一種抗HSV的糖蛋白gD的單克隆抗體以及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雜交瘤細(xì)胞，于2016年1月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：CCTCC NO:C201620。本發(fā)明還公開了一種抗HSV的糖蛋白gD的單克隆抗體，其包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的重鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)CDR1和CDR2序列，以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的輕鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)CDR1和CDR2序列。所述單克隆抗體可用于診斷和治療HSV感染或與HSV感染相關(guān)的疾病。本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)HSV或其感染的細(xì)胞的方法，包括：使所述HSV或其感染的細(xì)胞與上述單克隆抗體接觸，洗去未與所述HSV或其感染的細(xì)胞結(jié)合的單克隆抗體，然后顯示與所述HSV或其感染的細(xì)胞結(jié)合的單克隆抗體。本發(fā)明還公開了一種中和HSV的方法，包括：使所述HSV與權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體接觸。CCTCC NO: C20162020160127
【專利說明】
-種抗HSV的糖蛋白g叫勺單克隆抗體從及產(chǎn)生該抗體的雜交 瘤細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及抗體領(lǐng)域，更特別地設(shè)及一種抗HSV的糖蛋白曲的單克隆抗體，W及用 于產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘤疹病毒包括一大類的雙鏈脫氧核糖核酸病毒。通常已知的兩種病毒是單純性瘤 疹病毒1型和2型，稱為HSV巧日服V2及水痘-帶狀瘤疹病毒(VZV)。服Vl引起口面病痕，通常被 稱為發(fā)熱性瘤疹或感冒瘡。另外，有約30 %的病例生殖器瘤疹由HSVl引起。HSV2比HSVl不常 見，其引起生殖器損害。
[0003] 目前HSV檢測(cè)方法很多，有病毒培養(yǎng)分離法、HSV病毒抗原檢測(cè)法、抗體法、PCR法。 病毒培養(yǎng)分離法，是HSV檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)，將病毒接種于細(xì)胞進(jìn)行增殖，進(jìn)而分離鑒定毒 株型別。但此法周期長，要求嚴(yán)格，成本昂貴，操作繁瑣，適用于科學(xué)研究，不適于臨床常規(guī) 檢測(cè)。HSV病毒抗原檢測(cè)法，臨床大多采用酶聯(lián)免疫吸附法巧LISA)用于皮膚破損處HSV抗原 檢測(cè)。HSV病毒感染典型者，臨床會(huì)出現(xiàn)潰瘍、水瘤脈瘤等，用棉簽薩取破潰處作標(biāo)本，用雙 抗體夾屯、法檢測(cè)抗原。此方法敏感性、特異性較強(qiáng)，適合檢測(cè)臨床表現(xiàn)典型者。此外解育溫 度，標(biāo)本質(zhì)量和人為操作因素會(huì)導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)?？贵w法，使用多膚或重組表達(dá)病毒蛋白 組分作為抗原有較好的特異性和抗原性，利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)SV的IgG進(jìn)行分型 檢測(cè)，是臨床上常用的檢測(cè)手段。PCR法，其中FQ-PCR法應(yīng)用了巧光探針技術(shù)，具有高靈敏度 和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，也可作為臨床常用的檢測(cè)手段。
[0004] 盡管臨床上有抗病毒化學(xué)藥物治療法，但是HSV病毒感染仍然是嚴(yán)重威脅人類健 康的全球性難題。隨著免疫缺陷病人耐藥性的日益增長，使得探索新的有效的治療方法顯 得極為迫切。
[0005] 本發(fā)明篩選的一株能夠分泌針對(duì)HSV曲的單克隆抗體的融合細(xì)胞株，其分泌的單 克隆抗體能夠特異的識(shí)別HSV-I和HSV-2病毒的曲蛋白，并且能夠有效的中和HSV-2病毒感 染細(xì)胞。本發(fā)明篩選的單克隆抗體能夠用于HSV病毒的診斷及其感染的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明公開了一種雜交瘤細(xì)胞株27E1，其于2016年1月27日保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中屯、（詳細(xì)地址為：湖北省武漢市八一路229號(hào)，武漢大學(xué)保藏中屯、），保藏號(hào)為： CCTCC NO:C201620。
[0007] 本發(fā)明還公開了一種由上述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗HSV的糖蛋白曲的單克隆抗體， 其包含沈Q ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的重鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)CDRl和CDR2序列，W及 SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的輕鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)CDRl和CDR2序列。
[000引進(jìn)一步地，所述的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)由SEQ ID N0:5所示的核酸序列編碼， 并且所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)有SEQ ID N0:6所示的核酸序列編碼。
[0009] 本發(fā)明公開的單克隆抗體可用于制備診斷HSV感染或與HSV感染相關(guān)的疾病的試 劑。
[0010] 本發(fā)明公開的單克隆抗體還可用于制備治療HSV感染或與HSV感染相關(guān)的疾病的 藥物。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)樣品中的HSV或其感染的細(xì)胞的方法，包括:使所述樣品 與如權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體接觸，洗去未結(jié)合的單克隆抗體，然后顯示與所述 HSV或其感染的細(xì)胞結(jié)合的單克隆抗體，與所述單克隆抗體結(jié)合的物質(zhì)或細(xì)胞即為HSV或其 感染的細(xì)胞。該檢測(cè)方法可用于實(shí)驗(yàn)室用途，或者可用于醫(yī)學(xué)用途。
[0012] 進(jìn)一步地，顯示與所述HSV或其感染的細(xì)胞結(jié)合的單克隆抗體可采取免疫化學(xué)染 色法或免疫巧光染色法來進(jìn)行。例如，可提取樣品中的總蛋白，在對(duì)總蛋白進(jìn)行SDS聚丙締 酷氨凝膠電泳后，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用本發(fā)明的單克隆抗體解育膜，然后針對(duì)本發(fā)明的單克隆 抗體的綴合了辣根過氧化物酶的二抗解育，再加入辣根過氧化物酶的底物進(jìn)行顯色來顯 示?；蛘咴谠撁庖哂≯E方法中，可使用除辣根過氧化物酶W外的其他分子標(biāo)記或巧光標(biāo)記。 也可直接將分子標(biāo)記或巧光標(biāo)記綴合于本發(fā)明的單克隆抗體上。除了使用免疫印跡外，也 可使用免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)(二者統(tǒng)稱免疫化學(xué)）W及免疫巧光的方法來實(shí)現(xiàn)本發(fā) 明。運(yùn)些方法在本領(lǐng)域中是公知的。
[001引本發(fā)明還公開了一種中和HSV的方法，包括:使所述HSV本發(fā)明所述的單克隆抗體 接觸。該中和方法可用于實(shí)驗(yàn)室用途，或者可用于醫(yī)學(xué)用途。
【附圖說明】
[0014] 圖1為PCR擴(kuò)增曲1編碼片段的電泳圖，其中泳道中所示的是編碼曲截短的胞外區(qū) (l-343aa)gDl蛋白的核酸片段；
[0015] 圖2為原核表達(dá)產(chǎn)物跑SDS-PAGE膠后的考馬斯亮藍(lán)染色圖，其中，泳道1為誘導(dǎo)后 的包涵體，泳道2為誘導(dǎo)后的上清，泳道3為誘導(dǎo)后的全菌液，泳道4為未誘導(dǎo)的菌液，泳道M 為1曰dder m曰rker;
[0016] 圖3為原核表達(dá)產(chǎn)物跑SDS-PAGE膠后通過western blot得到的電泳圖，其中，泳道 1為誘導(dǎo)后的包涵體，泳道4為未誘導(dǎo)的菌液圖，泳道M為ladder marker;
[0017]圖4為兩只免疫小鼠血清中抗體的檢測(cè)原核表達(dá)的曲蛋白和真核表達(dá)的曲蛋白 的Western blot圖，其中，圖的上半部分為將1#小鼠的眼眶血為一抗分別進(jìn)行1:1000、1: 10000 W及1:100000的比例稀釋后對(duì)原核表達(dá)的曲(泳道1、3、5) W及對(duì)真核表達(dá)的曲蛋白 (泳道2、4、6)進(jìn)行檢測(cè)。NC為未免疫小鼠血清對(duì)照(泳道7為原核表達(dá)的曲，泳道8為真核表 達(dá)的曲）；
[001引圖的下半部分為將2#小鼠的眼眶血為一抗分別進(jìn)行1:1000、1:10000 W及1: 100000的比例稀釋后對(duì)原核表達(dá)的曲（泳道9、11、13) W及對(duì)真核表達(dá)的神蛋白（泳道10、 12、14)進(jìn)行檢測(cè)。NC為未免疫小鼠血清對(duì)照(泳道15為原核表達(dá)的曲，泳道16為真核表達(dá)的 曲）；
[0019]圖5為兩只免疫小鼠血清中的抗體檢測(cè)表達(dá)有曲蛋白的sf9細(xì)胞的巧光圖，其中， 固定用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)曲的sf9細(xì)胞，將免疫小鼠的血清分別進(jìn)行1:300(第2 行）、1:900(第3行）、1:2700(第4行)的梯度稀釋作為一抗，陰性對(duì)照(第1行)為免疫小 鼠的免疫前血清，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG;
[0020]圖6為純化的抗體溶液跑SDS-PAGE膠后的考馬斯亮藍(lán)染色圖，其中，泳道1、2、3、4、 5、6分別為純化后抗體的洗脫液，圖中的條帶分別為純化單抗的重輕鏈；（抗體結(jié)合在純化 柱上后用2mL的洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液每20化L 一管，大約10管，1-6為10管中去掉前2管和 后2管后的6管，然后分別取一定量進(jìn)行電泳）；
[0021 ]圖7為標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度-A595值的相關(guān)性曲線圖；
[0022] 圖8為本發(fā)明的單克隆抗體檢測(cè)曲蛋白的Western blot圖，其中，a、b和C分別是W S巧細(xì)胞表達(dá)的曲蛋白（泳道1KHSV-1感染的Vero細(xì)胞中的曲蛋白（泳道2)W及HSV-2感染 的Vero細(xì)胞中的曲蛋白（泳道3)為抗原的Western blot圖，泳道為M為蛋白marker;
[0023] 圖9為本發(fā)明的單克隆抗體檢測(cè)感染了HSV的細(xì)胞的巧光圖，其中，第1列為重組 病毒vAcBac-gD2感染的Sf 9細(xì)胞，第2列為服V-2感染的Vero細(xì)胞；
[0024] 圖10為被本發(fā)明的單克隆抗體中和后的HSV-2感染的細(xì)胞的活力柱狀圖，其中1為 單克隆抗體27E1、2為小鼠免疫前血清（陰性對(duì)照）、3為免疫小鼠多克隆血清（陽性對(duì)照）。
【具體實(shí)施方式】
[0025] W下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0026] 實(shí)施例1.雜交瘤細(xì)胞的制備
[0027] 1.免疫原的制備從HSV-2感染的Vero細(xì)胞裂解液中提取病毒的核酸為模板，通過 PCR(所用引物序列：gDl-F: 5 ' -CCGGAATTCGCCACCATGGGGCGTTTGACCTCCG-3 ' gDl-R: 5 ' - CCCAAGCTTCTAGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGATGATCAGGCCC GGGTTG-3 '）擴(kuò)增得到編碼曲截短的 胞外區(qū)曲1蛋白的核酸片段（圖1)，用EcoRIMindin雙酶切，然后將其克隆至原核表達(dá)載體 pET-32a上，并命名為祀T-32a-曲1。通過酶切和測(cè)序鑒定正確后，W電穿孔的方式將pET- 32a-gDl轉(zhuǎn)入大腸桿菌化21中，IPTG(終濃度為lmM)37°C誘導(dǎo)4小時(shí)。通過考馬斯亮藍(lán)染色 (圖2)和western blot(圖3)檢測(cè)到曲1蛋白表達(dá)于包涵體中。
[0028] 2.小鼠免疫從包涵體中純化曲1蛋白，用弗式完全佐劑（Sigma公司）乳化，分別免 疫2只6-8周齡的BALB/c小鼠（購自中國科學(xué)院武漢病毒研究所）。腹部皮下注射每只小鼠6 點(diǎn)，劑量為60yg/只。每14天加強(qiáng)免疫一次，抗原使用弗氏完全佐劑(Sigma公司）乳化，劑量 為30yg/只。4次免疫后，眼眶取血，通過western blot和免疫巧光對(duì)2只免疫小鼠血清中抗 體的特異性及效價(jià)進(jìn)行初步評(píng)估。如圖4和5所示所示，所得到的抗體對(duì)在稀釋IO5倍后仍 然可用于western blot檢測(cè)，在稀釋2700倍后，仍然可用于免疫巧光檢測(cè)，并且保持對(duì)曲1 蛋白的特異性。
[0029] 3.制備雜交瘤細(xì)胞取上述2#免疫小鼠的脾臟細(xì)胞，制成無菌細(xì)胞懸液化anks液， 配方：化Cl 8.01;KC1 0.4;CaCl2 0.14;Na肥〇3 0.35;KH2P040.06;Glucose 0.34g/l)，與骨 髓瘤細(xì)胞SP2/0(中國科學(xué)院武漢病毒研究所）W5:1比例融合，15(K)巧m離屯、5min。棄上清后 離屯、管放入37°C水浴中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入ImL的Hyb;ri-Max?(Sigma公司），并攬動(dòng)細(xì)胞。 在溫水中靜置Imin后，加入IOmL無血清的DMEM(新縱科），混勻，100化pm離屯、5min。棄上清后 加入IOmL血清(GIBC0公司）小屯、的將細(xì)胞吹打起來，并加入5血混合10XHAT(Sigma公司）的 胸腺細(xì)胞，混勻。再加入25mL含有2.1 %硝基纖維素(Sigma公司）的半固體培養(yǎng)基充分混勻， 然后均勻的倒入20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞放入濕盒中，置于37 °C，5 % C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 融合7天后，在解剖鏡下挑選圓、實(shí)、大的克隆團(tuán)轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基的96孔板中，放入37 °C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后用化ISA的方法對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行多輪篩選，并結(jié)合Western bolt和免疫巧光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到細(xì)胞株27E1提交至中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC) 保藏，保藏號(hào)為:CCTCC N0:C201620。
[0030] 實(shí)施例2.用雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體
[0031] 腹水誘生法制備單克隆抗體將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗涂并懸起，取1 X 105，lmL的懸浮細(xì)胞腹腔注射事先用石蠟油致敏的小鼠。7天后開始收集腹水，取出的腹 水于4°C離屯、4000巧m IOmin。小屯、吸出中間的腹水收集于離屯、管中，4°C或-20°C保存。用 HiTrap rProte in A(GE公司）親和層析法從腹水中純化抗體。SDS-PAGE膠鑒定純度，如圖6 所示，所純化的抗體溶液純度很高，只有表示重鏈和輕鏈的兩條帶，基本沒有雜帶。 化a壯ord法測(cè)定濃度(表1)，純化的抗體保存于-20°C。根據(jù)表1中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、 對(duì)應(yīng)的A595值為縱坐標(biāo)做線性關(guān)系圖并得到線性方程為y = 1.204X+0.732(圖7)。將蛋白樣 品稀釋液的A595值代入該方程，計(jì)算出蛋白樣品的濃度為0.556mg/mL。
[0032] 表1:標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度W及樣品蛋白濃度與對(duì)應(yīng)的A595值
[0033]
[0034] 單克隆抗體亞類鑒定用IOOmL PBS(化Cl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HP〇4 I Ommo I/L，K出P〇4 2mmo I/L，PH7.4)稀釋包被羊抗鼠 I gG至0.5iig/mL，每孔加 100化，4 °C 過夜。 傾空液體，用含0.05 %Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200化封閉液(含2 %BSA和3 %薦 糖的PBS)，37°C解育化。傾空液體用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1 mL雜交瘤上清，37°C解育 化。傾空液體用PBS-T清洗3次。用封閉液1:1000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠（包含IgMJgGU IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3)抗體（新縱科病毒疾病工程技術(shù)有限公司，湖北），每孔加入 0.1血，37 °C解育化。傾空液體用PBS-T清洗3次。每孔加入50化含0.15 % ABTS和003 %出化的 巧樣酸緩沖液進(jìn)行顯色反應(yīng)，10-20min內(nèi)測(cè)定405nm波長下的OD值。結(jié)果顯示讀2):本發(fā)明 單克隆抗體為IgG2a型鼠源單克隆抗體。表2純化的單克隆抗體的亞型鑒定
[00351
[UWW 單克陰抗體nj雙區(qū)斤列測(cè)足乂用'I'Kizoi試刑提取細(xì)胞巧27E1的總KM。巧脫5' 化11 RACE Kit使用說明書中描述的步驟，經(jīng)過adaptor連接、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA和outer PCR 反應(yīng)，獲得抗體的輕重鏈可變區(qū)基因片段，將其克隆到T Easy載體上，進(jìn)行測(cè)序。outer PCR 反應(yīng)所用的上游引物為5'化11 RACE Kit中攜帶的5'-RACE Outer Primer,下游引物為：重 鏈 CH-R: CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT;輕鏈化-R: GGATACAGTTGGTGCAGCATC。 測(cè)序得到編碼該單克隆抗體的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO:5和編碼該單克隆抗體的輕鏈可 變區(qū)序列SEQ ID N0:6。將編碼序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列后，通過分析，其中重鏈可變區(qū)CDRl 和CDR2序列分別為SEQ ID NO:巧日SEQ ID NO: 2所示的序列，輕鏈可變區(qū)CDR巧日CDR2序列分 別為沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4所示的序列。
[0037] 實(shí)施例3.檢測(cè)服V
[0038] 單克隆抗體反應(yīng)特異性鑒定分別^巾4。8曰。-旨02感染的3巧細(xì)胞表達(dá)的曲2、^及用 HSV-I或HSV-2(中科院武漢病毒所菌毒種保藏中屯、)感染的Vero細(xì)胞作為抗原，用免疫印跡 法檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體識(shí)別曲蛋白的特異性。免疫印跡實(shí)驗(yàn)過程如下:分別將sf9細(xì)胞 表達(dá)的神2蛋白、W及HSV-l和HSV-2感染的Vero細(xì)胞樣品用5XSampleBuffer(250mM TrisHClpH6.8，lO%SDS，3O%Glycerol，5%0-mercapitalethanol，O.O2%bromophenol blue)裂解并充分煮沸后跑膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶4它封閉過夜，用TBST緩 沖液洗膜3次，每次5min。將膜浸入單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清(其中含有雜交瘤細(xì)胞分 泌的單抗27E1)中，37°C解育2.化，TBST洗膜3次，每次5min。用含有0.5 %脫脂牛奶的TBS 1: 5000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，加入到洗好的膜上，37°C解育化。TBST洗涂3次后，用過氧 化物底物（SuperSi即al West Pico Qiemiluminescent Subtrate ,Fementas) W及顯影系 統(tǒng)(MicroQiemi Bio-imaging system,DNR)觀察目標(biāo)蛋白。如圖8所示，單克隆細(xì)胞株27E1 能特異并靈敏的識(shí)別sf9細(xì)胞表達(dá)或服V-I、服V-2感染的Vero細(xì)胞中的曲蛋白。
[0039] 分別WvAcBac-gD2感染的sf9細(xì)胞表達(dá)的曲2、W及用HSV-2(中科院武漢病毒所菌 毒種保藏中屯、)感染的Vero細(xì)胞作為抗原，用免疫巧光法檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體識(shí)別天 然構(gòu)象曲蛋白的特異性。免疫巧光實(shí)驗(yàn)過程如下:將Sf9細(xì)胞和Vero細(xì)胞分別平鋪到96孔板 上，每孔約lX104個(gè)細(xì)胞。貼壁后，用重組病毒vAcBac-gD2感染Sf9細(xì)胞(將處于對(duì)數(shù)生長期 的Sf9細(xì)胞接種到小皿中，28°C貼壁培養(yǎng)過夜。次日用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染扣gAcBac-gD2。轉(zhuǎn) 染后第5-7天，細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE(細(xì)胞變圓、膨大）收集上清即獲得重組桿狀病毒vAcBac- 曲2。用5個(gè)MOI重組桿狀病毒vAcBac-gD2感染Sf 9單層細(xì)胞，4天后用4 %多聚甲醒固定細(xì)胞 樣品。），用HSV-2感染Vero細(xì)胞，感染后換2%胎牛血清(GIBC0公司）的DMEM培養(yǎng)基(GIBC0公 司），3化后，用4%多聚甲醒固定IOmina XPBS洗涂3次。用新配制的0.15%化iton-X 100透 化IOmin，1 X PBS洗涂3次，每次5min。用5 %的BSA封閉細(xì)胞，37 °C解育30min后，1 X PBS洗涂3 次，每次5min。一抗為單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清原液，37 °C解育化，1 XPBS洗涂3次，每 次5min。二抗用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(fluorescein isothiocyanate[FITC]-conjugated； Proteintech)按1:1000稀釋，37°C解育化，I X PBS洗涂3次，每次5min，用巧光顯微鏡觀察。 如圖9所示:27E1既能識(shí)別感染了重組病毒vAcBac-gD2的sf9細(xì)胞，也能識(shí)別感染了服V-2病 毒感染的Vero細(xì)胞。
[0040] 實(shí)施例4.體外中和服V
[0041 ] 用Cell Counting Kit(CCK-8/WST-8)試劑盒（碧云天)檢測(cè)單克隆融合細(xì)胞分泌 的抗體對(duì)HSV-2的中和活性。具體方法為:在96孔板中接種Vero細(xì)胞，每孔約5 X IO3個(gè)細(xì)胞， 將96孔板放在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。將0.1個(gè)MOI的HSV-2分別與單克隆雜交瘤 細(xì)胞培養(yǎng)基上清原液、免疫后鼠多克隆血清（陽性對(duì)照)或免疫前血清（陰性對(duì)照)于37°C解 育化，之后用解育液感染Vero細(xì)胞（lOOiil/孔）。感染后4她向每孔中加入IOiil CCK-8溶液。 將96孔板在37°C解育化，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度。結(jié)果如圖10所示:單克隆雜交瘤 細(xì)胞株27E1分泌的抗體有較強(qiáng)的中和活性。
[0042] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。



【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞于2016年1月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏號(hào)為：CCTCC N0:C201620。2. -種抗HSV的糖蛋白gD的單克隆抗體，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞 產(chǎn)生鼠抗人IgG2亞類的抗體，包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示的重鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定 區(qū)CDRl和CDR2序列，以及SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的輕鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)CDRl和 CDR2序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)由 SEQ ID N0:5所示的核酸序列編碼，并且所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)有SEQ ID N0:6所示 的核酸序列編碼。4. 一種如權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，用于制備診斷HSV感染 或與HSV感染相關(guān)的疾病的試劑。5. -種如權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，用于制備治療HSV感染 或與HSV感染相關(guān)的疾病的藥物。6. -種檢測(cè)樣品中的HSV或其感染的細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟:使所述 樣品與如權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體接觸，洗去未結(jié)合的單克隆抗體，然后顯示與所 述HSV或其感染的細(xì)胞結(jié)合的單克隆抗體，與所述單克隆抗體結(jié)合的物質(zhì)或細(xì)胞即為HSV或 其感染的細(xì)胞。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，顯示與所述HSV或其感染的細(xì)胞結(jié)合的單 克隆抗體采取免疫化學(xué)組織化學(xué)法、免疫細(xì)胞化學(xué)法、免疫印跡法或免疫熒光染色法來進(jìn) 行。8. -種中和HSV的方法，其特征在于，包括以下步驟:使所述HSV與如權(quán)利要求2或3所述 的單克隆抗體接觸。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK105925537SQ201610249934
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月21日
【發(fā)明人】張濤, 王華林, 徐浩, 王志英, 李軼, 鄧菲
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院武漢病毒研究所