抗人pd-l1人源化單克隆抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種抗人PD?L1人源化單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明通過篩選得到了具有良好特異性、較高的親和性和穩(wěn)定性的抗人PD?L1人源化單克隆抗體，該抗體能夠特異性地與人PD?L1結(jié)合，并且不與B7家族成員結(jié)合，其可以通過和活化的T細(xì)胞結(jié)合進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞的活化作用，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。
【專利說(shuō)明】
抗人PD-L1人源化單克隆抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種抗人ro-Li人源化單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性應(yīng)答過程主要包含了 T細(xì)胞以及B細(xì)胞這兩類免疫細(xì)胞的 激活、分化和增殖。其中，T細(xì)胞功能的激活受到兩類信號(hào)的調(diào)控。一類是由T細(xì)胞受體(TCR) 識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的MHC-抗原復(fù)合物所提供的抗原特異性信號(hào)。另一類即為APC細(xì) 胞上所表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)蛋白與T細(xì)胞間形成的共刺激和抑制信號(hào)。而這一類共刺激或抑 制信號(hào)往往對(duì)T細(xì)胞的增殖、分化和激活起著至關(guān)重要的作用。正常情況下，免疫檢查點(diǎn)對(duì) 于維持機(jī)體自身耐受性(防止自身免疫)并保護(hù)機(jī)體免受外界病原體感染有重要作用。
[0003] PD-L1/PD1信號(hào)通路是免疫反應(yīng)中非常重要的共抑制信號(hào)途徑。程序性死亡受體-1(PD-1，亦稱為CD279)具有兩個(gè)細(xì)胞表面的糖蛋白配體，分別為H)-L1 (亦稱B7-H1、CD274) 和PD-L2 (亦稱B7-DC、CD273)。
[0004]人PD-L1基因編碼290個(gè)氨基酸（其中1-18位氨基酸為信號(hào)肽，19-238位氨基酸為 胞外段，239-259位氨基酸為跨膜段，260-290位氨基酸為胞內(nèi)段）。它是一個(gè)I型膜蛋白，一 般在T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及許多非造血細(xì)胞上表達(dá)。研究表明，當(dāng)ro-Li與 H)-l結(jié)合后，將會(huì)通過補(bǔ)充具有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。這兩種磷酸 酶能夠使CD3G鏈的免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM)磷酸化程度降低，削弱ZAP-70活化，并 抑制TCR下游信號(hào)傳遞，從而起到共抑制T細(xì)胞活化的作用，通過這種負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)來(lái)防止 效應(yīng)T細(xì)胞過度激活而導(dǎo)致自身免疫損傷。
[0005] 但是，如果腫瘤組織表達(dá)了 PD-L1，則能夠通過與免疫細(xì)胞的PD-1結(jié)合，削弱免疫 系統(tǒng)對(duì)腫瘤組織的殺傷作用。目前發(fā)現(xiàn)PD-L1能在許多腫瘤組織（胃癌、乳腺癌、胰腺癌、卵 巢癌、肺癌、前列腺癌以及惡性黑色素瘤等）以及浸潤(rùn)腫瘤微環(huán)境的骨髓細(xì)胞中高表達(dá)。而 pd-li的表達(dá)也與黑色素瘤、乳腺癌和卵巢癌的不良預(yù)后息息相關(guān)。若是能夠阻斷ro-Li與 PD-1之間的連接反應(yīng)，則能使T細(xì)胞的效應(yīng)功能得到恢復(fù)。諸如黑色素瘤一類的腫瘤，在其 形成之初便能表達(dá)PD-L1，從而具備了與生倶來(lái)的免疫逃逸能力，PD-L1的表達(dá)水平也往往 與疾病的預(yù)后密切相關(guān)。
[0006] 因此，在采用針對(duì)ro-1/PD-Ll信號(hào)通路免疫療法時(shí)，PD-L1的表達(dá)水平成為了非常 重要的生物標(biāo)志物，能幫助研究人員推測(cè)出哪些病人將更有可能對(duì)這類免疫療法產(chǎn)生響 應(yīng)。
[0007] 目前，以PD-L1為靶點(diǎn)的抗體藥物，已經(jīng)在臨床上展示出了出色的應(yīng)用前景。比如 羅氏的全人IgGl單克隆抗體MPDL3280A，它能夠阻斷PD-L1與PD-1和CD80的結(jié)合，并且通過 對(duì)其Fc片段的工程化改造削弱了抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用來(lái)提高安全性。在1期臨床試驗(yàn)中， PD-L1表達(dá)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者接受了 12周MPDL3280A治療后產(chǎn)生了 52%的響應(yīng)率，不 良反應(yīng)均為低級(jí)別的疲勞和惡心，沒有證據(jù)顯示其具有腎臟毒性。在黑色素瘤患者中，同樣 觀察到了對(duì)藥物的持續(xù)響應(yīng)，因此MTOL3280A被H)A授予了突破療法地位。其在晚期腎細(xì)胞 癌和非小細(xì)胞肺癌患者中的臨床研究也在同步進(jìn)行。另一個(gè)ro-Li單克隆抗體，輝瑞與默克 共同開發(fā)的Avelwnab，同樣正在轉(zhuǎn)移性默克爾細(xì)胞癌患者中進(jìn)行有效性和安全性評(píng)價(jià)。
[0008] 不僅如此，研究表明一些病毒感染也與PD-Li/ro-1信號(hào)通路息息相關(guān)。例如，在慢 性HIV感染中，PD-1被發(fā)現(xiàn)在特異性識(shí)別HIV的⑶8+T細(xì)胞表面高表達(dá)，病毒通過激活H)-L1/ ro-1信號(hào)途徑，使得特異性識(shí)別HIV的CD8+T細(xì)胞活性受到抑制，細(xì)胞因子的分泌能力及T細(xì) 胞自身的增殖能力大大削弱，引起了獲得性的免疫功能缺陷。由此可見，阻斷ro-Li/ro-1信 號(hào)通路，在這一類疾病的治療中，同樣具備相當(dāng)?shù)膽?yīng)用價(jià)值。
[0009] 由此可見，研發(fā)具備阻斷ro-Li/PD-1信號(hào)通路能力的藥物，將為腫瘤、病毒感染及 多種免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療帶來(lái)全新的方法，具備巨大的應(yīng)用潛力和市場(chǎng)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有良好特異性、較高的親和性 和穩(wěn)定性的抗人ro-Li人源化單克隆抗體。
[0011] 本發(fā)明第一方面涉及抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括選 自于如下一組的⑶R區(qū)：
[0012] (1)重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID N0:18-20所示，輕鏈CDR1、CDR2、 ⑶R3的序列分別如SEQ ID N0:34-36所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序列；
[0013] (2)重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID N0:18-20所示，輕鏈CDR1、CDR2、 ⑶R3的序列分別如SEQ ID N0:46、35和36所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序列；
[0014] (3)重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID N0:18-20所示，輕鏈CDR1、CDR2、 ⑶R3的序列分別如SEQ ID N0:52、35和36所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序列。
[0015] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包括選 自于如下的重鏈可變區(qū)框架區(qū)：？1?1、？1?2、？1?3、？1?4的序列分別如3￡〇10勵(lì) :21-24所示，或 分別與上述序列的同一性大于70%、80%、85%、90%、95%、99%的序列。
[0016] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包括選 自于如下的輕鏈可變區(qū)框架區(qū)：？1?1、？1?2、？1?3、？1?4的序列分別如3￡〇10勵(lì) :37-40所示，或 分別與上述序列的同一性大于70%、80%、85%、90%、95%、99%的序列。
[0017] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括選自 于如下的重鏈可變區(qū)：其序列如SEQ ID N0:6所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序 列。
[0018] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括選自 于如下的輕鏈可變區(qū)：其序列如SEQ ID N0:8、45或51所示，或者分別與上述序列的同一性 大于 70%、80%、85%、90%、95%、99% 的序列。
[0019] 具體的，本發(fā)明中抗人ro-Li人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈的序列 如SEQ ID N0:10所示。
[0020] 具體的，本發(fā)明中抗人ro-Li人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其輕鏈的序列 如SEQ ID N0:26、42或48所示。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的核酸分子，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸 序列，所述重鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0022] (l)SEQ ID NO：18-20；
[0023] (2)與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個(gè)的序列:a)結(jié)合相同抗原表位； b)同一性大于 70%、80%、85%、90% 或 97%。
[0024] 進(jìn)一步的，所述重鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0025] SEQ ID N0:6,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個(gè)的序列:a)結(jié)合相同抗 原表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、〇)與前述序列框架區(qū)中含有一個(gè)到幾 個(gè)核苷酸的替換。
[0026]在本發(fā)明的實(shí)施方案中所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:5所示的序列。
[0027] 進(jìn)一步的，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:9所示的序列。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項(xiàng)的核酸分子，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核酸 序列，所述輕鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0029] (2)SEQ ID NO：34-36；
[0030] (2)5￡〇10從)：46、35和36;
[0031] (3)SEQ ID N0:52、35和36;
[0032] (4)與前述（1)_(3)序列相比滿足以下二者中至少一個(gè)的序列:a)結(jié)合相同抗原表 位;b)同一性大于 70%、80%、85%、90% 或 97%。
[0033] 進(jìn)一步的，所述輕鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0034] SEQ ID N0:8、45或51，或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié) 合相同抗原表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、(：)與前述序列框架區(qū)中含有 一個(gè)到幾個(gè)核苷酸的替換。
[0035]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:7、43或49所示的序 列。
[0036] 進(jìn)一步的，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:25、41或47所示的序列。
[0037] 本發(fā)明第四方面涉及載體，其含有本發(fā)明第二或第三方面任一項(xiàng)的核酸分子。
[0038] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中所指的載體含有本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的核酸分子和第三方 面任一項(xiàng)的核酸分子。
[0039]本發(fā)明第五方面涉及宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第二或第三方面任一項(xiàng)的核酸分子 或本發(fā)明第四方面任一項(xiàng)的載體。
[0040] 本發(fā)明第六方面涉及偶聯(lián)物，其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的抗人PD-L1人源化 單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，以及其它生物活性物質(zhì)，所述抗人ro-Li人源化單克隆抗體 或其抗原結(jié)合部分直接或通過連接片段與其它生物活性物質(zhì)偶聯(lián)。
[0041] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述其它生物活性物質(zhì)選自可直接或間接抑制細(xì)胞生長(zhǎng) 或殺滅細(xì)胞、或通過激活機(jī)體免疫反應(yīng)從而抑制或殺滅細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的化學(xué)物 質(zhì)、毒素、多肽、酶、同位素、細(xì)胞因子或其他具有生物活性的單一物質(zhì)或混合物質(zhì)。
[0042] 本發(fā)明第七方面涉及組合物(例如藥物組合物），其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的 抗人ro-Li人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分、第二方面或第三方面任一項(xiàng)的核酸分子、 第四方面任一項(xiàng)的載體、第五方面任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞、或者本發(fā)明第六方面任一項(xiàng)的偶聯(lián) 物，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，以及任選的其它生物活性物質(zhì)。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明第七方面任一項(xiàng)的組合物(例如藥物組合物），所述其它生物活性物質(zhì) 包括但不限于其它抗體、融合蛋白或藥物(例如抗腫瘤藥物，如放、化療藥物）。
[0044] 本發(fā)明還涉及診斷試劑或試劑盒，其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的抗人ro-Ll人 源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，所述診斷試劑或試劑盒用于在體外(例如細(xì)胞或組織） 或體內(nèi)（例如人或動(dòng)物模型）診斷與ro-Ll相關(guān)的疾病(例如腫瘤或病毒感染，例如PD-L1高 表達(dá)的病毒感染或ro-Ll高表達(dá)的腫瘤）。
[0045] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述腫瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、黑 色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質(zhì)瘤、胃癌、鼻咽癌、喉 癌、宮頸癌、子宮體癌、骨肉瘤、甲狀腺癌、前列腺癌;所述病毒感染包括但不限于急性、亞急 性或慢性耶￥、11(^、111￥感染。
[0046] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的抗人ro-Ll人源化單克隆抗體或其抗原結(jié) 合部分、第二方面或第三方面任一項(xiàng)的核酸分子、第四方面任一項(xiàng)的載體、第五方面任一項(xiàng) 的宿主細(xì)胞、第六方面任一項(xiàng)的偶聯(lián)物或第七方面任一項(xiàng)組合物用于制備預(yù)防或治療與 PD-L1相關(guān)的疾病(例如腫瘤，微生物或病毒感染，例如PD-L1高表達(dá)的腫瘤或PD-L1高表達(dá) 的病毒感染)的藥物的用途。
[0047] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述腫瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、黑 色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質(zhì)瘤、胃癌、鼻咽癌、喉 癌、宮頸癌、子宮體癌、骨肉瘤、甲狀腺癌、前列腺癌;所述微生物感染包括但不限于細(xì)菌、真 菌、原生動(dòng)物感染;所述病毒感染包括但不限于急性、亞急性或慢性HBV、HCV、HIV感染。
[0048] 以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述:在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué) 和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的蛋白質(zhì)和核酸化 學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、微生物學(xué)、免疫學(xué)相關(guān)術(shù)語(yǔ)和實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng) 領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語(yǔ)和常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定 義和解釋。
[0049] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"抗體"是指通常由兩對(duì)相同的多肽鏈(每對(duì)具有一條"輕"（L)鏈 和一條"重"（H)鏈)組成的免疫球蛋白分子?？贵w輕鏈可分類為k和A輕鏈。重鏈可分類為y、 8、y、a或e，并且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可 變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個(gè)氨基酸的"J"區(qū)連接，重鏈還包含大約3個(gè)或更多個(gè)氨基 酸的"D"區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)（V H)和重鏈恒定區(qū)（CH)組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域 (CH1、Ch2和Ch3 )組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)（Vl )和輕鏈恒定區(qū)（Cl )組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè) 結(jié)構(gòu)域Cl組成?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種 細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)的結(jié)合。V H和Vl區(qū)還可被細(xì)分為具 有高變性的區(qū)域(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))，其間散布有較保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域。各 Vh和Vl由按下列順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從氨基末端至羧基末端排列的3個(gè) CDR和4個(gè)FR組成。各重鏈/輕鏈對(duì)的可變區(qū)（VH和Vl)分別形成抗體結(jié)合部位。氨基酸至各區(qū) 域或結(jié)構(gòu)域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md?(1987and 1991))，或Chothia&Lesk (1987)J.Mol .Biol .196:901-917;Chothia等人（1989)Nature 342:878-883的定義。術(shù)語(yǔ) "抗體"不受任何特定的產(chǎn)生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體 和多克隆抗體?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgGl，IgG2，IgG3或IgG4亞 型），IgAl，IgA2，IgD，IgESlgi^J^^
[0050] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"是指全長(zhǎng)抗體的一個(gè)或多個(gè)部分，所述 部分保持結(jié)合抗體所結(jié)合的相同抗原(例如，PD-L1)的能力，與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)抗原的特異 性結(jié)合。通常參見，F(xiàn)undamental Immunology，Ch? 7(Paul，W.，ed?，第2版，Raven Press， N.Y. (1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的?？赏ㄟ^重組DNA技術(shù)或通過 完整抗體的酶促或化學(xué)斷裂產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。在一些情況下，抗原結(jié)合部分包括Fab、 Fab'、F(ab'）2、Fd、Fv、dAb和互補(bǔ)決定區(qū)（Q)R)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗 體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合能力的抗體的至少一部 分。
[0051] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過篩選得到了具有良好特異 性、較高的親和性和穩(wěn)定性的抗人PD-L1人源化單克隆抗體，該抗體能夠特異性地與人PD-L1結(jié)合，并且不與B7家族成員結(jié)合，其可以通過和活化的T細(xì)胞結(jié)合進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞的活化 作用，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。
[0052]上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。
【附圖說(shuō)明】
[0053]圖1是鼠源ro-Ll抗體的ELISA結(jié)合活性結(jié)果圖；
[0054]圖2是鼠源H)-L1抗體的ELISA抑制活性結(jié)果圖；
[0055] 圖3是鼠源H)-L1抗體的細(xì)胞結(jié)合活性結(jié)果圖；
[0056] 圖4是鼠源H)-L1抗體的細(xì)胞抑制活性結(jié)果圖；
[0057] 圖5是人源化ro-Ll抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線圖；
[0058] 圖6是人源化ro-Ll抗體與其它B7家族成員的結(jié)合特異性以及與不同物種ro-Ll蛋 白的結(jié)合結(jié)果圖；
[0059] 圖7是人源化ro-Ll抗體與表面表達(dá)ro-Ll的CH0細(xì)胞的結(jié)合特異性結(jié)果圖；
[0060] 圖8是人源化ro-Ll抗體與重組人ro-Ll融合蛋白的結(jié)合特異性結(jié)果圖；
[0061 ]圖9是人源化ro-Ll抗體對(duì)ro-Ll結(jié)合ro-i的阻斷作用結(jié)果圖；
[0062] 圖10是人源化ro-Ll抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對(duì)細(xì)胞因子IFN- y分泌的影響結(jié) 果圖；
[0063] 圖11是人源化ro-Ll抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對(duì)細(xì)胞因子IL-2分泌的影響結(jié)果 圖；
[0064] 圖12是人源化ro-Ll抗體在血清中的穩(wěn)定性結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0065] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0066] 實(shí)施例一鼠源抗體篩選
[0067] 1.1動(dòng)物免疫
[0068] 采用經(jīng)典的免疫時(shí)間表，對(duì)BALB/c小鼠免疫，免疫原為hPD-Ll (人源PD-L1)蛋白 (購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司），以使動(dòng)物產(chǎn)生抗hPD-Ll的抗體，具體方案如表1所 示：
[0069] 表1 hPD-Ll蛋白動(dòng)物免疫方案
[0072] 1.2細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞篩選
[0073] 融合前調(diào)整小鼠骨髓瘤SP2/0的狀態(tài)，保證其生長(zhǎng)密度不超過于1.0 X106個(gè)細(xì)胞， 提前3天進(jìn)行終免，終免采用尾靜脈注射的方式，提前一天準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞，鋪板數(shù)量為2.0 X 104個(gè)細(xì)胞/孔。通過PEG融合，保證脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的數(shù)量比在10:1到5:1之間，每孔所 鋪脾細(xì)胞數(shù)量不超過1.0X10 5。融合7天以后收獲上清液并更換培養(yǎng)基。
[0074]收獲的上清液首先通過直接ELISA結(jié)合方法進(jìn)行初篩，將篩得的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后 收上清液進(jìn)行復(fù)篩。
[0075] 復(fù)篩采用細(xì)胞結(jié)合以及細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩輪篩選，篩選得到的陽(yáng)性克隆采用有 限稀釋法進(jìn)行亞克隆，鋪96孔板，分別為5個(gè)/孔，2個(gè)/孔和1個(gè)/孔。培養(yǎng)7天后采用直接 ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，挑選陽(yáng)性亞克隆進(jìn)行擴(kuò)增并保種。
[0076] 其中，所涉及的各實(shí)驗(yàn)方法的具體步驟如下：
[0077] A、ELISA 結(jié)合方法
[0078] 包被hPD-Ll-Fc在板上，加入梯度稀釋的抗體，孵育洗滌后，再加入羊抗鼠-HRP，顯 色，讀數(shù)擬合出反應(yīng)曲線，計(jì)算出EC50值。
[0079] B、細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)
[0080] 提前一天將hPD-Ll-Fc過表達(dá)細(xì)胞鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次日封閉后加入 梯度稀釋的抗體，再加入anti-mouse-EU，讀數(shù)即可。
[0081] C、細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)
[0082]提前一天將hPD-Ll-Fc過表達(dá)細(xì)胞鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次日封閉后加入 梯度稀釋的抗體，再加入F*Dl-Fc-Biotin，再加入Europium-labeled streptavidin，讀數(shù)即 可。
[0083] 1.3鼠源抗體的制備及活性鑒定
[0084] 將挑選陽(yáng)性亞克隆的雜交瘤細(xì)胞接種至SFM培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)7天左右，收集上清，離 心過濾后用Protein G純化柱純化，純化抗體分別進(jìn)行ELISA結(jié)合活性、ELISA抑制活性、細(xì) 胞結(jié)合活性、細(xì)胞抑制活性檢測(cè)。經(jīng)過篩選，獲得活性最高的一株鼠源抗ro-Li單克隆抗體， 命名為mouse anti-PD-Ll〇
[0085] 其中，所涉及的各實(shí)驗(yàn)方法的具體步驟如下：
[0086] A、ELISA 結(jié)合活性
[0087] 包被hPD-Ll-Fc在板上，加入梯度稀釋的抗體，孵育洗滌后，再加入羊抗鼠-HRP，顯 色，讀數(shù)擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖1所示，計(jì)算出EC50值，其與hPD-Ll結(jié)合活性EC50為 1 ? 67ng/mL〇
[0088] B、ELISA 抑制活性
[0089] 梯度稀釋的抗體和一定濃度的hPD-Ll-Fc-Biotin同時(shí)加入到包被hPD-Ll-Fc的板 上，孵育洗滌后再加入SA-HRP，顯色，讀數(shù)擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖2所示，計(jì)算IC50值，其 抑制活性IC50為0.86nM。
[0090] C、細(xì)胞結(jié)合活性
[0091] 提前一天將hPD-Ll-Fc過表達(dá)細(xì)胞鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次日封閉后加入 梯度稀釋的抗體，再加入ant i-mouse-EU，讀數(shù)即可，擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖3所示，計(jì)算 出其細(xì)胞結(jié)合活性EC50為30.29ng/mL。
[0092] D、細(xì)胞抑制活性
[0093]提前一天將hPD-Ll-Fc過表達(dá)細(xì)胞鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次日封閉后加入 梯度稀釋的抗體，再加入F*Dl-Fc-Biotin，再加入Europium-labeled streptavidin，讀數(shù)即 可，擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖4所示，計(jì)算出其細(xì)胞抑制活性IC50為637.8ng/mL。
[0094]實(shí)施例二鼠源抗體人源化及親和力成熟
[0095] 2.1鼠源抗體基因獲取
[0096] 米用Purelink RNA Micro kit提取mouse anti-PD-Ll雜交瘤總RNA，之后用 PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄總RNA制備cDNA。分別用Leader primer擴(kuò)增抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)，反應(yīng)體系及PCR條件分別如表2和表3所示。
[0097] 表2鼠源抗體基因 cDNA PCR反應(yīng)體系
[0099] 表3鼠源抗體基因 cDNA PCR反應(yīng)條件
[0101]電泳分析PCR結(jié)果，在有擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管中加入0.5yl LA Taq酶，72°C反應(yīng) lOmin。之后進(jìn)行酶連，反應(yīng)體系如表4所示。
[0102] 表4酶連反應(yīng)體系
[0104]酶連完成后轉(zhuǎn)化，挑克隆，保種，得到鼠源抗人PD-L1抗體。測(cè)序后，得到其重鏈可 變區(qū)核酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1和2所示，輕鏈可變區(qū)核酸序列和氨基酸序 列分別如SEQ ID N0:3和4所示。
[0105] 2.2人源化設(shè)計(jì)
[0106] 分析篩選得到的鼠源抗體序列，與人胚系（germline)基因比對(duì)，確定KV1-9*01為 輕鏈人源化框架序列，HVl-46*03為重鏈人源化框架序列。通過⑶R-grafting，將重鏈和輕 鏈的CDR并置到構(gòu)架序列，構(gòu)建人源化抗體，基因合成人源化抗體可變區(qū)的片段。得到其重 鏈可變區(qū)核酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:5和6所示，輕鏈可變區(qū)核酸序列和氨基 酸序列分別如SEQ ID N0:7和8所示。
[0107] 2.3抗體庫(kù)構(gòu)建
[0108]分析鼠源抗體CDR的DNA序列，確定可變區(qū)CDR中的突變位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物序列，將突 變位點(diǎn)所在的位置設(shè)計(jì)為NNS，使之編碼任意的氨基酸。以人源化抗體scFv為模板，PCR擴(kuò)增 scFv抗體庫(kù)，將scFv的抗體庫(kù)，通過sfn酶切位點(diǎn)，構(gòu)建到噬菌體質(zhì)粒中，構(gòu)建二級(jí)抗體庫(kù)。 [0109] 2.4抗體庫(kù)篩選
[0110]然后通過噬菌體展示進(jìn)行高親和力抗體篩選，具體方法如下：
[0111] A、通過電轉(zhuǎn)化，將含scFv的抗體庫(kù)的噬菌體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，經(jīng)過37 °C，220rpm，lh的恢復(fù)后，將輔助菌體(helper phage)加入到剩余的菌液中，另加入氨節(jié) 西林，37°C，220rpm，lh。2500rpm X 5min離心去上清，用2 X YT-AK培養(yǎng)基吹懸菌泥，37 °C， 220rpm過夜培養(yǎng)；
[0112] B、包被抗原:用包被緩沖液稀釋hPD-Ll-FC，混勻加入到免疫管中，4°C包被過夜；
[0113] C、重組噬菌體收集:上述過夜培養(yǎng)菌液，2500rpmX5min離心，收集上清10ml，加入 2ml PEG/NaCl，混勻放置冰上30-60min，10000g X 20min離心，去上清，用2 X YT培養(yǎng)基溶解 噬菌體庫(kù)；
[0114] D、封閉：免疫管用PBS洗兩次，加入封閉液，室溫lh。另外，取等體積封閉液與噬菌 體庫(kù)混合，室溫封閉l〇-15min;
[0115] E、孵育噬菌體庫(kù):免疫管用PBS洗2次，加入封閉好的噬菌體庫(kù)，37°C培養(yǎng)箱2-3h;
[0116] F、洗脫：取100yl TG1菌液（前一天接種）到10ml 2XYT中，37°C，220rpm培養(yǎng)到 A600值0.4-0.5。用TOST洗滌免疫管8次，再用roS洗2次，加入5ml對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌液，37 °C， 220rpm，lh;
[0117] G、0UTPUT:稀釋上述菌液至10-\10-2,分別取100ul涂平板；
[0118] H、下一輪篩選:取200ul helper phage加入到5ml洗脫后的菌液中，同時(shí)加入5ul 氨芐西林，37°(：，220鄺111，111。2500印111\5111111離心去上清，用1011112\￥1'-41(吹懸菌泥，37°(：， 220rpm過夜培養(yǎng)。
[0119] 重復(fù)步驟B-H。
[0120] 經(jīng)過三輪篩選，挑選單克隆，制備重組噬菌體，通過Phage ELISA方法，檢測(cè)重組噬 菌體活性，具體如下：
[0121] △、包被詘0-11+(：，4°(：過夜；
[0122] B、PBST 洗兩次，加入 phage 上清，25°C，lh;
[0123] C、PBST 洗三次，加入稀釋的 anti-M13-biotinAb，25°C，lh;
[0124] D、PBST洗三次，加入稀釋的HRP-streptavidin，25°C，lh;
[0125] E、PBST洗三次，加入預(yù)熱的TMB，25°C，lOmin，加入1M H2S〇4中止反應(yīng)，0D450檢測(cè)吸 光值。挑選陽(yáng)性克隆，送測(cè)序，通過PCR，重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)拼接至其對(duì)應(yīng)的人源抗體 的恒定區(qū)序列，擴(kuò)增的抗體重鏈和輕鏈全長(zhǎng)片段(包含信號(hào)肽)分別克隆入PCDNA3.1GS。
[0126] 通過以上實(shí)驗(yàn)，共篩選得到3株人源化抗體，分別命名為anti-PD-Ll-l，anti-PD-Ll-2，anti-ro-Ll-3。相應(yīng)的，anti-ro-Ll-l的重鏈和輕鏈質(zhì)粒名稱分別為P3?lGS-anti-PD-L1-1-HC和P3. lGS-anti-PD-Ll-1-LC，anti-PD-Ll-2的重鏈和輕鏈質(zhì)粒名稱分別為 P3.1GS-anti-PD-Ll-2-HC 和 P3.1GS-anti-PD-Ll-2-LC，anti-PD-Ll-3 的重鏈和輕鏈質(zhì)粒名 稱分別為 P3 ? lGS-anti-PD-Ll-3-HC 和 P3 ? lGS-anti-PD-Ll-3-LC。序列信息具體如下：
[0127] l)anti-PD-Ll-l重鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:9和10所示。其 中，重鏈可變區(qū)核苷酸序列為：
[0129] 橫線部分分別為0?1、001?2、0)1?，其序列編號(hào)分別為3￡〇10勵(lì)：11-13;未劃?rùn)M線 部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從) ：14-17。
[0130] 對(duì)應(yīng)的，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為：
[0132] 橫線部分分別為0?1、001?2、0)1?，其序列編號(hào)分別為3￡〇10勵(lì)：18-20;未劃?rùn)M線 部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從) :21-24。
[0133] &1^1-?〇-11-1輕鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如3￡〇10^) :25和26所示。其 中，輕鏈可變區(qū)核苷酸序列為：

[0135] 橫線部分分別為0?1、001?2、0)1?，其序列編號(hào)分別為3￡〇10勵(lì):27-29;未劃?rùn)M線 部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從) :3〇-33。
[0136] 對(duì)應(yīng)的，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為：
[0138] 橫線部分分別為0?1、001?2、0)1?，其序列編號(hào)分別為3￡〇10勵(lì):34-36 ;未劃?rùn)M線 部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從):37-40。
[0139] 2)anti-PD-Ll-2重鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:9和10所示。其 中，重鏈可變區(qū)核苷酸序列為：
[0141] 橫線部分分別為0?1、001?2、0)1?，其序列編號(hào)分別為3￡〇10勵(lì)：11-13;未劃?rùn)M線 部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從)：14-17。
[0142] 對(duì)應(yīng)的，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為：
[0144] 橫線部分分別為0?1、001?2、0)1?，其序列編號(hào)分別為3￡〇10勵(lì)：18-20;未劃?rùn)M線 部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從):21-24。
[0145] anti-PD-Ll-2輕鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:41和42所示。其 中，輕鏈可變區(qū)核苷酸序列為：
[0147] 橫線部分分別為〇?1、001?2、〇)1?3，其序列編號(hào)分別為3￡0 10^):44、28、29;未劃 橫線部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡0 1〇從):30-33。
[0148] 對(duì)應(yīng)的，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為：

[0150] 橫線部分分別為0)1?1、001?2、0)1?3，其序列編號(hào)分別為3￡〇10^):46、35、36 ;未劃 橫線部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從):37-40。
[0151] 3)anti-PD-Ll-3重鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:9和10所示。其 中，重鏈可變區(qū)核苷酸序列為：
[0153] 橫線部分分別為0?1、001?2、0)1?，其序列編號(hào)分別為3￡〇10勵(lì)：11-13;未劃?rùn)M線 部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從) ：14-17。
[0154] 對(duì)應(yīng)的，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為：
[0156] 橫線部分分別為0?1、001?2、0)1?，其序列編號(hào)分別為3￡〇10勵(lì)：18-20 ;未劃?rùn)M線 部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從):21-24。
[0157] anti-PD-Ll-3輕鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:47和48所示。其 中，輕鏈可變區(qū)核苷酸序列為：
[0159] 橫線部分分別為〇?1、001?2、〇)1?3，其序列編號(hào)分別為3￡0 10^):50、28、29;未劃 橫線部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡0 1〇從):30-33。
[0160] 對(duì)應(yīng)的，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為：
[0162] 橫線部分分別為〇?1、001?2、〇)1?3，其序列編號(hào)分別為3￡0 10^):52、35、36;未劃 橫線部分分別為?1?1、？1?2、？1?、？1?4，其序列編號(hào)分別為3￡〇10從) :37-40。
[0163] 實(shí)施例三人源化抗體表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0164] 由于三株抗體均表達(dá)出較好的特異性，本實(shí)施例僅以P3.1GS-PD-L1-1-HC和 P3.1GS-PD-L1-1-LC為模板作進(jìn)一步說(shuō)明。通過PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)抗體重鏈片段和輕鏈片段，構(gòu) 建人源化抗體表達(dá)質(zhì)粒。
[0165] 輕鏈和重鏈上下游引物、反應(yīng)體系及PCR條件如表5、表6和表7所示。
[0166] 表5人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應(yīng)的上下游引物
[0168]表6人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應(yīng)體系
L0170」表7人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應(yīng)條件
[0173]用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收輕鏈、重鏈的全長(zhǎng)序列。對(duì)抗體片段輕鏈、重鏈以及質(zhì) 粒分別進(jìn)行雙酶切，電泳后膠回收抗體酶切和質(zhì)粒酶切片段，之后對(duì)片段進(jìn)行酶連。酶連之 后的人源化抗體表達(dá)質(zhì)粒命名為P3.1GS-PD-L1-1。反應(yīng)體系如表8-表10所示。
[0174]表8人源化抗體輕鏈和重鏈雙酶切反應(yīng)體系
[0176]表9表達(dá)質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)體系
[0178] 表10抗體片段與表達(dá)質(zhì)粒片段酶連反應(yīng)體系
[0181] 將上述酶連產(chǎn)物加入到100此XL1-10感受態(tài)中，冰上30分鐘，然后，42°C熱擊90 秒，迅速放置冰上2分鐘，接著加入500yL LB培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)1小時(shí)，將菌液于4000rpm 離心5分鐘，棄500yL上清，用槍吹懸菌泥，涂布于含50yg/mL AMP的LB固體平板上，37°C過夜 培養(yǎng)。挑單菌落到5mL LB液體培養(yǎng)基（50yg/mL AMP)，37°C 250rpm培養(yǎng)6小時(shí)，PCR驗(yàn)證克 隆，用15%滅菌甘油保藏陽(yáng)性菌種，每個(gè)克隆2根，取一份凍存管送測(cè)序，另一份保存-20°C。
[0182] 實(shí)施例四穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株開發(fā)
[0183] 人源化抗體表達(dá)質(zhì)粒P3.1GS-PD-L1-1，轉(zhuǎn)染前采用Pvul對(duì)其進(jìn)行線性化;采用電 轉(zhuǎn)染的方法，將含有人源化抗體輕鏈、重鏈基因的線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CH0-KSM4，轉(zhuǎn)染2次。
[0184] 轉(zhuǎn)染后撤谷氨酰氨進(jìn)行加壓篩選，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞恢復(fù)2天后進(jìn)行加壓鋪板。培養(yǎng)約 30-40天后，96孔板可觀察到克隆長(zhǎng)出，此時(shí)進(jìn)行產(chǎn)量鑒定，將高產(chǎn)克隆轉(zhuǎn)移并擴(kuò)增培養(yǎng)。待 細(xì)胞數(shù)目達(dá)到2X106cells/mL左右接種進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收獲上清進(jìn)行產(chǎn)量 鑒定，獲得備選母克隆。將高產(chǎn)的克隆開展亞克隆篩選:半固體鋪板，6孔板每孔3000-5000 個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基2.5mL，鋪板后置于37 °C、5 % C02靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)7-12天可挑選單克隆。將挑 選的單克隆進(jìn)行產(chǎn)量鑒定，獲得備選克隆。
[0185] 將獲得9株高產(chǎn)細(xì)胞株進(jìn)行搖瓶補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。搖瓶補(bǔ)料方案為:采用CDM4CH0為基礎(chǔ) 培養(yǎng)基進(jìn)行接種，接種密度為5 X 105cel 1 s/mL，接種后置于37 °C、5 % C02、120rpm培養(yǎng)，接種 當(dāng)天記為第0天，培養(yǎng)至第3天開始補(bǔ)加70g/L的cell Boost 5,每天補(bǔ)加接種體積的6%直 至細(xì)胞收獲。經(jīng)過補(bǔ)料，細(xì)胞株的最高產(chǎn)量達(dá)到1.97g/L，表達(dá)的抗體命名為ant i-PD-Ll-1。
[0186] 實(shí)施例五抗體的結(jié)合特異性和結(jié)合動(dòng)力學(xué)比較
[0187]采用Biacore分析實(shí)施例四中的細(xì)胞株表達(dá)抗體的親和力及結(jié)合動(dòng)力學(xué)。利用標(biāo) 準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)和由Biacore提供的試劑盒，經(jīng)伯胺將羊抗人IgG共價(jià)連接至CM5芯片。將抗體 以10yL/min的流速在HBS EP緩沖液中流動(dòng)而測(cè)量結(jié)合。結(jié)合時(shí)間300秒，解離時(shí)間1200秒。 測(cè)定結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線如圖5所示，計(jì)算得到的ka、kd和KD值如表11所示。
[0188] 表11人源化抗體anti-PD-Ll-1的結(jié)合動(dòng)力學(xué)結(jié)果
[0190]實(shí)施例六ELISA測(cè)定與其它B7家族成員的結(jié)合特異性及與不同物種的PD-L1蛋白 的結(jié)合
[0191] 測(cè)試B7家族成員B7-l、B7-2和PD-L2蛋白及鼠、食蟹猴和人的PD-L1蛋白與人源化 抗體ant i-PD-Ll -1的結(jié)合。不同蛋白以0.5yg/mL的濃度在包被緩沖液中4 °C過夜。次日棄去 孔內(nèi)溶液用TOST洗兩次。然后加入1 % BSA，3 7 °C封閉1小時(shí)然后用TOST洗兩次。加入0.5yg/ mL抗體樣品，孵育1小時(shí)，PBST洗三次。用羊抗人FAB-HRP，1:10000稀釋，37°C孵育1小時(shí)， PBST洗三次。加入TMB顯色15min，以0.5M的H2S〇4中止反應(yīng)并在450nm讀出吸光度。
[0192] 結(jié)果如圖6所示，人源化抗體anti-PD-Ll-1不結(jié)合B7家族其它成員。人源化抗體 anti-PD-Ll-1以類似的親和力結(jié)合人或食蟹猴H)-L1蛋白。
[0193] 實(shí)施例七ELISA測(cè)定抗體與表面表達(dá)H)-L1的CH0細(xì)胞的結(jié)合特異性
[0194] 構(gòu)建在細(xì)胞表面表達(dá)重組人H)-L1的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞系，并通過ELISA測(cè) 定人源化抗體anti-PD-Ll-1的結(jié)合特異性。檢測(cè)前一天H)-L1過表達(dá)細(xì)胞鋪板，每孔鋪細(xì)胞 T75瓶長(zhǎng)滿的1/200。然后加入1%BSA，37°C封閉1小時(shí)。抗體5yg/mL起始依次進(jìn)行3倍稀釋共 8濃度梯度，100yL/孔，25°C孵育1小時(shí)，PBS洗一次。每孔加入50ng/mL anti-human-Eu的體 積是100yL，25°C反應(yīng)0.5小時(shí)，PBS洗一次。加入熒光增強(qiáng)液，激發(fā)光337nm/發(fā)射光620nm讀 數(shù)。
[0195] 結(jié)果如圖7所示，人源化抗體anti-PD-Ll-1能有效結(jié)合經(jīng)PD-L1轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞， EC50 達(dá)到 93.50ng/mL。
[0196] 實(shí)施例八ELISA測(cè)定抗體與重組人H)-L1融合蛋白的結(jié)合特異性
[0197] 0.5yg/mL的重組人PD-L1融合蛋白在包被緩沖液中4 °C過夜。次日棄去孔內(nèi)溶液用 TOST洗兩次。然后加入1 % BSA，3 7 °C封閉1小時(shí)。用TOST洗兩次?？贵w1 y g/mL起始依次進(jìn)行3 倍稀釋共8濃度梯度，lOOyL/孔，25 °C孵育1小時(shí)，PBS洗三次。用羊抗人FAB-HRP，1:10000稀 釋，37°C孵育1小時(shí)，TOST洗三次。加入TMB顯色15min，以0.5M的H2S0沖止反應(yīng)并在450nm讀 出吸光度。
[0198] 結(jié)果如圖8所示，人源化抗體anti-PD-Ll-1能有效的與重組人H)-L1融合蛋白相互 作用，EC50為19.47ng/mL。
[0199]實(shí)施例九抗體對(duì)ro-Li結(jié)合ro-i的阻斷作用
[0200] 0.5yg/mL的重組人PD-L1融合蛋白在包被緩沖液中4 °C過夜。次日棄去孔內(nèi)溶液用 PBST洗兩次。然后加入1%BSA，37°C封閉1小時(shí)然后用PBST洗兩次?？贵w10yg/mL起始依次進(jìn) 行2.5倍稀釋共8個(gè)濃度梯度與1邱/1^的^)14(^1(^11兩者等體積混合25°(：孵育1小時(shí)后， 用PBS洗一次。用鏈親和素-HRP，1:10000，37 °C孵育1小時(shí)，PBST洗三次。加入TMB顯色15min， 以0.5M的H2S〇4中止反應(yīng)并在450nm讀出吸光度。
[0201] 結(jié)果如圖9所示，人源化抗體anti-PD-Ll-1能阻斷配體H)-L1與H)-l的結(jié)合，IC50 為43?16ng/mL。
[0202 ]實(shí)施例十抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響 [0203] 先用roS緩沖液1:1稀釋血液，移取3mL的LSM至離心管內(nèi)，加入稀釋過的血液4mL， 注意加入的時(shí)候，確保使稀釋后的血液至于LSM的上層，不可混勾。400g，RT離心30-40min。 最后吸出分離出的上層的PBMC，100g離心10min。使用BD公司⑶4+細(xì)胞分離磁珠分離⑶4+T 細(xì)胞，使用BD公司DC細(xì)胞分離磁珠分離DC細(xì)胞。96孔板每孔⑶4+T細(xì)胞數(shù)量1 X 105，DC數(shù)量1 X 104，體積共計(jì)100此共培養(yǎng)。加入梯度稀釋的抗體，培養(yǎng)5天后檢測(cè)IFN- y，IL-2的濃度。 [0204] 結(jié)果如圖10和11所示，人源化抗體anti-PD-Ll-1能有效的促進(jìn)混合淋巴細(xì)胞分泌 IFN-丫和IL-2。
[0205]實(shí)施例^^一抗體在血清中的穩(wěn)定性
[0206]用猴血清稀釋人源化抗體anti-PD-Ll-1，濃度為0.511^/111匕37°(：分別放置0天、1 天、4天、7天。
[0207] 重組人ro-Ll融合蛋白以0.5yg/mL的濃度在包被緩沖液中4 °C過夜。次日棄去孔內(nèi) 溶液用TOST洗兩次。然后加入1%BSA，37°C封閉1小時(shí)然后用TOST洗兩次。穩(wěn)定性抗體樣品 以lyg/mL起始依次進(jìn)行3倍稀釋共8個(gè)濃度梯度，37°C孵育1小時(shí)，PBST洗三次。用羊抗人 FAB-HRP，1:10000稀釋，37°C孵育1小時(shí)，PBST洗三次。加入TMB顯色15min，以0 ? 5M的H2SO4中 止反應(yīng)并在450nm讀出吸光度。結(jié)果見圖12所示，人源化抗體anti-PD-Ll-1顯示出了良好的 血清穩(wěn)定性，7天之內(nèi)均未顯示明顯的活性衰減。
[0208] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和 變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在于:包括選自于如下 一組的CDR區(qū)： (1) 重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID NO: 18-20所示，輕鏈CDR1、CDR2、CDR3 的 序列分別如SEQ ID N0:34-36所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序列； (2) 重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID NO: 18-20所示，輕鏈CDR 1、CDR2、CDR3 的 序列分別如SEQ ID N0:46、35和36所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序列； (3) 重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID NO: 18-20所示，輕鏈CDR 1、CDR2、CDR3 的 序列分別如SEQ ID N0:52、35和36所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在 于:還包括選自于如下的重鏈可變區(qū)框架區(qū)：FR1、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 : 21-24所示，或分別與上述序列的同一性大于70%、80%、85%、90%、95%、99%的序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在 于:其重鏈的序列如SEQ ID NO: 10所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在 于:還包括選自于如下的輕鏈可變區(qū)框架區(qū)：FR1、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 : 37-40所示，或分別與上述序列的同一性大于70 %、80 %、85 %、90 %、95 %、99 %的序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在 于：其輕鏈的序列如SEQ ID NO:26、42或48所示。6. -種核酸分子，其特征在于:其包含能夠編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列，所述重鏈 可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO：18-20； (2) 與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié)合相同抗原表位;b)同 一性大于70%、80%、85%、90%或97%。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸分子，其特征在于:所述重鏈可變區(qū)包含選自如下一組的 氨基酸序列： SEQ ID N0:6,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個(gè)的序列:a)結(jié)合相同抗原表 位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區(qū)中含有一個(gè)到幾個(gè)核 苷酸的替換。8. -種核酸分子，其特征在于:其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列，所述輕鏈 可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO：34-36； (2) SEQIDN0:46、35和36; (3) SEQIDN0:52、35和36; (4) 與前述（1)-(3)序列相比滿足以下二者中至少一個(gè)的序列:a)結(jié)合相同抗原表位； b)同一性大于 70%、80%、85%、90% 或 97%。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸分子，其特征在于:所述輕鏈可變區(qū)包含選自如下一組的 氨基酸序列： SEQ ID N0:8、45或51，或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié)合相 同抗原表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區(qū)中含有一個(gè) 到幾個(gè)核苷酸的替換。10. -種載體，其特征在于:其含有權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的核酸分子。11. 一種宿主細(xì)胞，其特征在于：其含有權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求10 的載體。12. -種偶聯(lián)物，其特征在于:其含有權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的抗人PD-L1人源化單克隆抗 體或其抗原結(jié)合部分，以及其它生物活性物質(zhì)，所述抗人ro-Li人源化單克隆抗體或其抗原 結(jié)合部分直接或通過連接片段與其它生物活性物質(zhì)偶聯(lián)。13. -種組合物，其特征在于:其含有權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的抗人PD-L1人源化單克隆抗 體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求6-9的核酸分子、權(quán)利要求10的載體、權(quán)利要求11的宿主細(xì) 胞、或者權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，以及任選的其它 生物活性物質(zhì)。14. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求 6-9的核酸分子、權(quán)利要求10的載體、權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求12的偶聯(lián)物、或者權(quán) 利要求13的組合物用于制備預(yù)防或治療腫瘤、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病(T細(xì)胞功能障礙）、微生物 或病毒引起的感染的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/13GK105968200SQ201610340678
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】朱翔, 朱一翔, 郭樹華, 張佳春, 李戈
【申請(qǐng)人】瑞陽(yáng)(蘇州)生物科技有限公司