本申請(qǐng)要求2014年3月14日提交的U.S.S.N.61/953,064的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文。

政府支持

采用由National Institutes of Health以批準(zhǔn)號(hào)NCI 1R01CA173750-01授予的政府支持完成本發(fā)明。政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在人類受試者中誘導(dǎo)抗癌免疫響應(yīng)的方法與組合物。

背景

MICA是NKG2D(一種在大多數(shù)人類NK細(xì)胞、γδT細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上表達(dá)的C型凝集素樣、II型跨膜受體)的配體。在連接反應(yīng)時(shí)，NKG2D通過銜接蛋白DAP10發(fā)信號(hào)以喚起穿孔素依賴性細(xì)胞溶解并提供共同刺激。在人體內(nèi)，NKG2D配體包括MHC I類鏈相關(guān)蛋白A(MICA)、密切相關(guān)的MICB、UL-16結(jié)合蛋白(ULBP)1-4和RAE-1G。

雖然NKG2D配體通常不在健康的組織上發(fā)現(xiàn)，各種形式的細(xì)胞應(yīng)激(包括DNA損傷)可能上調(diào)配體表達(dá)，導(dǎo)致它們?cè)诙喾N實(shí)體和血液惡性腫瘤(包括黑素瘤)中的頻繁檢測。通過配體陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的NKG2D活化有助于外源腫瘤免疫，因?yàn)镹KG2D缺陷小鼠顯示提高的腫瘤易感性。但是在許多癌癥患者中，NKG2D介導(dǎo)的腫瘤免疫是無效的。部分地，通過NKG2D配體從腫瘤細(xì)胞中脫落，可以實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，這引發(fā)了表面NKG2D的內(nèi)在化和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的受損功能。參見例如Wu等人,“Prevalent Expression of the Immunostimulatory MHC Class I Chain-related Molecule is Counteracted by Shedding in Prostate Cancer”,J Clin Invest 114:560-8(2004)；Groh等人,“Tumour-derived Soluble MIC Ligands Impair Expression ofNKG2D and T-cell Activation”,Nature 419:734-8(2002)；Doubrovina等人,“Evasion from NK Cell Immunity by MHC Class I Chain-related Molecules Expressing Colon Adenocarcinoma”,J Immunol 171:6891-9(2003)。MIC從腫瘤中脫落造成在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的MIC的密度降低也是腫瘤逃避的機(jī)理之一。參見Marten等人,“Soluble MIC is Elevated in the Serum of Patients with Pancreatic Carcinoma Diminishing Gamma Delta T Cell Cytotoxicity”,Int J Cancer 119:2359-65(2006)?？扇苄訬KG2D配體也可以刺激調(diào)節(jié)性NKG2D+CD4+Foxp3-T細(xì)胞(其可以通過Fas配體、IL-10和TGF-β拮抗抗腫瘤細(xì)胞毒性)的擴(kuò)張。

MICA是從腫瘤細(xì)胞中脫落的NKG2D配體，即從細(xì)胞表面釋放到周圍介質(zhì)中，并且來自癌癥患者亞群的血清含有提高水平的可溶形式(sMICA)。MIC(術(shù)語“MIC”是指MICA和MICB)脫落部分通過與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶ERp5的相互作用來實(shí)現(xiàn)，所述蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶ERp5裂解MICα3結(jié)構(gòu)域中的二硫鍵，使其易受通過ADAM-10/17和MMP14進(jìn)行的蛋白酶解(proteolysis)。已經(jīng)描述了通過施用抗-MIC抗體或抗原結(jié)合肽片段來治療癌癥的方法。例如，US 8,182,809描述了此類方法，該方法利用特異性結(jié)合到位于MIC多肽的α3胞外域中的氨基酸序列NGTYQT的純化抗體或包含其抗原結(jié)合片段的多肽，以便抑制MIC多肽與ERp5的相互作用并抑制MIC的脫落。并且US 7,959,916描述了使用抗-MICα3結(jié)構(gòu)域抗體抑制MIC多肽從癌細(xì)胞中脫落的方法。腫瘤衍生的可溶性MIC多肽，MICA或MICB，或兩者，已經(jīng)也被建議作為癌癥的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記，并建議抗-MICA或抗-MICB抗體作為治療癌癥和自身免疫性疾病的治療劑。例如，US 7,771,718描述了使用抗MIC抗體以結(jié)合可溶性MIC多肽來減輕淋巴細(xì)胞中MIC誘導(dǎo)的NKG2D抑制方法。

在實(shí)踐中，使用治療性抗體治療癌癥或其它疾病的方法相對(duì)昂貴，因?yàn)樾枰圃齑罅烤哂凶銐蚣兌纫员爿斪⒅粱颊叩拇祟惪贵w?？紤]到大規(guī)模抗體生產(chǎn)的復(fù)雜性和對(duì)抗體輸注方案的專門要求，需要替代方法以便以更有效和成本有效的方式來靶向MIC多肽。本發(fā)明通過提供用于在受試者中誘導(dǎo)抗MIC抗體的疫苗提供了這一問題的解決方案。

腫瘤疫苗通常由共同作用以誘導(dǎo)識(shí)別和溶解腫瘤細(xì)胞的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的腫瘤抗原和免疫刺激分子(例如細(xì)胞因子或TLR配體)組成。此時(shí)，幾乎所有疫苗均含有共享的腫瘤抗原或全腫瘤細(xì)胞制劑(Gilboa,1999)。共享的腫瘤抗原是跨越多個(gè)個(gè)體在腫瘤中具有選擇性表達(dá)的免疫原性蛋白，并通常以合成肽或重組蛋白形式遞送至患者(Boon等人,2006)。相反，全腫瘤細(xì)胞制劑以自體照射細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞融合、熱休克蛋白制劑或總mRNA形式遞送至患者(Parmiani等人,2007)。因?yàn)槿[瘤細(xì)胞由患者分離，該細(xì)胞表達(dá)患者特異性腫瘤抗原以及共享的腫瘤抗原。最后，存在第三類腫瘤抗原，該抗原由于識(shí)別它們的技術(shù)困難而極少用于疫苗(Sensi等人,2006)。這一類由具有導(dǎo)致改變的氨基酸序列的腫瘤特異性突變的蛋白組成。此類突變蛋白具有以下潛力：(a)獨(dú)特地標(biāo)記腫瘤(相對(duì)于非腫瘤細(xì)胞)以便通過免疫系統(tǒng)識(shí)別和破壞(Lennerz等人,2005)；(b)避免中樞和有時(shí)的外周T細(xì)胞耐受，并由此被更有效的高親和力T細(xì)胞受體識(shí)別(Gotter等人,2004)。

概述

本發(fā)明提供了通過引發(fā)針對(duì)MIC多肽的免疫響應(yīng)來治療受試者的癌癥的組合物與方法。本文中所用的術(shù)語“MIC”指的是MICA和/或MICB。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的疫苗組合物，該組合物包含有效量的含有SEQ ID NO 1-23的一種或更多種或由其組成的肽作為免疫原性組分，所述有效量是有效引發(fā)針對(duì)MIC多肽或癌癥的免疫響應(yīng)的量。在另一實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含有效量的含有SEQ ID NO 1-4或2-4的一種或更多種、SEQ ID NO 5-7的一種或更多種、SEQ ID NO 8-10的一種或更多種、或SEQ ID NO 5-13的一種或更多種或由其組成的肽作為免疫原性組分。在另一實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含有效量的含有SEQ ID NO 14-23的一種或更多種、SEQ ID NO 15-23的一種或更多種、SEQ ID NO 18-23的一種或更多種、或SEQ ID NO 21-23的一種或更多種或由其組成的肽作為免疫原性組分。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物有效引發(fā)針對(duì)MIC多肽的體外免疫響應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該疫苗組合物有效引發(fā)針對(duì)MIC多肽的體內(nèi)免疫響應(yīng)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該免疫響應(yīng)針對(duì)未附著于細(xì)胞的MIC多肽，也稱為可溶性MIC多肽。該可溶性MIC可以為單體形式或多聚體形式。在另一實(shí)施方案中，該免疫響應(yīng)針對(duì)表達(dá)MIC多肽的癌細(xì)胞。該癌細(xì)胞可以是體外或體內(nèi)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物有效引發(fā)針對(duì)表達(dá)MIC多肽的癌細(xì)胞的免疫響應(yīng)。該癌細(xì)胞可以是體外或體內(nèi)的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該MIC多肽是MICA或MICB多肽，或含有MICA和MICB的α3結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。

任何表達(dá)MIC的癌細(xì)胞可以使用本發(fā)明的組合物和方法來處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和黑素瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，該癌癥是黑素瘤。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該肽包含以下或由以下組成：一種或更多種的SEQ ID NO 8-13，或與其任意一種具有90％或95％的氨基酸序列同一性的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該肽包含以下或由以下組成：一種或更多種的SEQ ID NO 15-23，或與其任意一種具有90％或95％的氨基酸序列同一性的肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含多種肽，所述肽選自兩種或更多種的SEQ ID NO 5-10，或與其任意一種具有95％的氨基酸序列同一性的肽；或選自兩種或更多種的SEQ ID NO 8-13，或與其任意一種具有90％的氨基酸序列同一性的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含多種肽，所述肽選自兩種或更多種的SEQ ID NO 15-20，或與其任意一種具有95％的氨基酸序列同一性的肽；或選自兩種或更多種的SEQ ID NO 21-23，或與其任意一種具有90％的氨基酸序列同一性的肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該肽綴合到載體蛋白上。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體蛋白選自破傷風(fēng)毒素和白喉毒素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含病毒衣殼蛋白，所述病毒衣殼蛋白經(jīng)改造以便在其表面上顯示所述至少一種肽或多種肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該病毒衣殼蛋白是乙型肝炎衣殼蛋白。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物為包含所述至少一種肽或多種肽的聚合物支架的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，該聚合物支架是多孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)聚合物支架。在一個(gè)實(shí)施方案中，該聚合物支架進(jìn)一步包含GM-CSF蛋白和Toll樣受體激動(dòng)劑的一者或兩者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該聚合物支架進(jìn)一步包含要用該組合物治療癌癥的受試者的自體腫瘤細(xì)胞裂解物。

本發(fā)明還提供了通過向受試者施用本文中描述的疫苗組合物來治療受試者的癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用本發(fā)明的疫苗組合物作為治療方案的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療方案進(jìn)一步包括放射療法、免疫療法、化學(xué)療法或靶向療法的一種或更多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用至少兩種、優(yōu)選三種獨(dú)立的本發(fā)明的疫苗組合物作為初免-加強(qiáng)(prime-boost)策略的一部分，各種疫苗組合物具有彼此不同的免疫原。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將由下列詳述和附圖以及由權(quán)利要求清楚可見。

附圖描述

圖1：在MICA*100參考結(jié)構(gòu)上的表位的作圖。使用重疊肽陣列進(jìn)行表位作圖。各個(gè)肽為20個(gè)氨基酸線性序列，每個(gè)肽具有10個(gè)氨基酸偏移(offset)。

圖2A和2B：在常見MICA與MICB等位基因中的表位保護(hù)。

圖3A和3B：具有適當(dāng)放置的MIC抗體的表位的嵌合蛋白設(shè)計(jì)。將MICAAbs 28和29的表位(以藍(lán)色和紅色突出顯示)置入具有類似Ig結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的不相關(guān)的蛋白，人CMV蛋白UL18。比較MICAa3(A)和嵌合蛋白(B)的結(jié)構(gòu)顯示了對(duì)MICA抗體28和29的表位的保護(hù)。

圖3C：嵌合蛋白的序列與MICA和UL18序列(C)比對(duì)。結(jié)合到人LIR的UL18的殘基發(fā)生突變(以白色顯示)。MICA的殘基206和210是多態(tài)的(分別為G/S和W/R)。

圖4A和4B：用于顯示MICA表位的二硫鍵穩(wěn)定性最小-MICA的設(shè)計(jì)。最小-MICA蛋白設(shè)計(jì)為將B細(xì)胞響應(yīng)集中于蛋白的關(guān)鍵部分。引入二硫鍵(綠色)以穩(wěn)定MICAAb29表位的構(gòu)象。連接Ab28和Ab29表位的β鏈被刪除(deleted)以降低蛋白柔性和改善溶解性。要注意的是，最小-MICA蛋白的N和C末端緊鄰，這使得能夠在乙型肝炎核衣殼的表面上顯示。藍(lán)色–Ab28表位，紅色–Ab29表位。

圖4C：最小-MICA的序列與MICA比對(duì)。

圖5A-5D是描述人抗MICA抗體的治療活性的一系列圖表。圖5A是描述用人U937腫瘤細(xì)胞(每周3×100微克Ab)的SCID植入小鼠的AML Ab2改善的存活率。在x軸上顯示經(jīng)過的天數(shù)，并在y軸上顯示百分比存活率。圖5B是描述抗體治療顯著降低了通過ELISA測得的獲治小鼠血清中的sMICA濃度的圖表。在x軸上顯示治療持續(xù)時(shí)間，并在y軸上顯示血清中的sMICA濃度。圖5C和5D顯示在治療一周后，MICA抗體減少了腫瘤勻漿中的sMICA(歸一化至腫瘤質(zhì)量；參見圖5C)，并提高了腫瘤細(xì)胞表面上的MICA表達(dá)，如通過流式細(xì)胞儀分析的那樣(參見圖5D)。圖5C中的x軸顯示實(shí)驗(yàn)條件，且y軸顯示腫瘤勻漿中的sMICA濃度。圖5D中的x軸顯示實(shí)驗(yàn)條件，且y軸顯示平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

圖6A-6F是描述人抗體在腫瘤中增強(qiáng)NK細(xì)胞聚積和功能的一系列圖表。對(duì)于這些數(shù)據(jù)，帶有U937腫瘤的SCID小鼠用MICAmAbs(3×100微克)治療一周，并評(píng)價(jià)NK細(xì)胞功能。圖6A、6B和6C顯示該抗體治療提高了通過腫瘤浸潤C(jī)D45⁺NK1.1⁺NK細(xì)胞的NKG2D(參見圖6A)和NKp46(參見圖6B)的表面水平，并在腫瘤中誘導(dǎo)NK細(xì)胞聚積(參見圖6C，歸一化至1×10⁵個(gè)CD45⁺細(xì)胞)。圖6D和6E顯示治療提高了通過腫瘤浸潤C(jī)D45⁺NK.1⁺NK細(xì)胞的IFNγ(參見圖6D)和穿孔素(參見圖6E)表達(dá)。圖6F描述了所有三種人MICA抗體提高了通過脾細(xì)胞進(jìn)行的⁵¹Cr標(biāo)記的YAC-1細(xì)胞的間接體內(nèi)(ex vivo)殺滅。

詳述

本發(fā)明提供了通過引發(fā)針對(duì)MIC多肽的免疫響應(yīng)治療受試者的癌癥的組合物和方法。術(shù)語“引發(fā)”、“刺激”和“誘導(dǎo)”可互換使用以表示在受試者中生成新生免疫響應(yīng)或表示提高了現(xiàn)有免疫響應(yīng)的強(qiáng)度或持久性。本發(fā)明的組合物含有至少一種MIC肽作為免疫原性組分(在本文中也稱為“免疫原”)，其包含MICA[SEQ ID NO:1]或MICB[SEQ ID NO:14]的全長α3結(jié)構(gòu)域[SEQ ID NO:1]或由其組成。在某些實(shí)施方案中，該MIC肽是選自SEQ ID NO:2-13或SEQ ID NO:15-23的表位。

在本發(fā)明的上下文中，表位是抗原分子的部分，其能夠引發(fā)對(duì)該分子的免疫響應(yīng)(優(yōu)選細(xì)胞毒性T細(xì)胞響應(yīng)或抗體分泌B細(xì)胞介導(dǎo)的響應(yīng))或可以被抗體結(jié)合。本發(fā)明人確定了作為CM33322Ab4、CM33322Ab28和CM33322Ab29的抗體結(jié)合表位的由SEQ ID NO:11-13和21-23表示的最小表位，其描述在美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/792,034與61/913,198和美國申請(qǐng)?zhí)?4/025,573中。從響應(yīng)免疫療法的癌癥患者中分離這些抗體。這些抗體通過抑制MIC蛋白從癌細(xì)胞上斷裂增強(qiáng)了NK細(xì)胞與CD8T細(xì)胞對(duì)抗癌細(xì)胞的活性。該抗體結(jié)合到MIC蛋白的α3結(jié)構(gòu)域上并在相關(guān)動(dòng)物模型中具有強(qiáng)抗腫瘤活性。這些臨床免疫學(xué)研究證明，針對(duì)MIC蛋白α3結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)抗體恢復(fù)了對(duì)抗癌癥的抗腫瘤免疫功能。按照本發(fā)明，被這些抗體識(shí)別的表位可以用作癌癥疫苗的免疫原性組分以刺激針對(duì)MICα3結(jié)構(gòu)域的抗體產(chǎn)生。本發(fā)明的一個(gè)重要要素在于，產(chǎn)生抗體對(duì)抗MICα3結(jié)構(gòu)域，但是不對(duì)抗MIC的α1-α2結(jié)構(gòu)域，只要NK細(xì)胞和CD8T細(xì)胞上的NKG2D受體結(jié)合到所述α1-α2結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明提供對(duì)人體中有效的抗MIC免疫響應(yīng)而言重要的MICA和B蛋白的表位，以及涉及使用其作為癌癥疫苗的免疫原性組分的方法和組合物。

表1：抗體結(jié)合表位在MICA*001參考序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列中的位置。表位以粗體顯示并加下劃線。

表2：被來自響應(yīng)癌癥免疫療法的患者的人抗體識(shí)別的MICA表位(表位加下劃線)

表3：具有短側(cè)翼序列的MICA表位

表4：最小MICA表位

表5：在MICB參考序列(SEQ ID NO:14)中被來自響應(yīng)癌癥免疫療法的患者的人抗體識(shí)別的MICB表位(表位加下劃線)

表6：具有短側(cè)翼序列的MICB表位

表7：最小MICB表位

本發(fā)明提供了適于施用于人類的疫苗組合物，包含至少一種MIC肽作為免疫原性組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種MIC肽包含MICA或MICB的全長α3結(jié)構(gòu)域或由其組成，該結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于參考序列，[SEQ ID NO:1]的氨基酸181至274。在另一實(shí)施方案中，所述至少一種肽包含選自SEQ ID NO:2-13或SEQ ID NO:15-23的任一種的MIC肽的肽表位或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種肽由選自SEQ ID NO:11-13或SEQ ID NO:21-23的肽表位和一個(gè)或更多個(gè)側(cè)翼氨基酸組成。在這方面，術(shù)語“側(cè)翼氨基酸”指的是在全長參考序列[對(duì)MICA為SEQ ID NO:1，或?qū)ICB為SEQ ID NO:14]中相鄰于肽表位序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)肽表位在其N末端或C末端、或兩者上包含2、4、6、8或10個(gè)側(cè)翼氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種肽由選自SEQ ID NO:11-13或SEQ ID NO:21-23的肽表位和一個(gè)或更多個(gè)側(cè)翼氨基酸組成，使得所述肽由大約25至30個(gè)氨基酸組成，或適于有效誘導(dǎo)響應(yīng)MIC蛋白的抗體的長度。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含選自SEQ ID NO:2-13或SEQ ID NO:15-23的MIC肽的至少兩種肽表位作為其免疫原性組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含選自SEQ ID NO:2-4或SEQ ID NO:15-23的MIC肽的至少兩種肽表位作為其免疫原性組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含選自SEQ ID NO:5-10的MIC肽的至少兩種肽表位作為其免疫原性組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含選自SEQ ID NO:11-13或SEQ ID NO:21-23的MIC肽的至少兩種肽表位作為其免疫原性組分。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含選自SEQ ID NO:2-13或SEQ ID NO:15-23的MIC肽的一種或更多種肽表位作為其免疫原性組分，其中所述肽表位為線性序列形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，該肽表位為結(jié)構(gòu)約束環(huán)形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽保留其天然二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如為一種或更多種環(huán)的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用二硫鍵或化學(xué)接頭產(chǎn)生該環(huán)。優(yōu)選地，該環(huán)適于模擬人類蛋白上MIC表位的三維構(gòu)象。

在另一實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含編碼SEQ ID NO:2-13或SEQ ID NO:15-23的肽的一種或更多種的核酸。該核酸可以為表達(dá)載體的形式，例如質(zhì)?；虿《据d體，或者該核酸可以包裝到納米粒子中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸通過注射遞送至受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸作為純化DNA或以納米粒子形式注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，注射已經(jīng)修飾以表達(dá)該核酸的修飾免疫細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由用包含該核酸的載體體外轉(zhuǎn)染或感染來修飾該免疫細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含多種肽作為其免疫原性組分，所述多種肽包含選自SEQ ID NO:2-13或SEQ ID NO:15-23的兩種或更多種肽或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種肽包含選自SEQ ID NO:2-4或SEQ ID NO:15-23的至少兩種肽或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種肽包含選自SEQ ID NO:5-10的至少兩種或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種肽包含選自SEQ ID NO:11-13或SEQ ID NO:21-23的至少兩種或由其組成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種肽或所述多種肽綴合至含有MHC-II表位的第二肽。優(yōu)選地，該第二肽的氨基酸序列由25個(gè)氨基酸或更少、或15個(gè)氨基酸或更少組成。在特定實(shí)施方案中，該第二肽由9-12個(gè)氨基酸、10-18個(gè)氨基酸、或8-18個(gè)氨基酸組成。優(yōu)選地，該第二肽含有T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，該T細(xì)胞表位是有效增強(qiáng)B細(xì)胞分化成產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞的T輔助細(xì)胞表位，或細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，該表位是不同的MHC等位基因的覆蓋型表位，或通過許多MHC同種異型呈遞的表位。在另一實(shí)施方案中，該表位是由不同的MHC等位基因呈遞的肽。

構(gòu)成或混入本發(fā)明的疫苗組合物中的肽優(yōu)選經(jīng)純化以除去污染的化學(xué)前體(如果化學(xué)合成的話)，或基本不含來自它們所衍生自的細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞材料。在特定實(shí)施方案中，該肽是60％，優(yōu)選65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％不含污染的化學(xué)前體、蛋白、脂質(zhì)或核酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該肽基本不含污染病毒。優(yōu)選地，用于施用于受試者的各組合物是至少95％、至少97％、或至少99％不含污染病毒。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物的至少一種肽或多種肽包含一種或更多種至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％與選自SEQ ID NO:2-13、SEQ ID NO:5-10、SEQ ID NO:11-13、SEQ ID NO:15-20和SEQ ID NO:21-23的任一種的肽相同的肽或由其組成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種肽或多種肽包含一種或更多種至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％與選自SEQ ID NO:2-13或SEQ ID NO:15-23的任一種的肽類似的肽或由其組成。在這方面，術(shù)語“類似”指的是根據(jù)相對(duì)于參考序列在查詢序列中保守性和非保守性氨基酸變化的數(shù)量定義的氨基酸序列相似度。保守性和非保守性氨基酸變化在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如W.R.Taylor,The Classification of Amino Acid Conservation,J.Theor.Biol.1986 119:205-218和D.Bordo與P.Argos,Suggestions for"Safe"Residue Substitutions in Site-Directed Mutagensis,1991J.Mol.Biol.217:721-729。通常，保守性氨基酸變化指的是一種氨基酸置換另一種具有基本類似的化學(xué)性質(zhì)的氨基酸，特別是參照氨基酸側(cè)鏈。非保守性變化指的是一種氨基酸置換另一種具有顯著不同的化學(xué)性質(zhì)的氨基酸。通常，保守性置換是本領(lǐng)域中被認(rèn)為不太可能影響多肽的整體結(jié)構(gòu)或生物功能的那些，而非保守性變化被認(rèn)為更有可能影響結(jié)構(gòu)和功能。

保守性氨基酸變化的非限制性實(shí)例包括在下列組中的氨基酸的置換：脂族、芳族、極性、非極性、酸性、堿性、可磷酸化疏水性、親水性、小非極性、小極性、大非極性和大極性。非保守性氨基酸變化的非限制性實(shí)例包括前述組之間的氨基酸置換。

在一個(gè)實(shí)施方案中，保守性氨基酸變化是其中所述殘基對(duì)的置換矩陣具有正值的置換。氨基酸置換矩陣的實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的，例如BLOSUM50矩陣或PAM250矩陣(參見W.A.Pearson,Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA,Meth.Enzymology,1990183:63-98,R.Doolittle編輯,Academic Press,San Diego)。打分矩陣(scoring matrices)的其它實(shí)例和它們之間的比較參見M.S.Johnson和J.P.Overington,1993,A Structural Basis for Sequence Comparisons:An Evalution of Scoring Methodologies,J.Mol.Biol.233:716-738。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，保守性氨基酸變化是一個(gè)氨基酸置換相同化學(xué)組中的另一個(gè)氨基酸，其中所述組選自中性和極性的氨基酸(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly、Asn、Gln)，帶負(fù)電荷和極性的氨基酸(Asp、Glu)，帶正電荷和極性的氨基酸(His、Arg、Lys)，缺乏環(huán)結(jié)構(gòu)的非極性氨基酸(Met、Ile、Leu、Val)，具有環(huán)結(jié)構(gòu)的非極性氨基酸(Phe、Tyr、Trp)和半胱氨酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包含嵌合蛋白作為其免疫原性組分，所述嵌合蛋白由兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立地選自SEQ ID NO 2-13或SEQ ID NO:15-23的MIC肽表位組成，其中所述表位是連接的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)MIC肽表位是相同的表位。在另一實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)MIC肽表位包含至少兩個(gè)不同的MIC肽表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含在病毒衣殼如乙型肝炎核衣殼的表面上顯示的嵌合蛋白作為其免疫原性組分。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包含嵌合蛋白作為其免疫原性組分，所述嵌合蛋白由置入具有與MICA相比類似的整體免疫球蛋白折疊的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域中的選自SEQ ID NO 2-13或SEQ ID NO:15-23的兩個(gè)或更多個(gè)MIC肽表位組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，該Ig結(jié)構(gòu)域是選自以下之一的Ig結(jié)構(gòu)域：UL18(人CMV)、IFN-α/β結(jié)合蛋白C12R的C端Ig結(jié)構(gòu)域(痘病毒誘騙受體，PDB ID:3OQ3)、來自T4樣噬菌體的外衣殼蛋白的N端Ig結(jié)構(gòu)域(Hoc，PDB ID:3SHS)和人CMV蛋白US2(PDB ID:1IM3)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包含適于單獨(dú)施用的兩種獨(dú)立組分，第一組分包含由第一MIC肽組成的免疫原，所述第一MIC肽包含MICA[SEQ ID NO:1]或MICB的全長α3結(jié)構(gòu)域或由其組成；第二組分包含由一個(gè)或更多個(gè)選自SEQ ID NO 2-13或SEQ ID NO:15-23的MIC肽表位組成的免疫原。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含含有由第一MIC肽組成的免疫原的第一組分，所述第一MIC肽包含MICA[SEQ ID NO:1]的全長α3結(jié)構(gòu)域或由其組成；以及一種或更多種附加組分，所述附加組分各自包含由一個(gè)或更多個(gè)選自SEQ ID NO 2-13或SEQ ID NO:15-23的MIC肽表位組成的免疫原。優(yōu)選地，第一組分以初免-加強(qiáng)方式根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法在第二組分或附加組分之前施用。

在與任意前述實(shí)施方案一致的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物可以包含一個(gè)或更多個(gè)編碼SEQ ID NO 1-23的MIC表位的多核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，編碼一個(gè)或更多個(gè)MIC表位的DNA為包含該DNA的納米粒子的形式。

肽變體

在一些情況下，本文中公開的肽的氨基酸序列可以被修飾和改變以產(chǎn)生例如肽變體(例如對(duì)本文中公開的肽具有限定的序列同源性的肽)，只要該肽變體的抗原結(jié)合性質(zhì)相對(duì)于未修飾肽得以保持或改善(可以使用本文中描述的體外和/或體內(nèi)測定和/或本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來評(píng)估任何修飾肽的抗原結(jié)合性質(zhì))。

雖然通常在氨基酸水平上觀察和討論肽變體，實(shí)際修飾通常在核酸水平上引入或進(jìn)行。例如，通過使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如克隆技術(shù))修飾編碼肽或其部分/片段的核酸，可以生成與本發(fā)明的肽具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98或99％氨基酸序列同一性的變體。

氨基酸序列修飾通常落入三類中的一類或更多類：置換性修飾、插入性修飾或缺失性修飾。插入包括氨基和/或端部融合以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。插入一般是將比氨基或羧基端部融合的那些更小的插入，例如大約一至四個(gè)殘基。缺失的特征是從蛋白序列中除去一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。通常，在蛋白分子中的任何一個(gè)位置處刪除不超過大約2至6個(gè)殘基。氨基酸置換通常為單一殘基，但是可以一次性在多個(gè)不同位置處發(fā)生；插入通常將為近似約1至10個(gè)氨基酸殘基；且缺失將為大約1至30個(gè)殘基的范圍。缺失或插入可以以相鄰對(duì)進(jìn)行，即缺失2個(gè)殘基或插入2個(gè)殘基。置換、缺失、插入或其任意組合可以組合以達(dá)成最終構(gòu)建物(construct)。突變必須不將序列放置在閱讀框之外，并優(yōu)選將不生成能夠產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。置換性修飾是其中至少一個(gè)殘基已經(jīng)被除去并在其位置中插入不同殘基的那些。在一些情況下，置換可以是保守性氨基酸置換。在一些情況下，本文中的肽相對(duì)于本發(fā)明的肽可以包括一個(gè)或更多個(gè)保守性氨基酸置換。例如，相對(duì)于表1中顯示的肽，變體可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-30、30-40或40-50個(gè)保守性氨基酸置換?；蛘?，相對(duì)于表1中顯示的肽，變體可以包括50個(gè)或更少、40個(gè)或更少、30個(gè)或更少、20個(gè)或更少、10個(gè)或更少、9個(gè)或更少、8個(gè)或更少、7個(gè)或更少、6個(gè)或更少、5個(gè)或更少、4個(gè)或更少、3個(gè)或更少、或者2個(gè)或更少保守性氨基酸置換。通常根據(jù)下表2進(jìn)行此類置換，并將其稱為保守性置換。預(yù)測對(duì)蛋白修飾的耐受性的方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見，例如Guo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,101(25):9205-9210(2004))。

表2：保守性氨基酸置換

在一些情況下，置換并非保守性的。例如，表1中顯示的肽中的氨基酸可以被可改變?cè)撾牡哪承┬再|(zhì)或方面的氨基酸替代。在一些情況下，可以進(jìn)行非保守性氨基酸置換以例如改變肽的結(jié)構(gòu)、改變肽的結(jié)合特性(例如提高或降低肽對(duì)抗原的結(jié)合親和力和/或改變提高或降低肽對(duì)抗原的結(jié)合特異性)。

在一些情況下，肽和/或肽變體可以包括或可以是表1中顯示的肽的片段。此類片段可以包括比表1中所示的CDRs、FRs和/或AAs少例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、3637、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、50-100、101-150個(gè)的氨基酸，例如，只要該片段保留該全長肽的至少部分結(jié)合特性(例如該全長肽的至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的結(jié)合特性)?？梢栽诎被┒?、羧基末端和/或本文中的肽內(nèi)進(jìn)行截?cái)唷?/p>

在一些情況下，肽變體的相互作用面可以與未修飾的肽相同(例如基本相同)，以便例如相對(duì)于未修飾的肽改變(例如提高或降低)、保留或保持該肽變體的結(jié)合特性。識(shí)別肽的相互作用面的方法在本領(lǐng)域中是已知的(Gong等人,BMC:Bioinformatics,6:1471-2105(2007)；Andrade和Wei等人,Pure andAppl.Chem.,64(11):1777-1781(1992)；Choi等人,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,77(1):14-25(2009)；Park等人,BMC:and Bioinformatics,10:1471-2105(2009))。

本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解如何確定兩個(gè)多肽的同一性(例如未修飾的肽和肽變體)。例如可以在比對(duì)兩個(gè)序列以使得同一性處于其最高水平之后計(jì)算該同一性。計(jì)算同一性的另一種方法可通過公布的算法來進(jìn)行。用于比較的序列的最佳比對(duì)可以通過以下方法來進(jìn)行：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math,2:482(1981)的局部同一性算法、Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性比對(duì)算法、Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的搜索相似性方法、這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，575Science Dr.,Madison,WI)或通過檢測(inspection)。

通過例如Zuker,Science 244:48-52(1989)；Jaeger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7706-10(1989)；Jaeger等人,Methods Enzymol.183:281-306(1989)中公開的算法可以對(duì)核酸獲得相同類型的同一性，對(duì)于至少涉及核酸比對(duì)的材料，所述文獻(xiàn)通過引用并入本文。要理解的是，通?？梢允褂萌魏畏椒?，并且在某些情況下，這些各種方法的結(jié)果可能不同，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解如果采用這些方法的至少一種發(fā)現(xiàn)同一性，該序列將據(jù)說具有所述同一性且欲公開在本文中。

在一些情況下，如在下文中方法段落中更詳細(xì)描述的那樣，本文中公開的治療組合物可以使用從使用本文中公開的方法獲得的免疫細(xì)胞(例如B細(xì)胞，包括記憶B細(xì)胞)中分離和/或純化的遺傳物質(zhì)(例如DNA和/或mRNA)來制造。一旦獲得此類遺傳物質(zhì)，使用其制造本文中公開的治療組合物的方法在本領(lǐng)域中是已知的和/或總結(jié)在下文中。

在一些情況下，肽可以包括可檢測標(biāo)記物。本文中所用的“標(biāo)記物”指的是一個(gè)部分，其具有使得所述標(biāo)記物連向的肽能夠被檢測的并入該部分中的至少一種元素、同位素或官能團(tuán)。標(biāo)記物可以直接連接(即經(jīng)由鍵)或可以通過接頭連接(如，諸如，例如環(huán)狀或無環(huán)的、支化或非支化的、取代或未取代的亞烷基；環(huán)狀或無環(huán)的、支化或非支化的、取代或未取代的亞烯基；環(huán)狀或無環(huán)的、支化或非支化的、取代或未取代的亞炔基；環(huán)狀或無環(huán)的、支化或非支化的、取代或未取代的亞雜烷基；環(huán)狀或無環(huán)的、支化或非支化的、取代或未取代的亞雜烯基；環(huán)狀或無環(huán)的、支化或非支化的、取代或未取代的亞雜炔基；取代或未取代的亞芳基；取代或未取代的亞雜芳基；或取代或未取代的亞?；?，或其任意組合，其可以組成接頭)。標(biāo)記物可以在不干擾被檢測的本發(fā)明的多肽的生物活性或特性的任何位置處連接到肽上。

標(biāo)記物可以包括：含有同位素部分的標(biāo)記物，所述同位素可以是放射性同位素或重同位素，包括但不限于²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、³¹P、³²P、³⁵S、⁶⁷Ga、^99mTc(Tc-99m)、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹⁶⁹Yb和¹⁸⁶Re；包括免疫或免疫反應(yīng)性部分的標(biāo)記物，其可以是抗體或抗原，其可以鍵合到酶(例如辣根過氧化物酶)；彩色的、發(fā)光的、磷光的或包括熒光部分的標(biāo)記物(例如熒光標(biāo)記物FITC)；具有一個(gè)或更多個(gè)光親和部分的標(biāo)記物；具有配體部分的標(biāo)記物，所述配體部分具有一個(gè)或更多個(gè)已知的結(jié)合配偶體(binding partner)(如生物素-抗生蛋白鏈菌素、FK506-FKBP等等)。

在一些情況下，標(biāo)記物可以包含一個(gè)或更多個(gè)光親和部分以便直接解析生物系統(tǒng)中的分子間相互作用?？梢圆捎枚喾N已知的發(fā)光團(tuán)(photophores)，大多數(shù)依靠重氮化合物、疊氮化物、或雙吖丙啶(diazirine)向氮賓或卡賓的光轉(zhuǎn)換(參見例如Bayley,H.,Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology(1983),Elsevier,Amsterdam,其全部內(nèi)容通過引用并入本文)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所用的光親和標(biāo)記物是被一個(gè)或更多個(gè)鹵素部分取代的鄰-、間-和對(duì)-疊氮基苯甲酰，包括但不限于4-疊氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸。

標(biāo)記物也可以是或可以充當(dāng)顯像劑。示例性顯像劑包括但不限于用于正電子放射斷層造影術(shù)(PET)、計(jì)算機(jī)輔助斷層造影術(shù)(CAT)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層造影術(shù)、x射線、熒光鏡透視檢查和磁共振成像(MRI)的那些；止吐劑；和對(duì)比劑。示例性診斷劑包括但不限于熒光部分、發(fā)光部分、磁性部分；釓螯合物(例如含有DTPA、DTPA-BMA、DOTA和HP-DO3A的釓螯合物)、鐵螯合物、鎂螯合物、錳螯合物、銅螯合物、鉻螯合物、可用于CAT和x射線成像的碘基材料、以及放射性核素。合適的放射性核素包括但不限于¹²³I、¹²⁵I、¹³⁰I、¹³¹I、¹³³I、¹³⁵I、⁴⁷Sc、⁷²As、⁷²Se、⁹⁰Y、⁸⁸Y、⁹⁷Ru、¹⁰⁰Pd、¹⁰¹mRh、¹¹⁹Sb、¹²⁸Ba、¹⁹⁷Hg、²¹¹At、²¹²Bi、²¹²Pb、¹⁰⁹Pd、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁷Cu、⁷⁵Br、⁷⁷Br、⁹⁹mTc、¹⁴C、¹³N、¹⁵O、³²P、³³P和¹⁸F。

熒光和發(fā)光部分包括但不限于通常稱為“染料”、“標(biāo)記物”或“指示劑”的多種不同的有機(jī)或無機(jī)小分子。實(shí)例包括但不限于熒光素、羅丹明、吖啶染料、Alexa染料、花青染料等等。熒光和發(fā)光部分可以包括多種天然存在的蛋白及其衍生物，例如基因工程變體。例如，熒光蛋白包括綠色熒光蛋白(GFP)，增強(qiáng)的GFP，紅色、藍(lán)色、黃色、青色和藍(lán)寶石熒光蛋白，造礁珊瑚熒光蛋白等等。發(fā)光蛋白包括熒光素酶、水母蛋白及其衍生物。許多熒光和發(fā)光染料和蛋白在本領(lǐng)域是已知的(參見例如美國專利公開2004/0067503；Valeur,B.,“Molecular Fluorescence:Principles and Applications”,John Wiley and Sons,2002；以及Handbook ofFluorescent Probes andResearch Products,Molecular Probes,第9版,2002)。

用于本發(fā)明的疫苗組合物的肽可以合成制造。在某些實(shí)施方案中，替換一個(gè)或更多個(gè)肽鍵以例如提高肽的生理穩(wěn)定性，通過：反向-翻轉(zhuǎn)鍵(retro-inverso bond)(C(O)-NH)；還原酰胺鍵(NH-CH₂)；硫亞甲基鍵(S-CH₂或CH₂-S)；氧亞甲基鍵(O-CH₂或CH₂-O)；亞乙基鍵(CH₂-CH₂)；硫代酰胺鍵(C(S)-NH)；反式烯烴鍵(CH＝CH)；氟取代的反式烯烴鍵(CF＝CH)；酮亞甲基鍵(C(O)-CHR或CHR-C(O)，其中R為H或CH₃)；和氟-酮亞甲基鍵(C(O)-CFR或CFR-C(O)，其中R為H或F或CH₃)。

在某些實(shí)施方案中，所述肽通過乙酰化、酰胺化、生物素?；?、肉桂?；?、法尼基化、熒光素化(fluoresceination)、甲?；⒍罐Ⅴ；?、棕櫚酰化、磷酸化(Ser、Tyr或Thr)、硬脂酰化、琥珀酰化和磺?；囊环N或更多種進(jìn)行修飾。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種肽或多種肽綴合到載體蛋白上。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體蛋白選自破傷風(fēng)毒素和白喉毒素。在另一實(shí)施方案中，修飾肽以便通過針對(duì)肽酶活性加以防護(hù)來延長體內(nèi)半衰期，例如US 2009/0175821中所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽或修飾肽進(jìn)一步綴合至聚乙二醇(PEG)、烷基(例如C1-C20直鏈或支鏈烷基)、脂肪酸基團(tuán)及其組合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種肽保持天然二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如為短二硫鍵連接的環(huán)。在另一實(shí)施方案中，使用二硫鍵或通過將肽暴露于化學(xué)接頭或交聯(lián)劑生成環(huán)形式的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含病毒衣殼蛋白，所述病毒衣殼蛋白經(jīng)改造以便在其表面上顯示所述至少一種肽或多種肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該病毒衣殼蛋白是乙型肝炎衣殼蛋白，例如描述在Proc Natl Acad Sci U S A.1999Mar 2；96(5):1915-20中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種肽或多種肽包含在膠束或納米粒子結(jié)構(gòu)中。使用膠束可以有利地例如保持肽二級(jí)結(jié)構(gòu)，如J.Am.Chem.Soc.,1998,120(39),第9979–9987頁中所述。

支架實(shí)施方案

在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物包含蛋白支架或?yàn)榈鞍字Ъ苄问?，并且所述至少一種肽或多種肽包含在該支架內(nèi)。特別優(yōu)選的支架是多孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)聚合物支架。在一個(gè)實(shí)施方案中，該支架進(jìn)一步包含GM-CSF蛋白和Toll樣受體激動(dòng)劑的一種或兩種。在一個(gè)實(shí)施方案中，該Toll樣受體激動(dòng)劑包含未甲基化CpG寡核苷酸(TLR9激動(dòng)劑)或由其組成。該支架還可以含有自體腫瘤細(xì)胞裂解物，其中自體參照治療的受試者(即受試者自己的腫瘤細(xì)胞的裂解物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該支架是US 2013/0202707、WO 2011/063336和US 2012/0100182中描述的WDVAX支架。該支架還描述在2009年1月11日在線出版的Nature Materials,DOI:10.1038/NMAT2357和Science Translation Medicine,Sci Transl Med 1,8ra19(2009)；DOI:10.1126/scitranslmed.3000359中。

添加劑和佐劑

本發(fā)明的疫苗組合物可以進(jìn)一步包含一種或更多種藥學(xué)上可接受的添加劑或佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗組合物不包含佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或更多種佐劑選自油基佐劑、CpG DNA佐劑、礦物鹽佐劑、礦物鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微粒佐劑、粘膜佐劑和細(xì)胞因子。

佐劑可以包含任意數(shù)量的遞送系統(tǒng)，例如礦物鹽、表面活性劑、合成微顆粒、水包油乳液、免疫刺激性復(fù)合物、脂質(zhì)體、病毒體和病毒樣顆粒。佐劑進(jìn)一步包含一種或更多種免疫響應(yīng)增效劑如微生物衍生物(例如細(xì)菌產(chǎn)物，毒素如霍亂毒素和來自大腸桿菌的不耐熱毒素，脂質(zhì)，脂蛋白，核酸，肽聚糖(peptidogylcans)，碳水化合物，肽)、細(xì)胞、細(xì)胞因子(例如樹突細(xì)胞、IL-12和GM-CSF)、激素和小分子。預(yù)期的佐劑包括但不限于油基佐劑(例如弗氏佐劑)、CpG寡核苷酸(參見Klinman 2003Expert Rev.Vaccines 2:305-15)、鋁鹽佐劑、鈣鹽佐劑、乳液和表面活性劑基制劑(例如MF59、ASO2、Montanide、ISA-51、ISA-720和QA21)。在疫苗佐劑方面的改進(jìn)的回顧參見Pashine等人.2005,Nature Med.11(4):S63-S68。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該佐劑包含一種或更多種Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，該TLR激動(dòng)劑是病原體相關(guān)激動(dòng)劑，選自三酰脂肽(革蘭氏陽性菌)、肽聚糖(革蘭氏陽性菌)、細(xì)菌脂蛋白、脂磷壁酸、LPS(牙齦卟啉單胞菌，問號(hào)鉤端螺旋體)、GPI-錨定蛋白(克氏錐蟲)、奈瑟氏球菌孔蛋白(neisserial porins)、血凝素(MV)、磷脂甘露聚糖(phospholipomannan)(念珠菌屬)、LAM(分枝桿菌)、ssRNA病毒(WNV)、dsRNA病毒(RSV、MCMV)、LPS(革蘭氏陰性菌)、F-蛋白(RSV)、甘露聚糖(念珠菌屬)、糖肌醇磷酸磷脂(錐蟲屬)、包膜蛋白(RSV和MMTV)、鞭毛蛋白(鞭毛菌)、酚可溶性調(diào)控蛋白(表皮葡萄球菌)、雙酰脂肽(支原體)、LTA(鏈球菌)、酵母聚糖(酵母屬)、病毒ssRNA(流行性感冒、VSV、HIV、HCV)、來自RNA病毒的ssRNA、dsDNA病毒(HSV、MCMV)、瘧原蟲色素(瘧原蟲屬)和未甲基化CpG DNA(細(xì)菌和病毒)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該TLR激動(dòng)劑是選自Pam3Cys、CFA、MALP2、Pam2Cys、FSL-1、Hib-OMPC、Poly I:C；poly A:U、AGP、MPL A、RC-529、MDF2β、CFA、鞭毛蛋白、MALP-2、Pam2Cys、FSL-1、鳥苷類似物、咪唑并喹啉(例如咪喹莫德、R848、瑞喹莫德())、洛索立賓、咪唑并喹啉、洛索立賓、ssPolyU、3M-012和CpG-寡核苷酸的合成配體。

制劑

本發(fā)明的疫苗組合物可以使用一種或更多種生理上可接受的載體或賦形劑來配制。例如，當(dāng)組合物配制為液體時(shí)，其可以包含無菌鹽水、葡萄糖溶液或緩沖溶液，或其它藥學(xué)上可接受的無菌流體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該制劑用于皮內(nèi)或皮下施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該制劑用于吸入或吹入(通過口或鼻)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該制劑用于經(jīng)口、含服、腸胃外、陰道或直腸施用。本文所用的術(shù)語腸胃外包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。

優(yōu)選地，配制該疫苗組合物以提供肽組分在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中提高的化學(xué)穩(wěn)定性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該制劑防止或減少肽的寡聚反應(yīng)。在另一實(shí)施例中，該制劑防止或減少該肽的氨基酸殘基的氧化。該制劑可以被凍干，或者可以是液體制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，配制該組合物用于注射。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物是無菌的凍干制劑，基本不含污染性細(xì)胞物質(zhì)、化學(xué)品、病毒或毒素。在特定實(shí)施方案中，在無菌單劑量容器中提供用于注射的制劑。該制劑可以含有或可以不含有添加的防腐劑。液體制劑可以采取諸如在油性或水性媒介物中的混懸劑、溶液或乳劑的形式，并且可以含有配制劑(formulatory agent)如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該制劑包含脂質(zhì)體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用一種或更多種用于治療癌癥的其它治療劑配制本發(fā)明的疫苗組合物。

本發(fā)明的疫苗組合物是藥物組合物，并可以包括一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體、添加劑或媒介物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體、添加劑或媒介物選自離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物遞送系統(tǒng)(SEDDS)如D-I-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、在藥物劑型中使用的表面活性劑如吐溫(Tween)或其它類似聚合物遞送基質(zhì)、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素基物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。環(huán)糊精如Ｉ-、θ-和Κ-環(huán)糊精，也可以有利地用于提高本文中所述配方的化合物的遞送。本發(fā)明的疫苗組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的酸、堿或緩沖劑以提高配制化合物或其遞送形式的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物為用于吸入和/或經(jīng)鼻給藥的溶液或粉末形式。此類組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)使用適當(dāng)?shù)姆稚┗驖櫇駝ㄖT如，例如吐溫80）和懸浮劑來配制。無菌可注射制劑還可以是在無毒的腸胃外可接受稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如作為在1,3-丁二醇中的溶液?？梢允褂玫目山邮艿拿浇槲锖腿軇┯绕涫歉事洞?、水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的固定油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以使用任何溫和的固定油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于制備注射劑，因?yàn)槭翘烊坏乃帉W(xué)上可接受的油，如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙烯化版本。這些油溶液或懸浮液還可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或通常用于配制藥學(xué)上可接受的劑型如乳劑和/或混懸劑的類似分散劑。其它常用表面活性劑如吐溫和司盤(Span)和/或通常用于制造藥學(xué)上可接受的固體、液體或其它劑型的其它類似乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑也可用于配制目的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物為口服可接受的劑型形式，包括但不限于膠囊劑、片劑、乳劑和水性混懸劑、分散劑和溶液。在用于口服的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還加入潤滑劑如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服，可用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)口服水性混懸劑和/或乳劑時(shí)，該活性成分可以懸浮或溶解在與乳化劑和/或懸浮劑組合的油相中。如果需要的話，可以加入某些甜味劑和/或調(diào)味劑和/或著色劑。

治療和給藥的方法

本發(fā)明的疫苗組合物可用于預(yù)防和治療癌癥。因此，本發(fā)明提供了在處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)下的受試者中預(yù)防癌癥的方法和在需要此類治療的受試者中治療癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和黑素瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是黑素瘤。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物施用于患有與MICA過度表達(dá)相關(guān)的癌癥的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自黑素瘤、肺癌、乳腺癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)腸癌、淋巴瘤或白血病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是黑素瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是漿細(xì)胞惡性腫瘤，例如，多發(fā)性骨髓瘤(MM)或漿細(xì)胞的癌前病癥。在一些實(shí)施方案中，受試者已被診斷為患有癌癥或易患癌癥。

本發(fā)明的疫苗組合物可以單獨(dú)施用，或作為如下所述的治療方案或組合治療的一部分施用。本發(fā)明的疫苗組合物還可以單獨(dú)施用，或多次施用，例如以初免-加強(qiáng)策略施用。在這方面，術(shù)語“初免-加強(qiáng)”指的是連續(xù)使用兩種不同的免疫原。這兩種不同的免疫原通常在一段時(shí)間后相繼施用，如10至30天或10至60天。在一個(gè)實(shí)施方案中，該時(shí)間段為2至4周。由此，例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物在時(shí)間0施用，且本發(fā)明的第二疫苗組合物(包含不同的免疫原)在一段時(shí)間后施用，例如10至30天，10至60天，或2至4周。

在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種不同的本發(fā)明的疫苗組合物如US 8,110,196中所述在多個(gè)部位處施用于受試者。優(yōu)選地，各部位引流至淋巴結(jié)或一組淋巴結(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物施用于引流至兩個(gè)或更多個(gè)淋巴結(jié)的多個(gè)部位，所述淋巴結(jié)選自頭頸部的淋巴結(jié)、腋淋巴結(jié)、氣管支氣管淋巴結(jié)、壁淋巴結(jié)、胃淋巴結(jié)、回結(jié)腸淋巴結(jié)以及腹股溝和腹股溝下(subinguinal)淋巴結(jié)。在另一實(shí)施方案中，該部位選自右臂、左臂、右大腿、左大腿、右肩、左肩、右乳房、左乳房、腹部、右臀和左臀。在一個(gè)實(shí)施方案中，該部位是或引流至未包膜的淋巴組織簇，其選自扁桃體、腺樣增殖體、闌尾和派爾集合淋巴結(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物施用于引流至脾臟的部位。

在一個(gè)實(shí)施方案中，各疫苗組合物通過獨(dú)立地選自皮內(nèi)、皮下、透皮、肌肉內(nèi)、經(jīng)口、直腸、陰道、通過吸入及其組合的途徑施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種組合物直接注射到不同解剖部位的淋巴結(jié)、淋巴結(jié)簇或未包膜的淋巴組織簇。

本發(fā)明的方法包括任何合適的給藥途徑，例如皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或粘膜。粘膜給藥途徑包括但不限于口服、直腸、陰道和鼻內(nèi)給藥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一種組合物透皮、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口、直腸、陰道或通過吸入來給藥。美國食品與藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的任何途徑可用于本發(fā)明的疫苗組合物。示例性給藥方法描述在FDA的CDERData Standards Manual,版本號(hào)004(其可以在fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm處獲得)。

優(yōu)選地，選擇給藥途徑以便將組合物靶向特定部位，例如通過直接注射至淋巴結(jié)或淋巴結(jié)簇、通過口服以靶向胃淋巴結(jié)、通過肛門給藥以靶向直腸淋巴結(jié)、通過吸入或氣溶膠靶向肺淋巴結(jié)、或通過任何其它合適的給藥途徑。

在本發(fā)明的方法包括向多個(gè)部位施用疫苗組合物的情況下，各組合物優(yōu)選基本同時(shí)施用，例如，在一到八小時(shí)內(nèi)或在相同的出診期間。在一個(gè)實(shí)施方案中，各組合物在一至二小時(shí)內(nèi)、在一至三小時(shí)內(nèi)、在一至四小時(shí)內(nèi)或在一至五小時(shí)內(nèi)施用。

當(dāng)該疫苗組合物為支架形式時(shí)，為受試者接種的方法包括將支架組合物植入受試者體內(nèi)，優(yōu)選皮下植入。在某些實(shí)施方案中，為受試者接種的方法可以包括在受試者解剖結(jié)構(gòu)的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域中植入或注射該支架疫苗組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括向受試者施用抗原呈遞細(xì)胞，該抗原呈遞細(xì)胞已經(jīng)用至少一種選自SEQ ID NO:2-13的MIC肽致敏。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括向受試者施用一種或更多種佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或更多種佐劑選自油基佐劑、CpG DNA佐劑、礦物鹽佐劑、礦物鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微粒佐劑、粘膜佐劑和細(xì)胞因子。此類佐劑可以與本發(fā)明的組合物一起配制，或與該組合物分開施用，例如在向受試者施用該組合物之前、同時(shí)或之后施用。

本文中公開的方法可應(yīng)用于寬范圍的物種，例如人類、非人靈長類動(dòng)物(例如猴子)、馬、牛、豬、綿羊、鹿、麋鹿、山羊、狗、貓、鼬、兔、豚鼠、倉鼠、大鼠和小鼠。

本文中使用的術(shù)語“治療”("treat"或"treating")指的是部分或完全減輕、抑制、改善和/或舒緩受試者所患有的疾病或病癥。在一些情況下，治療可以導(dǎo)致受試者所患有的疾病或病癥的持續(xù)不存在。

通常，方法包括選擇易受或患有病癥或疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者。在一些情況下，可以用本文中公開的藥物組合物治療該受試者的病癥或疾病。例如，在一些情況下，方法包括選擇患有癌癥的受試者，例如其中受試者的癌癥可以通過靶向MICA和/或血管生成素-2(angiopoetin-2)的一種或兩種來治療。

在一些情況下，治療方法可以包括根據(jù)預(yù)防或治療受試者所患有的疾病或病癥的需要單次施用、多次施用和重復(fù)施用。在一些情況下，治療方法可以包括在治療之前、在治療過程中和/或在治療之后評(píng)估受試者的疾病水平。在一些情況下，治療可以持續(xù)進(jìn)行，直到檢測到受試者的疾病水平的降低。

本文中所用的術(shù)語“施用(給藥)”("administer,""administering,"或"administration")指的是植入、吸收、攝取、注射或吸入本發(fā)明的肽，無論何種形式。在一些情況下，一種或更多種本文中公開的肽可以局部(例如經(jīng)鼻)和/或經(jīng)口施用于受試者。例如，本文中的方法包括施用有效量的化合物或化合物組合物以實(shí)現(xiàn)所需的或所規(guī)定的效果。任何特定患者的具體劑量和治療方案將取決于多個(gè)因素，包括所用具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、排泄率、藥物組合、疾病的嚴(yán)重程度和病程、病癥或癥狀、患者對(duì)疾病、病癥或癥狀的處置、以及治療醫(yī)生的判斷。

在給藥后，可以對(duì)受試者進(jìn)行評(píng)估以檢測、評(píng)價(jià)或確定他們的疾病水平。在一些情況下，治療可以持續(xù)進(jìn)行，直到檢測到受試者中疾病水平的變化(例如降低)。

在患者病癥改善時(shí)(例如受試者疾病水平的改變(例如降低))，可以在必要的情況下施用維持劑量的本發(fā)明的化合物、組合物或組合。隨后，可以根據(jù)癥狀降低給藥的劑量或頻率或兩者至保持改善的病癥的水平。但是，當(dāng)疾病癥狀出現(xiàn)任何復(fù)發(fā)時(shí)，患者可能長期需要間歇治療。

在一些情況下，本公開提供了檢測來自人類受試者的免疫細(xì)胞，例如B細(xì)胞和/或記憶B細(xì)胞的方法。此類方法可以例如用于監(jiān)控人類受試者中的免疫細(xì)胞，例如B細(xì)胞和/或記憶B細(xì)胞的水平，例如在一事件之后。示例性事件可以包括但不限于檢測疾病、感染；施用本文中公開的治療組合物、施用治療劑或治療方案、施用疫苗、誘導(dǎo)免疫響應(yīng)。此類方法可以臨床使用和/或用于研究。

有效量和劑量

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物的有效量是足以減輕患有癌癥的受試者中癌癥嚴(yán)重程度的量，或足以減輕或改善其一種或更多種癥狀的嚴(yán)重程度的量、足以防止癌癥進(jìn)展的量、足以防止癌癥進(jìn)一步轉(zhuǎn)移的量、足以引起癌癥的臨床消退的量、或足以增強(qiáng)或改善在本發(fā)明的疫苗組合物的同時(shí)、之前或之后施用的另一種療法或治療劑的治療效果的量。

癌癥的癥狀對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，并包括但不限于不尋常的痣特征、痣的外觀(包括不對(duì)稱、邊界、顏色和/或直徑)的變化、新著色的皮膚區(qū)域、不正常的痣、指甲下的變黑區(qū)域、乳房腫塊、乳頭變化、乳腺囊腫、乳房疼痛、死亡、消瘦、乏力、過度疲勞、進(jìn)食困難、食欲不振、慢性咳嗽、嚴(yán)重呼吸困難、咳血、血尿、便血、惡心、嘔吐、肝臟轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腹脹、胃氣脹、腹腔液、陰道出血、便秘、腹部膨大、結(jié)腸穿孔、急性腹膜炎(感染、發(fā)燒、疼痛)、疼痛、吐血、大量出汗、發(fā)燒、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、頭暈、發(fā)冷、肌肉痙攣、結(jié)腸轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、膀胱轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腎臟轉(zhuǎn)移和胰腺轉(zhuǎn)移，吞咽困難等等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物的有效量是足以產(chǎn)生抗體分泌B細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)本發(fā)明的疫苗組合物的一種或更多種肽的免疫響應(yīng)的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物的有效量是足以產(chǎn)生抗體分泌B細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)癌細(xì)胞的免疫響應(yīng)的量。本發(fā)明的疫苗組合物引發(fā)免疫響應(yīng)的能力可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何常規(guī)方法來確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，各組合物的有效量是足以在受試者中產(chǎn)生例如通過混合淋巴細(xì)胞T細(xì)胞測定法測得的細(xì)胞毒性T細(xì)胞響應(yīng)的量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，施用于受試者或在受試者的特定部位處施用的疫苗組合物的有效量是遞送1至1000微克的一種或更多種該組合物的肽的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽的量為1至100微克、1至200微克、1至300微克、1至400微克、1至500微克、1至600微克、1至700微克、1至800微克或1至900微克。在另一實(shí)施方案中，肽的量為1至10微克、1至20微克、1至30微克、1至40微克、1至50微克、1至60微克、1至70微克、1至80微克或1至90微克。優(yōu)選地，施用于受試者的肽的總量不超過5毫克，且最優(yōu)選該總量不超過2毫克。

組合治療

本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用本發(fā)明的疫苗組合物，以及一種或更多種附加治療劑或治療方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物作為包括手術(shù)、化學(xué)治療劑、或放射療法、免疫療法、或前述的任意組合的治療方案的一部分施用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療方案包含或進(jìn)一步包含一種或更多種免疫刺激劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或更多種免疫刺激劑選自抗-CTLA-4抗體或肽、抗-PD-1抗體或肽、抗-PDL-1抗體或肽、抗-OX40(也稱為CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗體或肽、抗-GITR(也稱為TNFRSF18、AITR和/或CD357)抗體或肽、抗-LAG-3抗體或肽和/或抗-TIM-3抗體或肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或更多種免疫刺激劑選自WO 2013/049517或WO 2008/036981中描述的抗MICA抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或更多種免疫刺激劑選自CM33322 Ab4、CM33322 Ab28和CM33322 Ab29，其描述在美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/792,034和61/913,198以及美國申請(qǐng)?zhí)?4/025,573中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療方案包含或進(jìn)一步包含一種或更多種細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包含一種或更多種細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種細(xì)胞因子是白介素或干擾素。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種細(xì)胞因子是選自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15和IL-18的白介素。在另一實(shí)施方案中，至少一種細(xì)胞因子是選自IFNα、IFNβ和IFNγ的干擾素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物作為治療方案的一部分施用，所述治療方案包括向受試者施用至少一種選自組蛋白去乙?；敢种苿?“HDAC”)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、烷基化劑和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的化學(xué)治療劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該化學(xué)治療劑是選自異羥肟酸、伏立諾他(Zolinza)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)(Merck)、曲古抑菌素A(TSA)、LAQ824(Novartis)、帕比司他(LBH589)(Novartis)、貝利司他(PXD101)(CuraGen)、ITF2357Italfarmaco SpA(Cinisello)、環(huán)四肽、酯肽(depsipeptide)(羅米地辛，F(xiàn)K228)(Gloucester Pharmaceuticals)、苯甲酰胺、恩替諾特(SNDX-275/MS-275)(Syndax Pharmaceuticals)、MGCD0103(Celgene)、短鏈脂族酸、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、pivanex(Titan Pharmaceutical)、CHR-3996(Chroma Therapeutics)和CHR-2845(Chroma Therapeutics)的HDAC抑制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該化學(xué)治療劑是選自硼替佐米(Millennium Pharmaceuticals)、NPI-0052(Nereus Pharmaceuticals)、卡非佐米(PR-171)(Onyx Pharmaceuticals)、CEP 18770和MLN9708的蛋白酶體抑制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該化學(xué)治療劑是烷基化劑，如馬法蘭(mephalan)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該化學(xué)治療劑是拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑如阿霉素(多柔比星)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療方案包含或進(jìn)一步包含化學(xué)療法、放射療法、細(xì)胞因子、趨化因子和其它生物信號(hào)分子、腫瘤特異性疫苗、細(xì)胞癌癥疫苗(例如GM-CSF轉(zhuǎn)導(dǎo)的癌細(xì)胞)、腫瘤特異性單克隆抗體、自體和同種異體干細(xì)胞解救(例如增加移植物抗腫瘤效果)、其它治療抗體、分子靶向療法、抗血管生成療法、具有治療目的的傳染劑(如腫瘤定位細(xì)菌)和基因療法的一種或更多種。

試劑盒

本發(fā)明提供了用于實(shí)施本發(fā)明的方法或治療方案的藥包或試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包含凍干形式的本發(fā)明的疫苗組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包含蛋白支架形式的本發(fā)明的疫苗組合物。

在另一實(shí)施方案中，該試劑盒在一個(gè)或更多個(gè)附加容器中進(jìn)一步包含細(xì)胞因子或佐劑。

各容器中的組合物可以為藥學(xué)上可接受的溶液的形式，例如與無菌鹽水、葡萄糖溶液或緩沖溶液、或其它藥學(xué)上可接受的無菌流體組合?；蛘?，該組合物可以凍干或干燥；在這種情況下，該試劑盒任選在單獨(dú)的容器中進(jìn)一步包含優(yōu)選無菌的藥學(xué)上可接受的溶液(例如鹽水、葡萄糖溶液等等)以便恢復(fù)該組合物以形成用于注射目的的溶液。

在另一實(shí)施方案中，該試劑盒進(jìn)一步包含一種或更多種可重復(fù)使用的或一次性的用于給藥的裝置(例如注射器、針頭、分配筆)，優(yōu)選以無菌形式包裝和/或包裝的酒精片。任選包括使用說明以便由臨床醫(yī)師或由患者施用該組合物。該試劑盒還可以包含其它材料，例如金屬或塑料箔，如泡罩包裝。

在一些實(shí)施方案中，本公開提供了在下列方法中使用本文中公開的疫苗組合物的任意一種或更多種(在下文中表示為“X”)的方法：

物質(zhì)X在一種或更多種本文中公開的疾病或病癥(例如癌癥，在下面的實(shí)施例中稱為“Y”)的治療中用作藥物。物質(zhì)X用于制造用于治療Y的藥物的用途；以及物質(zhì)X用于治療Y。

在一些情況下，本文中公開的治療組合物可以配制用于在美國銷售、進(jìn)口到美國和/或由美國出口。

除非另行定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。在本文中描述了用于本發(fā)明的方法和材料；也可以使用本領(lǐng)域已知的其它合適的方法與材料。材料、方法和實(shí)施例僅僅是說明性的，且并非意在限制。所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫條目和本文中提及的其它參考文獻(xiàn)通過引用以其全部并入。在沖突的情況下，將以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。

實(shí)施例

在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，該實(shí)施例不限制權(quán)利要求書中描述的本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：具有適當(dāng)放置的MICA抗體的表位的嵌合蛋白的設(shè)計(jì)

在圖3和4中顯示了兩種設(shè)計(jì)。在第一設(shè)計(jì)(圖3)中，將由人MICA抗體識(shí)別的兩個(gè)關(guān)鍵表位放入不相關(guān)的蛋白(來自人CMV的UL18)中，所述不相關(guān)蛋白具有類似的總免疫球蛋白折疊。在用人MICAα3結(jié)構(gòu)域的初次免疫后加強(qiáng)免疫的情況下，該蛋白應(yīng)當(dāng)尤其可用。

在第二設(shè)計(jì)(圖4)中，產(chǎn)生其中連接兩個(gè)關(guān)鍵表位的最小蛋白。因?yàn)镹端和C端緊鄰，該蛋白可以在病毒衣殼如乙型肝炎核衣殼的表面上顯示。

實(shí)施例2：人MICA抗體的治療活性

方法

該研究設(shè)計(jì)得到了機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(institutional animal care and use committee)的批準(zhǔn)(IACUC，方案ID 08-049)。六周齡雄性SCID(ICR-Prkdc^scid)小鼠獲自Taconic(Hudson,NY)。U937細(xì)胞獲自美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC,Manassas,VA)。為了進(jìn)行生存實(shí)驗(yàn)，將2×10⁶個(gè)細(xì)胞注入首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的腹膜腔中。在將小鼠隨機(jī)選擇至雙盲治療組中之前令腫瘤生長十天。各治療組含有十只小鼠，足以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室先前的經(jīng)驗(yàn)辨別生存益處。隨機(jī)選擇基于小鼠的體內(nèi)成像，治療組包含具有類似的整體平均信號(hào)強(qiáng)度的小鼠，顯示類似的腫瘤負(fù)荷。通過未進(jìn)行生存實(shí)驗(yàn)的外部實(shí)驗(yàn)室成員將治療雙盲。研究者以標(biāo)記為“A組”或“B組”的注射器給予治療。在各生存實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，研究并未混合。以100微克/劑靜脈注射給予抗體治療。動(dòng)物接受每周三劑，共進(jìn)行三周。每周將小鼠放血以便檢測循環(huán)sMICA。所有小鼠均包括在分析內(nèi)。

對(duì)于短期治療，皮下植入2×10⁶個(gè)U937細(xì)胞并令腫瘤生長(establish)十天。具有可觸知腫瘤的小鼠隨后用全人源抗體(同種型AML Ab2、Mel Ab28或Mel Ab29)治療一周(3×100微克)。初次治療后第八天，處死小鼠，并切除腫瘤和脾臟，記錄腫瘤質(zhì)量。在含有5毫升消化介質(zhì)的皮氏培養(yǎng)皿(petri dish)中將腫瘤切成小塊，所述消化介質(zhì)含有具有2％FBS的RPMI介質(zhì)、50U/毫升IV型膠原酶(Invitrogen)和10U/毫升DNA酶(Roche)。組織在消化介質(zhì)中在37℃下溫育2小時(shí)。隨后用溫和MACS Dissociator(Miltenyi Biotech)進(jìn)一步解離腫瘤。保存腫瘤細(xì)胞懸浮液的上清液用于測量局部sMICA濃度。細(xì)胞懸浮液經(jīng)70微米過濾器過濾并用PBS洗滌三次。單一細(xì)胞懸浮液隨后用Zombie Yellow(活性染料，BioLegend)、NKG2D-APC(CX5)、穿孔素-PE(eBioOMAK-D)、CD45-PacBlue(30-F11)、NKp46-PerCP/Cy5.5(29A1.4)、IFNγ-BV711(XMG1.2)、NK1.1-BV510(PK136)、CD16-APC/Cy7(93)和CD49b-FITC(DX5)染色以便進(jìn)行NK細(xì)胞分析。除了穿孔素(eBiosciences)之外，所有抗體來自BioLegend。細(xì)胞的附加單獨(dú)等分試樣使用抗MICA-PE(克隆6D4，BioLegend)染色用于MICA表達(dá)。

要理解的是，雖然已經(jīng)結(jié)合其詳述描述了本發(fā)明，前面的描述意在說明而不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求的范圍來限定。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修改在下面的權(quán)利要求范圍內(nèi)。

人MICA/B抗體有效抑制腫瘤微環(huán)境中的MICA脫落

建立用于評(píng)估人MICA抗體的治療功效的小鼠模型。小鼠不具有MICA或MICB直向同源基因(orthologs)，但是小鼠NKG2D受體識(shí)別人MICA/B。參見Liu等人.2013,JCI 123(10):4410-4422。我們?cè)诰哂蠳K細(xì)胞但缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞的SCID小鼠中植入了人U937細(xì)胞，一種AML細(xì)胞系。該模型使我們能夠確定人MICA抗體對(duì)NK細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)人腫瘤細(xì)胞的免疫的影響，但是CD8T細(xì)胞響應(yīng)不能在該模型中進(jìn)行評(píng)估。用鼠IgG2a Fc片段表達(dá)MICA抗體AML Ab2以使得能夠與鼠Fc受體適當(dāng)?shù)叵嗷プ饔??；颊呖贵w具有人IgG1同種型，其在功能上類似于小鼠IgG2a。用U937細(xì)胞植入小鼠并在十天后隨機(jī)分配到雙盲治療組中。三周時(shí)間的治療(3×100微克/周)提供了顯著的存活益處，在治療組(AML Ab2)中在第45天的存活率為55％，相比之下，在對(duì)照組(同種型)中為0％。參見圖5A。機(jī)理研究表明，在抗體治療僅兩周后，sMICA在血清中變得檢測不到，而sMICA水平在對(duì)照組中上升。參見圖5B。

我們接下來研究了使用三種全人源MICA/B抗體在早期時(shí)間點(diǎn)治療的功能效果。在患有皮下腫瘤的SCID小鼠治療一周后，在AML Ab2、Mel Ab28和Mel Ab29治療組中在小鼠中的sMICA水平與同種型對(duì)照相比大大降低。參見圖5C。腫瘤的流式細(xì)胞檢測分析也顯示了MICA在腫瘤細(xì)胞表面上顯著提高的表達(dá)，反映了體外結(jié)果。參見圖5D。這些結(jié)果證實(shí)，人MICA/B抗體有效抑制了腫瘤微環(huán)境中的MICA脫落，并由此提高了被細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞識(shí)別的腫瘤細(xì)胞上MICA的密度。

人MICA/B抗體由此改善了局部和全身兩者NK細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫

我們?cè)谝恢艿闹委煏r(shí)間點(diǎn)處對(duì)腫瘤浸潤NK細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的機(jī)理研究。抑制腫瘤中MICA脫落提高了在腫瘤浸潤NK細(xì)胞上的NKG2D表面表達(dá)。參見圖6A?？贵w治療還導(dǎo)致了腫瘤浸潤NK細(xì)胞的>40倍的擴(kuò)大，以及提高的NKp46受體的表達(dá)。參見圖6B和6C。擴(kuò)大的腫瘤浸潤NK細(xì)胞產(chǎn)生了更大量的IFNγ，一種對(duì)抗腫瘤免疫至關(guān)重要的細(xì)胞因子，并表達(dá)了更高水平的穿孔素，一種細(xì)胞毒性功能的關(guān)鍵分子。參見圖6d和6e。為了確定MICA/B抗體治療的小鼠中NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力，我們?cè)u(píng)估了通過脾臟NK細(xì)胞間接體內(nèi)殺滅YAC-1細(xì)胞。相對(duì)于同種型治療的小鼠，跨越所有抗MICA抗體治療的小鼠均觀察到增強(qiáng)的殺滅。參見圖6F。人MICA/B抗體由此改善了局部和全身兩者NK細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的免疫。