G種腸道病毒檢測(cè)抗體雙夾心elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)G種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO.1所示的VP1基因，表達(dá)的VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體為捕獲抗體，免疫成年健康家兔后制備的多克隆抗體，并標(biāo)記了辣根過(guò)氧化物酶（HRP）。安全性、與RT?PCR檢測(cè)結(jié)果具有100%符合率。試劑盒4℃保存6個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法無(wú)明顯差異。
【專利說(shuō)明】
G種腸道病毒檢測(cè)抗體雙夾心EL ISA檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)G種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)病毒的最新分類，小RNA病毒科腸道病毒屬包括A、B、C、D、E、F、G、H和J共9個(gè)種 腸道病毒。這些腸道病毒是引起人類和動(dòng)物呼吸道和消化道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要病 原體。其中A、B、C和D種腸道病毒引起人的感染;E、F和G種腸道病毒引起動(dòng)物感染如牛的E種 和F種腸道病毒感染和豬的G種腸道病毒感染，給人類的健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán) 重危害。羊腸道病毒感染是國(guó)內(nèi)外新發(fā)的一種臨床上以消化道和呼吸道為主要特征的疫 病。國(guó)內(nèi)有關(guān)羊腸道病毒感染的檢測(cè)與診斷尚未見(jiàn)有報(bào)道。
【申請(qǐng)人】于2014年從吉林多地爆 發(fā)的一種臨床上以嚴(yán)重腹瀉，高發(fā)病率和高致死率為主要特征的不明疫病中的山羊體內(nèi)分 離到G種腸道病毒CEV-JL14,經(jīng)過(guò)序列測(cè)定與分析發(fā)現(xiàn)，該毒株不同于目前報(bào)道的所有動(dòng)物 腸道病毒，其核苷酸序列的同源性與綿羊的最高，只有83%，表明所分離的毒株是一種新的 腸道病毒。有關(guān)該病毒的檢測(cè)與診斷方法及其防治缺乏研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)G種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
[0004] 一種G種腸道病毒抗原捕獲抗體，它是采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示 的基因，表達(dá)VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體。
[0005] -種G種腸道病毒酶標(biāo)抗體，是采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的 基因，表達(dá)VP1蛋白，免疫成年健康家兔后制備的多克隆抗體。
[0006] 所述的G種腸道病毒基因，可采用PCR技術(shù)，以G種腸道病毒基因組cDNA為模板 擴(kuò)增獲得，也可人工合成，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007] 所述的一種G種腸道病毒酶標(biāo)抗體標(biāo)記了辣根過(guò)氧化物酶。
[0008] 檢測(cè)G種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它的抗原捕獲抗體為上述的一 種G種腸道病毒抗原捕獲抗體，酶標(biāo)抗體為上述的一種G種腸道病毒酶標(biāo)抗體； 檢測(cè)G種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它是由下述方法制備的： 1)96孔ELISA板:用碳酸鹽緩沖液稀釋上述的一種G種腸道病毒抗原捕獲抗體，包被96 孔板，300 ng/孔，4°C，包被過(guò)夜;次日甩干，洗滌后，加入含2% BSA的TOST溶液每孔100yL， 37 °C封閉2h，洗凈甩干后塑封； (2) 樣品稀釋液（PBST pH7.4):NaCl 8.0g;KH2P〇4〇.2g;Na2HP〇4 .12H2〇 2.9g;KCl 0.2g補(bǔ)加二餾水致 1000 mL，加入0.5 mL Tween-20，50mL分裝； (3) 20倍濃縮洗滌液:NaCl 160.0g;KH2P04 4g;Na2HP〇4 .12H2〇 58g;KCl 4g補(bǔ)加二餾 水致 1000 ml;加入 10 ml Tween_20,50 mL分裝； (4) HRP標(biāo)記兔源抗VP1多克隆抗體:1:8000稀釋上述的一種G種腸道病毒酶標(biāo)抗體，無(wú) 菌分裝，每瓶lOmL; (5) 終止液:2!11〇1/11123〇4濃硫酸44.5 1111，雙蒸水355.5 1111，混勻后51^分裝； (6) 底物A:取OPD 200 mg，加雙蒸水至1000 mL，10 mL分裝； (7) 底物B:0.1 mol/L檸檬酸，0.2 mol/L磷酸氫二納，0.75 %過(guò)氧化氫6.4 mL，加三蒸 水至1000 11^，調(diào)至口115.0-5.43，10 11^分裝。
[0009] 本發(fā)明提供了檢測(cè)G種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它采用其堿基序 列如序列表SEQ ID NO. 1所示的基因，表達(dá)的VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆 抗體為捕獲抗體，免疫成年健康家兔后制備的多克隆抗體，并標(biāo)記了辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)。安全性、與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有100%符合率。試劑盒4°C保存6個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī) 方法無(wú)明顯差異。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1、 具有生物安全性。試劑盒所用的抗G種腸道病毒VP1單克隆抗體和多克隆抗體為原核 載體表達(dá)的重組蛋白誘導(dǎo)BALB/C小鼠和家兔產(chǎn)生，不含G種腸道病毒，因此不存在散毒危 險(xiǎn)； 2、 敏感性高。捕獲抗體和HRP標(biāo)記二抗均具有很高的免疫效價(jià)，因此提高了試劑盒的敏 感性和特異性。試劑盒檢測(cè)G種腸道病毒陽(yáng)性和陰性糞便樣品與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有100% 符合率； 3、 特異性強(qiáng)。試劑盒與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)，只檢出G種腸道病毒抗原，具有很高特 異性； 4、 穩(wěn)定性好。試劑盒4°C保存6個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法無(wú)明顯差異，具有很好的穩(wěn)定 性； 5、 快速簡(jiǎn)便。試劑盒2.0-2.5 h即可報(bào)告結(jié)果，使用方便，一般技術(shù)人員按說(shuō)明書即可 操作，條件一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行； 6、 不影響動(dòng)物正常生產(chǎn)。待檢樣品為糞便，采集容易、方便、不影響動(dòng)物正常生產(chǎn)，容易 被基層牛場(chǎng)接受； 7、 價(jià)格便宜。約3元/頭份，HRP標(biāo)記二抗和抗體制備技術(shù)成熟，均可大規(guī)模獲得。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1 PGEX-4T-1-VP1重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果（泳道M:DNA分子marker;泳道1 :pGEX-4T-1-VP1 EcoRI/XhoI雙酶切；泳道2:pGEX-4T-1-VPl EcoRI單酶切） 圖2重組VP1蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)分子量marker;泳道1 : pGEX-4T- 1-VP1重組菌未誘導(dǎo)總蛋白；泳道2:pGEX-4T-1-VPl重組菌誘導(dǎo)后總蛋白；泳道3:純化后的 重組VP1蛋白） 圖3病毒感染細(xì)胞IPMA檢測(cè)結(jié)果(A圖：未感染的Vero細(xì)胞，陰性對(duì)照;B圖：感染CEV的 Vero細(xì)胞） 圖4試劑盒各組分（（1)包被有VP1捕獲抗體及預(yù)處理的96孔ELISA板；（2)樣品稀釋液； (3) 20倍濃縮洗滌液；（4)HRP標(biāo)記抗VP 1兔源多抗；（5 )終止液；（6)底物A; (7 )底物B; (8 )陽(yáng)性 對(duì)照樣品；（9)陰性對(duì)照樣品）。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1 G種腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1、 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)目標(biāo)序列的堿基組成，分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增階_7基因，上下游分別含有EcoRI、Xho頂每 切位點(diǎn)。引物序列如下： 上游引物：5' TTGAATTCCAGGCTGGGTATGTGACT 3'（EcoRI) 下游引物：5' TCTCGAGTTAATGAAAATCACTGAGGGGTT 3'（Xhol) 2、 基因擴(kuò)增 常規(guī)Trizol法提取G種腸道病毒的基因組RNA，采用市售常規(guī)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明 操作獲得cDNA，并以其為模板擴(kuò)增基因，PCR反應(yīng)體系：
PCR 運(yùn)行條件：94°C 預(yù)變性 3min;94°C 變性 1.5min、54°C 退火 40sec、72°C 延伸 40sec，共 35個(gè)循環(huán);72°C再延伸6min。反應(yīng)結(jié)束后，取lyL進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0013] 3、目標(biāo)基因與pGEX-4T-l的連接、轉(zhuǎn)化 采用分子生物學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)酶切、連接等技術(shù)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-VP1，并采 用CaCl2法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)中。利用含1〇〇 yg/mL氨芐霉素的LB培養(yǎng)平 板篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行常規(guī)增菌培養(yǎng)，收獲菌體，提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRI/XhoI雙酶切鑒定， 如圖1所示。
[0014]實(shí)施例2 VP1重組蛋白的表達(dá)及純化 將鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，涂板， 37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種到3 mL含有100 yg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 過(guò)夜，然后取1 mL上述培養(yǎng)物接種到200 mL含有100 yg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 。(:振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（0D6QQ=0 ? 6)，加入IPTG(終濃度1 mmo 1/L)，20 °C誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，經(jīng) SDS-PAGE檢測(cè)，獲得了重組目標(biāo)蛋白VP1，如圖2所示(泳道2)。離心沉淀菌體，超聲破碎后 以1.5M尿素洗滌3次后獲得高純度的重組蛋白，如圖2所示(泳道3)。
[0015]實(shí)施例3抗羊腸道病毒VP1重組蛋白單克隆抗體和多克隆抗體的制備 1、抗VP 1單克隆抗體制備：選擇6-8周齡健康BALB/c小鼠以弗氏完全佐劑乳化純化的 VP1重組蛋白，每只小鼠多點(diǎn)皮下注射共100 yg，之后每間隔14d按照同樣方法加強(qiáng)免疫一 次，同時(shí)采集血清檢測(cè)效價(jià)。最后一次加強(qiáng)免疫采用直接腹腔注射l〇〇yg純化的蛋白，3~5天 后取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0混合于融合管內(nèi)，以300 g離心10 min，棄去上清，振蕩細(xì) 胞，使兩種細(xì)胞盡量混合均勻，然后于60 sec內(nèi)緩慢滴加預(yù)熱的PEG-4000溶液，再緩慢加入 無(wú)血清的1640培養(yǎng)基終止融合，靜置后再以1 000 r/min離心10 min，棄去上清后加入HAT 培養(yǎng)基，使細(xì)胞混勻懸浮，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第14 d換液，并檢測(cè)篩選分泌抗體的雜交 瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞的篩選采用間接ELISA，用純化的VP1重組蛋白作為包被抗原包被反應(yīng) 板，加入雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA篩選;對(duì)ELISA陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)一步克隆至 所有孔都為陽(yáng)性。通過(guò)3次細(xì)胞克隆最終獲得雜交瘤細(xì)胞株。取高壓滅菌的石蠟油0.5 mL， 注射到小鼠腹腔，7 d后腹腔注入106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，一周后抽取腹水，并置37°C 24 h后4°C 過(guò)夜，然后離心腹水，取上清，即為抗VP1單抗； 按上述操作，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)性試驗(yàn)，每次均可獲得多株合乎標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤細(xì)胞株。
[0016] 2、抗VP1多克隆抗體制備:選擇成年健康家兔以弗氏完全佐劑乳化純化的VP1重組 蛋白，每只家兔多點(diǎn)皮下共注射約2mg，之后每間隔14d以弗氏不完全佐劑乳化蛋白多點(diǎn)皮 下注射，并檢測(cè)血清效價(jià)。最后一次加強(qiáng)免疫直接采用腹腔注射2mg純化的蛋白，3~5天內(nèi)采 集血液收集血清。
[0017] 3、抗VP1多克隆抗體純化：取高免血清20mL，加入等體積10 mmol/L的PBS緩沖液 (pH7.2)，混勻后緩慢加入40 mL飽和硫酸銨，邊加邊攪拌;混合物4°C放置30 min后，以3000 rpm離心30 min。沉淀物以20 mL PBS溶解后，緩慢加入10 mL飽和硫酸銨，邊加邊攪拌，混合 物4°C放置30 min后，3000 rpm離心30 min,如此重復(fù)兩次。最后沉淀溶于4 mL PBS緩 沖液中，4°C透析24 h，蔗糖濃縮后分裝-80°C保存。提取的抗CEV VP1抗體過(guò)氧化物酶單層 細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA)進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示。
[0018] 實(shí)施例4 HRP標(biāo)記兔源抗VP1 IgG制備 采用郭春祥法對(duì)純化的IgG進(jìn)行HRP標(biāo)記：將5 mg HRP溶于H20,并與0.5 mL的0.1 M NaI〇4溶液混勻，4°C靜置30min。然后加入0.5 mL的0.16M乙二醇溶液混勻、室溫靜置30 min 后，加入純化的IgG lmL(約10mg)，混勻后裝入透析袋，以pH9.5的碳酸鹽緩沖液4°C透析12-18h。透析后所得溶液加入0.2mL的5 mg/mL的NaBH4溶液，于4°C靜置2h。然后采用過(guò)硫酸銨 沉淀法沉淀HRP標(biāo)記的IgG，PBS 4°C透析24-48h，蔗糖濃縮后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃 度，分裝_80°C保存。
[0019 ] 實(shí)施例5雙抗體夾心ELI SA方法的建立 1、反應(yīng)程序的建立 (1)雙抗體夾心ELISA方法的程序 以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋的抗VP1的單克隆抗體，4°C包被過(guò)夜，每孔包被200 ng。 以PBST (含0.05%Tween-20的PBS，pH7? 2)洗滌液洗板3次后，加入5%脫脂奶粉37°C封閉60 min。以TOST洗滌液洗滌3次后，加入1:5(W/V)預(yù)處理樣品100 yL，37°C感作60 min，然后以 洗滌液洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的二抗，每孔100 yL，37°C感作45 min。以同樣方法洗滌后，加 入(PD顯色試劑，每孔100此。室溫避光作用15 min后，加入2 mol/L H2S〇4 50yL終止反應(yīng)， 測(cè)定0D49Q值。
[0020] (2)HRP標(biāo)記抗VP1兔源多克隆抗體的最佳孵育量確定 應(yīng)用直接ELISA方法確定HRP標(biāo)記抗VP1抗VP1兔源多克隆抗體的最佳孵育量。用 PH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋VI抗原，包被0. lyg/孔，4°C過(guò)夜。以PBST(含0.05%Tween-20的 ros，pH7.2)洗滌液洗板3次后，加入5%脫脂奶粉37 °C封閉60 min。然后以PBST洗滌液洗滌3 次，加入預(yù)稀釋的HRP標(biāo)記兔源抗VPlIgG(100X，200X，400X，600X，800X，1000X，2000 X，4000X，6000X，8000X，10000X，12000X)，37°C感作45 min。以PBST洗板3次后，加入 OPD顯色試劑，室溫避光顯色15 min，然后加入2 mol/L H2S〇4 50yL終止反應(yīng)，測(cè)定0D49Q值。 選擇0D值在0.2左右且陽(yáng)性0D值/陰性0D值(P/N)比值最大時(shí)的一抗和二抗稀釋度為最佳工 作濃度。最終確定最佳孵育量為8000 X稀釋。
[0021] (3)捕獲抗體最佳包被量的確定： 應(yīng)用雙抗體夾心ELISA方法對(duì)捕獲抗體最佳包被量進(jìn)行確定。每孔加入以pH9.6的碳酸 鹽包被緩沖液稀釋的l〇〇yL的捕獲抗體，稀釋度分別為1 yg/mL, 2 yg/mL, 5 yg/mL, 10 y g/mL, 20 yg/mL, 30 yg/mL, 40 yg/mL, 50 yg/mL, 60 yg/mL, 80 yg/mL和100 yg/mL， 按照前述操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，選擇〇D值在0.2左右且陽(yáng)性0D值/陰性0D值(P/N)比值最大時(shí) 的一抗稀釋度為最佳工作濃度。最終捕獲抗體最佳包被量為300 ng/孔 (4)封閉液及作用時(shí)間的確定： 應(yīng)用確定的捕獲抗體及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度進(jìn)行雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)。分別以 2%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、1% BSA、2%BSA和5%BSA于37°C分別封閉30 min、lh和2h。顯色15 min后終止反應(yīng)。測(cè)定各樣本0D49Q值，比較各組的0D49Q值和P/N值。，確定ELISA反應(yīng)的最適封 條件為2%BSA，37°C封閉lh。
[0022] (5)雙抗體夾心ELISA方法的敏感性試驗(yàn)： 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定:取40份背景清晰的經(jīng)RT-PCR鑒定為羊腸道病毒(CEV)病原檢測(cè)陰性 的羊糞樣品，按l:l〇(W/V)將樣品以roS稀釋，3000 rpm離心15 min后，上清液用于雙抗體 夾心ELISA檢測(cè)，確定OD490值，以此40份樣品的平均OD490加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陰性與陽(yáng)性樣 品的臨界值，以此作為判定標(biāo)準(zhǔn)，即0D49Q多0D49Q (臟)+3 SD臟=0.109時(shí)樣品為陽(yáng)性。
[0023]敏感性試驗(yàn)：另取56份未知樣品按已建立的雙抗體夾心ELI SA方法進(jìn)行試驗(yàn)，判定 結(jié)果，并對(duì)該系列樣品進(jìn)行RT-PCR鑒定，兩者試驗(yàn)結(jié)果一致，表明所建立的雙抗體夾心 ELI SA方法具有很好的敏感性。
[0024] (6)雙抗體夾心ELISA方法特異性試驗(yàn)： 與口蹄疫病毒(FMDV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛細(xì)小病毒(BPV)陽(yáng)性樣品進(jìn)行雙抗 體夾心ELISA交叉試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示上述樣品均為陰性，說(shuō)明所建立的雙抗體夾心ELISA 方法與這些病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較好。
[0025] (7 )雙抗體夾心ELI SA方法的重復(fù)性試驗(yàn) 取4塊不同批次包被的酶標(biāo)板，每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)重復(fù)，在同一塊酶標(biāo)板上進(jìn)行批內(nèi)重 復(fù)，不同的酶標(biāo)板之間進(jìn)行批間重復(fù)，測(cè)定0D值，計(jì)算其變異系數(shù)，如果變異系數(shù)〈10%則說(shuō) 明其重復(fù)性和穩(wěn)定性很好。4個(gè)不同批次的酶標(biāo)板，結(jié)果一致。說(shuō)明檢測(cè)方法的重復(fù)性較好。 [0026] 實(shí)施例6雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒組裝 將建立好的雙抗夾心EL ISA方法中所用到的試劑盒材料：（1) 96孔EL ISA板、（2 )樣品稀 釋液、（3 ) 20倍濃縮洗滌液、（4 )HRP標(biāo)記兔源抗VP 1多克隆抗體、（5 )終止液、（6 )底物A、（ 7 )底 物B、（8)陽(yáng)性樣品、（9)陰性樣品，分別用相應(yīng)的廣口瓶加以封裝，貼上標(biāo)簽，組裝成試劑盒， 如圖4所示，具體操作如下： (1 )96孔ELISA板：用碳酸鹽緩沖液稀釋抗VP1鼠源單克隆抗體，包被96孔板，300 ng/ 孔，4°C，包被過(guò)夜;次日甩干，洗滌后，加入含2% BSA的PBST溶液每孔100yL，37°C封閉2h，洗 凈甩干后塑封。
[0027] (2)樣品稀釋液（PBST pH7.4):NaCl 8.0g;KH2P〇4 0.2g;Na2HP〇4 ? 12H20 2.9g; KC1 0.2g補(bǔ)加二餾水致 1000 mL，加入0.5 mL Tween-20，50mL分裝。
[0028] (3)20倍濃縮洗滌液：NaCl 160.0g;KH2P〇4 4g;Na2HP〇4 ? 12H20 58g;KCl 4g補(bǔ)加 二餾水致 1000 ml;加入 10 ml Tween-20,50 mL分裝。
[0029] (4)HRP標(biāo)記兔源抗VP1多克隆抗體：1:8000稀釋的HRP標(biāo)記兔源抗VP1多克隆抗 體，無(wú)菌分裝，每瓶1 OmL。
[0030] (5)終止液：2!11〇1/11123〇4濃硫酸44.5 1111，雙蒸水355.5 1111，混勻后51^分裝。
[0031] (6)底物A:取0PD 200 mg，加雙蒸水至 1000 mL，10 mL分裝。
[0032] (7)底物B:0.1 mol/L檸檬酸，0.2 mol/L磷酸氫二納，0.75 %過(guò)氧化氫6.4 mL，加 三蒸水至1〇〇〇11^，調(diào)至口115.〇-5.43，1〇11^分裝。
[0033] (8)陽(yáng)性樣品：將確定為CEV陽(yáng)性糞樣，以樣品稀釋液按1:5稀釋、離心，上清液經(jīng)過(guò) 滅活后，1 mL分裝。
[0034] (9)陰性樣品：將確定為CEV陰性糞樣，以樣品稀釋液按1:5稀釋、離心，上清液經(jīng)過(guò) 滅活后，1 mL分裝。
[0035]實(shí)施例7雙抗體夾心ELISA試劑盒的保質(zhì)期的確定 將組裝好的雙抗體夾心ELISA試劑盒4°C放置1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、九個(gè)月測(cè)定 其特異性和敏感性。結(jié)果該試劑盒4 °C保存6個(gè)月后，檢測(cè)效果與常規(guī)ELISA方法無(wú)明顯差 異，表明該試劑盒保質(zhì)期至少6個(gè)月。
[0036] 實(shí)施例8人工合成VP1基因 人工合成如序列表SEQ ID NO. 1所示的VP1基因，按實(shí)施例2方法表達(dá)蛋白VP1，用以制 備單克隆抗體和多克隆抗體及其檢測(cè)試劑盒，與實(shí)施例1的基因效果相似。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種G種腸道病毒抗原捕獲抗體，其特征在于：它是采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的基因，表達(dá)VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體。2. -種G種腸道病毒酶標(biāo)抗體，其特征在于：它是采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的基因，表達(dá)VP1蛋白，免疫成年健康家兔后制備的多克隆抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種G種腸道病毒酶標(biāo)抗體，其特征在于:所述的G種腸道 病毒基因?yàn)槿斯ず铣伞?. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種G種腸道病毒酶標(biāo)抗體，其特征在于:標(biāo)記了辣根過(guò)氧化 物酶。5. 檢測(cè)G種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于：它是由抗原捕獲抗 體為權(quán)利要求1所述的一種G種腸道病毒抗原捕獲抗體，酶標(biāo)抗體為為權(quán)利要求1所述的一 種G種腸道病毒酶標(biāo)抗體。6. 檢測(cè)G種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于：它是由下述方法制 備的： (1) 96孔ELISA板:用碳酸鹽緩沖液稀釋為權(quán)利要求1所述的一種G種腸道病毒抗原捕獲 抗體，包被96孔板，300 ng/孔，4°C，包被過(guò)夜;次日甩干，洗滌后，加入含2% BSA的PBST溶液 每孔lOOyL，37 °C封閉2h，洗凈甩干后塑封； (2) 樣品稀釋液（PBST pH7.4):NaCl 8.0g;KH2P〇4〇.2g;Na2HP〇4 ·12Η20 2.9g;KCl 0.2g補(bǔ)加二餾水致 1000 mL，加入0.5 mL Tween-20，50mL分裝； (3) 20倍濃縮洗滌液:NaCl 160.0g;KH2P〇4 4g;Na2HP〇4 ·12Η20 58g;KCl 4g補(bǔ)加二餾水 致 1000 ml;加入 10 ml Tween-20，50 mL分裝； (4) HRP標(biāo)記兔源抗VP1多克隆抗體:1:8000稀釋為權(quán)利要求2所述的一種G種腸道病毒 酶標(biāo)抗體，無(wú)菌分裝，每瓶1 OmL; (5) 終止液:2!11〇1/1!123〇4濃硫酸44.5 1111，雙蒸水355.5 1111，混勻后51^分裝； (6) 底物A:取0PD 200 mg，加雙蒸水至1000 mL，10 mL分裝； (7) 底物B:0.1 mol/L檸檬酸，0.2 mol/L磷酸氫二納，0.75 %過(guò)氧化氫6.4 mL，加三蒸 水至1000 1^，調(diào)至口!15.0-5.43，10 11^分裝。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK105968196SQ201610444075
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月21日
【發(fā)明人】王新平, 魯海冰, 王明月, 朱利塞, 郭昌明, 劉亞靜, 張群, 王芳
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)