體(1:500,Covance)實(shí)施感覺軸突的免疫熒光標(biāo)記。為了顯現(xiàn)Campenot室的軸突隔室中的免疫熒光標(biāo)記的感覺軸突，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上(在綠色熒光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。圖17D提供了在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時(shí)的E13大鼠外植體連合神經(jīng)元的培養(yǎng)物的照片。圖17D中的數(shù)據(jù)顯示了胱天蛋白酶-3在細(xì)胞主體中發(fā)揮功能，而胱天蛋白酶-6在軸突中發(fā)揮功能。在圖17D中，由左至右，上面的三幅照片顯示了對(duì)照神經(jīng)元同分別與胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-6抑制劑一起培養(yǎng)的神經(jīng)元相比較的GFP分析。下面的三幅照片相應(yīng)地顯示了對(duì)照神經(jīng)元同分別與胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-6抑制劑一起培養(yǎng)的神經(jīng)元相比較的TUNEL(細(xì)胞死亡)分析。用于生成此圖17D中所顯示的數(shù)據(jù)的材料和方法如下。如實(shí)施例2中所述實(shí)施連合外植體培養(yǎng)和存活測(cè)定法。通過(guò)如上文實(shí)施例7中所述TUNNEL測(cè)定法在連合外植體培養(yǎng)物中顯現(xiàn)連合細(xì)胞主體中的程序性細(xì)胞死亡。將連合外植體在4。/。PFA/PBS中固定并為單細(xì)胞水平的程序性細(xì)胞死亡(凋亡)的檢測(cè)加工，該4企測(cè)基于4吏用原位細(xì)胞死亡4企測(cè)試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)11684795910,Roche)依照制造商的說(shuō)明手冊(cè)(Roche)的DNA鏈斷裂標(biāo)記(TUNNEL技術(shù))。通過(guò)熒光顯微鏡檢術(shù)分析連合感覺和運(yùn)動(dòng)外植體培養(yǎng)物的細(xì)胞主體中的凋亡(圖17D)。在此測(cè)定法中以10uM使用胱天蛋白酶-3抑制劑Z-DEVD-FMK(Z-DEVD-FMK,產(chǎn)品目錄號(hào)264155，Calbiochem)。在此測(cè)定法中以1OuM使用胱天蛋白酶-6抑制劑Z-VEID-FMK(Z-VEID-FMK,產(chǎn)品目錄號(hào)550379，Becton，DickinsonandCompany,PHARMINGENDivision)。為了顯現(xiàn)GFP標(biāo)記的連合軸突，在Axiovert200Zeiss倒置顯孩t鏡上(在GFP的綠色焚光通道中)4吏用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。為了顯現(xiàn)熒光標(biāo)記的TUNNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞主體，在Axioplan-2成像Zeiss顯微鏡上(在供TUNNEL用的紅色焚光通道中)使用來(lái)自CarlZeissImagingSolutions的AxioVision40Release4.5.0.0SP1(03/2006)計(jì)算機(jī)軟件拍攝照片。實(shí)施例14:動(dòng)物模型中的DR6拮抗活性熟練技術(shù)人員可采用多種與不同神經(jīng)變性性疾病有關(guān)的動(dòng)物模型來(lái)檢驗(yàn)DR6拮抗劑在體內(nèi)的效果。例如，APP/RK轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)突變型淀粉狀蛋白前體蛋白多肽并展現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)變性和凋亡。因此，APP/RK轉(zhuǎn)基因小鼠提供了阿耳茨海默氏病的模型，其可用于檢驗(yàn)DR6拮抗劑對(duì)在此動(dòng)物模型中觀察到的與此綜合征有關(guān)的病理過(guò)程的效果(參見例如Moechars等,1Neuroscience91(3):819-830(1999))。多種其它轉(zhuǎn)基因鼠系(諸如APP23和JNPL3轉(zhuǎn)基因系)表達(dá)突變型阿耳茨海默氏相關(guān)多肽并進(jìn)一步展現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞損失。APP23和JNPL3轉(zhuǎn)基因小鼠如此提供阿耳茨海默氏病的備選模型，其中可施用DR6拮抗劑(參見例如McGowan等，TRENDSinGenetics巻22期5(2006》。G93ASODl轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人超氧化物歧化酶突變型多肽并展現(xiàn)升高水平的胱天蛋白酶-3表達(dá)以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡。G93AS0D1轉(zhuǎn)基因小鼠提供了肌萎縮性側(cè)索硬化的模型，其可用于檢驗(yàn)DR6拮抗劑的效果(參見例如Tokuda等，BrainRes.1148:234-242(2007);及Wang等，Eur.J.Neurosci.26(3):633-641(2007))。R6/2轉(zhuǎn)基因小鼠在其天然啟動(dòng)子的控制下表達(dá)亨廷頓的外顯子-l及延伸的N-末端多谷氨酸重復(fù)并展現(xiàn)漸進(jìn)性神經(jīng)病理學(xué)變化，其再現(xiàn)人類中的亨庭頓氏病(參見例如Mangarini等，Cell,87,493-506(1996);Chen等:Nat.Med.6,797-801(2000))。R6/2轉(zhuǎn)基因小鼠提供了亨庭頓氏病的模型，其可用于檢驗(yàn)DR6拮抗劑對(duì)在此動(dòng)物模型中觀察到的與此綜合征有關(guān)的病理過(guò)禾呈的歲文果(參見例^口\\^1^等,EuropeanJournalofNeuroscience,26:633-641(2007))。PK-KO轉(zhuǎn)基因小鼠不表達(dá)Park-2基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，展現(xiàn)與帕金森氏病類似的異常，并具有比來(lái)自野生型小鼠的神經(jīng)元對(duì)凋亡更加易感的神經(jīng)元(參見例如Casarejos等，JNeurochem.97(4):934-46(2006))。PK畫KO轉(zhuǎn)基因小鼠提供了帕金森氏病的模型，其可用于表征DR6拮抗劑對(duì)在此動(dòng)物模型中觀察到的與此綜合征有關(guān)的病理過(guò)程的效果。另外，許多轉(zhuǎn)基因小鼠系(諸如811111-/-8,2小鼠、攜帶人AP啟動(dòng)子下的純的239個(gè)三核苷酸CAG重復(fù)的轉(zhuǎn)基因小鼠、以及有人SMNC的至少一個(gè)拷貝在鼠背景中發(fā)揮功能的天然小鼠Smn基因轉(zhuǎn)基因雙重敲除)都或是不表達(dá)存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或是表達(dá)其改變型式，并因此展現(xiàn)與脊髓性肌萎縮疾病類似的異常(參見例如Hsiu等，NatureGenetics24，66-70(2000);Ferri等，Neuroreport15(2):275-280(2004);Ferri等,CurrBiol.2003Apr15;13(8):669陽(yáng)73;及Rossol等,JournalofCellBiology,巻163，期4,801-812(2003))。此類轉(zhuǎn)基因鼠系因此提供了脊髓性肌萎縮的模型，其可用于表征DR6拮抗劑對(duì)在此動(dòng)物模型中觀察到的與此綜合征有關(guān)的病理過(guò)程的效果。神經(jīng)病學(xué)疾病或病癥的動(dòng)物模型(包括上文所述那些)可用于檢驗(yàn)本文中所公開的DR6拮抗劑的效果，例如一種或多種結(jié)合DR6的抗體(例如3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7單克隆抗體)、和/或一種或多種結(jié)合APP的可溶性形式DR6(例如包含SEQIDNO:l氨基酸l-354的)、和/或一種或多種結(jié)合APP的抗體(例如22C11單克隆抗體)以及彼此組合的和/或與本領(lǐng)域已知的其它治療劑組合的這些藥劑。在本文中所公開的一種或多種DR6拮抗劑的實(shí)驗(yàn)測(cè)試的例示性方案中，可以將許多來(lái)自動(dòng)物;漠型的年齡和性別匹配的動(dòng)物(例如6月齡雌性APP/RK轉(zhuǎn)基因小鼠)指派給多個(gè)測(cè)試和/或?qū)φ战M之一。然后可以依照特定的施用方案對(duì)這些動(dòng)物的第一測(cè)試組施用選定的DR6拮抗劑(例如腹膜內(nèi)注射DR6拮抗劑抗體，每次注射20mg/kg體重，每?jī)芍芤淮?，持續(xù)6個(gè)月)。其它測(cè)試組的條件可以依照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐而變化，例如施用不同劑量的DR6拮抗劑(例如l、5、10、15mg/kg體重)、施用不同進(jìn)度表的DR6拮抗劑(例如每周一次，持續(xù)12個(gè)月)、施用不同的DR6拮抗劑(例如DR6免疫粘附素)、使用藥劑組合(例如與膽堿酯酶抑制劑組合的DR6拮抗劑)、使用不同施用路徑(例如靜脈內(nèi)施用)等。一組或多組的動(dòng)物可充當(dāng)對(duì)照，例如依照與接受DR6拮抗劑的測(cè)試組相同的施用過(guò)程接受無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水。在接受DR6拮抗劑后的有些時(shí)間段，然后可以對(duì)這些動(dòng)物的測(cè)試組和匹配對(duì)照組進(jìn)行比較，例如檢驗(yàn)和/或表征DR6拮抗劑在體內(nèi)的效果。例如，可些動(dòng)物的測(cè)試組和對(duì)照組的特定組織或器官(例如腦)的神經(jīng)元細(xì)胞的樣品以比較這些組中的神經(jīng)元細(xì)胞的狀況(參見例如Petrik等，NeuromolecularMed.9(3):216-29(2007))?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)諸如多光子顯樣i術(shù)的4支術(shù)來(lái)評(píng)估自這些組得到的樣品以證明諸如改變的神經(jīng)突軌跡、樹突棘損失或樹突變細(xì)(thinning)的現(xiàn)象(參見例如Tsai等，Nat.Neurosci.7,1181-1183(2004);及Spires等，J.Neurosci.25,7278-7287(2005))?；蛘?，可以用自這些組得到的血液或其它組織樣品進(jìn)行ELISA方案，其設(shè)計(jì)用于測(cè)量炎癥和/或凋亡的標(biāo)志物的水平，諸如IL-lp、TNF-a、IL-IO、p53蛋白、干擾素-y、或NF-kB(參見例如Rakover等，Neurodegener.Dis.4(5):392-402(2007);及Mogi等，NeurosciLett.414(1):94-7(2007))?；蛘?，可以在本領(lǐng)域已知的行為測(cè)試范例中比較來(lái)自測(cè)試組和匹配對(duì)照組的動(dòng)物，例如Morris水迷宮或目標(biāo)識(shí)別測(cè)試(參見例如Hsiao等,Science274，99-102(1996);Janus等，Nature408,979-982(2000);Morgan等，Nature408，982-985(2000);及Ennaceur等，Behav.BrainRes.1988;31:47-59)。測(cè)試組與匹配對(duì)照組動(dòng)物間的比較結(jié)果容許本領(lǐng)域技術(shù)人員檢驗(yàn)DR6拮抗劑在體內(nèi)在動(dòng)物模型中的效果。實(shí)施例1-13中所包括的數(shù)據(jù)及與此數(shù)據(jù)的有關(guān)表征證明了DR6拮抗劑會(huì)例如在體內(nèi)抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。具體而言，上文實(shí)施例1-13教導(dǎo)了例如(1)DR6在極其多種神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡；(2)APP是結(jié)合DR6并觸發(fā)DR6介導(dǎo)的凋亡的DR6關(guān)聯(lián)配體；和(3)在體外抑制DR6/APP結(jié)合相互作用的DR6拮抗劑因此在體內(nèi)抑制DR6介導(dǎo)的凋亡。鑒于申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)和公開內(nèi)容，熟練技術(shù)人員會(huì)合理預(yù)期動(dòng)物模型(諸如上文所述那些)和相關(guān)技術(shù)用于沖企驗(yàn)在這些動(dòng)物模型中觀察到的各種病理過(guò)程以驗(yàn)證DR6拮抗劑的生物學(xué)活性，如本文所述。實(shí)施例15:脊髓性肌萎縮動(dòng)物模型中的RA.l("1E5.5.7，，)、RA.2、RA.3("3F4.4.8")和RA.4抗體處理脊髓性肌萎縮(SMA)是侵襲脊髓前角中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性(recessive)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，而且認(rèn)為它源自SMN(存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)蛋白的減少(reduction)。SMA的動(dòng)物模型是具有品系名稱FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299AhmbTg(S畫2)89AhmbSmnltmlMsd/J(JAX5025)的轉(zhuǎn)基因小鼠系(參見例如Le等，HumanMolecularGenetics14(6):845-857(2005))。此三重突變小鼠包含兩個(gè)轉(zhuǎn)基因等位基因和一個(gè)靶定突變體。丁§(8畫2*(16^7)4299八1111113等位基因由缺少外顯子7的81^^cDNA組成，而Tg(SMN2)89Ahmb等位基因由完整的人SMN2基因組成。在下文說(shuō)明中，此品系也稱作德耳塔(A，Delta)7SMAKCMt型。對(duì)于靶定的Smn等位基因是純合的且對(duì)于兩種轉(zhuǎn)基因等位基因是純化的小鼠展現(xiàn)與患有脊髓性肌萎縮(SMA)的患者相似的癥狀和神經(jīng)病理。在出生時(shí)，三重突變體比正常的同窩出生者顯著地要更小。到第5天，肌肉軟弱的征候明顯并在隨后的一周里變得越來(lái)越顯著，即小鼠展現(xiàn)異常的步態(tài)、后肢顫抖和趨于摔倒。存活均值為大約13天。三重突變體小鼠進(jìn)一步展現(xiàn)受損的對(duì)表面翻正(surfacerighting)、負(fù)向地性(negativegeotaxis)和懸崖轉(zhuǎn)向(cliffaversion)的應(yīng)答，但是對(duì)觸覺刺激的應(yīng)答沒有受損。這些小鼠中自發(fā)的運(yùn)動(dòng)活性和握力也顯著受損(參見例如Butchbach等，NeurobiolDis.27(2):207-19(2007))。下面的方案設(shè)計(jì)用于檢驗(yàn)?zāi)承┛贵w(諸如DR6拮抗性抗體)和劑量對(duì)A7SMA模型小鼠(KO)的存活、體重和肌緊張性的效果。如上所述，此研究中所使用的小鼠可以是A-7SMA(JAX5025)KO模型(smn-/-;SMN2+/+;d7+/+)?？梢栽诔錾鷷r(shí)將窩隨^/L精選成10只動(dòng)物(或一些其它數(shù)目)，其中例如取出相等數(shù)目的雄性和雌性。遵循此方案，可以在第一次劑量給藥時(shí)(P3)將窩精選成8只小鼠?？梢詮难芯恐刑蕹魏尉哂猩儆?只幼仔的窩?？梢栽诔錾鷷r(shí)(PO)給來(lái)自在周一和周三之間出生的窩的小鼠剪尾?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)實(shí)施基因分型，例如使用可通過(guò)商業(yè)途徑從分子診斷學(xué)公司諸如TransnetyxInc獲得的活檢中轉(zhuǎn)基因、敲除、和敲入突變的自動(dòng)化基因分型服務(wù)篩選。通常在出生后48小時(shí)內(nèi)可獲得此基因型數(shù)據(jù)?？梢栽诶拘詫?shí)驗(yàn)中使用例如在周一到周三出生的小鼠。可以在P3開始給小鼠IP劑量給藥。此研究中的典型數(shù)目可以是(1)例如平均10只KO(5只雄性和5只雌性)對(duì)照接受媒介諸如無(wú)菌PBS;(2)例如平均10只KO(5只雄性和5只雌性)接受第一劑量的相應(yīng)抗體，其包含20mg/kg;和(3)例如平均10只KO(5只雄性和5只雌性)接受第二劑量的相應(yīng)DR6抗體，其包含5mg/kg。每種動(dòng)物可接受相應(yīng)RA.l、RA.2、RA.3、和RA.4抗體的IP劑，每周兩次。"RA.1抗體"對(duì)應(yīng)于"1E5.5.7"，而"RA.3抗體"對(duì)應(yīng)于"3F4.4.8"。"RA.2抗體"對(duì)應(yīng)于"4B6.9.7",而"RA.4抗體"對(duì)應(yīng)于"2C7.3.7"(Genentech,Inc.，一種結(jié)合DR6但不阻斷功能的抗體)。"RA.5抗體"對(duì)應(yīng)于"3B11.7.7"(Genentech,Inc.,—種結(jié)合DR6但可增強(qiáng)或刺激DR6活性的抗體)。RA.l、RA.2、RA.3和RA.4抗體可保存于4。C。在必要時(shí)，可以在劑量給藥前將這些抗體溫暖至室溫?？蒠吏用典型的々某介，諸如PBS。雖然此實(shí)施例中的RA.l、RA.2、RA.3、和RA.4單克隆抗體是使用人DR6多肽序列作為免疫原而生成的，但是所有這些抗體都與人以及大鼠和小鼠DR6起反應(yīng)，正如諸如實(shí)施例7中所描述的軸突變性和凋亡測(cè)定法的方案所顯示的。在一個(gè)例示性的實(shí)施方案中，所評(píng)估的DR6拮抗劑可以是拮抗性抗體RA.l、RA.2、RA.3和RA.4;每種抗體的處理組的數(shù)目可以是2(每組10只動(dòng)物)；施用路徑可以是IP;而劑量范圍可以是5和20mg/kg。任選的是，組可以如下(1)RA.1:5mg/kgIP;(2)RA.l:20mg/kgIP;(3)RA.2:5mg/kgIP;(4)RA.2:20mg/kgIP;(5)RA.3:5mg/kgIP;(6)RA.3:20mg/kgIP;(7)RA.4:5mg/kgIP;(8)RA.4:20mg/kgIP;和(9)媒介(PBS)IP。在此方案中，可以每天一次給小鼠稱重。在出生后天數(shù)(PND)10、12和14,可以給窩中的每只幼仔稱體重。在PND6、8、10、12、14和16，可以對(duì)研究中的每只動(dòng)物實(shí)施肌緊張性評(píng)估(參見例如下文所提供的例示性表型分型方案)。在出生日(PO)，可以使用無(wú)毒墨水給幼仔紋身，施加在皮下下，并采集剪尾樣品用于基因分型(結(jié)果通?？稍?8小時(shí)內(nèi)獲得)。在實(shí)驗(yàn)?zāi)翘?P3)，可以每天同一時(shí)間將有新生兒的母獸帶到實(shí)驗(yàn)室并在測(cè)試開始前不受打擾的呆上至少10分鐘?？梢允紫仍谮叺匦詼y(cè)試中然后在管測(cè)試中(管測(cè)試有2此連續(xù)的試驗(yàn))測(cè)試幼仔?？梢詫⒂鬃兄糜诩訜釅|上直至窩中的所有幼仔接受了測(cè)試，然后可以將所有幼仔返回它們的母獸(在操作后可以將幼仔與它們的籠草墊混合以將母獸的排斥降至最低)。可以自出生起每天檢查存活和體重直至斷奶。通常在先前實(shí)施的長(zhǎng)期MTD研究過(guò)程中評(píng)估藥物對(duì)新生兒軸體溫的影響。#溫,可以在規(guī)定的年齡采集軸體溫的一個(gè)讀數(shù)?？梢酝ㄟ^(guò)包括趨地性在內(nèi)的檢驗(yàn)方案對(duì)測(cè)試組和對(duì)照組的小鼠檢驗(yàn)差異。趨地性測(cè)試動(dòng)物在被面向下地放置在傾斜平臺(tái)上時(shí)給自己定向的能力。此測(cè)試測(cè)量運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和前庭系統(tǒng)?？墒褂肒aplan-Meier分析來(lái)實(shí)施存活評(píng)估，其中以Mantel-Cox作為事后檢驗(yàn)(post-hoctest)。為了分析隨時(shí)間重復(fù)測(cè)量得到的數(shù)據(jù)，可采用混合效果模型(MixedEffectsModels)(也稱作混合ANOVA模型)。此方法基于似然估算(likelihoodestimation)而非動(dòng)差估算(momentestimation)(像典型的重復(fù)測(cè)量ANOVA分析中的那樣)，但是它由于小鼠隨時(shí)間的死亡而更加易于丟失數(shù)值?？梢允褂肧AS9.1.3.(SASInstitute,Cary,NC)中的PROCMIXED程序來(lái)擬合所有模型。處理是模型中最重要的因素。還可以考慮性別和天數(shù)，以及它們與處理的相互作用。研究終點(diǎn)可以是死亡。可以通過(guò)諸如實(shí)施例14中所述(例如組織學(xué)分析)的方法進(jìn)一步評(píng)估動(dòng)物。另夕卜，可以評(píng)估血清/血液以測(cè)定RA.1、RA.2、RA.3和RA.4血清濃度。材料保藏以下材料已經(jīng)保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209,USA)(ATCC):材料ATCC保藏號(hào)保藏曰3F4.4.8PTA-80952006年12月21日4B6.9.7PTA-80942006年12月21日1E5.5.7PTA-80962006年12月21日此保藏是依據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)及其(布達(dá)佩斯條約)實(shí)施細(xì)則的規(guī)定進(jìn)行的。這保證了自保藏之日起保存保藏的存活培養(yǎng)物30年。保藏物可根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款通過(guò)ATCC獲得，并服從Genentech公司與ATCC之間的協(xié)議，它保證了在有關(guān)美國(guó)專利授權(quán)后或者在任何美國(guó)或外國(guó)專利申請(qǐng)向公眾公開后，以兩者中居先者為準(zhǔn)，公眾可永久且不受限制的獲得保藏培養(yǎng)物的后代，而且保證了依據(jù)35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14，特別要提及886OG638)由美國(guó)專利和商標(biāo)局長(zhǎng)批準(zhǔn)的個(gè)人將有資格獲得保藏培養(yǎng)物的后代。本申請(qǐng)的受讓人已同意，若保藏材料的培養(yǎng)物在合適條件下培養(yǎng)時(shí)死亡、丟失或遭到破壞，則他將在接到通知后迅速用同一培養(yǎng)物的另一份材料所授予的權(quán)利實(shí)施本發(fā)明的許可。認(rèn)為前述書面描述足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明并不限于本文所呈現(xiàn)實(shí)施例的范圍。實(shí)際上，根據(jù)上面的描述，在本文所顯示和描述之外，本發(fā)明的多種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，而且在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種抑制死亡受體6(DR6)結(jié)合淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的方法，包括在DR6對(duì)APP的結(jié)合受到抑制的條件下將DR6多肽和/或APP多肽暴露于一種或多種DR6拮抗劑。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑選自結(jié)合DR6的抗體、包含SEQIDNO:1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽、和結(jié)合APP的抗體。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述可溶性DR6多肽包括DR6免疫粘附素。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述可溶性DR6多肽包含融合至免疫球蛋白Fc區(qū)的DR6胞外結(jié)構(gòu)域序列。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體結(jié)合包含圖1(SEQIDNO:l)氨基酸l-349或42-349的DR6多肽。6.權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。7.權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體竟?fàn)幮砸种朴煞謩e以ATCC編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7單克隆抗體的結(jié)合。8.權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽是連接至一種或多種選自下組的非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物的聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述結(jié)合APP的抗體是單克隆抗體。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體竟?fàn)幮砸种?F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗體的結(jié)合。12.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合APP的抗體是連接至一種或多種選自下組的非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物的聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。13.權(quán)利要求l的方法，其中所述DR6多肽是在一種或多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的且所述一種或多種DR6拮抗劑的結(jié)合抑制DR6活化或信號(hào)傳導(dǎo)。14.權(quán)利要求13的方法，其中該方法是在體外實(shí)施的，用以抑制一種或多種表達(dá)DR6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的凋亡。15.權(quán)利要求13的方法，其中該方法是在體內(nèi)實(shí)施的，用以抑制一種或多種表達(dá)DR6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的凋亡。16.權(quán)利要求13的方法，其中所述一種或多種在細(xì)胞表面上表達(dá)DR6多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中至少一種是連合神經(jīng)元細(xì)胞、感覺神經(jīng)元細(xì)胞或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)月包。17.權(quán)利要求13的方法，其中該方法是在體內(nèi)在具有神經(jīng)學(xué)疾患或病癥的哺乳動(dòng)物中實(shí)施的。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述神經(jīng)學(xué)疾患或病癥是肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏病、亨庭頓氏病或阿耳茨海默氏病。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述神經(jīng)學(xué)疾患或病癥包含神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷，其源自中風(fēng)、對(duì)大腦或脊髓組織的創(chuàng)傷、或神經(jīng)元組織中的損害。20.權(quán)利要求l的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑中至少一種抑制DR6對(duì)包含SEQIDNO:6氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合。21.權(quán)利要求l的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑中至少一種抑制APP對(duì)包含SEQIDNO:1氨基酸1-655的DR6多肽的結(jié)合。22.—種治療患有神經(jīng)學(xué)疾患或病癥的哺乳動(dòng)物的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的一種或多種DR6拮抗劑。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑選自結(jié)合DR6的抗體、包含SEQIDNO:1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽、和結(jié)合APP的抗體。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述可溶性DR6多肽包括DR6免疫粘附素。25.權(quán)利要求23的方法，其中所述可溶性DR6多肽包含融合至免疫球蛋白Fc區(qū)的DR6胞外結(jié)構(gòu)域序列。26.權(quán)利要求23的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體結(jié)合包含圖1(SEQIDNO:l)氨基酸l-349或42-349的DR6多肽。27.權(quán)利要求23的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體o28.權(quán)利要求23的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體竟?fàn)幮砸种朴煞謩e以ATCC編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7單克隆抗體的結(jié)合。29.權(quán)利要求23的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽是連接至一種或多種選自下組的非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物的聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。30.權(quán)利要求22的方法，其中所述結(jié)合APP的抗體是單克隆抗體。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體竟?fàn)幮砸种茊慰寺】贵w22C11的結(jié)合。33.權(quán)利要求30的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體是連接至一種或多種選自下組的非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物的聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。34.權(quán)利要求22的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑中至少一種抑制DR6對(duì)包含SEQIDNO:6氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合。35.權(quán)利要求22的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑中至少一種抑制APP對(duì)包含SEQIDNO:1氨基酸1-655的DR6多肽的結(jié)合。36.權(quán)利要求22的方法，其中所述神經(jīng)學(xué)疾患或病癥是肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏病、亨庭頓氏病或阿耳茨海默氏病。37.權(quán)利要求22的方法，其中所述神經(jīng)學(xué)疾患或病癥包含神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷，其源自中風(fēng)、對(duì)大腦或脊髓組織的創(chuàng)傷、或神經(jīng)元組織中的損害。38.權(quán)利要求22的方法，其中對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用一種或多種別的治療劑。39.權(quán)利要求22的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑是經(jīng)注射、輸注或灌注對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用的。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述一種或多種別的治療劑選自NGF、凋亡抑制劑、EGFR抑制劑、卩-分泌酶抑制劑、，分泌酶抑制劑、膽堿酯酶抑制劑、抗A(3抗體和NMDA受體拮抗劑。41.一種鑒定抑制DR6對(duì)APP的結(jié)合的感興趣分子的方法，該方法包括在存在或不存在感興趣分子的情況中組合DR6和APP;并測(cè)定在存在所述感興趣分子的情況中對(duì)DR6結(jié)合APP的抑制。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述感興趣分子是結(jié)合APP的抗體、結(jié)合DR6的抗體或包含SEQIDNO:1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽。43.權(quán)利要求41的方法，其中對(duì)于在存在感興趣分子的情況中對(duì)于DR6對(duì)APP的結(jié)合的抑制的檢測(cè)是在無(wú)細(xì)胞測(cè)定法中實(shí)施的。44.權(quán)利要求41的方法，進(jìn)一步包括使用在細(xì)胞表面上表達(dá)DR6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)施所述方法；并檢測(cè)對(duì)DR6活化或信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。45.—種組合物，其包含依照權(quán)利要求40的方法鑒定的感興趣分子。46.權(quán)利要求45的組合物和載體。47.權(quán)利要求46的組合物，其中所述載體是藥學(xué)可接受載體。48.—種分離的DR6拮抗劑，包括(a)結(jié)合包含SEQIDNO:1的DR6多肽的單克隆抗體或(b)可溶性DR6多肽或(c)結(jié)合包含SEQIDNO:6的APP的單克隆抗體，其中所述DR6拮抗劑抑制APP對(duì)DR6的結(jié)合。49.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述可溶性DR6多肽包括DR6免疫粘附素。50.權(quán)利要求49的分離的DR6拮抗劑，所述可溶性DR6多肽包含融合至免疫球蛋白Fc區(qū)的DR6胞外結(jié)構(gòu)域序列。51.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合DR6的抗體結(jié)合包含圖1(SEQIDNO:l)氨基酸l-349或42-349的DR6多肽。52.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合DR6的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。53.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合DR6的抗體竟?fàn)幮砸种朴煞謩e以ATCC編號(hào)PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7單克隆抗體的結(jié)合。54.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽是連接至一種或多種選自下組的非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物的聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。55.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述DR6拮抗劑抑制DR6對(duì)包含SEQIDNO:6氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合。56.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述拮抗劑結(jié)合通過(guò)位阻抑制而抑制DR6對(duì)APP的結(jié)合的表位。57.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。58.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合APP的抗體竟?fàn)幮砸种?2Cll單克隆抗體的結(jié)合。59.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合APP的抗體是連接至一種或多種選自下組的非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物的聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。60.權(quán)利要求48的分離的DR6拮抗劑，其中所述拮抗劑抑制DR6對(duì)包含SEQIDNO:6氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合。61.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求47-60的DR6拮抗劑和藥學(xué)可接受載體。62.—種診斷患有神經(jīng)學(xué)病癥的或?qū)ι窠?jīng)學(xué)病癥易感的患者的方法，包括自所述患者獲取樣品并對(duì)所述樣品測(cè)試具有與SEQIDNO:1之DR6多肽序列不同的多肽序列的DR6多肽變體的存在。63.權(quán)利要求62的方法，進(jìn)一步包括鑒定所述多肽變體是否具有與對(duì)SEQIDNO:1之DR6多肽序列觀察到的親和力不同的對(duì)APP多肽的親和力。64.—種制品，包括(a)包含有效量的權(quán)利要求47-60的DR6拮抗劑的組合物；(b)裝有所述組合物的容器；和(c)粘貼至所述容器的標(biāo)簽或包括在所述容器中的包裝插頁(yè)，其提供關(guān)于所述DR6拮抗劑在神經(jīng)學(xué)疾患或病癥的治療中的用途的說(shuō)明。65.—種試劑盒，包括第一容器、所述容器上的標(biāo)簽、和裝在所述容器內(nèi)的組合物，其中所述組合物包含有效抑制至少一種類型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中的凋亡的活性劑，所述容器上的所述標(biāo)簽或包括在所述容器中的包裝插頁(yè)指示所述組合物可用于抑制至少一種類型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中的凋亡，且所述組合物中的所述活性劑包含權(quán)利要求47-60的至少一種DR6拮抗劑；裝有藥學(xué)可接受緩沖劑的第二容器；和關(guān)于使用所述DR6拮抗劑來(lái)抑制至少一種類型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中的凋亡的說(shuō)明。全文摘要提供了用于治療神經(jīng)學(xué)病癥(包括阿耳茨海默氏病)的包含DR6拮抗劑的方法和組合物。DR6拮抗劑包括增強(qiáng)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)、再生或存活的抗APP抗體、抗DR6抗體、DR6免疫粘附素和DR6變體(及其融合蛋白)。文檔編號(hào)C07K16/18GK101616934SQ200780051556公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日發(fā)明者阿納托利·尼科萊夫,馬克·特西爾-拉維格尼申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司