本發(fā)明屬于腫瘤治療和分子免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種抗pdl-1抗體、其藥物組合物及其用途。具體地，本發(fā)明涉及一種抗pdl-1的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
：pd-1/pdl-1信號(hào)通路在調(diào)節(jié)免疫耐受、微生物感染及腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。pd-1(programmedcelldeath1，程序性細(xì)胞死亡因子1)的表達(dá)主要在t細(xì)胞等免疫細(xì)胞，而pd-1的配體pdl-1主要在許多人類腫瘤組織呈高表達(dá)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤等多種人類腫瘤組織中檢測(cè)到pdl-1蛋白的表達(dá)，且pdl-1的表達(dá)水平和患者的臨床及預(yù)后緊密相關(guān)。阻斷pd-1/pdl-1信號(hào)通路可使被抑制的t細(xì)胞激活，進(jìn)而攻擊癌細(xì)胞。阻斷pd-1/pdl-1信號(hào)可以促進(jìn)腫瘤抗原特異性t細(xì)胞的增殖，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，進(jìn)而抑制局部腫瘤生長(julieretal.,2012，nengljmed.366:2455–2465)；pdl-1單抗可上調(diào)浸潤cd8+t細(xì)胞ifn-γ的分泌，表明pd-1/pdl-1信號(hào)通路的阻斷在以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答為目的的腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用(blankcetal.,2006，int.j.cancer.119:317–327)。另外，pdl-1在體內(nèi)還可以與b7-1結(jié)合。已有研究表明pdl-1/b7-1復(fù)合物也是t細(xì)胞活化的負(fù)信號(hào)，二者的結(jié)合可以導(dǎo)致t細(xì)胞表面活化標(biāo)記物的表達(dá)下降，抑制t細(xì)胞增殖等。il-2(interlukin2，白細(xì)胞介素2)是由th細(xì)胞分泌的一種淋巴因子，具有廣泛的免疫活性：①刺激t細(xì)胞增殖分化；②刺激產(chǎn)生殺傷性t淋巴細(xì)胞；③刺激nk細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)nk活性；⑤刺激產(chǎn)生淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lak細(xì)胞)細(xì)胞，即淋巴細(xì)胞在il-2刺激下，經(jīng)3-6天體外培養(yǎng)可成為一種對(duì)新瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈殺傷作用的細(xì)胞，稱為lak細(xì)胞。ifn-γ(interferon-γ，干擾素-γ)由t細(xì)胞產(chǎn)生，具有直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，增加表面mhc抗原和腫瘤壞死因子表達(dá)，抗腫瘤血管生成等多種抗腫瘤作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ifn-γ可以通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的fas/fasl表達(dá)以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)fas所介導(dǎo)凋亡途徑的敏感性，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊的能力降低，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。目前，業(yè)界普遍認(rèn)為針對(duì)pdl-1通路的抗體將導(dǎo)致治療多種腫瘤治療的突破性的進(jìn)展：用于治療非小細(xì)胞性肺癌，腎細(xì)胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(hometm.b.,parisig.,etal.,anti-pd1therapyinmelanoma.seminoncol.2015jun；42(3):466-473)，白血病以及貧血病(heldsa,heinea,etal.,advancesinimmunotherapyofchronicmyeloidleukemiacml.currcancerdrugtargets.2013sep；13(7):768-74)。目前，尚需要開發(fā)新的具有更好的結(jié)合效率的抗pdl-1抗體，以有效地阻斷pd-1與pdl-1的結(jié)合，并且激活t淋巴細(xì)胞。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出重組的pdl-1作為抗原免疫小鼠，經(jīng)小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞。發(fā)明人通過進(jìn)行對(duì)大量樣本的篩選，得到了如下的雜交瘤細(xì)胞株：雜交瘤細(xì)胞株lt005，其于2015年8月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno:c2015133。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，雜交瘤細(xì)胞株lt005能夠分泌產(chǎn)生與pdl-1特異性結(jié)合的特異性單克隆抗體(命名為5c10)，并且該單克隆抗體能夠十分有效地阻斷pd-1與pdl-1的結(jié)合。另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了阻斷pd-1與pdl-1的結(jié)合的單克隆抗體5f10和9f6。進(jìn)一步地，本發(fā)明人創(chuàng)造性地制得了抗pdl-1的人源化抗體，分別命名為5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2。更進(jìn)一步地，本發(fā)明人創(chuàng)造性地對(duì)5c10h2l2的恒定區(qū)進(jìn)行了突變，得到5c10h2l2-igg1mt抗體，有效地降低了adcc(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)和/或cdc(complement-dependentcytotoxicity)。本發(fā)明人還驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗體特別是5c10、5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1、5c10h2l2、5f10、9f6和5c10h2l2-igg1mt均能有效地結(jié)合人t細(xì)胞，并且激活t細(xì)胞，誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞分泌ifn-γ和il-2；具有用于制備防治肺癌、黑色素瘤、腎腫瘤、卵巢癌、白血病等癌癥以及貧血病的藥物的潛力。由此提供了下述發(fā)明：本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為seqidno:15－17的cdr，和/或所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為seqidno:18－20的cdr；或者所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為seqidno:29－31的cdr，和/或所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr；或者所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為seqidno:35－37的cdr，和/或所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr。5c10、5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2這5個(gè)單抗的cdr的氨基酸序列相同：hcdr1：gfslsnyd(seqidno:15)hcdr2：iwtggat(seqidno:16)hcdr3：vrdsnyrydepfty(seqidno:17)lcdr1：qsigtn(seqidno:18)lcdr2：yas(seqidno:19)lcdr3：qqsnswpyt(seqidno:20)。5f10單抗的cdr的氨基酸序列如下：hcdr1:gfdikdty(seqidno:29)hcdr2:idpadgnt(seqidno:30)hcdr3:arglgawfas(seqidno:31)lcdr1:qditns(seqidno:32)lcdr2:yts(seqidno:33)lcdr3:qqghtlppt(seqidno:34)。9f6單抗的cdr的氨基酸序列如下：hcdr1:gfnikdty(seqidno:35)hcdr2:idpangnt(seqidno:36)hcdr3:srgppggigeyiyamdy(seqidno:37)lcdr1:ssvsssy(seqidno:38)lcdr2:sts(seqidno:39)lcdr3:hqyhrsppt(seqidno:40)。上述cdr可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)手段，例如通過vbase2數(shù)據(jù)庫根據(jù)imgt定義分析下面的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或者輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列得到。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列選自seqidno:2、seqidno:6和seqidno:10,和/或所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列選自seqidno:4、seqidno:8和seqidno:12；或者所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列選自seqidno:21,和/或所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列選自seqidno:23；或者所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列選自seqidno:25,和/或所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列選自seqidno:27。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的單克隆抗體，其選自如下的(1)至(7)：(1)重鏈可變區(qū)的氨基酸序如seqidno:2所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:4所示(5c10)；(2)重鏈可變區(qū)的氨基酸序如seqidno:6所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:8所示(5c10h1l1)；(3)重鏈可變區(qū)的氨基酸序如seqidno:10所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:12所示(5c10h2l2或5c10h2l2-igg1mt)；(4)重鏈可變區(qū)的氨基酸序如seqidno:6所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:12所示(5c10h1l2)；(5)重鏈可變區(qū)的氨基酸序如seqidno:10所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:8所示(5c10h2l1)；(6)重鏈可變區(qū)的氨基酸序如seqidno:21所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:23所示(5f10)；(7)重鏈可變區(qū)的氨基酸序如seqidno:25所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:27所示(9f6)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段選自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互補(bǔ)決定區(qū)片段、單鏈抗體(例如，scfv)、人源化抗體、嵌合抗體或雙抗體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的單克隆抗體以小于大約100nm，例如小于大約10nm、1nm、0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm、0.3nm、0.2nm、0.1nm或更小的ec50結(jié)合pdl-1蛋白；優(yōu)選地，所述ec50通過間接elisa方法測(cè)得。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的單克隆抗體包括非-cdr區(qū)，且所述非-cdr區(qū)來自不是鼠類的物種，例如來自人抗體；優(yōu)選地，所述單克隆抗體的恒定區(qū)選自人igg1、igg2、igg3或igg4的恒定區(qū)；優(yōu)選地，所述單克隆抗體的恒定區(qū)選自突變的人igg1恒定區(qū)，更優(yōu)選地，突變的人igg1恒定區(qū)為按照eu編號(hào)系統(tǒng)在234、235和237位點(diǎn)進(jìn)行如下的1種、2種或3種突變：l234a、l235a和g237a。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述單克隆抗體是有雜交瘤細(xì)胞株lt005產(chǎn)生的單克隆抗體，所述雜交瘤細(xì)胞株lt005保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno:c2015133。本發(fā)明的另一方面涉及一種分離的核酸分子a，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列，其中，所述抗體的重鏈可變區(qū)包含：氨基酸序列為seqidno:15－17的cdr；優(yōu)選地，所述抗體的重鏈具有seqidno:2、seqidno:6或seqidno:10所示的氨基酸序列；更優(yōu)選地，所述核酸分子具有seqidno:1、seqidno:5或seqidno:9所示的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的重鏈可變區(qū)包含：氨基酸序列為seqidno:29－31的cdr，優(yōu)選地，所述抗體的重鏈具有seqidno:21所示的氨基酸序列，更優(yōu)選地，所述核酸分子具有seqidno:22所示的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的重鏈可變區(qū)包含：氨基酸序列為seqidno:35－37的cdr，優(yōu)選地，所述抗體的重鏈具有seqidno:25所示的氨基酸序列，更優(yōu)選地，所述核酸分子具有seqidno:26所示的核苷酸序列。本發(fā)明的再一方面涉及分離的核酸分子b，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列，其中，所述抗體輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為seqidno:18－20的cdr；優(yōu)選地，所述抗體輕鏈可變區(qū)具有seqidno:4、seqidno:8或seqidno:12所示的氨基酸序列；更優(yōu)選地，所述核酸分子具有seqidno:3、seqidno:7或seqidno:11所示的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含：氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr，優(yōu)選地，所述抗體的輕鏈具有seqidno:23所示的氨基酸序列，更優(yōu)選地，所述核酸分子具有seqidno:24所示的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含：氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr，優(yōu)選地，所述抗體的輕鏈具有seqidno:27所示的氨基酸序列，更優(yōu)選地，所述核酸分子具有seqidno:28所示的核苷酸序列。本發(fā)明的再一方面涉及一種分離的核酸分子c，其包含前述的核酸分子a，以及前述的核酸分子；可選地，核酸分子c還包括連接序列，其用于連接核酸分子a和核酸分子b。本發(fā)明的再一方面涉及一種載體，其包含本發(fā)明的分離的核酸分子a、分離的核酸分子b或分離的核酸分子c。本發(fā)明的再一方面涉及一種宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的分離的核酸分子a、分離的核酸分子b或分離的核酸分子c，或者包含本發(fā)明的載體。關(guān)于上述的“分離的核酸分子a”“分離的核酸分子b”或“分離的核酸分子c”，其中字母a、b或c僅僅是為了描述清楚，或者用于區(qū)分，字母本身并不表示特別的含義。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以及從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的步驟。本發(fā)明的再一方面涉及雜交瘤細(xì)胞株lt005，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno:c2015133。本發(fā)明的再一方面涉及一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠競(jìng)爭結(jié)合雜交瘤細(xì)胞株lt005分泌的抗體或片段針對(duì)的抗原結(jié)合表位。優(yōu)選的，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有以下任一活性效果：阻斷pdl-1與pd-1或b7-1結(jié)合的藥物，調(diào)節(jié)(例如下調(diào))pdl-1活性或水平的藥物，解除pd-1或者pdl-1對(duì)機(jī)體免疫抑制的藥物，或者提高t淋巴細(xì)胞中ifn-γ和/或il-2表達(dá)的藥物。本發(fā)明的再一方面涉及一種偶聯(lián)物，其包括單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段以及偶聯(lián)部分，其中，所述單克隆抗體為本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述偶聯(lián)部分為可檢測(cè)的標(biāo)記；優(yōu)選地，所述偶聯(lián)部分為放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、有色物質(zhì)或酶。本發(fā)明的再一方面涉及一種試劑盒，其包括本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，或者包括本發(fā)明的偶聯(lián)物；優(yōu)選地，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識(shí)別所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；任選地，所述第二抗體還包括可檢測(cè)的標(biāo)記，例如放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、有色物質(zhì)或酶。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或者本發(fā)明的偶聯(lián)物在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測(cè)pdl-1在樣品中的存在或其水平。本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或者本發(fā)明的偶聯(lián)物；可選地，其還包括藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或者本發(fā)明的偶聯(lián)物在制備預(yù)防和/或治療和/或輔助治療和/或診斷腫瘤或者貧血病的藥物中的用途；優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、肺癌例如非小細(xì)胞性肺癌、肝癌、胃癌、腸癌例如結(jié)腸癌或直腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤和白血病。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或者本發(fā)明的偶聯(lián)物在制備如下藥物中的用途：阻斷pdl-1與pd-1或b7-1結(jié)合的藥物，調(diào)節(jié)(例如下調(diào))pdl-1活性或水平的藥物，解除pd-1或者pdl-1對(duì)機(jī)體免疫抑制的藥物，或者提高t淋巴細(xì)胞中ifn-γ和/或il-2表達(dá)的藥物。本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外方法，包括施加細(xì)胞以有效量的本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或者本發(fā)明的偶聯(lián)物的步驟，所述方法選自如下：阻斷pdl-1與pd-1或b7-1結(jié)合的方法，調(diào)節(jié)(例如下調(diào))pdl-1活性或水平的方法，解除pd-1或者pdl-1對(duì)機(jī)體免疫抑制的方法，或者提高t淋巴細(xì)胞中ifn-γ和/或il-2表達(dá)的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法是非治療目的的。本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預(yù)防腫瘤或者貧血病的方法，包括給予受試者有效量的本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或者本發(fā)明的偶聯(lián)物的步驟；優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、肺癌例如非小細(xì)胞性肺癌、肝癌、胃癌、腸癌例如結(jié)腸癌或直腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤和白血病。在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。如本文中所使用的，當(dāng)提及pdl-1蛋白(programmeddeath-ligand1,ncbigenbankid:np_054862.1)的氨基酸序列時(shí)，其包括pdl-1蛋白的全長，或者pdl-1的胞外片段pdl-1ecd或者包含pdl-1ecd的片段；還包括pdl-1ecd的融合蛋白，例如與小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)進(jìn)行融合的片段。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在pdl-1蛋白的氨基酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包括但不限于置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學(xué)功能。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“pdl-1蛋白”應(yīng)包括所有此類序列，包括所示的序列以及其天然或人工的變體。并且，當(dāng)描述pdl-1蛋白的序列片段時(shí)，其不僅包括的序列片段，還包括其天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。如本文中所使用的，術(shù)語ec50是指半最大效應(yīng)濃度(concentrationfor50％ofmaximaleffect)，是指能引起50％最大效應(yīng)的濃度。如本文中所使用的，術(shù)語“抗體”是指，是指通常由兩對(duì)多肽鏈(每對(duì)具有一條“輕”(l)鏈和一條“重”(h)鏈)組成的免疫球蛋白分子?？贵w輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為igm、igd、igg、iga和ige。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個(gè)氨基酸的“j”區(qū)連接，重鏈還包含大約3個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“d”區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch)組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2和ch3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)(vl)和輕鏈恒定區(qū)(cl)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域cl組成?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(c1q)的結(jié)合。vh和vl區(qū)還可被細(xì)分為具有高變性的區(qū)域(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr))，其間散布有較保守的稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的區(qū)域。各vh和vl由按下列順序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4從氨基末端至羧基末端排列的3個(gè)cdr和4個(gè)fr組成。各重鏈/輕鏈對(duì)的可變區(qū)(vh和vl)分別形成抗體結(jié)合部位。氨基酸至各區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定義。術(shù)語“抗體”不受任何特定的產(chǎn)生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亞型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗體。如本文中所使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”是指包含全長抗體的片段的多肽，其保持特異性結(jié)合全長抗體所結(jié)合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競(jìng)爭對(duì)抗原的特異性結(jié)合，其也被稱為“抗原結(jié)合部分”。通常參見，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的?？赏ㄟ^重組dna技術(shù)或通過完整抗體的酶促或化學(xué)斷裂產(chǎn)生抗體的抗原結(jié)合片段。在一些情況下，抗原結(jié)合片段包括fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)片段、單鏈抗體(例如，scfv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合能力的抗體的至少一部分。如本文中所使用的，術(shù)語“fd片段”意指由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語“fv片段”意指由抗體的單臂的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語“dab片段”意指由vh結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段(ward等人,nature341:544-546(1989))；術(shù)語“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語“f(ab')2片段”意指包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個(gè)fab片段的抗體片段。在一些情況下，抗體的抗原結(jié)合片段是單鏈抗體(例如，scfv)，其中vl和vh結(jié)構(gòu)域通過使其能夠產(chǎn)生為單個(gè)多肽鏈的連接體配對(duì)形成單價(jià)分子(參見，例如,bird等人,science242:423-426(1988)和huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988))。此類scfv分子可具有一般結(jié)構(gòu)：nh2-vl-接頭-vh-cooh或nh2-vh-接頭-vl-cooh。合適的現(xiàn)有技術(shù)接頭由重復(fù)的ggggs氨基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接頭，但也可使用其變體(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本發(fā)明的其他接頭由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情況下，抗體的抗原結(jié)合片段是雙抗體，即，雙價(jià)抗體，其中vh和vl結(jié)構(gòu)域在單個(gè)多肽鏈上表達(dá)，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并且產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合部位(參見，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:1121-1123(1994))。在另一些情況下，抗體的抗原結(jié)合片段是“雙特異性抗體”，指由第一抗體(片段)和第二抗體(片段)或抗體類似物通過偶聯(lián)臂所形成的偶聯(lián)物，偶聯(lián)的方式包括但不限于化學(xué)反應(yīng)、基因融合和酶促?？贵w的抗原結(jié)合片段可以是“多特異性抗體”包括例如：三特異性抗體和四特異性抗體，前者是具有三種不同抗原結(jié)合特異性的抗體，而后者是具有四種不同抗原結(jié)合特異性的抗體。例如，經(jīng)設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(darpin)，與igg抗體，scfv-fc抗體片段相連或其組合，如cn104341529a?？筰l-17a的fynomer與抗il-6r抗體結(jié)合，如wo2015141862a1。在另一些情況下，抗體的抗原結(jié)合片段是“雙功能抗體偶聯(lián)物”，指由第一抗體(片段)和或第二生物學(xué)功能片段(非抗體及其類似物)通過偶聯(lián)臂所形成的偶聯(lián)物，偶聯(lián)的方式包括但不限于化學(xué)反應(yīng)、基因融合和酶促，第二生物學(xué)功能片段包括具有結(jié)合活性多肽、蛋白、聚乙二醇(peg)，核素，核酸，小分子毒素，受體或配體等，該偶聯(lián)物保留了各自抗體的活性，故具有雙功能和雙特異性?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)(例如，重組dna技術(shù)或酶促或化學(xué)斷裂法)從給定的抗體(例如本發(fā)明提供的單克隆抗體5c10、5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2)獲得抗體的抗原結(jié)合片段(例如，上述抗體片段)，并且以與用于完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結(jié)合片段。在本文中，除非上下文明確指出，否則當(dāng)提及術(shù)語“抗體”時(shí)，其不僅包括完整抗體，而且包括抗體的抗原結(jié)合片段。如本文中所使用的，術(shù)語“單抗”和“單克隆抗體”是指，來自一群高度同源的抗體分子中的一個(gè)抗體或抗體的一個(gè)片斷，也即除可能自發(fā)出現(xiàn)的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對(duì)抗原上的單一表位具有高特異性。多克隆抗體是相對(duì)于單克隆抗體而言的，其通常包含至少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識(shí)別抗原上的不同表位。單克隆抗體通?？刹捎胟ohler等首次報(bào)道的雜交瘤技術(shù)獲得(nature,256:495,1975)，但也可采用重組dna技術(shù)獲得(如參見u.s.p4,816,567)。如本文中所使用的，術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一部分源自一個(gè)抗體(其可以源自某一特定物種或?qū)儆谀骋惶囟贵w類或亞類)，且輕鏈或/和重鏈的另一部分源自另一個(gè)抗體(其可以源自相同或不同的物種或?qū)儆谙嗤虿煌目贵w類或亞類)，但無論如何，其仍保留對(duì)目標(biāo)抗原的結(jié)合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。如本文中所使用的，術(shù)語“人源化抗體”是指，人源免疫球蛋白(受體抗體)的全部或部分cdr區(qū)被一非人源抗體(供體抗體)的cdr區(qū)替換后得到的抗體或抗體片段，其中的供體抗體可以是具有預(yù)期特異性、親和性或反應(yīng)性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗體。此外，受體抗體的構(gòu)架區(qū)(fr)的一些氨基酸殘基也可被相應(yīng)的非人源抗體的氨基酸殘基替換，或被其他抗體的氨基酸殘基替換，以進(jìn)一步完善或優(yōu)化抗體的性能。關(guān)于人源化抗體的更多詳細(xì)內(nèi)容，可參見例如，jonesetal.,nature,321:522525(1986)；reichmannetal.,nature,332:323329(1988)；presta,curr.op.struct.biol.,2:593596(1992)；和clark,immunol.today21:397402(2000)。人源化的方法根據(jù)目前常用的人源化方法中的一種或幾種的結(jié)合。例如采用下面所述的方法。人源化的方法可以采用cdr移植(cdrgrafting)的方法。本方法首先確定鼠源抗體的cdr區(qū)域，隨后將獲得的鼠源重鏈及輕鏈的6個(gè)cdr嫁接到與鼠源fr區(qū)具有較高相似度的人源模板上。人源模板的選擇可以是原始種系序列(germline)，如來源于imgt數(shù)據(jù)庫中的germline序列，也可以是成熟抗體的序列，如來源于genebank中的抗體序列。cdr移植完成的抗體可以采用回復(fù)突變的方法，即將個(gè)別人源模板氨基酸，回復(fù)突變回鼠源氨基酸以保證抗體親和力。人源化的方法可以采用sdr移植(sdrgrafting)的方法。本方法首先需要確定鼠源抗體的sdr區(qū)域。sdr區(qū)域的確定可以通過丙氨酸掃描(alaninescanning)的方法。隨后將獲得的鼠源sdr嫁接到與鼠源序列具有較高相似度的人源模板上。人源模板的選擇可以是原始種系序列(germline)，如來源于imgt數(shù)據(jù)庫中的germline序列，也可以是成熟抗體的序列，如來源于genebank中的抗體序列。cdr移植完成的抗體可以采用回復(fù)突變的方法，即將個(gè)別人源模板氨基酸，回復(fù)突變回鼠源氨基酸以保證抗體親和力。tamura,m.,d.e.milenic,m.iwahashi,e.padlan,j.schlom&s.v.kashmiri:structuralcorrelatesofananticarcinomaantibody:identificationofspecificitydeterminingresidues(sdrs)anddevelopmentofaminimallyimmunogenicantibodyvariantbyretentionofsdrsonly.j.immunol.,164,1432-41(2000)人源化的方法可以采用表面重排(resurfacing)的方法。本方法首先通過鼠源抗體計(jì)算機(jī)建?；蛘叩鞍捉Y(jié)晶的方法，獲得鼠源抗體模型，根據(jù)模型，確定可及表面的氨基酸，隨后將這些氨基酸突變?yōu)閷?duì)應(yīng)的人源氨基酸。人源氨基酸的選擇可以是相同位點(diǎn)上，人源抗體中占有較高比例的氨基酸。padlan,e.a.:apossibleprocedureforreducingtheimmunogenicityofantibodyvariabledomainswhilepreservingtheirligand-bindingproperties.mol.immunol.,28,489-98(1991)人源化的方法可以采用過人源化(superhumanization)的方法。本方法首先確定鼠源抗體的cdr區(qū)域，隨后選擇與鼠源6個(gè)cdr有較高相似度的人源序列作為模板，將6個(gè)鼠源cdr嫁接到選擇的模板上。人源模板的選擇可以是原始種系序列(germline)，如來源于imgt數(shù)據(jù)庫中的germline序列，也可以是成熟抗體的序列，如來源于genebank中的抗體序列。cdr移植完成的抗體可以采用回復(fù)突變的方法，即將個(gè)別人源模板氨基酸，回復(fù)突變回鼠源氨基酸以保證抗體親和力。tan,p.,d.a.mitchell,t.n.buss,m.a.holmes,c.anasetti&j.foote:"superhumanized"antibodies:reductionofimmunogenicpotentialbycomplementaritydeterminingregiongraftingwithhumangermlinesequences:applicationtoananti-cd28.j.immunol.,169,1119-25(2002)如本文中所使用的，術(shù)語“分離的”或“被分離的”指的是，從天然狀態(tài)下經(jīng)人工手段獲得的。如果自然界中出現(xiàn)某一種“分離”的物質(zhì)或成分，那么可能是其所處的天然環(huán)境發(fā)生了改變，或從天然環(huán)境下分離出該物質(zhì)，或二者情況均有發(fā)生。例如，某一活體動(dòng)物體內(nèi)天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態(tài)下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術(shù)語“分離的”或“被分離的”不排除混有人工或合成的物質(zhì)，也不排除存在不影響物質(zhì)活性的其它不純物質(zhì)。如本文中所使用的，術(shù)語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達(dá)時(shí)，載體稱為表達(dá)載體。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(yac)、細(xì)菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動(dòng)物病毒等?？捎米鬏d體的動(dòng)物病毒包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)。一種載體可以含有多種控制表達(dá)的元件，包括但不限于，啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。如本文中所使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指，可用于導(dǎo)入載體的細(xì)胞，其包括但不限于，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等的真菌細(xì)胞，如s2果蠅細(xì)胞或sf9等的昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，cho細(xì)胞，cos細(xì)胞，nso細(xì)胞，hela細(xì)胞，bhk細(xì)胞，hek293細(xì)胞或人細(xì)胞等的動(dòng)物細(xì)胞。如本文中使用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指，兩分子間的非隨機(jī)的結(jié)合反應(yīng)，如抗體和其所針對(duì)的抗原之間的反應(yīng)。在某些實(shí)施方式中，特異性結(jié)合某抗原的抗體(或?qū)δ晨乖哂刑禺愋缘目贵w)是指，抗體以小于大約10-5m，例如小于大約10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的親和力(kd)結(jié)合該抗原。如本文中所使用的，術(shù)語“kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)，其用于描述抗體與抗原之間的結(jié)合親和力。平衡解離常數(shù)越小，抗體-抗原結(jié)合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。通常，抗體(例如，本發(fā)明的單克隆抗體5c10、5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2)以小于大約10-5m，例如小于大約10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的解離平衡常數(shù)(kd)結(jié)合抗原(例如，pdl-1蛋白)，例如，如使用fortebio分子相互作用儀測(cè)定的。如本文中所使用的，術(shù)語“單克隆抗體”和“單抗”具有相同的含義且可互換使用；術(shù)語“多克隆抗體”和“多抗”具有相同的含義且可互換使用；術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”具有相同的含義且可互換使用。并且在本發(fā)明中，氨基酸通常用本領(lǐng)域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。如本文中所使用的，術(shù)語“雜交瘤”和“雜交瘤細(xì)胞株”可互換使用，并且當(dāng)提及術(shù)語“雜交瘤”和“雜交瘤細(xì)胞株”時(shí)，其還包括雜交瘤的亞克隆和后代細(xì)胞。例如，當(dāng)提及雜交瘤細(xì)胞株lt005時(shí)，其還指雜交瘤細(xì)胞株lt005的亞克隆和后代細(xì)胞。如本文中所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領(lǐng)域公知的(參見例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，ph調(diào)節(jié)劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如tween-80；離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑包括但不限于氯化鈉。如本文中所使用的，術(shù)語“佐劑”是指非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)其與抗原一起或預(yù)先遞送入機(jī)體時(shí)，其可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。佐劑有很多種，包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)、弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子等。弗氏佐劑是目前動(dòng)物試驗(yàn)中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑則在臨床實(shí)驗(yàn)中使用較多。如本文中所使用的，術(shù)語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預(yù)防疾病(例如腫瘤)有效量是指，足以預(yù)防，阻止，或延遲疾病(例如腫瘤)的發(fā)生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發(fā)癥的量。測(cè)定這樣的有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，對(duì)于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴(yán)重度、患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時(shí)施用的其他治療等等。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的單克隆抗體5c10能夠很好地特異性與pdl-1結(jié)合，并且能夠十分有效地阻斷pd-1與pdl-1的結(jié)合，特異地解除pdl-1對(duì)機(jī)體免疫抑制，激活t淋巴細(xì)胞。附圖說明圖1：pdl-1ecd-mfc融合蛋白的sds-page檢測(cè)結(jié)果。從左至右的4個(gè)泳道的樣品及其上樣量依次為：m：marker10μl；上樣層析柱樣品10μl；層析柱穿透10μl；層析柱洗脫10μl。圖2：pd-1-hfc融合蛋白的sds-page檢測(cè)結(jié)果。從左至右的2個(gè)泳道的樣品及其上樣量依次為：上樣層析柱樣品10μl；m：marker10μl。圖3：b7-1-hfc融合蛋白的sds-page檢測(cè)結(jié)果。從左至右的2個(gè)泳道的樣品及其上樣量依次為：上樣層析柱樣品10μl；m：marker10μl。圖4：5c10抗體的sds-page檢測(cè)結(jié)果。從左至右的4個(gè)泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體1μg；純化的上樣流穿液；非還原型蛋白電泳上樣緩沖液1μg。圖5：5c10的人源化抗體5c10h1l1的sds-page檢測(cè)結(jié)果。從左至右的4個(gè)泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；層析柱洗脫10μl；上樣層析柱穿透10μl；上樣層析柱樣品10μl。圖6：5c10的人源化抗體5c10h1l2的sds-page檢測(cè)結(jié)果。從左至右的4個(gè)泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；層析柱洗脫10μl；上樣層析柱穿透10μl；上樣層析柱樣品10μl。圖7：5c10的人源化抗體5c10h2l1的sds-page檢測(cè)結(jié)果。從左至右的4個(gè)泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；層析柱洗脫10μl；上樣層析柱穿透10μl；上樣層析柱樣品10μl。圖8：5c10的人源化抗體5c10h2l2的sds-page檢測(cè)結(jié)果。從左至右的4個(gè)泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；層析柱洗脫10μl；上樣層析柱穿透10μl；上樣層析柱樣品10μl。圖9：單抗5c10h2l2的動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)檢測(cè)結(jié)果。圖10：hplp的動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)檢測(cè)結(jié)果。圖11：pcab的動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)檢測(cè)結(jié)果。圖12：fortebio測(cè)定5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1結(jié)合。圖13：單抗5c10h1l1與293t細(xì)胞表面pdl-1的結(jié)合結(jié)果。圖14：單抗5c10h1l2與293t細(xì)胞表面pdl-1的結(jié)合結(jié)果。圖15：單抗5c10h2l1與293t細(xì)胞表面pdl-1的結(jié)合結(jié)果。圖16：單抗5c10h2l2與293t細(xì)胞表面pdl-1的結(jié)合結(jié)果。圖17：hplp與293t細(xì)胞表面pdl-1的結(jié)合結(jié)果。圖18：pcab與293t細(xì)胞表面pdl-1的結(jié)合結(jié)果。圖19：采用間接elisa方法分別測(cè)定5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1與人pdl-1的結(jié)合。圖20：采用間接elisa方法分別測(cè)定5c10h2l2、hplp與猴pdl-1的結(jié)合。圖21：5c10h2l2抗體與人pdl-1、人pd-l2以及鼠pdl-1的結(jié)合活性elisa檢測(cè)。圖22：5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1與pd-1競(jìng)爭elisa結(jié)果。圖23：5c10h2l2與b7-1競(jìng)爭elisa結(jié)果。圖24：5c10h2l2通過阻止pdl-1與pd-1的結(jié)合提高ifn-γ的分泌。圖25：5c10h2l2通過阻止pdl-1與pd-1的結(jié)合提高il-2的分泌。圖26a：5c10h2l2-igg1mt與fcγriiia的動(dòng)態(tài)親和力biacore檢測(cè)。圖26b：與fcγriiia的動(dòng)態(tài)親和力biacore檢測(cè)。圖27a：5c10h2l2-igg1mt與c1q的動(dòng)態(tài)親和力biacore檢測(cè)。圖27b：與c1q的動(dòng)態(tài)親和力biacore檢測(cè)。圖28：5c10h2l2-igg1mt對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞療效。關(guān)于生物材料保藏的說明：雜交瘤細(xì)胞株lt005，其于2015年8月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno:c2015133，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編：430072。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市場(chǎng)購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的balb/c小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。使用的t細(xì)胞來自中山康方生物醫(yī)藥有限公司。制備例1：融合蛋白pdl-1ecd-mfc的制備1.基因pdl-1ecd-mfc的合成對(duì)基因pdl-1的胞外片段pdl-1ecd(programmedcelldeath1ligand1,ncbigenbankid:np_054862.1)，在科技文獻(xiàn)中pdl-1和pd-l1可以互換使用，本文統(tǒng)一使用pdl-1，所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與小鼠igg的fc蛋白片段(mfc)進(jìn)行融合設(shè)計(jì)。為提高目的基因在293f細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率，委托金斯瑞公司蛋白序列相對(duì)應(yīng)的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化，并委托金斯瑞公司合成相對(duì)應(yīng)的融合蛋白基因。2.puc57simple-pdl-1ecd-mfc質(zhì)粒的獲得：由金斯瑞公司將合成的pdl-1ecd-mfc融合基因克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)表達(dá)載體中，獲得puc57simple-pdl-1ecd-mfc質(zhì)粒。3.pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將質(zhì)粒puc57simple-pdl-1ecd-mfc進(jìn)行酶切(xbai和bamhi)，電泳回收得到的融合基因片段pdl-1ecd-mfc與pcdna3.1表達(dá)載體(購自invitrogen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞dh5a(購自tiangen公司)，轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)按照說明書進(jìn)行。篩選得到陽性的pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc克隆菌落，按照常規(guī)方法擴(kuò)增大腸桿菌，然后采用試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，dp103-03)并按照試劑盒的說明書提取得到pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc重組質(zhì)粒。4.按照lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑盒(購自invitrogen公司)方法將重組質(zhì)粒pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞(購自invitrogen公司)。5.將重組質(zhì)粒pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞7天后，將培養(yǎng)液通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及hitrapproteinahp柱進(jìn)行純化pdl-1ecd-mfc融合蛋白，并取純化后樣品加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液，進(jìn)行sds-page電泳檢測(cè)。如圖1所示，目標(biāo)蛋白大約在53kd處。制備例2：融合蛋白pd-1-hfc的制備1.基因pd-1-hfc的合成對(duì)基因pd-1的胞外片段pd-1ecd(programmedcelldeathprotein1,ncbigenbankid:np_005009.2)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與人igg的fc蛋白片段(hfc)進(jìn)行融合設(shè)計(jì)。為提高目的基因在293f細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率，委托金斯瑞公司蛋白序列相對(duì)應(yīng)的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化，并委托金斯瑞公司合成相對(duì)應(yīng)的融合蛋白基因。2.puc57simple-pd-1ecd-tev-hfc質(zhì)粒的獲得將金斯瑞公司將合成的和pd-1ecd-tev-hfc融合基因克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)表達(dá)載體中，獲得puc57simple-pd-1ecd-tev-hfc質(zhì)粒。3.pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc重組質(zhì)粒的構(gòu)建將質(zhì)粒puc57simple-pd-1ecd-tev-hfc進(jìn)行酶切(xbai和bamhi)，電泳回收得到的融合基因片段pd-1ecd-tev-hfc與pcdna3.1表達(dá)載體(購自invitrogen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞dh5a(購自tiangen公司)，轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)按照說明書進(jìn)行。篩選得到陽性的pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc克隆菌落，按照常規(guī)方法擴(kuò)增大腸桿菌，然后采用試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，dp103-03)并按照試劑盒的說明書提取得到pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc重組質(zhì)粒。4.按照lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑盒(購自invitrogen公司)方法分別將重組質(zhì)粒pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞(購自invitrogen公司)。5.分別將重組質(zhì)粒pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞7天后，將培養(yǎng)液通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及mabselectsure柱進(jìn)行純化pd-1ecd-tev-hfc融合蛋白，并取純化后樣品加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液，進(jìn)行sds-page電泳檢測(cè)，還原型蛋白樣品電泳圖如圖2所示。制備例3：b7-1-hfc的制備1.基因b7-1-hfc的合成對(duì)基因b7-1(clusterofdifferentiation80(alsocd80andb7-1),ncbigenbankid:np_005182.1)的胞外片段b7-1ecd所對(duì)應(yīng)的氨基酸與人igg的fc蛋白片段(hfc)進(jìn)行融合設(shè)計(jì)。為提高目的基因在293f細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率，委托金斯瑞公司蛋白序列相對(duì)應(yīng)的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化，并委托金斯瑞公司合成相對(duì)應(yīng)的融合蛋白基因。2.puc57simple-b7-1ecd-hfc質(zhì)粒的獲得將金斯瑞公司將合成的和b7-1ecd-hfc融合基因克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)表達(dá)載體中，獲得puc57simple-b7-1ecd-hfc質(zhì)粒。3.pcdna3.1-b7-1ecd-hfc重組質(zhì)粒的構(gòu)建將質(zhì)粒puc57simple-b7-1ecd-hfc進(jìn)行酶切(xbai和bamhi)，電泳回收得到的融合基因片段b7-1ecd-hfc與pcdna3.1表達(dá)載體(購自invitrogen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得pcdna3.1-b7-1ecd-hfc，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞dh5a(購自tiangen公司)，轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)按照說明書進(jìn)行。篩選得到陽性的pcdna3.1-b7-1ecd-hfc克隆菌落，按照常規(guī)方法擴(kuò)增大腸桿菌，然后采用試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，dp103-03)并按照試劑盒的說明書提取得到pcdna3.1-b7-1ecd-hfc重組質(zhì)粒。4.按照lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑盒(購自invitrogen公司)方法分別將重組質(zhì)粒pcdna3.1-b7-1ecd-hfc轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞(購自invitrogen公司)。5.分別將重組質(zhì)粒pcdna3.1-b7-1ecd-hfc轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞7天后，將培養(yǎng)液通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及mabselectsure柱進(jìn)行純化b7-1ecd-hfc融合蛋白，并取純化后樣品加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液，進(jìn)行sds-page電泳檢測(cè)，還原型蛋白樣品電泳圖如圖3所示。實(shí)施例1：雜交瘤細(xì)胞株lt005的獲得以及單克隆抗體5c10、5f10、9f6的制備利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出重組的pdl-1ecd-mfc融合蛋白作為抗原免疫小鼠，經(jīng)小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞。通過大量的樣本篩選，得到了一種雜交瘤細(xì)胞株lt005，該細(xì)胞株能夠分泌產(chǎn)生與pdl-1特異性結(jié)合的單克隆抗體5c10。本發(fā)明還制得了另外兩種單克隆抗體5f10和9f6。具體方法如下：1.雜交瘤細(xì)胞株的建立用前面制備例1制得pdl-1ecd-mfc融合蛋白作為抗原，取免疫balb/c小鼠(購自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，參照目前已確立的方法(e.g.,stewart,s.j.,“monoclonalantibodyproduction”,inbasicmethodsinantibodyproductionandcharacterization,eds.g.c.howardandd.r.bethell,bocaraton:crcpress,2000)。用pdl-1ecd-mfc作為抗原包被酶標(biāo)板，進(jìn)行間接elisa法篩選，得到分泌與pdl-1ecd-mfc特異性結(jié)合的新的抗體的雜交瘤細(xì)胞。對(duì)間接elisa篩選得到的雜交瘤細(xì)胞，通過競(jìng)爭elisa篩選出能夠分泌與配體pd-1(pd-1-hfc，制備例2值得)競(jìng)爭結(jié)合pdl-1的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并經(jīng)過有限稀釋法得到穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株。將該雜交瘤細(xì)胞株命名lt005，其分泌的單克隆抗體命名為5c10。雜交瘤細(xì)胞株lt005，其于2015年8月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno:c2015133，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編：430072。類似地，本發(fā)明人還構(gòu)建了另外2株雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的抗體為鼠源抗體，抗體分別命名為5f10和9f6。2.抗體5c10、5f10和9f6的制備用含10％的低igg胎牛血清對(duì)本發(fā)明pdl-1-5c10細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，7天后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行純化制備抗體5c10。抗體5f10、9f6按照上述方法制備。3.抗體5c10的sds-page電泳檢測(cè)：將純化后的樣品分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，純化的上樣流穿液，煮沸后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，還原型蛋白樣品目標(biāo)蛋白大約在50kd和25kd處，非還原型蛋白樣品目標(biāo)蛋白大約在150kd處(圖4)。4.鼠源抗體5c10、5f10和9f6的親和力、競(jìng)爭親和力以及細(xì)胞親和力的檢測(cè)：elisa親和力測(cè)試方法請(qǐng)參見實(shí)施例9，elisa競(jìng)爭親和力測(cè)試方法請(qǐng)參見實(shí)施例13facs細(xì)胞親和力測(cè)試方法請(qǐng)參見實(shí)施例8。結(jié)果如下面的表1所示。表1:鼠源抗體5c10、5f10、9f6親和力，競(jìng)爭親和力以及細(xì)胞親和力以檢測(cè)結(jié)果表明，三個(gè)抗體鼠源抗體在親和力和競(jìng)爭親和力方面不遜于對(duì)照抗體pcab(制備見實(shí)施例5)，其中，5c10在細(xì)胞親和力及陽性率表現(xiàn)最好，5f10細(xì)胞親和力優(yōu)于pcab，9f6陽性率優(yōu)于對(duì)照抗體pcab。實(shí)施例2：單克隆抗體5c10、5f10和9f6的輕鏈和重鏈序列的獲得按照培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)菌總rna提取試劑盒(tiangen，貨號(hào)dp430)的方法，從實(shí)施例1獲得的雜交瘤細(xì)胞株lt005中提取mrna。按照transgenbiotechtransscriptfirst-strandcdnasynthesissupermix試劑盒說明書合成cdna，并進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行ta克隆，具體操作參照peasy-t1cloningkit(transgenct101)試劑盒說明書進(jìn)行。將ta克隆的產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下：編碼單抗5c10重鏈可變區(qū)的核苷酸：(360bp)caggtgcaactgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagaacctgtccattacctgcactgtctctgggttctcattaagcaactatgatataagctggattcgccagccaccaggaaagggtctggagtggctcggagtaatatggactggtggagccacaaattataattcagctttcatgtccagactgagcatcagtagggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatattactgtgtgagagattcgaactataggtacgacgagccgtttacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(seqidno:1)單抗5c10重鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(120aa)qvqlkesgpglvapsqnlsitctvsgfslsnydiswirqppgkglewlgviwtggatnynsafmsrlsisrdnsksqvflkmnslqtddtaiyycvrdsnyrydepftywgqgtlvtvsa(seqidno:2)編碼單抗5c10輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(318bp)gacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtctctcctgcagggccagtcagagcattggcacaaacatacactggtttcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctcataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatcagggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattactactgtcaacaaagtaatagctggccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaata(seqidno:3)單抗5c10輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(106aa)dilltqspailsvspgervslscrasqsigtnihwfqqrtngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqsnswpytfgggtklei(seqidno:4)類似地，可獲得單克隆抗體9f6和5f10的輕鏈和重鏈序列。單抗5f10重鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(117aa)evqlqqsgaelvkpgasvklsctasgfdikdtyihwvkqrpeqglewigridpadgntrydpkfqdkttittdtssntahlqlssltsedtavyycarglgawfaswgqgtlvtvsa(seqidno:21)編碼單抗5f10重鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(351bp)gaggttcagctgcagcagtctggggcagagcttgtgaagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcgacattaaagacacctatatccactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggagtggattggaaggattgatcctgcggacggtaatactaggtatgacccgaagttccaggacaagaccactataacaaccgacacatcctccaacacagcccacctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtgctagaggcctcggagcttggtttgcttcctggggccaagggactctggtcactgtctctgca(seqidno:22)單抗5f10輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(106aa)diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqditnslnwyqqkpdgtvkllihytsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqghtlpptfgggtklei(seqidno:23)編碼單抗5f10輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(318bp)gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattaccaattccttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatccactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtcatacgcttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatc(seqidno:24)單抗9f6重鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(124aa)evqlqqsgaelvkpgasvklsctasgfnikdtymywvkqrpeqglewigridpangntkydpkfqgkatitadtsantaylqlssltsedtavyycsrgppggigeyiyamdywgqgtsvtvss(seqidno:25)編碼單抗9f6重鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(372bp)gaggttcagctgcagcagtctggggcagagcttgtgaagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgtactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggagtggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatactaaatatgacccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatccgccaacacagcctacctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgttctagaggccctccaggaggtatcggcgagtatatctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(seqidno:26)單抗9f6輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(107aa)qivltqspaimsaslgervtmtctasssvsssylhwyqqkpgsspklwiystsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyychqyhrspptfgggtklei(seqidno:27)編碼單抗9f6輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(321bp)caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaacgggtcaccatgacctgcactgccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtcccagctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccaccagtatcatcgttccccacccacgttcggtggaggcaccaagctggaaatc(seqidno:28)實(shí)施例3：人源化抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1、5c10h2l2的輕鏈和重鏈序列的設(shè)計(jì)根據(jù)pdl-1蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)(pdbcode3bik，lin,dyet.al.,pnasusa105(8):3011-6(2008)以及實(shí)施例2獲得的抗體5c10的序列，通過計(jì)算機(jī)模擬抗體模型，根據(jù)模型設(shè)計(jì)突變，得到抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1、5c10h2l2的可變區(qū)序列(重鏈恒定區(qū)為iggamma-1chaincregion，accession:p01857，輕鏈恒定區(qū)為igkappachaincregion，accession:p01834)，可變區(qū)序列如下：1.5c10人源化單克隆抗體5c10h1l1的輕鏈和重鏈序列編碼5c10h1l1重鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(360bp)caggtccagctgcaggagtcaggccccggcctggtgaagcccagtgagaacctgtcaatcacctgcacagtctctggcttctcactgagcaattacgacatcagttggattcgacagccccctggaaagggcctggaatggctgggcgtgatctggacaggcggggcaactaactataatccagcctttaaaagccggctgaccatttccagagacaactccaagtctcaggtgtctctgaaaatgagctccctgcaggccgctgataccgctgtgtactattgtgtcagggacagcaattaccgctatgatgagcccttcacatactgggggcagggaactctggtgaccgtctctagt(seqidno:5)5c10h1l1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(120aa)qvqlqesgpglvkpsenlsitctvsgfslsnydiswirqppgkglewlgviwtggatnynpafksrltisrdnsksqvslkmsslqaadtavyycvrdsnyrydepftywgqgtlvtvss(seqidno:6)編碼5c10h1l1輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(321bp)gaaatcgtgctgacacagagccctgacacactgagcgtgactcccaaggagaaagtcaccctgacatgccgggcatcacagagcatcggaacaaacattcactggttccagcagagaccaggccagagccccaagctgctgatcaaatacgcctccgaatctatcagtggcattccttcccgattctcaggcagcgggtccggaaccgactttactctgaccattaactctgtggaggctgaagatgccgctacatactattgccagcagtctaatagttggccttataccttcggccaggggacaaagctggagatcaaa(seqidno:7)5c10h1l1輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(107aa)eivltqspdtlsvtpkekvtltcrasqsigtnihwfqqrpgqspkllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftltinsveaedaatyycqqsnswpytfgqgtkleik(seqidno:8)2.5c10人源化單克隆抗體5c10h2l2的輕鏈和重鏈序列編碼5c10h2l2重鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(360bp)caggtccagctgcaggagtccggccccggcctggtgaagccctccgagacactgtctatcacctgcacagtcagcggcttctcactgagcaactacgacatctcctggattcgacagccccctggaaagggcctggaatggctgggcgtgatctggacaggcggggcaactaactataatccagccctgaaatctcggctgactattagtagagacaactcaaagaatcaggtgtccctgaaaatgagctccgtcaccgccgctgatacagctgtgtactattgtgtcagggacagcaattaccgctatgatgagccctttacctactgggggcagggaactctggtgaccgtctctagt(seqidno:9)5c10h2l2重鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(120aa)qvqlqesgpglvkpsetlsitctvsgfslsnydiswirqppgkglewlgviwtggatnynpalksrltisrdnsknqvslkmssvtaadtavyycvrdsnyrydepftywgqgtlvtvss(seqidno:10)編碼5c10h2l2輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列：(321bp)gaaatcgtgctgacacagtctcctgataccctgagcgtgactcccaaggagaaagtcaccctgacatgcagggcatcacagagcatcggaacaaacattcactggttccagcagaagccaggccagagccccaagctgctgatcaaatacgcctccgaatctattagtggagtgccttcccgcttctcaggcagcgggtccggaaccgactttactctgaccatcaactctgtggaggctgaagatgccgctacatactattgccagcagtctaatagttggccttataccttcggccaggggacaaagctggagatcaaa(seqidno:11)5c10h2l2輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列：(107aa)eivltqspdtlsvtpkekvtltcrasqsigtnihwfqqkpgqspkllikyasesisgvpsrfsgsgsgtdftltinsveaedaatyycqqsnswpytfgqgtkleik(seqidno:12)3.5c10人源化單克隆抗體5c10h1l2的輕鏈和重鏈序列編碼5c10h1l2重鏈可變區(qū)的核苷酸序列：seqidno:5，5c10h1l2重鏈可變區(qū)的氨基酸序列：seqidno:6。編碼5c10h1l2輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列：seqidno:11，5c10h1l2輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列：seqidno:12。4.5c10人源化單克隆抗體5c10h2l1的輕鏈和重鏈序列編碼5c10h2l1重鏈可變區(qū)的核苷酸序列：seqidno:9，5c10h2l1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列：seqidno:10。編碼5c10h2l1輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列：seqidno:7，5c10h2l1輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列：seqidno:8。實(shí)施例4：5c10人源化抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2的制備和sds-page電泳檢測(cè)將5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2的重鏈cdna(重鏈可變區(qū)序列分別如seqidno:5、seqidno:9所示；重鏈恒定區(qū)序列為higg1序列)和輕鏈的cdna(輕鏈可變區(qū)序列分別如seqidno:7、seqidno:11所示；輕鏈恒定區(qū)為humankappa序列)分別克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)載體中，獲得puc57simple-5c10h1、puc57simple5c10l1、puc57simple-5c10h2和puc57simple-5c10l2克隆質(zhì)粒。然后參照制備例1中的方法，亞克隆到pcdna3.1載體中。提取重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)液通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及hitrapproteinahp柱進(jìn)行純化。將純化后的樣品分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行sds-page電泳檢測(cè)，結(jié)果分別如圖5、圖6、圖7和圖8所示，還原型蛋白樣品目標(biāo)蛋白大約在50kd和25kd處，非還原型蛋白樣品目標(biāo)蛋白大約在150kd處。實(shí)施例5：人源化抗體5c10h2l2的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定使用fortebio分子相互作用儀測(cè)定人源化抗體5c10h2l2與抗原pdl-1(ncbigenbankid:np_054862.1，編碼核酸序列為seqidno:13，所編碼的氨基酸序列為seqidno:14)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。1.前期的實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備(1)參照制備例1中的pdl-1ecd-mfc的制備方法制備pdl-1-mfc蛋白，并用tev蛋白酶酶切pdl-1-mfc蛋白，過柱純化獲得pdl-1抗原。pdl-1的基因序列:(870bp)atgaggattttcgccgtctttatctttatgacctactggcatctgctgaacgcttttactgtgaccgtccccaaggatctgtatgtggtggagtacggaagcaacatgactatcgagtgcaagttccccgtggaaaaacagctggacctggccgctctgattgtctattgggagatggaagataagaatatcattcagtttgtgcacggcgaggaagacctgaaagtccagcatagctcctacaggcagcgcgcccgactgctgaaggatcagctgtccctggggaacgcagccctgcagatcaccgacgtgaaactgcaggatgctggagtctacaggtgcatgatctcttacggcggggctgattataagcgcattacagtgaaagtcaatgcaccttataacaagatcaatcagagaattctggtggtcgacccagtgaccagtgagcacgaactgacatgtcaggctgagggctaccccaaggcagaagtgatctggacctctagtgatcatcaggtcctgtcagggaaaaccacaactaccaacagcaagcgagaggaaaaactgttcaatgtgacatccactctgaggatcaacacaactaccaatgagattttctattgcacttttcggagactggaccctgaggaaaaccacaccgcagagctggtcatcccagaactgccactggcacacccacctaatgagcgaacacacctggtcatcctgggagccattctgctgtgcctgggcgtcgctctgactttcatttttcggctgagaaaggggcggatgatggacgtgaaaaagtgtggcattcaggatactaactcaaaaaagcagtccgatacccatctggaagaaacc(seqidno:13)pdl-1蛋白的氨基酸序列:(290aa)mrifavfifmtywhllnaftvtvpkdlyvveygsnmtieckfpvekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrarllkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritvkvnapynkinqrilvvdpvtseheltcqaegypkaeviwtssdhqvlsgkttttnskreeklfnvtstlrintttneifyctfrrldpeenhtaelvipelplahppnerthlvilgaillclgvaltfifrlrkgrmmdvkkcgiqdtnskkqsdthleet(seqidno:14)(2)陽性對(duì)照抗體hplp和pcab的獲得本發(fā)明選擇hplp或pcab作為陽性對(duì)照，其中，hplp是已上市的atezolizumab(商品名)，pcab是進(jìn)入臨床的pdl-1抗體。atezolizumab(商品名)購自roche公司。hplp(亦稱為kf025hplp)的制備可參照美國專利申請(qǐng)us2010/0203056a1例如其實(shí)施例10，該抗體的vh序列請(qǐng)參見該專利中的序列20，vl序列請(qǐng)參見該專利中的序列21。pcab的制備可參照美國專利us7,943,743b2例如其實(shí)施例1，該抗體的vh序列請(qǐng)參見該專利中的序列1，vl序列請(qǐng)參見該專利中的序列11。2.實(shí)驗(yàn)方法為檢測(cè)5c10h2l2、hplp和pcab與抗原pdl-1的親和力，將5μg/ml的抗原pdl-1采用氨基偶聯(lián)的方式固定于ar2g傳感器表面，經(jīng)乙醇胺封閉，于pbst中平衡后，將傳感器固定的抗原與抗體結(jié)合?？贵w濃度從200nm三倍稀釋，緩沖液為10mmpbst。采用fortebiodataanalysis7.0軟件，分析5c10h2l2、hplp和pcab與抗原pdl-1的親和力。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗體5c10h2l2、hplp和pcab與pdl-1結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2，動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)檢測(cè)結(jié)果分別如圖9-11所示。表2：抗體5c10h2l2、hplp、pcab動(dòng)力學(xué)參數(shù)抗體名稱kd(m)kon(1/ms)kon誤差kdis(1/s)kdis誤差5c10h2l28.08e-115.58e+062.06e+054.51e-041.66e-05hplp3.68e-114.07e+061.02e+051.50e-049.99e-06pcab1.28e-106.55e+063.88e+058.37e-042.25e-05kd為親和力常數(shù)；kon為抗原抗體結(jié)合速率；kdis為抗原抗體解離速率；kd＝kdis/kon。結(jié)果表明，3種抗體均與抗原有較好的親和力，5c10h2l2和hplp與抗原的親和力強(qiáng)于pcab。實(shí)施例6：fortebio測(cè)定5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1結(jié)合為檢測(cè)5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1的結(jié)合，將5μg/ml的抗原pdl-1采用氨基偶聯(lián)的方式固定于ar2g傳感器表面，經(jīng)乙醇胺封閉，于pbst中平衡。然后將傳感器固定的抗原與抗體結(jié)合，抗體濃度從33.33nm三倍稀釋，緩沖液為10mmpbst。然后把傳感器于10μg/ml配體pd-1中浸泡420s。5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1結(jié)合結(jié)果如圖12所示。由圖可見，各抗體均能夠有效地抑制人pdl-1與pd-1的結(jié)合，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系，各劑量的熒光強(qiáng)度及曲線模擬的結(jié)合效率ec50見表3。表3：抗體5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1結(jié)合抗體(nm)5c105c10h2l2hplp33.330.0058-0.01090.012711.110.0038-0.00780.01493.7040.0088-0.00070.00731.2350.02890.01030.02680.41150.05990.04250.06970.13720.07390.07320.08670.045720.07730.06010.0947ec50(nm)0.8170.6540.625結(jié)果表明，3種抗體均能夠有效地抑制人pdl-1與pd-1的結(jié)合，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例7：5c10h2l2與hplp阻斷pd1/pdl-1結(jié)合采用htrf的方法比較5c10h2l2與hplp阻斷pd1/pdl-1結(jié)合。使用pd1/pdl-1bindingassay(cisbio，貨號(hào):63adk000cplpeh)試劑盒。用稀釋緩沖液稀釋5c10h2l2與hplp，100μg/ml起始，3倍稀釋，10個(gè)濃度點(diǎn)。加入2μl樣品、4μlpdl-1-euk和4μltag-pd1，離心，室溫孵育20分鐘。加入10μlanti-tag-xl665，瞬時(shí)離心，室溫孵育2小時(shí)。使用pherastarfs(bmg)進(jìn)行讀數(shù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入graphprism進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，hplp和5c10h2l2對(duì)pd1/pdl-1結(jié)合阻斷的能力一致，分別為67.29ng/ml和68.97ng/ml，2種抗體均能夠有效地抑制人pdl-1與pd-1的結(jié)合。實(shí)施例8：流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)人源化抗體與細(xì)胞表面抗原pdl-1的結(jié)合活性首先構(gòu)建表達(dá)pdl-1抗原的宿主細(xì)胞293t；然后用本發(fā)明中制備的人源化抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1及陽性對(duì)照抗體(hplp和pcab)對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。然后采用流式細(xì)胞術(shù)分析驗(yàn)證抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1及陽性對(duì)照抗體(hplp和pcab)對(duì)細(xì)胞表面具有天然構(gòu)象的抗原的特異性結(jié)合。具體步驟如下：1.表達(dá)pdl-1抗原的宿主細(xì)胞293t的構(gòu)建按照lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑盒(購自invitrogen公司)方法將包含pdl-1的載體plenti6.3-pdl-1(載體plenti6.3購自invitrogen公司)轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)pdl-1的克隆群體。2.抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測(cè)采用常規(guī)胰酶消化方法上述步驟獲得的表達(dá)pdl-1抗原的宿主細(xì)胞293t，并使每個(gè)收集管細(xì)胞數(shù)為2×105。用pbs(1％bsa)配制濃度分別為50nm，20nm，10nm，3nm，1nm，0.1nm，0.01nm，0nm的各抗體稀釋液，冰上與表達(dá)pdl-1的293t細(xì)胞孵育2小時(shí)，pbs清洗3次。用pbs按1:100稀釋fitc-goat-anti-humanigg,每管加入100μl,冰上孵育1小時(shí)，pbs清洗3次。并加入300μlpbs重懸后，在流式細(xì)胞儀上用fitc通道檢測(cè)熒光信號(hào)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1、5c10h2l2及陽性對(duì)照抗體(hplp和pcab)與293t細(xì)胞表面pdl-1的結(jié)合結(jié)果分別如圖13-18所示。由圖可見，被檢測(cè)抗體均能有效地結(jié)合宿主細(xì)胞293t表面的靶標(biāo)pdl-1蛋白，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系。通過對(duì)結(jié)合的被檢測(cè)抗體進(jìn)行熒光定量分析，曲線模擬各抗體的結(jié)合效率ec50，如下的表4所示。表4：流式細(xì)胞儀檢測(cè)5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab結(jié)合宿主細(xì)胞293t表面抗原pdl-1的熒光強(qiáng)度分析結(jié)果表明，被檢測(cè)抗體均能有效地結(jié)合宿主細(xì)胞293t表面的靶標(biāo)pdl-1蛋白，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例9：間接elisa方法檢測(cè)人源化抗體與人pdl-1的結(jié)合活性采用間接elisa方法分別測(cè)定5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1及陽性對(duì)照抗體(hplp和pcab)與人pdl-1的結(jié)合活性。酶標(biāo)板中加入抗原孵育，4℃度過夜，用1％的bsa37℃度封閉2h后，分別加入抗體，37℃度孵育30min，加入hrp標(biāo)記羊抗人igg(h+l)二抗(jackson，109-035-088)，用tmb(neogen，308177)進(jìn)行顯色反應(yīng)5min，并在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450nm波長吸光度。檢測(cè)上述抗體與人pdl-1結(jié)合結(jié)果分別如圖19所示。由圖可見，5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab能有效地結(jié)合人pdl-1蛋白，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系，各劑量的熒光強(qiáng)度及曲線模擬的結(jié)合效率ec50見表5。表5：5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab與人pdl-1的結(jié)合(間接elisa)結(jié)果表明，本發(fā)明的抗體能有效地結(jié)合人pdl-1蛋白，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例10：間接elisa方法檢測(cè)5c10h2l2抗體與猴pdl-1的結(jié)合活性考慮到藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)需要用到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谂卸ㄊ遣皇呛秃镒拥陌锌乖梢越Y(jié)合，如果可以結(jié)合就可以采用猴子做藥代動(dòng)力學(xué)和毒理實(shí)驗(yàn)。采用間接elisa方法分別測(cè)定5c10h2l2和陽性對(duì)照抗體hplp與猴pdl-1的結(jié)合活性。酶標(biāo)板中加入抗原孵育，4℃度過夜，用1％的bsa37℃度封閉2h后，分別加入抗體，37℃度孵育30min，加入hrp標(biāo)記羊抗人igg(h+l)二抗(jackson，109-035-088)，用tmb(neogen，308177)進(jìn)行顯色反應(yīng)5min，并在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450nm波長吸光度。檢測(cè)5c10h2l2和hplp與猴pdl-1結(jié)合結(jié)果分別如圖20所示。由圖可見，5c10h2l2和hplp能有效地結(jié)合猴pdl-1蛋白，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系，各劑量的熒光強(qiáng)度及曲線模擬的結(jié)合效率ec50見表6。表6：5c10h2l2和hplp與猴pdl-1的結(jié)合(間接elisa)結(jié)果表明，5c10h2l2和hplp能有效地結(jié)合猴pdl-1蛋白，且5c10h2l2與猴pdl-1蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)于hplp,并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例11：間接elisa方法檢測(cè)5c10h2l2抗體與人pdl-1、人pd-l2以及鼠pdl-1的結(jié)合活性采用間接elisa方法測(cè)定5c10h2l2抗體與人pdl-1、人pd-l2(購自義翹神州，貨號(hào)10292-h08h)以及鼠pdl-1(購自義翹神州，貨號(hào)50010-m08h)的結(jié)合活性。人pdl-1、人pd-l2以及鼠pdl-1，酶標(biāo)板中加入0.5μg/ml抗原100μl孵育，4℃度過夜?？贵w稀釋至起始濃度為1μg/ml，按3倍比例梯度稀釋，共稀釋11個(gè)濃度。用1％的bsa37℃度封閉2h后，分別加入抗體，37℃度孵育30min。按1:20000稀釋，加入hrp標(biāo)記羊抗人igg(h+l)二抗(購自jackson，貨號(hào)109-035-088)，用tmb(購自neogen，貨號(hào)308177)進(jìn)行顯色反應(yīng)5min，并在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450nm波長吸光度。5c10h2l2抗體與人pdl-1、人pd-l2以及鼠pdl-1結(jié)合結(jié)果如圖21所示。由圖可見，5c10h2l2能有效地結(jié)合人pdl-1蛋白，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系，各劑量的吸光強(qiáng)度及曲線模擬的結(jié)合效率ec50＝9.16ng/ml；而5c10h2l2與人pd-l2和鼠pdl-1不存在結(jié)合。結(jié)果表明，5c10h2l2抗體與人pdl-1特異性結(jié)合，而atezolizumab與鼠pdl-1結(jié)合(參見在fda的公開審評(píng)資料pharmacologyreview，applicationnumber761034orig1s000),本發(fā)明具有優(yōu)良的特異性。實(shí)施例12：競(jìng)爭elisa方法檢測(cè)人源化抗體與pdl-1、pd-1的競(jìng)爭結(jié)合活性采用競(jìng)爭elisa方法分別測(cè)定5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1及陽性對(duì)照抗體(hplp和pcab)與pd-1競(jìng)爭結(jié)合抗原pdl-1的能力。酶標(biāo)板中加入受體孵育，4℃度過夜，用1％的bsa37℃度封閉2h，抗體與抗原在室溫混合孵育15分鐘后，混合液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，37℃度孵育30min，加入hrp標(biāo)記羊抗鼠igg(h+l)二抗(jackson，109-035-062)，用tmb(neogen，308177)進(jìn)行顯色反應(yīng)5min，并在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450nm波長吸光度。檢測(cè)上述抗體與pd-1競(jìng)爭結(jié)合抗原pdl-1的結(jié)果如圖22所示。由圖可見，5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab均能有效地與pd-1競(jìng)爭結(jié)合抗原pdl-1，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系，各劑量的熒光強(qiáng)度及曲線模擬的結(jié)合效率ec50見表7。表7：5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab與pd-1競(jìng)爭結(jié)合pdl-1elisa結(jié)果表明，被檢測(cè)抗體均能有效地與pd-1競(jìng)爭結(jié)合抗原pdl-1，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例13：競(jìng)爭elisa方法檢測(cè)5c10h2l2抗體與pdl-1、b7-1的競(jìng)爭結(jié)合采用競(jìng)爭elisa方法分別測(cè)定5c10h2l2及陽性對(duì)照抗體(hplp和pcab)與b7-1(b7-1-hfc，制備例3制得)競(jìng)爭結(jié)合抗原pdl-1的能力。酶標(biāo)板中加入受體孵育，4℃度過夜，用1％的bsa37℃度封閉2h，抗體與抗原在室溫混合孵育15分鐘后，混合液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，37℃度孵育30min，加入hrp標(biāo)記羊抗鼠igg(h+l)二抗(jackson，109-035-062)，用tmb(neogen，308177)進(jìn)行顯色反應(yīng)5min，并在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450nm波長吸光度。檢測(cè)上述抗體與b7-1競(jìng)爭結(jié)合抗原pdl-1的結(jié)果如圖23所示。由圖可見，5c10h2l2、hplp、pcab均能有效地與b7-1競(jìng)爭結(jié)合抗原pdl-1，各劑量的熒光強(qiáng)度及曲線模擬的結(jié)合效率ec50見表8。表8：5c10h2l2、hplp、pcab與b7-1競(jìng)爭結(jié)合pdl-1elisa*抑制不徹底，應(yīng)該理解為競(jìng)爭實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)窗口與另外兩個(gè)抗體相比較??；另如表7所示，hplp在1:27開始再增加濃度時(shí)，如1:9，1:3，3μg/ml時(shí)，od讀數(shù)隨濃度增加降低不明顯，不能達(dá)到5c10h2l2和pcab3ug/ml時(shí)的數(shù)值。結(jié)果表明，被檢測(cè)抗體均能與b7-1競(jìng)爭結(jié)合抗原pdl-1，其中5c10h2l2的競(jìng)爭結(jié)合活性較強(qiáng)，ec50是pcab的1/2倍；hplp隨著濃度增高，但是抑制程度并未呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)。實(shí)施例14：5c10h2l2及陽性對(duì)照抗體(hplp和pcab)的細(xì)胞生物學(xué)活性分析為檢測(cè)單克隆抗體5c10h2l2及陽性對(duì)照抗體(hplp和pcab)對(duì)外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell:pbmc)il-2和ifn-γ分泌的影響，采用ficoll-paqueplus(gehealthcarelotno.:171440-02)分離pbmc，將分離出來的pbmc加入il-4(peprotechk2513，1000u/ml)和gm-csf(peprotechh1513，1000u/ml)誘導(dǎo)6天后，加入tnf-α(peprotechg1513，200u/ml)誘導(dǎo)3天獲得dc細(xì)胞。pbmc中分離得到t細(xì)胞，將獲得的dc細(xì)胞與t細(xì)胞按1:10的比例混合培養(yǎng)，同時(shí)加入不同比例的抗體5c10h2l2(higg做為對(duì)照)培養(yǎng)5-6天后，采用elisa試劑盒檢測(cè)ifn-γ(購自達(dá)科為公司)和il-2(購自達(dá)科為公司)的分泌量。dc細(xì)胞和t細(xì)胞混合培養(yǎng)后ifn-γ和il-2的分泌檢測(cè)結(jié)果分別如圖24、圖25所示：5c10h2l2、hplp和pcab均能有效地誘導(dǎo)混合淋巴細(xì)胞分泌ifn-γ和il-2，并且其分泌量與抗體呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例15：經(jīng)修飾人類igg1恒定區(qū)的單抗5c10h2l2-igg1mt的設(shè)計(jì)和制備本發(fā)明對(duì)重鏈恒定區(qū)為iggamma-1chaincregion，accession:p01857，輕鏈恒定區(qū)為igkappachaincregion，accession:p01834的eu編號(hào)系統(tǒng)234,235，237進(jìn)行突變?nèi)缦拢簂234a，l235a，g237a，命名為5c10h2l2-igg1mt。參照實(shí)施例4的方法制備5c10h2l2-igg1mt。實(shí)施例16：fortebio測(cè)定5c10h2l2-igg1mt與fcγriiia、c1q的動(dòng)態(tài)親和力1.通過fortebio(購自pall貨號(hào)octet,qke)分析表征了5c10h2l2-igg1mt、與fcγriiia的親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。具體步驟如下：使用fortebio提供的標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑盒，通過生物素與鏈霉素的結(jié)合將純化的fcγriiia-biotin連接到sa芯片(鏈霉素包被的芯片)上，固定條件：1μg/mlfcγriiia-biotin,300s?？贵w濃度為4000nm結(jié)合120s，的，在pbst(ph7.4)緩沖液解離180s。用octet軟件將結(jié)合和解離曲線模型擬合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖26a和26b所示。結(jié)果表明：5c10h2l2-igg1mt、均不與fcγriiia結(jié)合，間接表明其都不具備adcc活性。2.通過fortebio(購自pall貨號(hào)octet,qke)分析表征了5c10h2l2-igg1mt、與c1q(購自fitzgerald，貨號(hào)32r-ac049)的親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。具體步驟如下：使用fortebio提供的標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑盒，通過生物素與鏈霉素的結(jié)合將純化抗體連接到sa芯片(鏈霉素包被的芯片)上，固定條件：20ug/mlantibody-biotin,300s。c1q濃度為200nm,2倍濃度梯度，結(jié)合120s。在pbst(ph7.4)緩沖液解離180s。用octet軟件將結(jié)合和解離曲線模型擬合。為了使結(jié)合常數(shù)估計(jì)中的親合力的影響降至最小，只用對(duì)應(yīng)于結(jié)合和解離階段的最初的數(shù)據(jù)段進(jìn)行擬合。測(cè)定的kd、kon和koff值顯示在表9中，具體圖譜如圖27a和圖27b。表9：5c10h2l2-igg1mt、與c1q動(dòng)態(tài)親和力結(jié)果表明，5c10h2l2-igg1mt比與c1q動(dòng)態(tài)親和力更低。實(shí)施例17：測(cè)定5c10h2l2-igg1mt的cdc細(xì)胞活性首先培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞hcc1954(購自atcc貨號(hào)crl-2338)是pdl-1陽性的細(xì)胞。用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基(rpmi1640+10％牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)。hcc1954檢測(cè)培養(yǎng)基(rpmi1640+10％人血清)稀釋5c10h2l2-igg1mt藥物10000μg/ml起始，5倍稀釋，10個(gè)濃度梯度。采用常規(guī)胰酶消化方法上述的腫瘤細(xì)胞，收集管細(xì)胞數(shù)，用對(duì)應(yīng)檢測(cè)培養(yǎng)基(含rpmi1640+10％人血清)重懸，加入10000細(xì)胞/孔至對(duì)應(yīng)的稀釋好抗體96孔板中，共培養(yǎng)5小時(shí)。然后每孔加入cck8試劑20μl(購自東仁化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)ck04,lot:jj744)，反應(yīng)至3小時(shí)，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)(廠家：moleculardevices,型號(hào)：spectramaxm2)，通過檢測(cè)線粒體內(nèi)的脫氫酶的活性，反映出抗體對(duì)hcc1954細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示，5c10h2l2-igg1mt未對(duì)hcc1954細(xì)胞產(chǎn)生cdc殺傷作用。實(shí)施例18：對(duì)結(jié)腸癌的體內(nèi)療效1.受試藥物5c10h2l2-igg1mt，人igg均由四川科倫藥物研究院有限公司提供；其中購自roche公司，人igg購自成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司。配制方法：三藥均用含0.1％bsa生理鹽水稀釋成所需濃度。1.試驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物mc-38/h-11細(xì)胞是小鼠結(jié)腸癌mc-38(購自cobioer,貨號(hào)cbp60825)細(xì)胞通過crispr/cas9技術(shù)敲除小鼠內(nèi)源性pdl-1，轉(zhuǎn)染并表達(dá)人pdl-1的單克隆細(xì)胞,因此，mc-38/h-11細(xì)胞只高表達(dá)人pdl-1蛋白。c57bl/6小鼠，7-8周，♀，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。2.實(shí)驗(yàn)步驟每只小鼠皮下接種1×105mc-38/h-11細(xì)胞，接種后第二天(d0)隨機(jī)分組并腹腔注射(ip)藥物，隔1天1次(q2d)；溶劑組注射相同體積的人igg(15mg/kg)，5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)、(15mg/kg)，注射體積0.1ml/10g體重。各組均為10只小鼠。3.實(shí)驗(yàn)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)為考察藥物對(duì)腫瘤生長的影響，具體指標(biāo)為t/c％或抑瘤率tgi(％)。每周二次用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑,腫瘤體積(v)計(jì)算公式為：v＝1/2×a×b2其中a、b分別表示長、寬。t/c％＝t/c×100,c、t分別為溶劑組和治療組的腫瘤體積或腫瘤重量。抑瘤率(tgi)(％)＝(c-t)/c×100,c、t分別為溶劑組和治療組的腫瘤體積或腫瘤重量。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下面的表10所示。表10：5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)、對(duì)小鼠結(jié)腸癌mc-38/h-11小鼠皮下移植瘤的療效注：隨機(jī)分組，第一次給藥時(shí)間為d0；d27為給藥后第27天。5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)對(duì)mc-38/h-11小鼠皮下移植瘤的抑瘤率分別為63.9％、75.8％和68.6％(根據(jù)平均腫瘤體積計(jì)算)；鑒于每組腫瘤的個(gè)體差異較大，采用中位腫瘤體積計(jì)算抑瘤率比較合理，則抑瘤率調(diào)整為100％、100％和100％；參比藥物(15mg/kg)對(duì)mc-38/h-11的抑瘤率為93.8％(根據(jù)中位腫瘤體積計(jì)算)；采用中位腫瘤重量計(jì)算抑瘤率，則5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)對(duì)mc-38/h-11的抑瘤率分別為100％、100％、100％，的抑瘤率為93.7％；中位腫瘤體積與中位腫瘤重量計(jì)算所得抑瘤率非常一致，說明腫瘤體積測(cè)量方法的可靠性。5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)不但抑制腫瘤生長，還抑制腫瘤成瘤，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(d27)，5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)劑量組成瘤率分別為40％、40％和40％，組的成瘤率為50％。荷瘤小鼠對(duì)以上藥物均能很好耐受，沒有明顯體重減輕等癥狀發(fā)生。相比較，5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)對(duì)小鼠結(jié)腸癌mc-38/h-11小鼠皮下移植瘤較具有更強(qiáng)的抑瘤作用。實(shí)施例19：對(duì)肺癌的體內(nèi)療效建模方法：將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞hcc827(購自atcc貨號(hào)crl-2868)皮下接種nog鼠，構(gòu)建肺癌荷瘤鼠模型，待腫瘤長到約100mm3,給藥前小鼠靜脈注射激活后的人pbmcs模擬人免疫系統(tǒng)，然后給藥。給藥方案：給藥劑量為10mg/kg，靜脈注射、每兩天一次，共計(jì)給藥四次。給藥后每周兩次測(cè)定腫瘤體積。分為對(duì)照igg，5c10h2l2-igg1mt，三組，每組6只。腫瘤生長曲線見圖28。結(jié)果顯示，在第4天開始，5c10h2l2-igg1mt組的腫瘤體積明顯小于組和igg對(duì)照組，5c10h2l2-igg1mt的腫瘤生長幾乎被完全抑制，組和igg對(duì)照組腫瘤在不斷生長，證明了本發(fā)明抗體較具有更強(qiáng)的體內(nèi)抑瘤作用。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。sequencelisting<110>四川科倫藥物研究院有限公司<120>一種pdl-1抗體、其藥物組合物及其用途<130>idc170033<150>201610122117.6<151>2016-03-04<160>40<170>patentinversion3.2<210>1<211>360<212>dna<213>artificial<220><223>編碼單抗5c10重鏈可變區(qū)的核苷酸<400>1caggtgcaactgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagaacctgtccatt60acctgcactgtctctgggttctcattaagcaactatgatataagctggattcgccagcca120ccaggaaagggtctggagtggctcggagtaatatggactggtggagccacaaattataat180tcagctttcatgtccagactgagcatcagtagggacaactccaagagccaagttttctta240aaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatattactgtgtgagagattcgaac300tataggtacgacgagccgtttacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca360<210>2<211>120<212>prt<213>artificial<220><223>單抗5c10重鏈可變區(qū)的氨基酸序列<400>2glnvalglnleulysgluserglyproglyleuvalalaprosergln151015asnleuserilethrcysthrvalserglypheserleuserasntyr202530aspilesertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpleu354045glyvaliletrpthrglyglyalathrasntyrasnseralaphemet505560serargleuserileserargaspasnserlysserglnvalpheleu65707580lysmetasnserleuglnthraspaspthralailetyrtyrcysval859095argaspserasntyrargtyraspgluprophethrtyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserala115120<210>3<211>318<212>dna<213>artificial<220><223>編碼單抗5c10輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列<400>3gacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagt60ctctcctgcagggccagtcagagcattggcacaaacatacactggtttcagcaaagaaca120aatggttctccaaggcttctcataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttcc180aggtttagtggcagtggatcagggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtct240gaagatattgcagattactactgtcaacaaagtaatagctggccgtacacgttcggaggg300gggaccaagctggaaata318<210>4<211>106<212>prt<213>artificial<220><223>單抗5c10輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列<400>4aspileleuleuthrglnserproalaileleuservalserprogly151015gluargvalserleusercysargalaserglnserileglythrasn202530ilehistrppheglnglnargthrasnglyserproargleuleuile354045lystyralasergluserileserglyileproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuserileasnservalgluser65707580gluaspilealaasptyrtyrcysglnglnserasnsertrpprotyr859095thrpheglyglyglythrlysleugluile100105<210>5<211>360<212>dna<213>artificial<220><223>編碼5c10h1l1重鏈可變區(qū)的核苷酸序列<400>5caggtccagctgcaggagtcaggccccggcctggtgaagcccagtgagaacctgtcaatc60acctgcacagtctctggcttctcactgagcaattacgacatcagttggattcgacagccc120cctggaaagggcctggaatggctgggcgtgatctggacaggcggggcaactaactataat180ccagcctttaaaagccggctgaccatttccagagacaactccaagtctcaggtgtctctg240aaaatgagctccctgcaggccgctgataccgctgtgtactattgtgtcagggacagcaat300taccgctatgatgagcccttcacatactgggggcagggaactctggtgaccgtctctagt360<210>6<211>120<212>prt<213>artificial<220><223>5c10h1l1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列<400>6glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu151015asnleuserilethrcysthrvalserglypheserleuserasntyr202530aspilesertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpleu354045glyvaliletrpthrglyglyalathrasntyrasnproalaphelys505560serargleuthrileserargaspasnserlysserglnvalserleu65707580lysmetserserleuglnalaalaaspthralavaltyrtyrcysval859095argaspserasntyrargtyraspgluprophethrtyrtrp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