一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測(cè)羊肚菌菌絲的制作方法
【專利摘要】一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測(cè)羊肚菌菌絲，其特征是：利用抗原與抗體特異性結(jié)合及酶對(duì)底物的顯色催化作用，檢測(cè)羊肚菌菌絲含量。a、是采用雙抗體夾心ELISA方法，其中一種抗體為鼠源抗羊肚菌單克隆抗體山、利用該方法測(cè)得羊肚菌菌絲濃度與0D值之間的關(guān)系曲線，并且曲線線性相關(guān)程度高；c、該方法對(duì)羊肚菌菌絲的檢測(cè)是特異性的檢測(cè)，作為羊肚菌菌絲的鑒定檢測(cè)。有益效果是：通過(guò)采用雙抗體夾心ELISA方法，對(duì)羊肚菌菌絲的含量進(jìn)行快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)，也即掌握了對(duì)培養(yǎng)基中羊肚菌的含量這個(gè)羊肚菌人工栽培的關(guān)鍵技術(shù)，大大地提高了菇農(nóng)的種植效率，降低了栽培羊肚菌的生產(chǎn)成本與風(fēng)險(xiǎn)。
【專利說(shuō)明】一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測(cè)羊肚菌菌絲

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種羊肚菌菌絲定量檢測(cè)方法的改進(jìn)。

【背景技術(shù)】
[0002] 羊肚菌是一種珍稀的食用菌，以美味著稱。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)其具有對(duì)人體多方 面的保健價(jià)值。由于人工栽培技術(shù)不成熟，產(chǎn)品基本靠野生資源的采集，價(jià)格居高不下。實(shí) 現(xiàn)羊肚菌的人工栽培具有巨大的商業(yè)價(jià)值。羊肚菌出菇的物質(zhì)基礎(chǔ)是大量生長(zhǎng)的羊肚菌菌 絲，可以說(shuō)羊肚菌菌絲數(shù)量的多少是決定了羊肚菌栽培是否能實(shí)現(xiàn)出菇的關(guān)鍵因素。因而 及時(shí)、準(zhǔn)確的了解培養(yǎng)基中羊肚菌的含量是羊肚菌人工栽培的關(guān)鍵技術(shù)手段。由于目前還 沒(méi)有定量檢測(cè)羊肚菌菌絲的實(shí)驗(yàn)手段與方法，菇農(nóng)只能用肉眼觀察培養(yǎng)基憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷菌 絲的含量，很難做到科學(xué)客觀了解菌絲含量。
[0003] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱ELISA)是一種免疫學(xué)技術(shù)方法，利用抗原與抗體特異性 結(jié)合及酶對(duì)底物的顯色催化作用，來(lái)檢測(cè)抗原或抗體的免疫學(xué)檢測(cè)方法，在醫(yī)學(xué)及病原等 的檢測(cè)上有較為成熟的應(yīng)用。
[0004] 另一種理論上可行的檢定羊肚菌菌絲的方法是在實(shí)驗(yàn)室條件下的提取羊肚菌樣 品的DNA，通過(guò)RT-PCR測(cè)定來(lái)推算菌絲含量，該方法的優(yōu)勢(shì)是精準(zhǔn)，缺點(diǎn)是需要專業(yè)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)周期長(zhǎng)(數(shù)天)，費(fèi)用昂貴。
[0005] 參考文獻(xiàn)： (1) 穆晞惠，童朝陽(yáng)，郝蘭群，等.雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)相思子毒素[J].細(xì)胞與 分子免疫學(xué)雜志.2007, 23 (8):763 - 766. (2) 王一東，劉建.一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法：中 國(guó)，200910218152. 8 [P]· 2010-06-09. (3) 馬帥，陳華林，王雅文，等.免疫酶染色法對(duì)羊肚菌菌絲特異性靶位的初步定位與 分析[J]·菌物研究，2014, 12 (2) :115-118。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是：提供一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測(cè)羊肚菌菌 絲，它可簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)羊肚菌菌絲含量。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：利用抗原與抗體特異性結(jié)合及酶對(duì)底物的顯色催化作用， 檢測(cè)羊肚菌菌絲含量。
[0008] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：1.是采用雙抗體夾心ELISA方法，其中一種抗體為鼠 源抗羊肚菌單克隆抗體。2.該方法可以測(cè)得羊肚菌菌絲濃度與0D值之間的關(guān)系曲線，并且 曲線線性相關(guān)程度高。3.該方法對(duì)羊肚菌菌絲的檢測(cè)是特異性的檢測(cè)，可以作為羊肚菌菌 絲的鑒定檢測(cè)。
[0009] 本發(fā)明的方法是： 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱ELISA)是一種免疫學(xué)技術(shù)方法，利用抗原與抗體特異性結(jié)合 及酶對(duì)底物的顯色催化作用，來(lái)檢測(cè)抗原或抗體的免疫學(xué)檢測(cè)方法，在醫(yī)學(xué)及病原等的檢 測(cè)上有較為成熟的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所闡述的檢測(cè)方法是利用免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾 心法原理。
[0011] 利用固定在酶標(biāo)板上的抗羊肚菌抗體，特異性吸附樣品中的羊肚菌菌絲抗原，在 第二抗體及酶標(biāo)抗體對(duì)抗原特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上，利用酶對(duì)底物的催化作用，使底物產(chǎn)生 特定波長(zhǎng)的顏色物質(zhì)，底物顏色的深淺與抗體結(jié)合的抗原的多少正相關(guān)。通過(guò)酶標(biāo)儀可以 測(cè)得不同量的標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原所對(duì)應(yīng)的底物顏色不同深淺(吸光度、也稱0D值)，建立標(biāo)準(zhǔn) 羊肚菌濃度與吸光度對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程，在相同條件下測(cè)得樣品的吸光度， 即可用標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程求得樣品中羊肚菌菌絲的含量。
[0012] 本發(fā)明的具體檢測(cè)方法是： 選取合適的鼠源抗羊肚菌菌絲的單克隆抗體及兔抗羊肚菌多克隆抗血清；制備經(jīng)物理 性破碎的液體培養(yǎng)的羊肚菌菌絲標(biāo)準(zhǔn)抗原；在優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，建立抗羊肚菌菌絲 抗原的雙抗體夾心ELISA法；檢測(cè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌絲樣品，建立吸光度（0D值）與 菌絲濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程；在相同工作條件下測(cè)待檢樣本的吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn) 曲線的線性方程計(jì)算得到樣品中羊肚菌菌絲的含量值。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：通過(guò)采用雙抗體夾心ELISA方法，對(duì)羊肚菌菌絲的含量進(jìn) 行快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)，也即掌握了對(duì)培養(yǎng)基中羊肚菌的含量這個(gè)羊肚菌人工栽培的關(guān)鍵技 術(shù)，大大地提高了菇農(nóng)的種植效率，降低了栽培羊肚菌的生產(chǎn)成本與風(fēng)險(xiǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是本發(fā)明之包被濃度與0D值間關(guān)系曲線圖； 圖2是本發(fā)明測(cè)得的羊肚菌標(biāo)準(zhǔn)品與0D值標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述： (一）本發(fā)明的實(shí)施實(shí)例所需實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器設(shè)備 1.菌株 羊肚菌（Morehella esculenta)菌株（51589號(hào))，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。
[0016] 2檢測(cè)樣本 于2012年5月采自吉林市豐滿區(qū)的野生羊肚菌子實(shí)體及其地表下的土壤基質(zhì)樣本(凍 存于長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室)。
[0017] 3 試劑 (1) HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)，購(gòu)于北京中杉金橋生物 技術(shù)有限責(zé)任公司； (2) TMB，sigma 公司； (3) 抗羊肚菌單克隆抗體和多克隆抗體 鼠抗羊肚菌單克隆抗體（C6A8細(xì)胞株、腹水）和兔抗羊肚菌多抗(兔高免血清)，由長(zhǎng)春 理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備并保存。
[0018] 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。
[0019] 4主要儀器與設(shè)備 HZQ-QX型恒溫振蕩培養(yǎng)箱哈東聯(lián)公司，MDF-192型低溫冰箱SANYO公司，F(xiàn)DU1100小型 凍干機(jī)EYELA公司，ELx800?酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司，hiac CF 16RX日本日立高速 冷凍離心機(jī)，等。
[0020] (二）實(shí)施的具體步驟 (1)所用抗體效價(jià)的測(cè)定：用常規(guī)間接ELISA法[8]分別測(cè)定抗羊肚菌多抗和單抗的效 價(jià)，間接ELISA法測(cè)得，抗羊肚菌多抗、單抗的效價(jià)分別為1:2. 05X 104和1:2. 56X 103。
[0021] (2)抗羊肚菌單克隆抗體的酶標(biāo)板包被：將抗羊肚菌 的單克隆抗體用PH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液分別稀釋25 X、50 X、100 κ......25600 X ,其蛋白濃度分別為 1850mg/L、925mg/L、462mg/L......1. 81mg/L 包被酶標(biāo)板，加入200 x稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品(抗原)、200 x稀釋的兔抗羊肚菌多抗、5000 x稀釋 的酶標(biāo)二抗及底物，對(duì)抗原進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測(cè)，其0D值與包被抗體濃度變化結(jié)果 見(jiàn)圖1。在包被抗體稀釋濃度為25600 X至12800 X時(shí)0D值呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)其稀釋濃度高于 800 X時(shí)，0D值趨于平穩(wěn)，故選擇最適包被抗體濃度為稀釋800 ,其蛋白濃度為57. 88mg/ L〇
[0022] (3)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：于250ml錐形瓶加入125ml馬鈴薯培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱Η)Β)， 用封口膜封口，滅菌后待用。將4°C保存的羊肚菌菌種斜面置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌操作挑 取適量菌絲接種于上述滅菌的中，將培養(yǎng)瓶放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度23°C，轉(zhuǎn)速110 r/min振蕩培養(yǎng)。約4 d后得到球狀羊肚菌菌絲。將培養(yǎng)得到的球狀羊肚菌菌絲880 xg 離心5min，收集沉淀菌絲，同樣的方法用pH7. 4的磷酸鹽緩沖液（以下簡(jiǎn)稱PBS)洗漆沉淀 菌絲三次。將沉淀菌絲經(jīng)低溫冷凍干燥機(jī)凍干24h，得到羊肚菌菌絲凍干品。稱取0.31g 凍干菌絲，與3g無(wú)菌海砂混合，加入適量_PBS研磨20min，880 χ g離心5min，取上清，再 經(jīng)9800 X g離心3min，取上清，最后得羊肚菌標(biāo)準(zhǔn)樣品體積為2. 35ml，菌絲濃度為1. 32 X. 105mg/L。該溶液即為羊肚菌菌絲標(biāo)準(zhǔn)樣品，冷凍或4°C保存，備用。
[0023] (4)夾心法的初步建立及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化： (1)抗體包被：用PH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液將羊肚菌單克隆抗體（C6A8腹水， 蛋白濃度為4. 631 χ 104 mg/L)稀釋成蛋白濃度為200mg/L，包被酶標(biāo)板，每孔加100 μ?, 其中一孔不加抗體，作為試劑空白。4°C過(guò)夜后甩去包被液，用含有0.05%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液（以下簡(jiǎn)稱PBS-T)洗3次，3min/次，甩干。
[0024] (2)加待檢樣品：除試劑空白及另留一列孔作為陰性對(duì)照外，其余孔加適當(dāng)稀釋的 陽(yáng)性羊肚菌菌絲標(biāo)準(zhǔn)品各100 μ?,陰性對(duì)照孔加100 μ?的PBS-T，37°C孵育lh，用PBS-T洗 3次，3 min/次，甩干。
[0025] (3)加兔抗羊肚菌多抗(兔陽(yáng)性血清，蛋白濃度為1. 026 X 105mg/L):除試劑空白 孔外，其余各孔加蛋白濃度為500mg/L的兔抗羊肚菌多抗，每孔100 μ.1，37?孵育45min， PBS-T洗5次，3 min/次，甩干。
[0026] (4)加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG :所有各孔加1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG，每孔 100 JU.1，37 °C溫育 45min，洗漆 5 次，3 min/ 次，甩干。
[0027] (5)加底物顯色液：在各孔中加入新配制的底物顯色液100 μ.1,37?避光，顯色 15min〇
[0028] (6)終止反應(yīng)：在各個(gè)孔中加入2mol/L H2S04溶液50 μ?。
[0029] (7)檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化：在ELxSOO?型酶標(biāo)檢測(cè)儀上450nm波長(zhǎng)處，測(cè)定0D 值。在陽(yáng)性、陰性對(duì)照成立的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同包被濃度、一抗?jié)舛鹊葘?duì)應(yīng)的0D值進(jìn)行 ELISA夾心法工作條件的優(yōu)化，在優(yōu)化了的條件基礎(chǔ)上建立ELISA雙抗體夾心法。
[0030] 1. 2. 3 ELISA雙抗體夾心法工作曲線的建立 用已建立的ELISA雙抗體夾心法，以標(biāo)準(zhǔn)品為檢樣分別加入稀釋2 X、4 X、8 X、16 X 、32 X、64 X、128 X、256 X和512 X的標(biāo)準(zhǔn)樣品，以PBS-T做為陰性對(duì)照，進(jìn)行檢測(cè)。利用 Excel辦公軟件，以標(biāo)準(zhǔn)樣品凍干菌絲濃度為橫坐標(biāo)，波長(zhǎng)450nm處的0D值為縱坐標(biāo)作圖， 獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品菌絲濃度與0D值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程。
[0031] (4)利用夾心法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程：以不同的羊肚菌標(biāo)準(zhǔn)樣品干菌絲濃度 為橫坐標(biāo)，0D值為縱坐標(biāo)作圖，建立ELISA雙抗體夾心法標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌絲濃度與0D值對(duì) 應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品菌絲濃度為2.58 X 102飛.60 X 104mg/L之間時(shí)，菌絲濃度 對(duì)數(shù)值與其0D值呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)（圖2)。對(duì)此進(jìn)行線性回歸分析，線性回歸方程為 y=0. 0949X-0. 0338, R2=0. 9943。
[0032] (5)待檢樣品的處理及檢測(cè)：稱取含有羊肚菌菌絲的樣本1. 02g，與3 g海砂混合 均勻，加入一定體積的PBS研磨20min。880 X g離心5min，取上清液，9800 g離心3min， 最后得上清1. 〇ml，該溶液即為土壤基質(zhì)中菌絲含量檢測(cè)樣本。羊肚菌樣本中菌絲含量的測(cè) 定，根據(jù)上述步驟建立的ELISA雙抗體夾心法，檢測(cè)經(jīng)處理得到的檢測(cè)樣本的0D值，根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、回收率可得出土壤樣本中所含菌絲含量數(shù)值。
【權(quán)利要求】
1. 一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測(cè)羊肚菌菌絲，其特征是： 利用抗原與抗體特異性結(jié)合及酶對(duì)底物的顯色催化作用，檢測(cè)羊肚菌菌絲含量。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測(cè)羊肚菌菌絲，其 特征是： a、 是采用雙抗體夾心ELISA方法，其中一種抗體為鼠源抗羊肚菌單克隆抗體； b、 利用該方法測(cè)得羊肚菌菌絲濃度與0D值之間的關(guān)系曲線，并且曲線線性相關(guān)程度 商； c、 該方法對(duì)羊肚菌菌絲的檢測(cè)是特異性的檢測(cè)，作為羊肚菌菌絲的鑒定檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104215759SQ201410500474
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】王一東, 劉建 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春理工大學(xué)