專利名稱：抗人腱生蛋白單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人腱生蛋白單克隆抗體、獲得它們的方法及原料、所說抗體在表達腱生蛋白的腫瘤的診斷和治療方法中的用途以及含有所述抗體并適于在醫(yī)療領(lǐng)域中應(yīng)用的材料。
背景技術(shù)：
腫瘤療法的專一性通常成為決定治療是否成功的限制因素。事實上，許多抗癌劑的毒性效果和低耐受性限制了它們的用途以及患者的生活質(zhì)量。
毒性的降低與只針對癌細胞的治療選擇性直接相關(guān)。單克隆抗體是適于特異定位于腫瘤的理想工具，而且當它們與親和素/生物素擴增體系聯(lián)合時，可成為一種將活性分子定向于腫瘤位點的非常有效的方法。
腱生蛋白是一種胞外基質(zhì)分子，其在胚胎發(fā)生期間、疤痕形成過程和腫瘤發(fā)生期間的成年組織中、以及新形成的血管中表達。在正常的成年組織中幾乎沒有腱生蛋白，而在許多實體腫瘤的基質(zhì)中則有所表達，諸如膠質(zhì)瘤(Burdon等，Cancer Res.，432796-2805，1983)、乳癌(Chiquet-Ehrisrnann等，1986)、肺癌(Natali等，Inti.J.Cancer，5456-68，1989)、纖維肉瘤和鱗狀細胞癌(Ramos，D.M.等，liltl.J.Cancer，75680-687，1998)。腱生蛋白在膠質(zhì)瘤中表達，但在相應(yīng)的正常腦組織中則無表達。有關(guān)腱生蛋白的深入討論，讀者可參閱專利申請WO 92/04464，Wistar和相關(guān)文獻。
基于專利申請EP 0 496 074，G.Paganelli等人已研發(fā)了一種被稱為“三步預(yù)靶向”的方法用于腫瘤的全身和區(qū)域性治療，其有關(guān)結(jié)果報道于以下文獻中Cremonesi，M.等，Eur.J.Nucl.Med.，26(2)110-120，1999；Paganelli，G.等，Eur.J.Nucl.Med.，26(4)348-357，1999；Paganelli，G.等，Cancer Biother.&Radiopharm.，16(3)227-235，2001；Grana，C.等，Br.J.Cancer，86207-212，2001。
有關(guān)此類型的癌癥治療方法的其它參考文獻有WO 94/04702和US 5,578,287。
三步預(yù)靶向治療法，也以商標PAGRIT著稱，其基礎(chǔ)是依次靜脈內(nèi)施用生物素化抗腱生蛋白單克隆抗體、鏈霉親和素和90Y-生物素，在施加鏈霉親和素和90Y-生物素之前先分別加入親和素和生物素化白蛋白(“追蹤”步驟)，以降低抗體和鏈霉親和素的循環(huán)水平。三步預(yù)靶向法的選擇性是由于使用抗腱生蛋白單克隆抗體造成的。與針對于細胞表面抗原的靶向方式相比較，靶向于胞外基質(zhì)分子的優(yōu)勢在于不受腫瘤細胞自身對抗原表達的調(diào)控的影響。為獲得最佳的腫瘤對非腫瘤的生物分布比率，已確定了預(yù)靶向療法的劑量、施用次數(shù)和“追蹤”步驟。
Paganelli研究利用了獲自48名成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)或惡性星細胞瘤(AA)患者的結(jié)果(Paganelli，G.，et al.，Eur.J.Nucl.Med.，26(4)348-357，1999)，證明該療法確實無毒性并且有初步的療效，只是少數(shù)病例對鏈霉親和素有過敏反應(yīng)。事實上，治療結(jié)束2個月后，25％的患者顯現(xiàn)出腫瘤塊縮小(全部有反應(yīng)＝6％，部分反應(yīng)＝11％，反應(yīng)較小＝8％)，52％的患者維持穩(wěn)定，總響應(yīng)率為77％。
在許多預(yù)期存活期在6個月以下的這些患者中，對治療的反應(yīng)持續(xù)1年以上。
生物素化抗腱生蛋白抗體的作用是定位于腫瘤和介質(zhì)中，通過生物素化的分子，親和素和隨后的90Y-生物素積聚，將放射性同位素直接導(dǎo)向腫瘤內(nèi)部?？闺焐鞍卓贵w已是以下專利和專利申請的對象美國專利申請US 5,624,659，Duke University；JP 2219590，Rikagaku；WO 92/04464，Wistar；以及WO 03/072608，Sigma-Tau。
一種特別的抗腱生蛋白抗體被描述在下述文獻中Siri，A.等，Nucl.Acid Res.，19(3)525-531，1991；Balza，E.，et al，F(xiàn)EBS 33239-43，1993；而有關(guān)它的治療用途可參閱Riva，P.等，Acta Oncol.38(3)351-9，1999；Riva，P.等，Cancer，80(12)2733-42；1997；Riva，P.等，.Int.J.Cancer，57-13，1992。
在上述研究中用于產(chǎn)生所說抗體的克隆被命名為BC-2。申請者已證明克隆BC-2不適于工業(yè)開發(fā)，因為它產(chǎn)生一額外的非功能性輕鏈(可能來源于親本骨髓瘤株系)，在大規(guī)模生產(chǎn)過程進行期間，此輕鏈的表達水平增加，阻礙了工業(yè)規(guī)模的抗體純化。
因此，人們認識到需要有可在藥用所需純度水平上以工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)抗腱生蛋白單克隆抗體。
早先的專利申請WO 03/072608(申請者為Sigma Tau IndustrieFarmaceutiche Riunite S.p.A.)中描述了抗腱生蛋白抗體ST2146的產(chǎn)生，該抗體無額外的非功能性輕鏈，能識別與抗體BC-4共享的抗原性表位，所述的抗體BC-4也被非功能性輕鏈污染了。
本發(fā)明的對象抗體ST2485識別與BC-2所識別表位部分共享的表位，因而位于同一蛋白區(qū)域內(nèi)。此區(qū)域在多種腫瘤組織中大量表達。因此，獲得特異于此區(qū)域的均一單克隆抗體用于癌癥診斷或靶向是非常重要的。
此外，本發(fā)明證實，除了ST2146之外，抗體ST2485也具有結(jié)合腱生蛋白的優(yōu)點，因此可用于聯(lián)合使用這兩種抗體的預(yù)靶向方法中。
發(fā)明簡述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)抗人腱生蛋白單克隆抗體解決了上述問題，因為它沒有非功能性輕鏈，且在與另一抗腱生蛋白抗體聯(lián)合使用時具有加和的優(yōu)勢。此抗體及其制備方法和治療用途都是本發(fā)明的對象，尤其是用于制備治療諸如腫瘤等以腱生蛋白的表達為特征的疾病的產(chǎn)品。
本發(fā)明涉及抗體和抗體片段，其可選地包含額外標記物和診斷劑，還涉及獲得所述抗體和抗體片段的方法、含有所說抗體及其片段的藥物組合物和利用它們進行診斷和治療的方法，以及用于執(zhí)行所說方法的試劑盒。
本發(fā)明還涉及編碼所說抗體或其片段的DNA、含有所述DNA的載體、含有所述載體的宿主細胞、由核苷酸序列SEQ ID NO1和SEQ IDNO2編碼的蛋白質(zhì)、編碼所述蛋白質(zhì)及片段的DNA、特異互補決定區(qū)(CDR)以及含所述CDR的蛋白質(zhì)。具體而言，本發(fā)明的對象還包括產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤。
作為本發(fā)明對象的抗體的特征在于分別如

圖17和18所示的輕鏈和重鏈SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的可變區(qū)序列。為簡便起見，作為本發(fā)明對象的抗體將以名稱ST2485表示。
此外，ST2485的片段或其嵌合或重組衍生物可在本發(fā)明范圍內(nèi)產(chǎn)生和應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的對象還包括能與人腱生蛋白A1-4-D區(qū)域內(nèi)的抗原性表位結(jié)合的所說抗體的蛋白水解片段。在描述本發(fā)明的過程中，所謂的抗體片段指能結(jié)合人腱生蛋白C的A1-4-D區(qū)域內(nèi)抗原性表位的那些片段。
依照本發(fā)明，所說的抗體或蛋白水解片段優(yōu)選是生物素化的。
本發(fā)明的另一對象是產(chǎn)生抗體ST2485的雜交瘤細胞系，被稱為cST2485。
該雜交瘤細胞系在2003年11月12日根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定被保藏在Centro di Biotecnologie Avanzate，Largo Rossana Benzi 10，Genoa，意大利，保藏號為PD03003。
此外，本發(fā)明的對象還包括抗體ST2485的重組衍生物，它可選地是生物素化的。具體而言，所說的重組衍生物優(yōu)選那些其中小鼠恒定區(qū)被它的人對應(yīng)物所取代的衍生物(Ferrer，C.等，J.Biotechnol.，5251-60，1996)，或者其中的小鼠恒定區(qū)被諸如親和素家族成員(PenIchet ML.，Manuel，L.，etal.，J.Immunol.，1634421-4426，1999)、可用于刺激腫瘤定向免疫學(xué)效應(yīng)器的生長因子(例如GCSF、GM-CSF)等生物學(xué)活性組分所取代的衍生物，或者其中的小鼠恒定區(qū)被藥用活性組分所取代的衍生物，所說的藥用活性組分有諸如超抗原、毒素、細胞因子或可用于增強抗腫瘤療效的任何其它蛋白質(zhì)(DiMassimo，AM等，British J.Cancer，75(6)822-828，1997；Parente D.等，Anticancer Research，17(6A)4073-4074，1997)。獲取所述衍生物的方法是本領(lǐng)域?qū)＜冶娝苤摹?br> 本發(fā)明的另一對象在于抗體ST2485的綴合衍生物，可可選地是生物素化的。
具體而言，綴合衍生物優(yōu)選其中生物學(xué)活性組分通過常規(guī)系統(tǒng)方式與抗體結(jié)合的那些衍生物。生物學(xué)活性化合物的實例有親和素家族成員、可用于刺激定向腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)器的生長因子(例如G-CSF、GM-CSF)，或者其中的小鼠恒定區(qū)被藥用活性組分所取代的那些衍生物，諸如超級抗原、毒素、細胞因子或可用于增強抗腫瘤療效的任何其它蛋白質(zhì)、抗腫瘤藥物和放射性同位素。
本發(fā)明更進一步的目標在于利用所述抗體或其衍生物制備在癌癥放射免疫療法中有效的藥用產(chǎn)品，該放射免疫療法優(yōu)選依照所謂三步預(yù)靶向方法(也以商標PAGRITO為人所知)進行，包括給患有表達腱生蛋白的癌癥的患者施用抗體ST2485或其水解片段，優(yōu)選經(jīng)生物素化的抗體或片段。
將作為本發(fā)明目標的抗體的重組衍生物及綴合物用于癌癥治療是有優(yōu)勢的。因此，利用所述抗體及其片段或衍生物制備治療表達腱生蛋白的腫瘤的藥物構(gòu)成本發(fā)明的又一個目標。
為了進行放射免疫治療，描述了兩種治療用試劑盒，一種是全身性的，另一種是局部性使用的。這些試劑盒的已知商標為PAGRIT。所述的全身用試劑盒包含5個小瓶，其中小瓶1含有依照本發(fā)明的生物素化抗體或其片段或衍生物；小瓶2中含有親和素；小瓶3中含有鏈霉親和素；小瓶4中含有生物素化人白蛋白；以及小瓶5中含有生物素DOTA(或WO 02/066075中所述的生物素的衍生物)。局部用試劑盒包括3個小瓶，相當于全身用試劑盒的小瓶1、2和5。將小瓶制備成適于對待治療的受試者、優(yōu)選人受試者進行注射的形式。為了進行放射免疫治療，描述了一種稱為IART(針對放射性核素療法的外科手術(shù)期中親和素化作用(Intraoperative Avidination for RadionuclideTreatment))的方法，其基礎(chǔ)是對經(jīng)歷外科手術(shù)切除腫塊的患者輔以本發(fā)明制劑的手術(shù)期中治療，本發(fā)明制劑可單獨施用或與PAGRITX試劑盒的其它組分聯(lián)合使用。
含生物素化抗體或其片段的特殊的容器，優(yōu)選為適于注射的小瓶形式，也構(gòu)成本發(fā)明的一個對象。
依照本發(fā)明的某一實施方案，在治療用試劑盒中，生物素化抗體與其它抗腱生蛋白抗體組合，所述抗體優(yōu)選針對于該蛋白質(zhì)的類EGF區(qū)?；蛘?，該生物素化抗體可與特異于腫瘤的其它抗體偶聯(lián)。有關(guān)此類型方法的大體描述可參閱文獻EP 0 496 074，European Journal ofNuclear Medicine Vol.26，No4；April，1999；348-357，US 5,968,405。
本發(fā)明的另一目標是利用單克隆抗體ST2485通過腫瘤的體內(nèi)免疫定位而獲取圖像用于診斷目的(“成像”)。
本發(fā)明的另一目標是在測試中將單克隆抗體ST2485與第二種抗腱生蛋白抗體組合生產(chǎn)診斷試劑盒用于測定腱生蛋白的循環(huán)水平。
本發(fā)明的這些目標和其它目標將詳述于下文，同時輔以實施例和附圖加以說明。
附圖簡述圖1人腱生蛋白C以及產(chǎn)生BC-2樣抗體所采用策略的示意圖。
圖2在還原和非還原條件下進行的抗體ST2485的SDS-PAGE(a，b)和蛋白質(zhì)印跡(c，d)分析。在還原條件下，在抗體輕鏈水平處觀察到一雙重條帶(b，d)。
圖3對經(jīng)酶PNGaseF(來自黃桿菌屬(Flavobacterium)的肽-N-糖苷酶)消化而去糖基化的抗體ST2485進行SDS-PAGE分析觀察到高分子量輕鏈條帶消失。
圖4抗體ST2485和BC-2的羥磷灰石層析圖譜。
圖5通過蛋白質(zhì)印跡分析ST2485對人腱生蛋白和對Tn(A(1-4)-D)片段的結(jié)合特異性。
圖6ST2485和BC-2之間對結(jié)合腱生蛋白C(a)或結(jié)合Tn(A(1-4)-D)片段(b)的競爭性ELISA。
圖7ST2485與BC-2相比較對腱生蛋白C(a)和對Tn(A(1-4)-D)片段(b)的免疫反應(yīng)性。
圖8生物素化ST2485和BC-2對腱生蛋白C(a)和對Tn(A(1-4)-D)片段(b)的免疫反應(yīng)性。
圖9抗體ST2485與表達于LMM3腫瘤(小鼠乳癌)中的和表達于正常小鼠腸中的小鼠腱生蛋白的交叉反應(yīng)性。
圖10在裸鼠中進行ST2485生物分布研究所采用的流程。
圖11和11a多種施用劑量下ST2485與BC-2相比較的生物分布。在所有的施用劑量下，ST2485在腫瘤中的積聚至少是BC-2的兩倍。
圖12和12a與BC-2相比，ST2485的腫瘤比非腫瘤比率。在所有的施用劑量下，抗體ST2485的比率均較高。
圖13通過ELISA測試方法進行抗腱生蛋白抗體ST2485和ST2146的體外干擾(a)和加和測試(b)。
圖14和14a通過BiaCore分析進行抗體ST2485和ST2146的體外加和檢驗。
圖15抗體ST2485和ST2146體內(nèi)加和研究所采用的方案。
圖16抗體ST2485和ST2146的體內(nèi)加和作用，以每克腫瘤內(nèi)定位的抗體的納克數(shù)表示。
圖17ST2485輕鏈(VL)可變區(qū)的SEQ ID NO1序列。所編碼氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
圖18ST2485重鏈(VH)可變區(qū)的SEQ ID NO2序列。所編碼氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)明者制備了命名為ST2485的新型抗人腱生蛋白抗體，它的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，該抗體是由雜交瘤細胞系cST2485產(chǎn)生的。所述抗體能與人腱生蛋白A(14)-D區(qū)域內(nèi)的抗原性表位結(jié)合。
本發(fā)明抗體的蛋白水解片段能結(jié)合人腱生蛋白的A(14)-D區(qū)域內(nèi)的抗原性表位。
本發(fā)明抗體的重組衍生物是依照本領(lǐng)域?qū)＜冶娝苤某Ｒ?guī)方法獲得的。重組衍生物優(yōu)選那些小鼠恒定區(qū)被它的人對應(yīng)物所取代的衍生物，或者被生物學(xué)或藥用活性組分取代、或者被親和素家族成員取代的衍生物。
依照本發(fā)明，綴合衍生物是用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法獲得的。
優(yōu)選的綴合衍生物是那些其中生物學(xué)活性部分與抗體結(jié)合的衍生物。所述的生物學(xué)活性部分的實例有親和素家族成員、可用于刺激定向腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)器的生長因子(例如G-CSF、GM-CSF)；藥用活性組分，諸如毒素、超級抗原、細胞因子或可用于增強抗癌效果的任何其它蛋白質(zhì)；抗癌藥物和放射性同位素。
有關(guān)重組和綴合衍生物制備的進一步信息，讀者可參閱文獻WO03/072608。
依照本發(fā)明，單克隆抗體的重組或綴合衍生物也可稱為“衍生物”。
在本發(fā)明的某一優(yōu)選實施方案中，抗體、其片段及衍生物可被生物素化。
依照本發(fā)明的抗體，其片段及衍生物還可方便的包含額外的標記物和診斷試劑。
本發(fā)明還包括編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA。本發(fā)明還包含含有所述DNA的載體以及含有所述載體的宿主細胞。
載體和宿主細胞是本領(lǐng)域所常規(guī)已知的。
本發(fā)明還包含由核苷酸序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2或其片段編碼的蛋白質(zhì)以及編碼它的DNA。
本發(fā)明還包含上述抗體的特異性CDR(互補決定區(qū))以及含有所述CDR的蛋白質(zhì)。
制備本發(fā)明抗體的過程包括以下步驟a)用人腱生蛋白的A(14)-D片段免疫接種動物，優(yōu)選小鼠；b)將所述動物的體脾細胞與不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞融合；c)挑選單克隆抗體。
單克隆抗體ST2485是由上文所確定的雜交瘤細胞系cST2485生成的。
依照本發(fā)明，可選地生物素化的抗體或其片段或其衍生物被用于制備藥用產(chǎn)品，該藥用產(chǎn)品被用于治療和診斷以腱生蛋白的表達為特征的疾病。具體而言，所述的疾病是腫瘤，更具體而言包括膠質(zhì)瘤、乳癌、肺癌、纖維肉瘤和鱗狀細胞癌。
在某一優(yōu)選的方面，上述藥用產(chǎn)品被用于實體瘤的雙階段手術(shù)期間治療中，該方法被描述于國際申請WO03/07268中。在這種類型的療法中，先施用生物素化的抗體，然后施加親和素，從而為后來真正使用的抗癌劑構(gòu)建“人造受體”。在這種情況下，抗癌劑將通過生物素進行投遞，生物素將被包含在適于與抗癌劑形成復(fù)合物的化學(xué)化合物(在下文中被稱為生物素化合物)中，在手術(shù)后階段全身施用。事實上，生物素將只定位于存在親和素的部位，在此情況下我們可確保親和素存在于我們預(yù)期治療的區(qū)域，因為它是在手術(shù)期間早數(shù)小時(如4至72小時)由外科醫(yī)生導(dǎo)入的。
它的優(yōu)勢在于大大減少了切除原發(fā)瘤和輔助治療之間所耽誤的時間。
至于本發(fā)明的工業(yè)用途方面，依照制藥學(xué)領(lǐng)域的標準操作，本文所述的抗體適于制備藥用組合物或者治療或診斷試劑盒。
藥用組合物和試劑盒完全是本領(lǐng)域傳統(tǒng)的類型，而且本領(lǐng)域?qū)＜抑换谄胀ǖ闹R即可制備。藥用組合物的例子參閱本發(fā)明所引用的文獻。有關(guān)試劑盒的情況也是如此。尤其優(yōu)選的是用于腫瘤放射免疫療法的試劑盒，如上述文獻所述的研究中Paganelli等、專利EP 0496 074、WO 02/066075、WO03/072608和WO 03/075960。放射免疫治療試劑盒的具體使用可利用文獻WO 03/069632中所述的裝置進行。
含有所述抗體或其衍生物或片段(可選地生物素化)并與至少一種藥用可接受賦形劑或載體混合的藥用組合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的某一具體實施方案中，試劑盒是供全身放射免疫治療用的，尤其是三步預(yù)靶向放射免疫療法，其中包含5個小瓶，其中小瓶1含有可選地生物素化的抗體或其片段或重組衍生物或其綴合物或類似物；小瓶2中含有親和素；小瓶3中含有鏈霉親和素；小瓶4中含有生物素化人白蛋白；以及小瓶5中含有生物素DOTA。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所說試劑盒是供局部放射免疫治療用的，并且包含3個小瓶，它們相當于全身用試劑盒的小瓶1、2和5。
在某一特別優(yōu)選的實施方案中，在含生物素DOTA的小瓶中，所述的生物素DOTA是化學(xué)式(I)的化合物
其中Q是-(CH2)n-基團，其中n是4-12的整數(shù)，這種情況下R’不存在；或者Q選自-(CH2)a-CH(R′)b-(CH2)b-，其中a和b獨立地是從0至n的整數(shù)，R′如下文所定義；或者Q是環(huán)已基、苯基，在此情況下R′是環(huán)己基或苯基環(huán)上的取代基團；R是氫或者-Λ，其中-Λ是式(II)的大環(huán)， 其中的各個Y可能是相同或不同的，并選自氫基、直鏈或支鏈C1-C4烷基、-(CH2)m-COOH，其中m是從1到3的整數(shù)，X是氫或基團-CH2-U，其中U選自甲基、乙基和對氨基苯基，或者X是基團-(CHW)o-Z，其中o是從1到5的整數(shù)，W是氫、甲基或乙基，Z是5-或6元雜環(huán)基團，其中包含一個或多個選自O(shè)、N-R1(其中R1是氫或者直鏈或支鏈C1-C4烷基)和S的雜原子；或者Z選自基團-NH2、-NH-C(＝NH)-NH2或-S-R2，其中R2是直鏈或支鏈C1-C4烷基；p數(shù)字2或3；R′選自氫、直鏈或支鏈C1-C4烷基、-(CH2)q-T，其中T選自-S-CH3、-OH、-COOH，而q是數(shù)字1或2；R″具有與R′相同的意義，條件如下如果R是-Λ，則R″是氫；如果R是氫，則R″是-Λ，或者R和R″分別是-(CH2)r-Λ(對于R)，其中r是4至12的整數(shù)，和-Λ(對于R′)，Q是-(CH2)n-基團，其中n是從4至12的整數(shù)。
這些化合物可參閱專利文獻WO 02/066075。
在特別優(yōu)選的實施方案中，在含有親和素的小瓶內(nèi)，所述親和素是其中兩分子親和素通過-NH2基團以辛二酸鹽的形式結(jié)合的親和素二聚體，或者是其中兩分子親和素通過-COOH基團借助分子量為3,400的聚乙二醇相結(jié)合的親和素二聚體，可參閱WO 03/075960。
在依照本發(fā)明的試劑盒中，可選地生物素化的抗體、其蛋白水解片段、其衍生物可與其它抗腱生蛋白抗體、優(yōu)選靶向于該蛋白質(zhì)的類EGF區(qū)的抗體聯(lián)合，或者與其它腫瘤特異性抗體聯(lián)合。
除了用于治療表達腱生蛋白的腫瘤之外，本發(fā)明的所有方面還可用于腫瘤診斷，尤其是腫瘤免疫定位，例如，成像。
本發(fā)明的另一目標是容器，優(yōu)選處于適于注射的小瓶形式，其中包含抗體或其蛋白水解片段或其衍生物，它們可選地是被生物素化和/或放射性標記的。
在本發(fā)明的另一方面，在夾心法體外ELISA檢測中，所述抗體或其片段、重組衍生物或類似物與第二種腱生蛋白特異性抗體聯(lián)合使用，使用條件是其中所述的第二種抗體結(jié)合腱生蛋白上的第二個抗原性表位，其目的是測定循環(huán)的腱生蛋白水平，尤其是含A(14)-D區(qū)域的異形體。
以下實施例對本發(fā)明進行了進一步的描述。
實施例1為了建立具有BC-2特異性、但不會產(chǎn)生非功能性輕鏈的新雜交瘤，用人腱生蛋白的A(14)-D片段免疫Balb/c小鼠，所述片段包含被BC-2所識別的表位(Siri，A.等，Nucl.AcidRes.，19(3)525-531，1991；Balza，E.等，F(xiàn)EBS，33239-43，1993)。人腱生蛋白C的示意圖和產(chǎn)生BC-2樣抗體所采用的策略參見圖1。
依照標準方法將用Tn(A(1-4)-D)片段免疫的小鼠的脾細胞與不產(chǎn)生免疫球蛋白Sp2/0-Agl4的骨髓瘤細胞融合(Cianfriglia，M.等，Methods Enzymol.，121193-210，1986)，用來自SK-Mel 28人黑素瘤細胞(ICLC HTL99010)的純化腱生蛋白通過ELISA測試對所獲得的雜交瘤群進行篩選。
將分泌抗腱生蛋白抗體的雜交瘤通過在含F(xiàn)CS的生長培養(yǎng)基中有限稀釋兩次，并在動物來源(無動物來源組分培養(yǎng)基HyClone，HyQRPerbio)的無蛋白培養(yǎng)基中稀釋兩次進行克隆。
ST2485參照物的產(chǎn)生是通過以下步驟完成的即在一個兩升的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)cST2485雜交瘤細胞；兩次連續(xù)的限制性稀釋亞克隆cST2485后生產(chǎn)細胞庫(Post Production Cell Bank，PPCB)，選擇到亞克隆cST2485/A3e/A12f，用于產(chǎn)生主細胞庫(Master Cell Bank，MCB)和工作細胞庫(Working Cell Bank，WCB)。
ST2485是IgG1/k亞型的小鼠免疫球蛋白。
圖2顯示了在還原和非還原條件下抗體ST2485的SDS-PAGE(a，b)和蛋白質(zhì)印跡(c，d)分析。在還原條件下(b，d)，在抗體的輕鏈水平處觀察到一條雙帶；蛋白質(zhì)印跡分析證實這兩條帶具有如免疫球蛋白輕鏈一樣的免疫反應(yīng)性。
如圖3所示，抗體ST2485的羥磷灰石層析分析通過輕微不對稱的峰證實了抗體的輕度異質(zhì)性。另一方面，在同一分析中，抗體BC-2呈現(xiàn)出明顯的異質(zhì)圖譜，其中有三個明顯的峰，只有峰1相當于完整的功能性均一抗體。
為了確定抗體ST 2485的異質(zhì)性的種類，用酶PNGaseF(來自黃桿菌屬的肽-N-糖苷酶)消化上述后一種樣品的N-糖苷殘基。在制造商所指示的條件下，用Prozyme去糖基化作用試劑盒(目錄號GE51001)進行所述酶消化將大約8μg的ST2485和5mU的酶在10μl反應(yīng)混合液中37℃反應(yīng)過夜。在還原條件下將消化和未消化的抗體ST2485進行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠用考馬斯亮蘭染色。
正如圖4中所述的在還原條件下進行的SDS-PAGE分析顯示，消化造成了高分子量輕鏈條帶消失。此發(fā)現(xiàn)表明抗體ST2485的兩條輕鏈條帶相當于同一抗體的糖基化(高分子量)和非糖基化(低分子量)變體。免疫球蛋白DNA序列資料也證實了潛在的N-糖基化位點的存在(圖17)。
用已公布的cDNA擴增k輕鏈的可變區(qū)，所用引物是識別抗體恒定區(qū)的引物對(5′GGGAAGATGGATACA GTTGGTG(SEQ ID NO5)、5′CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG)(SEQ ID NO6)，參閱文獻M.Sassant等，Nucl.Ac.Res.(1994)22，1768-1769。
如圖5中呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)印跡分析所證明的，ST2485與腱生蛋白A(1-4)-D區(qū)的結(jié)合是特異性的。所述抗體結(jié)合人腱生蛋白和A(1-4)-D片段，但不結(jié)合同一蛋白質(zhì)的EGF-類片段，所述EGF-類片段包含被BC-4抗體所識別的表位。
如圖6中所述的兩種抗體之間的競爭性ELISA檢測所顯示的，抗體ST2485與人腱生蛋白在獨特的表位或者部分與BC-2共享的表位相結(jié)合。以預(yù)實驗中確定的濃度將生物素化抗體BC-2與濃度逐漸升高的非生物素化BC-2(曲線1)或ST2485(曲線2)分配到用抗原腱生蛋白C(a)或TnA(1-4)-D片段(b)致敏的平板上。然后加入HRP-鏈霉親和素及相關(guān)的呈色底物TMB，以檢測生物素化抗體的結(jié)合?？贵wST2485對BC-2與腱生蛋白C或TnA(1-4)-D片段的結(jié)合有40％的抑制作用。
如圖7所示，與BC-2相比較，通過ELISA檢測評估ST2485對腱生蛋白C和TnA(1-4)-D片段的免疫反應(yīng)性。將濃度逐漸升高的抗體ST2485和BC-2以及正常小鼠免疫球蛋白(nMIgG)分配于用腱生蛋白C(a)或TnA(1-4)-D片段(b)致敏的平板上，加入用堿性磷酸酶標記的抗小鼠二抗和相關(guān)的呈色底物(pNPP)，可以測定抗體的劑量-反應(yīng)曲線。達到1.0OD所必需的ST2485的量較BC-2的量而言，對于完整的腱生蛋白(a)大約少13倍，對于TnA(1-4)-D片段(b)大約少10倍。
通過BIAcore分析測定了抗體ST2485對腱生蛋白C和TnA(1-4)-D片段的親和力。對于腱生蛋白C，ST2485的KD1是9.77×10-10M(ka1＝6.02×105；kd1＝5.88×10-4)，而BC-2的KD1是2.54×10-7M(ka1＝9.85×103；kd1＝2.5×10-3)。對于TnA(1-4)-D片段，ST2485的KD1是9.72×10-10M(ka1＝3.28×105；kd1＝3.19×10-4)，而BC-2的KD1是7.39×10-8M(ka1＝2.68×104；kd1＝1.93×10-3)。
在生物素化之后保持免疫反應(yīng)性是抗體用于預(yù)定向的一個基本要求，因此通過ELISA和BIAcore檢測法比較了生物素化ST2485(每分子結(jié)合8.3分子生物素)和生物素化BC-2(每分子結(jié)合7.6分子生物素)的表現(xiàn)。參見圖8，將濃度逐漸升高的生物素化和未生物素化抗體ST2485和BC-2以及正常小鼠免疫球蛋白(nMIgG)分配于用腱生蛋白C(a)或TnA(1-4)-D片段(b)致敏的平板上，加入用堿性磷酸酶標記的抗小鼠二抗和相關(guān)的呈色底物(pNPP)，使得可能測定各個生物素化抗體相比較于其非生物素化抗體而言的劑量反應(yīng)曲線(剩余的免疫反應(yīng)性)。生物素化ST2485和BC-2對腱生蛋白C的剩余免疫反應(yīng)性分別等于76％和88％。對于TnA(1-4)-D片段，生物素化ST2485和BC-2的剩余免疫反應(yīng)性分別等于73％和83％。
生物素化抗體對完整腱生蛋白的BIAcore分析顯示生物素化ST2485的親和力KD1＝2.88×10-9M(ka1＝2.8×105；kd1＝8.07×10-4)，而生物素化BC-2的親和力KD1＝3.71×10-7M(ka1＝6.0×103；kd1＝2.23×10-3)。因此生物素化的ST2485保持了良好的免疫反應(yīng)性和親和力特征，所保持的對腱生蛋白的親和力比生物素化的BC-2高100倍。
對多種人腫瘤(乳癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌)進行的免疫組化研究顯示，ST2485在胞外基質(zhì)水平的定位與文獻所報道的有關(guān)BC-2的相似(Natali，PG等，Int.J.Cancer，47.811-16，1991)。這些研究還顯示了ST2485與小鼠腱生蛋白、包括那些表達于正常小鼠組織中的腱生蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)的能力，這也可參見圖9。將固定于福爾馬林中的LMM3腫瘤(小鼠乳癌)和正常小鼠腸道切片與10μg/ml的ST2485或正常的小鼠IgG1抗體(對照)一起保溫。在與生物素化抗小鼠二抗一起保溫后，加入呈色底物DAB(Vector)檢測與腱生蛋白結(jié)合的親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(Vectastain Elite ABC kit)。用Mayer′s蘇木精進行對比。LMM3和小鼠腸切片對于ST2485顯示出陽性，而對對照抗體則不顯示陽性。不可能進行與BC-2比較的這些試驗，因為該抗體不識別包埋于石蠟中的固定化組織切片。
ST2485識別小鼠腱生蛋白(包括正常組織所表達的那些)的能力增加了下文所述小鼠模型中抗體生物分布試驗中所獲得的結(jié)果的顯著性。
為了評估抗體定位于腫塊的能力，進行了生物素化125I-標記的ST2485和BC-2的生物分布的研究。依照圖10中所示意的流程，在已植入了表達腱生蛋白的人腫瘤的裸鼠中進行這些試驗。
對所述動物皮下接種溶于0.1ml無菌鹽水溶液的4×106個人結(jié)腸癌HT-29細胞。15天后，當腫瘤塊大小達到大約200mg后，五個動物一組接受靜脈內(nèi)施用125I-BC2、125I-ST2485或正常小鼠125I-免疫球蛋白(nMIg)，所有抗體均被生物素化(7-9個生物素/mol)且以5個不同的劑量注射0.2-0.5-1-2-5μg/小鼠，溶于100μl無菌PBS中。施用抗體5天后，將動物處死并取血液、脾、腎、肝和腫瘤樣品用于測定其中存在的放射性。在處死動物的24小時之前，對其靜脈內(nèi)施用溶于100μl無菌PBS中的親和素，劑量較抗體高100倍(追蹤)。
圖11和11a所顯示的結(jié)果表明，無論劑量多少(抗體的量表示為每克組織所注射劑量的百分數(shù)％ID/gr)，BC-2和ST2485都特異性地定位于腫瘤處。此外，在所有檢測的劑量上，ST2485均顯示出較BC-2更多的定位于腫瘤處，通常保持較高的腫瘤比非腫瘤的比率(圖12和12a)。具體而言，在1μg/小鼠的劑量上，ST2485在腫瘤內(nèi)的積累等于注射劑量的16％，而BC-2的積累不超過任一被檢測劑量的5％。
在1μg/小鼠的劑量上，對于ST2485而言，腫瘤血液的比率大于20(最佳劑量)，而對于抗體BC-2而言，在任何被檢測的劑量上此比率都從未超過6。在其它器官內(nèi)，對于ST2485而言，在劑量1μg/小鼠時，相對于脾、腎和肝，腫瘤比非腫瘤的比率分別是9、26和43。另一方面，對于BC-2，在所有被檢測的劑量處，這些比率通常都低于7。腫瘤比非腫瘤的比率參見圖12和12a。
為了評估在PAGRIT和IART方法中聯(lián)合使用抗腱生蛋白抗體ST2485和ST2146的可能性(ST2416針對的是該蛋白質(zhì)中類EGF區(qū)內(nèi)的表位(De Santis，R.等，Br.J.Cancer，88996-1003，2003，WO 03/072608))，用這兩種抗體進行了體外和體內(nèi)加和實驗。圖13是在用腱生蛋白C致敏的平板上進行的兩個ELISA測試，其結(jié)果顯示了抗體ST2485和ST2146之間無表位干擾(13a)以及它們與抗原結(jié)合的加和特性(13b)。為了評估干擾作用(a)，在缺乏(1)和存在(2)飽和濃度ST2146的條件下，將濃度逐漸升高的生物素化抗體ST2485分配于用腱生蛋白C致敏的微量滴定板上疊加曲線1和2表明兩抗體之間無表位干擾，因為生物素化ST2485與腱生蛋白的結(jié)合不受ST2146存在的影響(反之亦然；數(shù)據(jù)未顯示)。曲線3顯示的是在非生物素化飽和ST2485(對照)存在條件下接種生物素化ST2485獲得的信號。
圖13b顯示了加和性測試結(jié)果，其中飽和劑量的生物素化抗體ST2485和ST2146被分開或一起分配于用腱生蛋白C致敏的微量滴定板上兩種抗體的混合物產(chǎn)生的信號等于所述信號的總和，因此證明了這兩種抗體的結(jié)合是有加和性的。
此外，還用BIACore分析檢測了兩種抗體的體外加和性，結(jié)果如圖14和14a所示。依照文獻(De SantisR.等；Br.J.Cancer，88996-1003，2003)所述方法將腱生蛋白固定在芯片(CM5感受器芯片，Biosense)上。連續(xù)兩次注射飽和濃度(10M)的第一種抗體(a中是ST2485，c中是ST2146)，然后注射第二種抗腱生蛋白抗體(a中是ST2146；c中是ST2485)。感受圖譜a)和c)顯示這兩種抗體能以加和方式結(jié)合各自的表位，如各個單獨抗體所產(chǎn)生的共振信號增加所顯示的。感受圖譜b)和d)表示了分別注射ST2485和ST2146，隨后注射各自的同種型對照抗體mIgG2b和mIgG1的結(jié)果。
此外，還在前述動物模型中進行了兩種抗體ST2485和ST2146的體內(nèi)加和性研究。實驗方案如圖15中所示，而獲得的結(jié)果如圖16所示，以每克腫瘤中的抗體ng數(shù)表示。數(shù)據(jù)證明了所述的兩種抗體在動物模型中也存在加和性。事實上，兩種標記抗體的混合物在腫瘤中的積累是理論值(兩種單獨標記抗體的數(shù)學(xué)總和)的93％。用放射性標記抗體和第二種“冷”抗體的混合物處理對照動物組，以避免任何的干擾。
用已公布的cDNA擴增k輕鏈的可變區(qū)，所用引物是識別抗體輕鏈恒定區(qū)的引物對(5′GGGAAGATGGATACA GTTGGTG(SEQ ID NO5)、5′CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG)(SEQ ID NO6)，參閱文獻M.Sassant等，Nucl.Ac.Res.(1994)22，1768-1769。
用已公布的cDNA擴增γ重鏈的可變區(qū)，所用引物是識別抗體重鏈恒定區(qū)的引物對5′ATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAG 3′(SEQ ID NO7)、5′GCACAACCACCATACTGAGAAG 3′)(SEQ ID NO8)，參閱文獻M.Sassant等，Nucl.Ac.Res.(1994)22，1768-1769。
圖17顯示了ST2485輕鏈可變區(qū)(VL)的序列SEQ ID NO1。
圖18顯示了ST2485重鏈可變區(qū)(VH)的序列SEQ ID NO2。
與BC-2相比較的ST2485的有關(guān)比較性試驗表明抗體ST2485具有以下特征-識別人腱生蛋白A(1-4)-D區(qū)域內(nèi)的表位，其與BC-2的表位接近或部分重疊；-就其輕鏈和重鏈的組成而言，它是均一的抗體，因為所觀察到的異質(zhì)性是由于輕鏈糖基化變體所造成的；-它比BC-2具有更強的免疫反應(yīng)性；-它比BC-2具有更高的對抗原的親和力；-至于生物素化之后免疫反應(yīng)性的維持，它與BC-2相當；-在動物模型內(nèi)腫瘤定位方面，它比BC-2優(yōu)越；-在體外和體內(nèi)動物模型中，它都與抗腱生蛋白單克隆抗體ST2146以加和方式結(jié)合腱生蛋白C。
文獻Balza E.，Siri A.，Ponassi M.，Caocci F.，Linnala A.，Virtanen I.，ZardiL.Production and characterization of monoclonal antibodies specific fordifferent epitopes of human tenascin.FEBS，33239-43，1993.
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<221>CDS<222>(1)..(393)<400>1atg gat ttt caa gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt gct tca48Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc96Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc aac144Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Asn35 40 45tca agt gta cgt ttc atg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc192Ser Ser Val Arg Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct240Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tat tct gtc aca atc288Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Val Thr Ile85 90 95agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg336Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110agt agt aat tca ccc agg acg ttc ggt gga ggc acc aag gtg gaa atc384Ser Ser Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile115 120 125aga cgg gct393Arg Arg Ala
130<210>2<211>414<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(1)..(414)<400>2atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15gtc cac tct gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag96Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30cct gga gct tca atg aag att tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc144Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe35 40 45act ggc tac acc atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag aac ctt192Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu50 55 60gaa tgg att gga ctt att aat cct cac aat ggt ggt act acc tac aac240Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn65 70 75 80cag aag ttc aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc aac288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn85 90 95aca gcc tac atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tat tac tgt aca aga ccc ggg ggt tac tac tgg ttc ttc gat gtc tgg384Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Gly Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp115 120 125ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca414Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135<210>3<211>131<212>PRT<213>Mus musculus<400>3Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Asn35 40 45
Ser Ser Val Arg Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Val Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Ser Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile115 120 125Arg Arg Ala130<210>4<211>138<212>PRT<213>Mus musculus<400>4Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe35 40 45Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Gly Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp115 120 125Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5gggaagatgg atacagttgg tg 22
<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6caagagcttc aacaggaatg ag 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7atggagttag tttgggcagc ag 22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8gcacaaccac catactgaga ag 2權(quán)利要求
1.抗人腱生蛋白單克隆抗體，優(yōu)選小鼠的，其輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，它的能結(jié)合人腱生蛋白A(1-4)-D區(qū)域內(nèi)的抗原性表位的蛋白水解片段，它的重組衍生物、綴合物和能結(jié)合人腱生蛋白A(1-4)-D區(qū)域內(nèi)的抗原性表位的類似功能性類似物。
2.依照權(quán)利要求1的抗體片段，其可選地包含另外的標記物和診斷劑。
3.依照權(quán)利要求1的抗體的重組衍生物，其中的小鼠恒定區(qū)被它的人對應(yīng)物取代。
4.依照權(quán)利要求1的抗體的重組衍生物，其中的小鼠恒定區(qū)被生物學(xué)活性組分所取代。
5.依照權(quán)利要求1的抗體的重組衍生物，其中的小鼠恒定區(qū)被藥用活性組分所取代。
6.依照權(quán)利要求1的抗體的重組衍生物，其中的小鼠恒定區(qū)被親和素家族成員所取代。
7.權(quán)利要求1所述的抗體的衍生物，它與生物學(xué)活性物質(zhì)相綴合。
8.依照權(quán)利要求1的生物素化抗體或依照權(quán)利要求2的生物素化片段，或依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物。
9.編碼權(quán)利要求1的抗體或權(quán)利要求2的片段的DNA。
10.含有權(quán)利要求9的DNA的載體。
11.含有權(quán)利要求10的載體的宿主細胞。
12.由核苷酸序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2編碼的蛋白質(zhì)或其片段。
13.編碼權(quán)利要求12的蛋白質(zhì)或其片段的DNA。
14.依照權(quán)利要求1的抗體的特異CDR(互補決定區(qū))和含有所述CDR的蛋白質(zhì)。
15.產(chǎn)生權(quán)利要求1的抗體的雜交瘤，其依照布達佩斯條約的規(guī)定于2003年11月12日保存于Centro di Biotecnologie Avanzate，LargoRossana Benzi 10，Genoa-Italy，保藏號為PD03003。
16.用于制備權(quán)利要求1的抗體的方法，包括a)用人腱生蛋白的A(1-4)-D片段免疫動物；b)將所述動物的體脾細胞與不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞融合；c)選擇單克隆抗體。
17.可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物，或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述的片段，或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物在制備用于治療或診斷以腱生蛋白的表達為特征的疾病的藥物產(chǎn)品中的用途。
18.依照權(quán)利要求17的用途，其中所述的疾病是腫瘤。
19.依照權(quán)利要求18的用途，其中所述的腫瘤選自膠質(zhì)瘤、乳癌、肺癌、纖維肉瘤和鱗狀細胞癌。
20.可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物，或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述片段，或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物在制備用于實體腫瘤的兩階段手術(shù)期間治療的藥物產(chǎn)品中的用途。
21.含有可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者可選地生物素化的權(quán)利要求2的片段、或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物并與至少一種藥用可接受載體和/或賦形劑相混合的藥物或診斷組合物。
22.用于全身放射免疫療法、尤其是三步預(yù)定向放射免疫療法的試劑盒，其由5個小瓶組成小瓶1包含可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述片段、或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物；小瓶2含有親和素；小瓶3含有鏈霉親和素；小瓶4含有生物素化人白蛋白；小瓶5含有生物素DOTA。
23.用于局部放射免疫療法的試劑盒，其包括3個小瓶；小瓶1含有可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述片段、或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物；小瓶2含有親和素；小瓶3含有生物素DOTA。
24.依照權(quán)利要求22或23的試劑盒，其中分別在小瓶5或小瓶3中的生物素DOTA是化學(xué)式(I)的化合物 其中Q是-(CH2)n-基團，其中n是4-12的整數(shù)，這種情況下R’不存在；或者Q選自-(CH2)a-CH(R′)b-(CH2)b-，其中a和b獨立地是從0至n的整數(shù)，R′如下文所定義；或者Q是環(huán)己基、苯基，在此情況下R′是環(huán)己基或苯基環(huán)上的取代基；R是氫或者-Λ，其中-Λ是式(II)的大環(huán)， 其中的各個Y可能是相同或不同的，選自氫、直鏈或支鏈C1-C4烷基、-(CH2)m-COOH，其中m是從1到3的整數(shù)，X是氫或基團-CH2-U，其中U選自甲基、乙基和對氨基苯基，或者X是基團-(CHW)o-Z，其中o是從1到5的整數(shù)，W是氫、甲基或乙基，Z是5-或6-元雜環(huán)基團，其中包含一個或多個選自O(shè)、N-R1(其中R1是氫或者直鏈或支鏈C1-C4烷基)和S的雜原子；或者Z選自基團-NH2、-NH-C(＝NH)-NH2或-S-R2，其中R2是直鏈或支鏈C1-C4烷基；p是數(shù)字2或3；R′選自氫、直鏈或支鏈C1-C4烷基、-(CH2)q-T，其中T選自-S-CH3、-OH、-COOH，而q是數(shù)字1或2；R″具有與R′相同的意義，條件如下如果R是-Λ，則R″是氫；如果R是氫，則R″是-Λ，或者R和R″分別是-(CH2)r-Λ(對于R，其中r是4至12的整數(shù))和-Λ(對于R′)；Q是-(CH2)n-基團，其中n是從4至12的整數(shù)。
25.依照權(quán)利要求22-24中任一項的試劑盒，其中的小瓶3包含親和素二聚體，其中兩個親和素分子通過-NH2基團以辛二酸鹽(酯)的方式結(jié)合。
26.依照權(quán)利要求22-24中任一項的試劑盒，其中的小瓶3包含親和素二聚體，其中兩個親和素分子通過-COOH基團借助分子量為3,400的聚乙二醇結(jié)合。
27.依照權(quán)利要求22或23的試劑盒，其中可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述片段、或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物與其它抗腱生蛋白抗體組合，優(yōu)選所述其它抗體靶向于該蛋白質(zhì)的類EGF區(qū)域。
28.依照權(quán)利要求22或23的試劑盒，其中可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述片段、或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物與其它腫瘤特異性抗體組合。
29.可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述片段、或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物在制備用于腫瘤免疫定位法中的組合物中的用途。
30.一種適于注射的容器，優(yōu)選地處于小瓶的形式，其中含有可選地生物素化和/或放射性標記的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述片段、或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物。
31.腫瘤成像方法，包括對腫瘤患者或疑似腫瘤患者施用可選地生物素化的權(quán)利要求1所述抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者可選地生物素化的權(quán)利要求2所述片段、或者依照權(quán)利要求4-7的生物素化衍生物，并檢測所說的腫瘤。
32.依照權(quán)利要求31的方法，其中所述抗體或其蛋白水解片段或重組衍生物或綴合物或類似物是放射性標記的。
33.含有依照權(quán)利要求1的抗體或其蛋白水解片段或其重組衍生物或其綴合物或類似物、或者依照權(quán)利要求2的片段、或者依照權(quán)利要求4-7的衍生物以及第二種腱生蛋白特異性抗體的聯(lián)合。
34.依照權(quán)利要求33的聯(lián)合在體外夾心ELISA檢測中的應(yīng)用，條件是其中所說的第二種抗體與第二個抗原性表位結(jié)合，從而測定循環(huán)的腱生蛋白水平，尤其是含A(1-4)-D區(qū)域的同工型的水平。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種抗人腱生蛋白單克隆抗體，其輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體的能結(jié)合人腱生蛋白A
文檔編號C07K16/30GK1946740SQ200580006132
公開日2007年4月11日 申請日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者R·德圣蒂斯, A·佩利恰, G·帕隆博, P·卡爾米納蒂 申請人:泰克諾根公司