專利名稱:具有抗腫瘤活性的人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及具有有效的抗腫瘤活性的人源化抗體。特別地,該人源化抗體特異性地結(jié)合并直接殺滅人結(jié)腸腫瘤細胞,并且在抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)試驗中呈現(xiàn)出有效的免疫介導(dǎo)的抗人結(jié)腸癌細胞的細胞毒性活性。此外,本發(fā)明涉及這些人源化抗體在治療和診斷中的用途。
背景技術(shù):
碳水化合物結(jié)構(gòu)可能是腫瘤特異性的或腫瘤相關(guān)的抗原,并且因此是許多產(chǎn)生抗體免疫策略的焦點。然而,產(chǎn)生抗碳水化合物特異性抗體是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù),因為它們?nèi)狈μ禺愋?、親和性或只是IgM類的(Christensen等,2009)。此外,產(chǎn)生具有殺滅癌細胞能力的人源化抗碳水化合物抗體是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù),從很少量的關(guān)于這些抗體的報道中反映出這一事實。只存在一個已經(jīng)成功人源化的抗糖脂抗體的實例;該抗體在體外和體內(nèi)識別神經(jīng)節(jié)苷脂GM2并殺滅人腫瘤細胞(US專利6,423,511和6,872,392)。盡管沒有人源化,但存在另兩個已經(jīng)工程化用于人類給藥的碳水化合物結(jié)合抗體的實例。第一種,抗碳水化合物抗體RAV-12是在體外和體內(nèi)顯示出對抗人結(jié)腸癌細胞功效的嵌合鼠-人 IgG1 (Loo等,2007)。第二種,抗碳水化合物抗體HMMC-I已經(jīng)在體外顯示出對抗人卵巢癌的功效。HMMC-I是通過轉(zhuǎn)染色體(transchromosomal)KM小鼠產(chǎn)生的完全人抗體(Nozawa等, 2004)。國際專利申請No.W02005/108430公開了稱為SC104的抗癌小鼠單克隆抗體。 在此將該申請的公開內(nèi)容引入作為參考。SC104結(jié)合的抗原的確切性質(zhì)尚不清楚,但 W02005/108430表明了抗原是sialyltetraosyl碳水化合物。還公開了 SC104能夠直接誘導(dǎo)細胞死亡,而不需要免疫效應(yīng)細胞。
發(fā)明內(nèi)容
在第一個方面中,本發(fā)明提供了 Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū) (FR3)、第三個CDR(CDRiB)和第四個框架區(qū)(FR4),其中FRl 的序列是 XJQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVXfYSiy^SEQ ID NO 卯),其中& 是 Q 或 E& 是 S 或 T
& 是 I、L或 V)(4是3 或T或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO 96)或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R2 的序列是 WIRQ)(5PGKGLX6WX7G (SEQ ID NO :97),其中X5 是 S 或 P& 是 Q 或EX7 是 M 或 I或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選至少與其90%相同的序列,CDR2 的序列是 HlHX8SGRPirX9PSDC1c1S (SEQ ID NO :98),其中& 是 F、Y 或 WX9 是 N 或 DXltl 是 K、L、H、F、R 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選至少與其90%相同的序列,F(xiàn)R3 的序列是 RXn)(12ISX13)(14TAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :99),其中X11 是 V 或 IX12 是 T 或 SX13 是 R 或 KX14 是 E 或 D或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選至少與其90%或至少95%相同的序列,附帶條件是位置6的殘基必須是R或K,CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100),或與其至少90 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 101),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第二個方面中,本發(fā)明提供了 Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個⑶R,其中框架區(qū)的序列與序列QVQLQESGP GLVKPSETLSLTCTVSGYSX3SffIRQPPGKGLQffIGRVTISX13ETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCARffGQGTLVT VSS(SEQ ID NO :102)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同;其中)(3是I、L或V,并且)(13是1 或K ;并且CDRl的序列是SGYSWH (SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;CDR2 的序列是 HlHX8SGRPirX9PSDC1c1S (SEQ ID NO :98),其中& 是 F、Y 或 WX9 是 N 或 DX1。是 K、L、H、F、R 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列;
CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100),或與其至少90 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第三個方面中,本發(fā)明提供了 \抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū) (FR3)、第三個CDR(CDRiB)和第四個框架區(qū)(FR4),其中FRl 的序列是 EX15VLTQSPGTLSLSX16GERATLSC(SEQ ID NO :187)其中,X15 是 I 或 NX16 是 A 或 P或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO 188),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列,CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(17DFTLTISRVEPEDFAVYYC (SEQ ID NO 191),其中,X17 是 T 或 N或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R4的序列是reQGTKLEIKR(SEQ ID NO 193),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第四個方面中,本發(fā)明提供了 \抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個⑶R,其中框架區(qū)的序列與序列EIVLTQSPG TLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO 194)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同,并且CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列;CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列。在第五個方面中,本發(fā)明提供了 Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū) (FR3)、第三個CDR(CDRiB)和第四個框架區(qū)(FR4),其中FRl 的序列是 EVQU!QWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSXw)(19(SEQ ID NO :201),其中
父18是1、1^或 VX19 是 S 或 T或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R2 的序列是 WIRQPPGKGLEWX2CIG(SEQ ID NO :202),其中是 M 或 I或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98),其中X21 是 F、Y 或 W是 N 或 D&3是1(、1^、!1、卩、1 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R3 的序列是 RX2J25IS)(26DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :203),其中Xm 是 V 或 IXm 是 S 或 TXai 是 R 或 K或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,前提條件是位置6的殘基必須是R或K,CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100),或與其至少90 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 101),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第六個方面中,本發(fā)明提供了 Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個CDR,其中框架區(qū)的序列與序列EVQLQQWGA gllkpsetlsltcavygysx18swirqppgkglewigrvtisx26dtsknqfslklssvtaadtavyycarwgqgtlvt
VSS(SEQ ID NO :204)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同,其中&8是I、L或V,而&6是1 或K,并且CDRl的序列是SGYSWH (SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98),其中)(21 是 F、Y 或 W是 N 或 DX23 是 K、L、H、F、R 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列;和CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 10),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第七個方面中,本發(fā)明提供了 \抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū) (FR3)、第三個CDR(CDR3)和第四個框架區(qū)(FR4),其中FRl 的序列是 EX27VLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :211),其中,X27 是 I 或 N或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO 188),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列,CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(28DFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :212),其中是 T 或 N或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R4的序列是FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO 193),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第八個方面中,本發(fā)明提供了 \抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個⑶R,其中框架區(qū)的序列與序列EIVLTQSPA TLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO 213)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同,并且CDRl的序列為SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列,CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;和CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列。本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域,作為抗體的一部分呈現(xiàn)時,將結(jié)合人結(jié)腸癌細胞系 Colo205。如將理解的,抗體由分別包含可變區(qū)和恒定區(qū)的兩個重鏈和分別包含可變區(qū)和恒定區(qū)的兩個輕鏈組成。當(dāng)所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是¥11結(jié)合結(jié)構(gòu)域時,結(jié)合人結(jié)腸癌細胞系Colo205 的抗體將由兩個所述Vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域,SEQ ID NO. 7的兩個輕鏈和SEQ ID NO. 92或SEQ ID NO. 52的兩個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域組成。以相似的方式,當(dāng)所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是&結(jié)合結(jié)構(gòu)域時, 結(jié)合人結(jié)腸癌細胞系Colo205的抗體將由兩個所述八結(jié)合結(jié)構(gòu)域,SEQ ID NO. 93的兩個八恒定結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO. 94或SEQ ID N0. 50的兩個重鏈組成。
圖1-如通過流式細胞儀所示的,Use 104(SEQ ID NO :3/SEQ ID NO :1中所列的可變區(qū))和嵌合SC104(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO :2)抗體和人IgGl同種型對照對SC104抗原陽性(C170, Colo205)和SC104抗原陰性(HCT-116)人結(jié)腸癌細胞系的結(jié)合(左圖)和直接殺滅(右圖)活性,序列ID指的是序列號。嵌合SC104和鼠SC104抗體呈現(xiàn)出相當(dāng)?shù)目乖栃匀私Y(jié)腸癌細胞系的選擇性結(jié)合和直接殺滅活性。兩種抗體都沒有結(jié)合和直接殺滅抗原陰性人結(jié)腸癌細胞系。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖2-人受體框架1U6A或IQLR上結(jié)合Kabat-限定CDR-Hl的SC104的人源化 (-□“)產(chǎn)生了沒有結(jié)合SC104抗原陽性人結(jié)腸癌細胞系C170的非功能性抗體變體。使用抗原陽性細胞系C170通過流式細胞儀測定了使用嫁接至人受體1U6A(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO 9,圖 Α)或 IQLR(SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :10,圖 B)的 Kabat-限定 CDR-Hl 的人源化SC104變體的結(jié)合活性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖3-人受體框架1U6A或IQLR上結(jié)合AbM-限定CDR-Hl的SC104的人源化(-▲-) 產(chǎn)生了結(jié)合SC104抗原陽性人結(jié)腸癌細胞系C170的抗體變體。使用抗原陽性細胞系C170 通過流式細胞儀測定了結(jié)合嫁接至人受體1U6A(SEQ ID NO :7/SEQ ID N0:11,圖Α)或 IQLR(SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :12,圖 B)的 AbM-限定 CDR-Hl 的人源化 SC104 變體的結(jié)合活性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖4-針對增強1U6A人源化SC104的結(jié)合活性的輕鏈和重鏈氨基酸置換的分析。 通過流式細胞儀,通過抗原陽性細胞系C170的結(jié)合活性試驗,分析了每條鏈中置換的影響。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。A 含有 Kabat CDR-Hl 的嫁接;SEQ ID NO :9 是未取代的 VH,SEQ ID NO :15 含有 Vh 取代Q1E、Q46E、I48M、V67I、T68S、V71R和E72D,SEQ ID NO :7 指的是結(jié)合單個置換 A15P 的 Vl,而SEQ ID NO 16指的是含有三個置換I2N、A15P和T69N的Vl。B 含有 AbM CDR-Hl 的嫁接;SEQ ID NO 11 指的是不含置換的 VH, SEQ ID NO 13 含有VH置換Q1E、Q46E、I48M、V67I、T68S、V71R和E72D,SEQ ID NO :7 指的是結(jié)合單個置換 A15P的VL, SEQ ID NO 16指的是含有三個置換I2N、A15P和T69N的Vl。重鏈氨基酸置換(-□-或-〇_)增強了 ITOA-人源化SC104抗體變體與抗原陽性細胞系C170的結(jié)合活性。比較起來,輕鏈氨基酸置換似乎在增強人源化SC104的結(jié)合活性中不太重要。圖5-含有AbM限定⑶R-Hl的1U6A人源化抗體中結(jié)合的六個單獨Vh置換的分析。 通過流式細胞儀,通過抗原陽性細胞系C170的結(jié)合活性試驗,分析了置換的影響。這些變化是Q46E或I48M或V67I或T68S或V71R或E72D,并且分別通過SEQ ID N0:19至 來描述。置換R71(SEQ ID NO :23)(-〇_)在增強人源化SC104的結(jié)合功效中最有利。嵌合 SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。 每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖6_Vh置換R71 (- □-或-▲ _)增強了 AbM-和Kabat-限定CDR-Hl抗體變體與抗原陽性細胞系C170的結(jié)合活性,如通過流式細胞儀所測定的。嵌合SC104抗體(SEQ IDNO :4/SEQ ID NO 2)被顯示為比較對象,人IgG1同種型被用作陰性對照。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士 SD。A 基于 IQLR 的 SC104 變體士 V71R 置換;AbM 限定 CDR-Hl 嫁接SEQ ID NO :12(-R) 和 SEQ ID NO :26(+R) ;Kabat 限定 CDR-Hl 嫁接:SEQ ID NO :10(-R)和 SEQ ID NO :27(+R)。B 基于 1U6A 的 SC104 變體士 V71R 置換;AbM 限定 CDR-Hl 嫁接:SEQ ID NO :11(_R) 和 SEQ ID NO :25(+R) ;Kabat 限定 CDR-Hl 嫁接:SEQ ID NO :9(-R)和 SEQ ID NO :28(+R)。圖7-對含有Kabat限定CDR-Hl的IQLR人源化SC104變體中的Vh置換G27Y的結(jié)合活性的作用。在基于流式細胞儀的SC104抗原陽性細胞系C170的結(jié)合試驗中檢測時,該置換沒有增強 IQLR 人源化 SC104 (SEQ ID NO :27 (+R)和 SEQ ID NO :29(+R+Y) (-□-或-▲-) vs含有Vh的AbM-⑶R-HlSEQ ID NO 26)的結(jié)合活性。為了比較,顯示了不含R71的結(jié)合 Kabat-限定 CDR-Hl 的 IQLR 人源化變體,SEQ ID NO :10。嵌合 SC104 抗體(SEQ ID NO :4/ SEQ ID NO 2)被顯示為比較對象,人IgG1同種型被用作陰性對照。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士 SD。圖8-基于流式細胞儀的結(jié)合試驗,證明了通過嵌合SC104的⑶R-H2內(nèi)的F53置換從框架2:CDR-H2邊界除去預(yù)計的強MHC II類結(jié)合肽序列時對結(jié)合活性的影響。將F53 轉(zhuǎn)變成另一個芳香族殘基,如W(SEQ ID N0:30)或Y(SEQ ID M :31) (-□-或-〇-),對結(jié)合活性具有可以忽略的影響,而置換成優(yōu)選的殘基P(SEQ ID NO :32),強烈地降低了與 SC104抗原陽性細胞系C170的結(jié)合活性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2) 與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖9-就與抗原陽性(C170,Colo205)或抗原陰性(HCT-116)人結(jié)腸癌細胞系的特異性和結(jié)合活性而言,將具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104變體(1TOA VL/VH SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50 ;IQLR VL/VH SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38)與具有較高預(yù)測的免疫原性的人源化抗體變體(1U6A VL/VH SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :25 ;IQLR VL/VH SEQ ID NO 8/SEQ ID NO 26)進行比較,如通過流式細胞儀所測定的。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/ SEQ ID NO 2)與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士 SD。圖10-基于流式細胞儀的結(jié)合試驗,證明了可變重鏈的1U6A框架1中位置四的殘基 I (-〇-)(SEQ ID NO 50)和 L(- 口 -) (SEQ ID NO 62)而不是 C(- ▲ -) (SEQ ID NO 55)給予了具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體變體最高的與SC104抗原陽性人結(jié)腸癌細胞系C170的結(jié)合活性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)與人IgG1 同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖11-基于流式細胞儀的結(jié)合試驗,證明了可變重鏈的1U6A框架3中位置71的正電荷殘基R(SEQ ID NO :50) (-□-),而不是負電荷殘基D (SEQ ID NO :75) (-▲-)或中性殘基W(SEQ ID NO 90) (- ■-)給予了具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體變體最高的與SC104抗原陽性人結(jié)腸癌細胞系C170的結(jié)合活性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士 SD。圖12-如使用SC104抗原陽性人結(jié)腸癌細胞系C170通過流式細胞儀所測定的,結(jié)合 1U6A 框架的 SC104 抗體變體(VL/VH SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50 禾口 SEQ ID NO :7/SEQ
18ID NO 25) (- □-或-■-)與相應(yīng)的 IQLR 衍生的 SC104 變體(VL/VH SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38和SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :26)相比,具有更有效的直接殺滅活性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士 SD。圖13-如使用SC104抗原陽性人結(jié)腸癌細胞系C170通過LDH釋放試驗所測定的, 結(jié)合 1U6A 框架的人源化 SC104 抗體變體(Vl/Vh SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50 和 SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO 25) (- □-或-■-)與相應(yīng)的 IQLR 衍生的 SC104 變體(VL/VH SEQ ID NO :8/ SEQ ID NO :38和SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :26)相比,具有較高的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性活性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)被顯示為比較對象,而人IgG1 同種型被用作陰性對照。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖14-如使用SC104抗原陽性人結(jié)腸癌細胞系Colo205通過細胞生活力試驗所測定的,結(jié)合 1U6A 框架的 SC104 抗體變體(VL/VH SEQ ID NO 7/SEQ ID NO :50 和 SEQ ID N0: 7/SEQ ID NO 25) (- □-或-■-)與相應(yīng)的 IQLR 衍生的 SC104 抗體變體(VL/VH SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38禾口 SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :26)相比,具有更有效的補體依賴性細胞毒性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)與人IgG1同種型陰性對照一起顯示為比較對象。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖15-如使用SC104抗原陽性WiDr人結(jié)腸癌細胞系通過LDH釋放試驗所測定的, 幾夫堿(kifunensin)處理的具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體(SEQ ID N0 7/SEQ ID NO 50)(-〇-)與未處理的抗體(-▲-)相比,具有較高的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性活性。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖16-如使用SC104抗原陽性Colo201人結(jié)腸癌細胞系通過LDH釋放試驗所測定的,Potelligent 工程化的具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體(SEQ ID NO -J/ SEQ ID NO 94)(-〇-)與未處理的抗體(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)相比,具有較高的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性活性。每個點表示三個重復(fù)樣品的平均值士SD。圖17-用具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO 50)處理帶有HD9異種移植腫瘤的小鼠,與介質(zhì)對照處理相比,導(dǎo)致明顯降低的生長。 上圖6-10只小鼠組中,平均士SEM腫瘤體積。星號表示處理組之間的顯著差異,ρ < 0. 05, Marm-Whitney測試。下圖研究結(jié)束時的平均和單獨的腫瘤重量。P值是通過Marm-Whitney 測試測定的。圖18-用具有較低預(yù)測的免疫原性的Potelligent⑧工程化的人源化SC104抗體 (-O “) (SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :94)處理帶有Colo201異種移植腫瘤的小鼠,與介質(zhì)對照處理相比,導(dǎo)致明顯降低的腫瘤體積。10只小鼠組中的平均士SEM。星號表示處理組之間的顯著差異,ρ < 0. 05,t-測試。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及人源化抗癌結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域是基于小鼠抗體 SC104(W02005/108430)并且包含修飾的人框架序列,以提高結(jié)合和活性,并且降低預(yù)測的免疫原性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,在此產(chǎn)生和描述的序列可以進一步被修飾,以通過親和性突變來提高結(jié)合和提高Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。在此所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以單獨使用或結(jié)合使用,用于人癌癥的診斷和/或治療,例如結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌。
在第一個方面中,本發(fā)明提供了 Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū) (FR3)、第三個CDR(CDRiB)和第四個框架區(qū)(FR4),其中FRl 的序列是 XJQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVXfYSiy^SEQ ID NO 卯),其中X1 是 Q 或 EX2 是 S 或 T父3是1、1^或 VX4 是 S 或 T或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO 96)或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R2 的序列是 WIRQ)(5PGKGLX6WX7G (SEQ ID NO :97),其中)(5是3 或 PX6 是 Q 或 E父7是] 或 I或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選至少與其90%相同的序列,CDR2 的序列是 HlHX8SGRPirX9PSDC1c1S (SEQ ID NO :98),其中X8 是 F、Y 或 WX9 是 N 或 DX1。是 K、L、H、F、R 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選至少與其90%相同的序列,F(xiàn)R3 的序列是 RXn)(12ISX13)(14TAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :99),其中X11 是 V 或 I父12是丁或SX13 是 R 或 KX14 ^ E ^ D或與其至少90%或至少95 %相似的序列,優(yōu)選至少與其90 %或至少95 %相同的序列,附帶條件是位置6的殘基必須是R或K,CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 101),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第二個方面中,本發(fā)明提供了 Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個⑶R,其中框架區(qū)的序列與序列QVQLQESGP GLVKPSETLSLTCTVSGYSX3SffIRQPPGKGLQffIGRVTISX13ETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCARffGQGTLVT VSS(SEQ ID NO :102)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同;其中)(3是I、L或V,并且)(13是1 或K ;并且CDRl的序列是SGYSWH (SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;CDR2 的序列是 HlHX8SGRPirX9PSDC1c1S (SEQ ID NO :98),其中X8 是 F、Y 或 WX9 是 N 或 DX1。是 K、L、H、F、R 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列;CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和 FR4 的優(yōu)選序列如下FRl 選自 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS(SEQ ID NO 103),QVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVSGYSIT(SEQ ID NO 104),QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLS(SEQ ID NO :105), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLT(SEQ ID NO 106), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVS( SEQ ID NO 107), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVT(SEQ ID NO :108),QVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVTGYSIS(SEQ ID NO 109),QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT(SEQ ID NO :110), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLS(SEQ ID NO :111), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLT( SEQ ID NO :112), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVS(SEQ ID NO :113),QVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVTGYSVT(SEQ ID NO :114),EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS(SEQ ID NO :115), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIT(SEQ ID NO :116), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLS( SEQ ID NO :117), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLT(SEQ ID NO :118),EVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVSGYSVS(SEQ ID NO :119),EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVT(SEQ ID NO :120), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIS(SEQ ID NO :121), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT( SEQ ID NO :122), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLS(SEQ ID NO :123),EVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVTGYSLT(SEQ ID NO 124),EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSTGYSVS(SEQ ID NO :125) 和 EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVT(SEQ ID NO :126)。CDRl 是 SGYSWH (SEQ ID NO :96);FR2 選自 WIRQSPGKGLQWIG(SEQ ID NO :127), WIRQSPGKGLQWMG (SEQ ID NO :128), WIRQSPGKGLEffIG(SEQ ID NO :129),WIRQSPGKGLEWMG(SEQ ID NO :130),WIRQPPGKGLQffIG(SEQ ID NO :131), WIRQPPGKGLQWMG(SEQ ID NO :132), WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :133)和 WIRQPPGKGLEWMG(SEQ ID NO :134);CDR2 選自 HIHFSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO :135), HIHFSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO :136),HIHFSGRPTYNPSLLS(SEQ ID NO : 137),HIHFSGRPTYNPSLHS(SEQ ID NO :138),HIHFSGRPTYNPSLFS(SEQ ID NO : 139),HIHFSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO:
140), HlHffSGRPTYNPSLSS(SEQID NO 141), HIHffSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO142),HIHffSGRPTYNPSLLS (SEQIDNO 143),HIHffSGRPTYNPSLHS (SEQIDNO:144)HIHffSGRPTYNPSLFS (SEQIDNO:145),HIHffSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO ;:146)HIHYSGRPTYNPSLSS (SEQIDNO:147),HIHYSGRPTYNPSLKS (SEQIDNO :148)HIHYSGRPTYNPSLLS(SEQIDNO:149),HIHYSGRPTYNPSLHS(SEQIDNO:150)HIHYSGRPTYNPSLFS(SEQIDNO:151),HIHYSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO:152)HIHFSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO153),HIHFSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO:154)HIHFSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO155),HIHFSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO156),HIHFSGRPTYDPSLFS (SEQIDNO157),HIHFSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO158),HlHffSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO159),HIHffSGRPTYDPSLKS(SEQIDNO160),HIHffSGRPTYDPSLLS(SEQIDNO161),HIHffSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO162),HIHffSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO163),HIHffSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO164),HIHYSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO165),HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQIDN0;166),HIHYSGRPTYDPSLLS(SEQIDNO 167),HIHYSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO168),
HIHYSGRPTYDPSLFS(SEQ ID NO :169)和 HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQ ID NO :170);
FR3 選自 RVTISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO 171),RVTISRDTAKNQFS LKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :172),RVTISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 173), RVTISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :174),RVSISRETAKNQFSLKLTSMTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :175),RVSISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO : 176),RVSIS KETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :177), RVSISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(S EQ ID NO :178), RITISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :179),RIITSRDTAKNQFS LKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :180),RITISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 181),RIITSKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 182),RISISRETAKNQFSLKLTSMTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :183),RISISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO : 184),RISIS KETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO 185)和 RISISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO 186),CDR3 是 KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO 100),禾口FR4 是 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO : 101)。在第三個方面中,本發(fā)明提供了 VL抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū) (FR3)、第三個CDR(CDRiB)和第四個框架區(qū)(FR4),其中FRl 的序列是 EX15VLTQSPGTLSLSX16GERATLSC(SEQ ID NO :187)其中,X15 ^ I ^ NXjA或P或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO 188),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列,CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(17DFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :191),其中,X17 是 T 或 N或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R4的序列是reQGTKLEIKR(SEQ ID NO 193),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第四個方面中,本發(fā)明提供了 \抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個⑶R,其中框架區(qū)的序列與序列EIVLTQSPG TLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO 194)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同,并且CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列;CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列。FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和 FR4 的優(yōu)選序列如下FRl 選自 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :195),EIVLTQSPGTLSLSAGERATLSC(SEQ ID NO 196),ENVLTQSPGTLSLSPG ERATLSC(SEQ ID NO 197)和 ENVLTQSPGTLSLSAGERATLSC(SEQ ID NO :198)。CDRl 是 SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188);FR2 是 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189);CDR2 是 DTSNLAS(SEQ ID NO :190);FR3 是 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :199)或 GIPDRFSGSGSGN DFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :200);CDR3 是 FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)禾口FR4 是 FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO :193)。在第五個方面中,本發(fā)明提供了 VH抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū) (FR3)、第三個CDR(CDR3)和第四個框架區(qū)(FR4),其中FRl 的序列是 EVQU!QWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSXw)(19(SEQ ID NO :201),其中父18是1、1^或 VX19 是 S 或 T或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R2 的序列是 WIRQPPGKGLEWX2CIG(SEQ ID NO :202),其中&。是 M 或 I或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,
CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98),其中)(21是卩、¥ 或WX22 ^ N ^ D&3是1(、1^、!1、卩、1 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R3 的序列是 RX2J25IS)(26DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :203),其中X24 ^ V ^ IX25 ^ S ^ TXa^R 或 K或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,前提條件是位置6的殘基必須是R或K,CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100),或與其至少90 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 101),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第六個方面中,本發(fā)明提供了 Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個CDR,其中框架區(qū)的序列與序列EVQLQQWGA gllkpsetlsltcavygysx18swirqppgkglewigrvtisx26dtsknqfslklssvtaadtavyycarwgqgtlvt
VSS(SEQ ID NO :204)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同,其中‘是I、L或V,而&6是1 或K,并且CDRl的序列是SGYSWH (SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S (SEQ ID NO :98),其中X21 是 F、Y 或 WX。是 N 或 DX23 是 K、L、H、F、R 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列;和CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100),或與其至少90 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和 FR4 的優(yōu)選序列如下FRl 選自EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSIS(SEQ ID NO 205), EVQLQQffGAGLLKPSETLSLTCA VYGYSIT(SEQ ID NO :206),EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSLS(SEQ ID NO :207),EVQLQQff GAGLLKPSETLSLTCAVYGYSLT(SEQ ID NO 208), EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSVS(SEQ ID NO 209)和 EVQUIQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSVT(SEQ ID NO :210);CDRl 是 SGYSWH (SEQ ID NO 96);FR2 是 WIRQPPGKGLEWIG(SEQ ID NO :133)或 WIRQPPGKGLEWMG (SEQ ID NO :134);CDR2 選自 HIHFSGRPTYNPSLSS (SEQ ID NO 135),HIHFSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO :136),HIHFSGRPTYNPSLLS(SEQ ID NO 137),HIHFSGRPTYNPSLHS(SEQ IDNO 138), HIHFSGRPTYNPSLFS(SEQID NO :139),HIHFSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO 140), HlHffSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO:141), HIHffSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO:142),HIHffSGRPTYNPSLLS (SEQIDNO 143),HIHffSGRPTYNPSLHS(SEQIDNO:144),HIHffSGRPTYNPSLFS (SEQIDNO ;:145),HIHffSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO:146),HIHYSGRPTYNPSLSS(SEQIDNO :147),HIHYSGRPTYNPSLKS (SEQIDNO:148),HIHYSGRPTYNPSLLS(SEQIDNO:149),HIHYSGRPTYNPSLHS (SEQIDNO:150),HIHYSGRPTYNPSLFS (SEQIDNO ::151),HIHYSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO152),HIHFSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO :153),HIHFSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO154),HIHFSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO :155),HIHFSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO156),HIHFSGRPTYDPSLFS (SEQIDNO:157),HIHFSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO158),HlHffSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO:159),HIHffSGRPTYDPSLKS(SEQIDNO160),HIHffSGRPTYDPSLLS(SEQIDNO:161),HIHffSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO162),HIHffSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO ::163),HIHffSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO164),HIHYSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO :165),HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO166),HIHYSGRPTYDPSLLS(SEQIDNO ;:167),HIHYSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO168),HIHYSGRPTYDPSLFS(SEQ IDNO 169)和 HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQ ID NO :170);FR3選自 RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :218),RVTISKDTSKNQFS LKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :219),RVSISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 220),RVSISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :221),RITISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :222),RITISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 223),RISIS RDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 224), RISISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(S EQ ID NO :225)。CDR3 是 KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO :100)。FR4 是 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 101)。在第七個方面中,本發(fā)明提供了 \抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū) (FR3)、第三個CDR(CDRiB)和第四個框架區(qū)(FR4),其中FRl 的序列是 EX27VLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :211),其中,)(27 是 I 或 N或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO 188),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列,CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,F(xiàn)R3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(28DFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :212),其中是 T 或 N或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列,CDR3的序列是FQGSEYPLT (SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,F(xiàn)R4的序列是FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO 193),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。在第八個方面中,本發(fā)明提供了 \抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個⑶R,其中框架區(qū)的序列與序列EIVLTQSPA TLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO 213)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同,并且CDRl的序列為SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列,CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;和CDR3的序列是FQGSEYPLT (SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列。FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和 FR4 的優(yōu)選序列如下FRl 選自 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO :214)或 ENVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :21 。CDRl 是 SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)。FR2 是 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)。CDR2 是 DTSNLAS(SEQ ID NO 190)。FR3 是 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :216)或 GIPDRFSGSGSGN DFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :217)。CDR3 是 FQGSEYPLT(SEQ ID NO 192)。FR4 是 FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO :193)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的Vh和\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域進一步包含恒定結(jié)構(gòu)域。恒定結(jié)構(gòu)域可以是人或非人靈長類動物恒定區(qū),優(yōu)選人恒定區(qū)。在一個實施方案中, 重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的序列是 ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 52);或ASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO 92);或ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 53);禾口輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的序列為TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAI^Q SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 93) 在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中,提供了包含第一個方面的V1^n第二個方面的 Vl或第三個方面的Vh和第四個方面的\的抗體。本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體特異性地結(jié)合癌細胞,該癌細胞表達由SC104結(jié)合的抗原,癌癥特別是結(jié)直腸癌和非結(jié)直腸癌,如卵巢、胰腺、前列腺和肺癌。因此,在另一個方面中,本發(fā)明提供了治療受試者癌癥的方法,其中癌癥選自結(jié)直腸、卵巢、胰腺、前列腺和肺癌,該方法包括將治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體給藥于受試者。本發(fā)明還提供了檢測樣品中癌細胞存在的方法,該方法包括將細胞樣品接觸根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體,并且檢測根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體與細胞的結(jié)合。如所知的,可以使用本領(lǐng)域公知的方法來改進本發(fā)明中研發(fā)和描述的序列,以提高結(jié)合,例如,通過親和性成熟,或通過除去預(yù)測的MHC II類結(jié)合基序來降低免疫原性??梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)其功能性特征,如抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、血清半衰期、生物分布以及與Fc受體的結(jié)合,或這些的任意組合,來進一步增強在此研發(fā)和描述的序列的治療實用性??梢酝ㄟ^蛋白質(zhì)工程、糖工程或化學(xué)方法來實現(xiàn)這種調(diào)節(jié)。根據(jù)所需的治療應(yīng)用,可以有利地提高或降低這些活性中的任一種。用于抗體親和性成熟的各種方法是本領(lǐng)域已知的。這些中的許多是通過誘變,以及隨后的為了提高的親和性而進行選擇和/或篩選的基于產(chǎn)生變體蛋白的組或文庫的一般策略。誘變通常在DNA水平進行,例如,通過易出錯PCRCThie,Voedisch等,2009)、基因改組(shuffling) (Kolkman和Stemmer,2001)、使用誘變化學(xué)物質(zhì)或輻射、使用具有易出錯復(fù)制機制的“突變子”株(Greener,1996)或控制天然親和性成熟機制的體細胞超突變方法(Peled,Kuang等,2008)。還可以在RNA水平進行誘變,例如,通過使用Q β復(fù)制酶 (Kopsidas, Roberts等,2006)??梢院Y選提高的變體蛋白的基于文庫的方法可以基于各種展示技術(shù),如噬菌體、酵母、核糖體、細菌或哺乳動物細胞,并且是本領(lǐng)域公知的(Benhar, 2007)。可以通過更定點/更有預(yù)測性的方法來實現(xiàn)親和性成熟,例如,通過定向誘變或通過來自3D蛋白建模的發(fā)現(xiàn)指導(dǎo)的基因合成(參見,例如,Queen, Schneider等,1989或US 專利 6,180,370 或 US 專利 5,225,539)。Ferrara, Brunker 等,2006 ;Li, Sethuraman 等,2006 ;Stavenhagen, Gorlatov 等, 2007 ;Shields,Namenuk 等,2001 ;Shinkawa,Nakamura 等,2003 和 W02008/006554 已經(jīng)描述了提高ADCC的方法。在優(yōu)選的形式中,本發(fā)明的抗體具有降低的巖藻糖水平。Idusogie,Wong 等,2001 ;Dall ‘ Acqua,Cook 等,2006 ;Michaelsen,Aase 等, 1990 ;Brekke,Bremnes 等,1993 ;Tan,Shopes 等,1990 ;Norderhaug,Brekke 等,1991 已經(jīng)描述了提高CDC的方法。描述提高ADCC和CDC方法的參考文獻包括Natsume,化等,2008。在此通過交叉參考包括這些參考文獻每一篇的公開內(nèi)容。用于調(diào)節(jié)抗體血清半衰期和生物分布的各種方法是基于改變抗體和新生Fc受體 (FcRn)之間的相互作用,新生Fc受體是在保護IgC免受分解代謝并且維持高血清抗體濃度中起關(guān)鍵作用的受體。Dall'Acqua等描述了 IgGl的Fc區(qū)中增強與Fcfoi的結(jié)合親和性的置換,由此提高血清半衰期 all,Acqua, Woods等,200 ,并且用M252Y/S254T/T256E 的三個置換進一步證明了增強的生物利用率和ADCC活性的調(diào)節(jié)(Dall’ Acqua,Kiener等, 2006)。還可以參見 U. S.專利 No. 6,277,375 ;6,821,505 ;和 7,083,784。Hinton 等描述了位置250和428的給予提高的體內(nèi)半衰期的恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸置換(Hinton,Johlfs等, 2004)。(Hinton,Xiong 等,2006)。還可以參見 U. S.專利 No. 7,217,797。Petkova 等描述了位置307,380和434的給予提高的體內(nèi)半衰期的恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸置換(Petkova,Akilesh 等,2006)。還可以參見 Shields 等(Shields, Namenuk 等,2001)和 W02000/42072。調(diào)節(jié)與Fc受體的結(jié)合以及隨后通過這些受體介導(dǎo)的功能(包括Fcfoi結(jié)合和血清半衰期)的恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸置換的其他實例描述于U. S.專利申請No. 20090142340 ;20090068175 ;和 20090092599ο已知連接抗體分子的多糖影響抗體與Fc受體和多糖受體的相互作用,并且由此影響抗體活性,包括血清半衰期(Kaneko,Nimmerjahn等,2006 Jones, Papac等,2007 ; 和Kanda,Yamada等,2007)。因此,調(diào)節(jié)所需抗體活性的特定糖型(glycoform)可以給予治療優(yōu)勢。產(chǎn)生工程化糖型的方法是本領(lǐng)域已知的,并且包括但不限于U. S.專利 No. 6,602, 684 ;7,326,681 ;7,388,081 ;和 W02008/006554 所述的那些。通過添加聚乙二醇(PEG)延長半衰期已經(jīng)廣泛用于延長蛋白質(zhì)的血清半衰期,例如,由 Fishburn (Fi shburn,2008)所綜述的。如將被認(rèn)識的,可以在本發(fā)明的序列內(nèi)制得保守性氨基酸置換?!氨J匦灾脫Q”意思是具有相似特性的氨基酸。如本說明書中所用的,將以下的氨基酸組看成是保守性置換H、R 禾口 K ;D、E、_Q;V、I 禾口 L ;C 和 M ;S、T、P、A 禾口 G ;禾口F、Y 和 W。如將看到的,本說明書使用術(shù)語“%相似”和“%相同”來描述許多序列。如所理解的,術(shù)語“ %相同,,意思是在特定區(qū)域的兩個序列的比較中,兩個序列在相同位置具有特定數(shù)目的相同殘基。術(shù)語“%相似”具有相似的意思,但除了兩個序列之間的相同氨基酸數(shù)目之外,還必須關(guān)注氨基酸不相同但是上述保守性置換的位置。在整個說明書中,詞語“包括(comprise) ”或變形,如“包括(comprises) ”或“包括(comprising) ”,將理解為意味著包括所述要素、整體或步驟,或要素、整體或步驟的組, 但不排除任何其他要素、整體或步驟,或要素、整體或步驟的組。本說明書中提及的所有出版物在此引入作為參考。本說明書中已經(jīng)包括的文獻、 法案、材料、裝置、論文等的任何討論僅僅是用于提供本發(fā)明內(nèi)容的目的。沒有當(dāng)作允許這些物質(zhì)的任一或全部形成現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)或是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的公知常識的部分,因為在本申請的每個權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前,其存在于澳大利亞或別處。為了可以更好地理解本發(fā)明的性質(zhì),現(xiàn)在將通過參考以下實施例來描述其優(yōu)選形式。
具體實施例方式實施例1嵌合SC104抗體的產(chǎn)生將鼠SC104重鏈可變區(qū)(Vh)SEQ ID NO 1電子(in silico)格式化至人IgGl主鏈上(人IgGl重鏈CHl,鉸鏈,CH2&CH3結(jié)構(gòu)域,如NCBI登錄號AAH7M19及其衍生物),以產(chǎn)生嵌合SC104重鏈SEQ ID NO :2。相似地,將SC104輕鏈可變區(qū)(Vj SEQ ID NO :3電子 (in silico)格式化至人IgGl主鏈上(如NCBI登錄號P01834及其衍生物),以形成相應(yīng)的嵌合SC104輕鏈SEQ ID NO :4。DNA構(gòu)建體的格式化和產(chǎn)生將所得到的重鏈和輕鏈氨基酸序列回翻譯成DNA序列。在編碼重鏈多肽信號序列 SEQ ID NO 5的核苷酸序列中的上游包括了 5,-Vh-特異性限制位點AscI。將TthlllI限制位點引入編碼3’ -Vh區(qū)氨基酸TVSS的多核苷酸序列中。5’ -Vl-特異性限制位點BsiWI 結(jié)合編碼輕鏈多肽信號序列SEQ ID NO :6的核苷酸序列的上游。在編碼位于\區(qū)C-端的氨基酸RT的核酸序列的3-端包括RsrII限制位點。為了在CHO細胞中表達,然后使用 GeneOptimizer 技術(shù)(GeneArtJIH)將這些序列優(yōu)化。隨后通過合成的寡核苷酸(GeneArt,德國)的裝配,從頭合成可變區(qū)。將添加的限制位點用于將可變區(qū)克隆至含有合適IgGl恒定區(qū)的基于谷氨酰胺合成酶(GS)中國倉鼠卵巢(CHO)的基因表達系統(tǒng)載體中(Lonza,UK)。將所得到的含重鏈和含輕鏈的載體用于共同轉(zhuǎn)染CHO-KlSV細胞,以產(chǎn)生抗體??贵w構(gòu)建體的細胞培養(yǎng)和瞬時表達將CHO-KlSV(Lonza,UK)細胞以 2X IO5 個細胞 /ml_4X IO6 個細胞 /ml 在 Freestyle CHO化學(xué)限定的細胞生長培養(yǎng)基anvitrogen )中培養(yǎng),并且培養(yǎng)物補充6mM終濃度的L-谷氨酰胺anvitrogen )。將細胞在36. 5 °C、10 % CO2和140rpm 下培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前一天,將100ml培養(yǎng)體積以5X IO5個細胞/ml接種于500ml開口 Erlenmeyer 燒瓶(Corning )中。第二天,在 15mL Corning 試管中制備 ^iL 的 OptiPRO SFManvitrogen ),并與100 μ g的每種抗體鏈混合。將所得到的混合物通過 0. 2ym 13mm注射器端過濾裝置(Millipore )過濾至含有200 μ lFreestyle Max試劑 (Invitrogen )的新鮮15mL Corning 試管中。將混合物在室溫下培養(yǎng)10分鐘,然后加入之前接種的CH0-K1SV細胞中。7天后,通過在3000g下離心10分鐘來收集上清液,然后通過0. 2 μ m膜過濾至無菌容器中(Corning⑧過濾裝置)??贵w的純化將從轉(zhuǎn)染的CHO細胞收集的上清液調(diào)節(jié)至pH7. 4,然后裝載至HiTrap ProteinA 柱上(lmL, GE Healthcare)。用 30mL 的 IX PBS (pH7. 4)洗滌柱子。使用 0. IM pH3 的檸檬酸來進行洗脫。使用kba 脫鹽柱(Pierce )將洗脫的抗體脫鹽至IX PBS中(pH7. 4)。 通過A28tl值測定抗體濃度?;诹魇郊毎麅x的結(jié)合試驗在96V-孔平板(Eppendorf)中,用100 μ 1緩沖液(PBS加1 % FCS)中各種濃度的鼠SC104、嵌合SC104或人源化變體和人IgG1同種型(Sigma-Aldrich )在黑暗中在冰上培養(yǎng)活的腫瘤細胞和對照細胞OX105,如通過藍排除法所判斷的),重復(fù)三份。用緩沖液將細胞洗滌兩次,接著在含有分別用于檢測嵌合或鼠抗體的山羊抗人IgG(Fe-特異性的, Sigma-Aldrich ,綴合 FITC)或山羊抗鼠 IgG (Fe-特異性的,Sigma-Aldrich ,綴合 FITC) 的100 μ 1緩沖液中培養(yǎng)20min。洗滌后,將細胞重懸浮于緩沖液中,并在Cell Lab Quanta SC MPL上(Beckman Coulter),通過流式細胞儀,使用EV、側(cè)面散射和FL-I門控,來分析抗體結(jié)合;在獲取過程中,通過在下面墊個冷包(Eppendorf)來冷卻96-孔平板中的細胞。將結(jié)果表達為平均熒光強度(MFI);通過GraphPad Prism 軟件,使用非線性回歸分析,計算了曲線斜率值?;诹魇郊毎麅x的直接殺滅試驗在96V-孔平板(Eppendorf)中,用80 μ 1緩沖液(PBS加1 % FCS)中各種濃度的鼠SC104、嵌合SC104或人源化變體和人IgG1同種型(Sigma-Aldrich )在黑暗中在室溫下將活的腫瘤細胞O X 105,如通過藍排除法所判斷的)培養(yǎng)2. 5至3小時,重復(fù)三份。向每個孔中,加入20 μ 1緩沖液中的0. 15g 7AAD (BD ι Bioscience),并且將細胞再培養(yǎng)20min, 接著在Cell Lab Quanta SC MPL上(Beckman Coulter),通過流式細胞儀,使用EV、側(cè)面散射和FL-I門控,來測定細胞生活力;在獲取過程中,通過在下面墊個冷包(Eppendorf)來冷卻96-孔平板中的細胞。將結(jié)果表達為7AAD+細胞的百分比;通過GraphPad Prism 軟件,使用非線性回歸分析,計算了曲線斜率值。嵌合SC104抗體具有有效且特異性的與人結(jié)腸腫瘤細胞的結(jié)合并直接殺滅人結(jié)腸腫瘤細胞的活性測試嵌合和鼠親本SC104抗體與人結(jié)腸癌細胞系C170(ECACC登錄號97071507) 和Colo205(ATCC登錄號CCL_22》的結(jié)合;之前使用流式細胞儀試驗已經(jīng)顯示出鼠SC104 抗體強烈結(jié)合這些細胞系(Durrant,Harding等,2006)。圖1(左圖)顯示了 SC104抗體與 C170和Colo205的結(jié)合,但人IgG1同種型對照沒有,鼠和嵌合SC104抗體在一定的抗體濃度范圍內(nèi)都呈現(xiàn)出相似的結(jié)合強度。相反,沒有一個抗體結(jié)合人結(jié)腸癌系HCT-116(ATCC登錄號CCL-M7),由此將其定義為SC104抗原陰性。已知鼠SC104抗體誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤細胞的直接殺滅,不需要免疫效應(yīng)細胞或補體 (Durrant, Harding等,2006)。實際上,鼠和嵌合SC104抗體都顯示出有效直接的抗原陽性細胞C170和Colo205殺滅,但人IgG1同種型對照沒有;相反,抗體沒有顯示超過抗原陰性細胞HCT-116的背景殺滅(圖1,右圖)。使用不同抗原陰性人結(jié)直腸腫瘤細胞(HCT15,ATCC登錄號CCL-225)、人非腫瘤細胞(MRC5,ATCC登錄號CCL-171)或來自正常人捐獻者的外周血單核細胞的其他實驗顯示出對于鼠和/或嵌合SC104抗體沒有結(jié)合和沒有直接殺滅活性(數(shù)據(jù)未顯示)??傊?,嵌合 SC104抗體與親本鼠SC104抗體相比較時,具有相似的效力和特異性。因此,將嵌合SC104 抗體用作參照,來測試隨后產(chǎn)生的人源化SC104抗體變體的活性。實施例2SC104的人源化通過3D建模選擇合適的人框架受體使用晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(參見,例如,Research Collaboratory for StructuralBioinformatics(RCSB)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,http//www, rcsb. otr/pdb/home/home. do 世界蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的一部分,http //www, wwpdb. org)和軟件包Discovery Studio ¥1.7仏(3沈1巧8@,舊六),構(gòu)建了鼠5(104重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(Vl)的獨立3D模型。簡而言之,通過Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)詢問蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,使用鼠SC104重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)搜尋,以鑒定伴隨晶體結(jié)構(gòu)信息的相似多肽序列的抗體。隨后基于與鼠SC104可變區(qū)共享的氨基酸序列同一性和鑒定的晶體結(jié)構(gòu),將這些結(jié)構(gòu)用于構(gòu)建同源性模型。使用這些鼠%和\模型,從與鼠抗體那些共享框架結(jié)構(gòu)同源性的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獨立鑒定出合適的人Vh和\受體框架。為了確保正確的重鏈和輕鏈配對, 通過人源化過程進行相同抗體晶體結(jié)構(gòu)的Vh和\人受體框架。優(yōu)選具有更好鼠-人重鏈框架區(qū)結(jié)構(gòu)同源性的人受體抗體,其優(yōu)于具有更好鼠-人輕鏈框架同源性的那些。這些包括Pdb登錄號1U6A和1QLR。對人框架受體進行評價,以測試是否這些結(jié)構(gòu)能夠合適地支持 SC104 CDR0人源化抗體構(gòu)建體的格式化最初,鑒于CDR嫁接技術(shù)(參見,例如(Queen, Schneider等,1989)或US專利 6,180,370或US專利5,225,539)是基于這種分類,根據(jù)Kabat的方法(參見Kabat,1991) 限定鼠SC104互補性決定區(qū)(CDR)。在后一種人源化嘗試中,使用AbM命名法(參見,例如 (Dubel,2007)和其中結(jié)合的參考文獻)限定重鏈的CDRl (CDR-Hl),表1。使用DNAMar 軟件包(版本8 ;Lasergene ,USA)將⑶R電子(in silico)格式化至選定的人框架上。將 Vh區(qū)格式化至含有CH1、鉸鏈、CH2&CH3結(jié)構(gòu)域(如,NCBI登錄號AAH72419及其衍生物)的人IgGl重鏈上。伴隨地,使用相應(yīng)的人IgGl輕鏈恒定區(qū)(如NCBI登錄號P01834及其衍生物),將\區(qū)格式化。結(jié)合Kabat限定⑶R-Hl的人源化SC104變體出人意料地產(chǎn)生無功能抗體將人受體框架1U6A和IQLR用于SC104人源化。將鼠SC104輕鏈CDR格式化至 1U6A和IQLR輕鏈框架區(qū)上。通過用脯氨酸置換除去1U6A框架序列中位置15的不常見丙氨酸殘基(A15P),產(chǎn)生SEQ ID NO :7。按照以上所述的,將基于IQLR的人源化SC104輕鏈格式化,以產(chǎn)生SEQ ID NO :8。將相應(yīng)的基于1U6A的SC104重鏈格式化,以含有Kabat限定CDR-H1,SEQ ID NO :9。伴隨地,將基于IQLR的SC104重鏈格式化,以含有Kabat-限定 ⑶R-Hl,SEQ ID NO :10。在CHO細胞中共同表達基于1U6A的輕鏈和重鏈組合SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :9。在CHO細胞中還共同表達了基于IQLR的輕鏈和重鏈組合SEQ ID NO 8 和SEQ ID NO=IO0通過蛋白A親和性色譜純化所得到的抗體,并且使用流式細胞儀測試活細胞結(jié)合活性。令人驚訝地,這些都結(jié)合了 Kabat-限定⑶R-Hl的人源化抗體變體不能結(jié)合SC104抗原陽性細胞(圖2)。結(jié)合AbM-限定⑶R-Hl的人源化SC104變體令人驚訝地產(chǎn)生功能性抗體結(jié)合Kabat-限定⑶R-Hl人源化時出人意料的失敗后,應(yīng)用了 AbM-限定⑶R-Hl命名法(表1)。隨后,將基于1U6A-和IQLR的SC104重鏈格式化,以結(jié)合AbM-限定⑶R-H1, 分別為SEQ ID NO :11和12。在CHO細胞中共同表達基于1U6A的輕鏈和重鏈組合SEQ ID NO :7和SEQ ID NO 110在CHO細胞中還共同表達了基于IQLR的輕鏈和重鏈組合SEQ ID NO :8和SEQ ID N0:12。通過蛋白A親和性色譜純化所得到的抗體,并且使用流式細胞儀測試活細胞結(jié)合活性。令人驚訝地,這些都結(jié)合了 AbM-限定⑶R-Hl的人源化抗體變體結(jié)合了 SC104抗原陽性細胞(圖3)。提高人源化SC104的結(jié)合活性圖3顯示了與使用嵌合SC104觀察到的相比,人源化SC104抗體具有次最佳結(jié)合活性。這些數(shù)據(jù)表明為了使人源化SC104在結(jié)合活性中不具反應(yīng)損失,一個或多個框架氨基酸置換是重要的。為了解決這一問題,比較了鼠SC104和1U6A的框架多肽序列。使用鼠SC104可變區(qū)3D模型,將框架之間的氨基酸差異電子(in silico)標(biāo)記并查閱。鑒定了六個Vh和三個Vl氨基酸(包括置換A15P,以除去1U6A受體框架中發(fā)現(xiàn)的該位置的不常見丙氨酸殘基),用于進一步的體外研究,來測試它們對人源化抗體的結(jié)合活性的貢獻。使用 IQLR-人源化SC104進行了相似的分析,由此標(biāo)記了四個Vh和兩個\氨基酸,用于體外測試。IQLR人源化SC104中為體外研究標(biāo)記的所有位置與已經(jīng)在1U6A人源化SC104中鑒定的那些相同。隨后將嘗試聚焦于只使用1U6A受體鑒定在增強人源化SC104效力中關(guān)鍵的殘基。人源化Vh框架中需要的預(yù)測置換對于增強結(jié)合活性比人源化\中預(yù)測的那些更
重要重新合成編碼基于1U6A的SC104重鏈的AbM-和Kabat-限定CDR-Hl變體的基因, 以引入總共六個氨基酸殘基置換-Q46E、I48M、V67I、T68S、V71R、E72D (Kabat編號)。這分別產(chǎn)生了 SEQ ID NO 13 (AbM CDR-H1) ^P 15 (Kabat CDR-Hl)。通過以上所示的方法,將另外兩個氨基酸置換-QlE和S25T標(biāo)記為優(yōu)先性低于上述六個,其中并且也引入SEQ ID NO 13中,產(chǎn)生了 SEQ ID NO 14,為含有總共八個氨基酸置換的AbM-限定⑶R-Hl變體。相應(yīng)的AbM-和Kabat-嫁接的重鏈序列-SEQ ID NO 11和9,分別用作未置換對照。將基于1U6A的輕鏈格式化,引入三個置換_I2N、A15P、T69N (Kabat編號)_以形成 SEQ ID N0:16。將相應(yīng)的輕鏈序列SEQ ID NO :7用作最小置換的對照。將重鏈和輕鏈的置換和未置換或最小置換的組合共同表達,并且在基于流式細胞儀的細胞結(jié)合試驗中測定其活性。在含有Kabat-限定⑶R-Hl的嫁接中,兩個人源化SC104抗體變體SEQ ID NO :7/ SEQ ID N0:15和SEQ ID NO :16/SEQ ID NO :15共享相同的引入了上述六個氨基酸置換的重鏈(SEQ ID N0:15)。這些抗體展示出相似的陽性結(jié)合活性,與是否與含有置換(SEQ ID NO 16)或最小置換(SEQ ID NO 7)的輕鏈配對無關(guān)。相反,將重鏈變成含有Kabat-限定 ⑶R-Hl并且沒有氨基酸置換,如SEQ ID NO :9,則消除了結(jié)合,與是否使用輕鏈SEQ ID NO 7或SEQ ID N0:16無關(guān),圖4A。相似地,含有單個或所有三個置換(分別為SEQ ID NO 7 和16)的輕鏈與包含AbM-限定CDR-Hl的重鏈(參見,例如,SEQ ID NO 11和13,分別表示未置換和含置換的重鏈)配對時沒有明顯地影響人源化SC104抗體變體的有效結(jié)合活性, 圖4B。當(dāng)重鏈SEQ ID NO: 13轉(zhuǎn)換成重鏈SEQ ID NO 14時,觀察到了與圖4B相似的趨勢, 并且使用嵌合SC104(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO :2)進行了相同的基于流式細胞儀的結(jié)合試驗,結(jié)果未顯示。該數(shù)據(jù)表明置換QlE和S25T沒有負責(zé)通過重鏈SEQ ID N0:13和14與其未置換對應(yīng)物SEQ ID NO :11相比所示的有效結(jié)合活性。因此,沒有進一步研究置換QlE和 S25T。此外,這些數(shù)據(jù)證明了 1U6A重鏈中的一個或多個置換對于產(chǎn)生具有增強的結(jié)合活性的人源化SC104變體的重要性。將1U6A人源化SC104的重鏈中的置換在位置-I48M、V67I、T68S和V71R-引入 Kabat-嫁接的IQLR重鏈序列中(SEQ ID N0:10),產(chǎn)生SEQ ID N0:17。相似地,在IQLR人源化SC104輕鏈-I2N和T69N-中形成置換,以產(chǎn)生SEQ ID NO :18。用未置換(SEQ ID NO: 8)或含置換(SEQ ID NO 18)輕鏈表達時,含有AbM-限定CDR-Hl (SEQ ID NO 12)的抗體活性沒有受到顯著影響。表達具有含有上述置換的Kabat-限定CDR-Hl (SEQ ID NO 17)的 1QLR-SC104變體與未置換的IQLR伴侶SEQ ID NO :8產(chǎn)生了具有低結(jié)合活性的人源化變體。 用SEQ ID NO :17與完全置換的輕鏈SEQ ID NO :18共同表達時產(chǎn)生的抗體觀察到的可忽略的結(jié)合活性表明輕鏈中的置換對于IQLR-人源化SC104的結(jié)合活性是不利的。除了之前所述的那些,這些抗體變體的結(jié)合數(shù)據(jù)概括于表2中。Vh框架中R71的存在對于產(chǎn)生高活性人源化SC104是重要的單獨的1U6A重鏈可變區(qū)框架置換Q46E、I48M、V67I、T68S、V71R和E72D與Q1E — 起格式化至SEQ ID NO :11中,以產(chǎn)生SEQ ID N0:19至24。將所得到的重鏈與輕鏈SEQ ID NO 7共同表達,并且通過基于流式細胞儀的結(jié)合試驗來比較所得到的人源化SC104變體。 具有Q46E、I48M、V67I、T68S和E72D的人源化SC104抗體變體彼此間呈現(xiàn)出相似的結(jié)合活性,但與嵌合SC104抗體相比時,明顯較低,圖5。相反,攜帶V71R置換的人源化SC104抗體變體(由SEQ ID NO 23編碼)顯示出與嵌合SC104抗體相似的增強結(jié)合活性。這些數(shù)據(jù)表明除了 AbM-限定CDR-Hl以外,R71對于高效力的人源化形式的SC104是重要的。重新格式化含R71的重鏈來引入置換E1Q,SEQ ID NO :25,在與輕鏈SEQ ID NO :7共同表達時, 沒有改變所得到抗體的高水平的結(jié)合活性(未顯示)。R71增強了包含AbM-和Kabat-限定CDR-Hl的SC104人源化變體的結(jié)合活性將鑒定為對于使用人受體1U6A人源化的SC104的有效結(jié)合活性為關(guān)鍵的置換 V71R引入基于IQLR的SC104變體中,變體含有分別如SEQ ID NO 26和27中詳細描述的 AbM-或Kabat-限定CDR-Hl。為了比較,還將V71R引入了基于1U6A的SC104變體SEQ ID NO 10中,其包含Kabat-限定⑶R-Hl,以形成SEQ ID NO :28。在CHO細胞中共同表達基于IQLR的輕鏈和重鏈組合SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 26或SEQ ID NO :27。在CHO細胞中還共同表達了基于1U6A的輕鏈和重鏈組合SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :28。通過蛋白A 親和性色譜純化所得到的抗體,并且通過流式細胞儀測試對抗原陽性細胞系C179的活細胞結(jié)合活性。如通過流式細胞儀測量的,置換V71R顯著增強了基于IQLR的含有AbM-限定 CDR-Hl的SC104對抗原陽性細胞系C170的活細胞結(jié)合活性,對相應(yīng)的Kabat-限定嫁接的抗體,程度較低,圖6A。比較中,如通過流式細胞儀測量的,置換V71R顯著增強了 Kabat-和 AbM-限定⑶R-Hl基于1U6A的SC104變體對抗原陽性細胞系C170的活細胞結(jié)合活性,圖 6B。增強其中⑶R-Hl的AbM-和Kabat限定不同的區(qū)域中人源化SC104變體的結(jié)合活
性的氨基酸置換的鑒定與Kabat-嫁接的對應(yīng)物相比,AbM限定重鏈⑶Rl在CDR的氨基末端包括其他五個捐獻者氨基酸殘基,表1。這種含有AbM-限定CDR-Hl的SC104變體相對于其Kabat嫁接的對應(yīng)物一致的增強效力是令人驚訝的。表3比較了來自捐獻者(包括在AbM CDR-Hl嫁接物中)、1U6A和IQLR受體序列的這五個氨基酸,比較捐獻者和1U6A序列,顯示出非保守性差異G27Y最可能引起增強含有AbM-限定CDR-Hl的人源化變體相對于嵌合體的效力,因為T30S是保守性改變。將該置換G27Y結(jié)合至Kabat嫁接的1QLR-SC104變體SEQ ID NO 27 (+R),以產(chǎn)生SEQ ID N0:29(+R+Y)。在CHO細胞中共同表達該重鏈和基于IQLR的輕鏈SEQ ID NO :8,并且按照之前所述的純化所得到的抗體。為了比較,在通過流式細胞儀的抗原陽性細胞系C170的比較性活細胞結(jié)合活性中,包括結(jié)合Kabat-限定⑶R-Hl但不含R71 的IQLR人源化抗體(SEQ ID NO 10)和第二個結(jié)合AbM-限定CDR-Hl并含有R71的變體 (SEQ ID N0J6),圖7。出人意料地,通過輕鏈和重鏈組合SEQ ID NO :8和SEQ ID NO 29 產(chǎn)生的合成的人源化抗體變體不具有結(jié)合活性。實施例3具有較低預(yù)測的免疫原性的SC104變體對于預(yù)測的T細胞表位(Epibase ,Algonomics,比利時),電子(in silico)篩選鼠SC104可變區(qū)氨基酸序列。鑒定了兩個預(yù)測的II類主要組織相容性復(fù)合體(II類MHC) 結(jié)合肽。這些位于重鏈中的框架(FR)2 ⑶R-H2和⑶R-H2 :FR3邊界處。這些是特別令人感興趣的,因為對于它們的去除預(yù)測涉及置換CDR氨基酸殘基,這可以改變抗體結(jié)合效力。重鏈Vh區(qū)預(yù)測的II類MHC結(jié)合肽去除預(yù)測表明了用色氨酸(SEQ ID NO 30)或酪氨酸(SEQ ID NO :31),或優(yōu)選脯氨酸 (SEQ ID NO 32)置換CDR-H2序列HIHFSGRPTYNPSLSS的位置4的苯丙氨酸殘基時,鼠Vh區(qū)中的FR2:⑶R-H2 II類MHC結(jié)合肽的強度將降低。這些重鏈與輕鏈SEQ ID NO :4在CHO 細胞中共同表達,并且按照之前所述的通過蛋白A色譜純化所得到的抗體。令人驚訝地,使用嵌合SC104的比較性的基于流式細胞儀的結(jié)合試驗揭示了置換F53W和F53Y對通過嵌合 SC104觀察到的有效結(jié)合活性具有可以忽略的影響,而置換F53P明顯降低了所得到抗體的結(jié)合效力,圖8。此外,電子(in silico)免疫原性預(yù)測(通過軟件ftx)Pred,Singn,H 禾口 Raghava, G. P. S. ) (2001), ProPred-Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics,17 (12),1236-37。http://www. imtech. res. in/raghava/propred/)禾口 / 或 SYFPETHI(Rammensee, Bachmann 等,1999) ;http//www, syfpeithi. de/Scripts/ MHCServer. dll/EpitopePrediction. htm)表明了 SC104CDR-H2 嫁接至人受體主鏈 1U6A 或 IQLR中時,這種預(yù)測的II類MHC結(jié)合肽的強度降低。第二種預(yù)測的在⑶R-Hl :FR3邊界的II類MHC結(jié)合肽的存在預(yù)測存在于鼠和人源化SC104抗體序列中。具有較低預(yù)測的免疫原性的SC104變體基于基于ITOA-和IQLR-基的SC104的受體框架,產(chǎn)生了新的人源化變體,對其去除了潛在的II類主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合序列。簡而言之,只預(yù)測人源化輕鏈可變區(qū)具有容許的(即,種系)II類MHC結(jié)合序列,而預(yù)測IQLR和1U6A的重鏈可變區(qū)分別具有一個和兩個強結(jié)合的II類主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合序列。緊接著通過Kabat的方法限定CDR-Hl之前,還預(yù)測了更多的較弱結(jié)合的推定II類MHC結(jié)合序列。產(chǎn)生了置換策略,目的在于去除這些預(yù)測的II類MHC結(jié)合表位。構(gòu)建了如構(gòu)建了如SEQ ID NO 33至SEQ ID NO 38列出的一組基于IQLR的具有預(yù)測的較低免疫原性的SC104重鏈可變區(qū)變體。還構(gòu)建了如SEQ ID NO 39至SEQ ID NO 50列出的一組基于1U6A的具有預(yù)測的較低免疫原性的SC104重鏈可變區(qū)變體。在CHO細胞中進行了基于IQLR的輕鏈SEQ ID NO :8與變體SEQ ID N0:33至SEQ ID NO :38中每一個的共同表達,并且按照之前詳述的來純化所得到的抗體。相似地,在CHO細胞中進行了基于1U6A的輕鏈SEQ ID NO 7與變體SEQ ID NO 39至SEQ ID NO :50中每一個的共同表達,并且按照之前詳述的來純化所得到的抗體。在活細胞流式細胞儀試驗中,將具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體變體的對表達SC104抗原的人結(jié)腸癌細胞(C170,Colo205)的結(jié)合活性與嵌合SC104比較。在每種情況中,觀察到與嵌合抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合活性。SC104抗體結(jié)合也是細胞類型特異性的, 因為較低預(yù)測的免疫原性SC104變體沒有結(jié)合SC104抗原陰性人結(jié)腸癌細胞HCT116 ;圖9 中顯示了較低預(yù)測的免疫原性SC104變體的有效且特異性結(jié)合的實例。重鏈可變區(qū)中給予具有較低預(yù)測的免疫原性的SC104變體最佳結(jié)合活性的關(guān)鍵殘基的鑒定緊接著Kabat-限定⑶R-Hl之前的橫跨框架區(qū)中的氨基酸位置沈至30的序列 GY27SI29S結(jié)合至受體框架1U6A或IQLR中時,給予了具有較低預(yù)測的免疫原性的SC104變體高結(jié)合活性(圖9)。相反,序列GY27SF29S結(jié)合至基于IQLR受體框架的構(gòu)建體中時,令人驚訝地導(dǎo)致了差的結(jié)合活性(圖7),表明Y27不是涉及給予高結(jié)合活性的唯一殘基。隨后通過改變ITOA-人源化重鏈SEQ ID NO 50的這個位置存在的氨基酸來研究了位置四的不同氨基酸殘基對結(jié)合活性的影響。將重鏈變體與輕鏈SEQ ID NO :7在CHO細胞中共同表達, 按照之前所述的,通過蛋白A親和性色譜來純化,并通過流式細胞儀來測試。示例性結(jié)合數(shù)據(jù)顯示于圖10中,而表4概括了所有測試置換的結(jié)合活性。令人驚訝地,只有位置四的殘基 I(SEQ ID NO 50), L (SEQ ID NO :62)或 V(SEQ ID NO :70)給予了具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體變體最佳的結(jié)合活性,而大部分置換,包括I29F (SEQ ID NO :58), 導(dǎo)致了差的對SC104抗原陽性人癌細胞C170的結(jié)合活性。之前已經(jīng)證明了可變重鏈的框架3中的R71在產(chǎn)生具有最佳高結(jié)合活性的人源化變體中的重要性,圖6。為了進一步提高基于1U6A的具有較低預(yù)測的免疫原性的SC104變體的結(jié)合活性,將位置71的殘基進行置換,以產(chǎn)生一組重鏈變體。隨后將這些變體與輕鏈 SEQ ID N0:7在CHO細胞中共同表達,按照之前所述的,通過蛋白A親和性色譜來純化,并通過流式細胞儀來測試。示例性結(jié)合數(shù)據(jù)顯示于圖11中,而表5概括了所有測試置換的結(jié)合活性。出乎意料地,只有位置71的正電荷殘基R和K(分別為SEQ ID NO 50和81)給予了人源化SC104抗體變體對SC104抗原陽性人結(jié)腸癌細胞系C170的最高結(jié)合活性。CDR-H2中N-X-S基序的修飾已知N-連接的糖基化牽涉蛋白質(zhì)產(chǎn)物異質(zhì)性,并且潛在地影響免疫原性。對鼠可變區(qū)進行了潛在N-連接的糖基化位點的分析(參見,例如(如,2007)或R. Gupta,E. Jung和 S. Brunak 的 http //www, cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc 的軟件預(yù)測算法 NetNGlyc)。該分析鑒定出⑶R-H2序列內(nèi)的N-X-S基序,NPS。通常,N-X-S基序表示推定的N-連接的糖基化位點,然而,當(dāng)X是脯氨酸殘基時,該規(guī)則例外,這種情況下也是如此(參見,例如(Gavel 和von Heijne, 1990))。無論如何,進行了分析,以觀察⑶R-H2中的這種N殘基關(guān)于保持結(jié)合活性的方面是否容許改變。將嵌合SC104序列中的NPS序列改變成DPS,產(chǎn)生了 SEQ ID NO :51ο將輕鏈SEQ ID NO :4和重鏈SEQ ID NO :51在CHO細胞中共同表達,并且隨后純化所得到的產(chǎn)物(按照之前所述的)。在基于流式細胞儀的對SC104抗原陽性細胞系C170的結(jié)合試驗中,比較了所得到的抗體。與嵌合SC104比較時,通過⑶R-H2內(nèi)N — D置換去除 N-X-S基序?qū)λ玫娇贵w的結(jié)合效力具有可忽略的影響。實施例4
基于流式細胞儀的直接殺滅試驗按照實施例1中所述的,使用嵌合SC104、人源化SC104抗體變體或人IgG1同種型(Sigma-Aldrich 測試了活的腫瘤細胞O X 105,如通過藍排除法判斷的)。除了 SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :26 和 SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38 的基于 IQLR 的變體組合外,選擇由輕鏈和重鏈組合 SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :25 禾口 SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50 組成的基于 1U6A的人源化SC104抗體變體,用于進一步的研究。具有較低預(yù)測的免疫原性的新人源化SC104抗體變體具有有效的對抗人結(jié)腸癌細胞的直接殺滅活性具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體變體顯示出有效的人結(jié)腸癌細胞的直接殺滅活性,而不需要免疫效應(yīng)細胞。圖12顯示出使用C170腫瘤細胞通過這些人源化SC104抗體變體、嵌合SC104抗體和人同種型對照直接殺滅的實例。使用Colo205腫瘤目標(biāo)細胞測試時,獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。令人驚訝地,與IQLR框架衍生的SC104 抗體變體(SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :28 禾口 SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38)相比,1U6A 衍生的 SC104 抗體變體(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :25 和 SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)顯示出更有效的直接殺滅活性。鑒于這些SC104抗體變體相似的結(jié)合活性,因此這種直接殺滅活性的差異是出乎意料的(圖9)。實施例5抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)試驗使用Lymphopi^p ,根據(jù)制造商的實驗方案(Axis-Siield PoCAS),從正常人捐獻者的Buffy Coat制劑(由澳大利亞紅十字血液服務(wù)中心提供)純化效應(yīng)(外周血單核細胞)細胞。將活的效應(yīng)細胞(5 X IO6個/ml)在RPMI 1640 (Gibco )加10 % FCS中,在 37°C禾口 10% CO2下培養(yǎng)過夜。用PBS接著培養(yǎng)基(RPMI 1640w/o酚紅,Gibco ,加0. 5% FCS)洗滌腫瘤目標(biāo)細胞和效應(yīng)細胞,重懸浮于培養(yǎng)基中,并在96-孔U孔平板(Corning )中,在200 μ 1試驗中,用各種濃度的抗體(嵌合SC104、人源化SC104或人IgG1同種型, Sigma-Aldrich #15154)培養(yǎng),重復(fù)三份,試驗由以下終濃度的物質(zhì)組成目標(biāo)細胞, IX IO5個細胞/ml ;效應(yīng)細胞,2. 5 X IO6個細胞/ml ;抗體范圍10至0. 001ug/ml。對于對照, 在Triton .-X(Sigma-Aldrich )的不存在(最小目標(biāo))或存在(最大目標(biāo))下只培養(yǎng)目標(biāo)細胞,并且在抗體的不存在下培養(yǎng)目標(biāo)和效應(yīng)細胞(背景)。將平板在160xg下離心2min,并在潮濕的(X)2氣體和37°C下培養(yǎng)4小時。使用乳酸脫氫酶釋放試驗測量了細胞死亡。簡而言之,將平板在250xg下旋轉(zhuǎn)5min,并根據(jù)制造商的指導(dǎo),使用細胞毒性檢測試劑盒(Roche),將100 μ 1細胞上清液測試乳酸脫氫酶釋放。為了最小化污染細胞攜帶,將上清液通過96-孔0. 2微米Acroft^p 平板(Pall)過濾。通過在492nm處閱讀吸光度來定量LDH釋放,并使用以下的等式來計算百分比細胞毒性100X [樣品-平均(背景)]/平均(最大目標(biāo)-最小目標(biāo));通過GraphPad Prism 軟件,使用非線性回歸分析計算了 EC5tl 值。補體依賴性細胞毒性(⑶C)試驗在96孔平孔平板中(Corning ),在150 μ 1試驗中,在培養(yǎng)基(RPMI1640w/o, 酚紅,Gibco ,加5% FCS)中培養(yǎng)活的腫瘤目標(biāo)細胞,使用人補體血清(Sigma-Aldrich #S1764)和各種濃度的抗體(嵌合SC104,人源化SC104或人IgG1同種型,Sigma-Aldrich ,#15154),重復(fù)三份,試驗由以下終濃度的物質(zhì)組成目標(biāo)細胞,13. 3X IO4個細胞/ml,補體,15% ;抗體范圍10至O.Olug/ml。對于對照,在補體不存在(目標(biāo)背景)或存在(目標(biāo)&補體背景)下只培養(yǎng)目標(biāo)細胞,并且只在培養(yǎng)基中培養(yǎng)補體(補體背景)。將平板在 160xg下離心2min,并在潮濕的(X)2氣體和37°C下培養(yǎng)2_3小時。根據(jù)制造商的指導(dǎo),使用 CellTiter 96 試劑盒(Promega )測量細胞死亡,包括另外3_4小時的培養(yǎng)時間段。通過在492nm處閱讀吸光度來定量目標(biāo)細胞的死亡,并使用以下公式來計算百分比細胞毒性 100X [樣品-平均(目標(biāo)&補體背景)]/[平均(補體背景)_平均(目標(biāo)&補體背景)]; 通過GraphPad Prism. 軟件,使用非線性回歸分析計算了 EC5tl值。具有較低預(yù)測的免疫原性的新人源化SC104抗體變體具有有效的對抗人結(jié)腸腫瘤細胞的細胞毒性在抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性和補體依賴性細胞毒性試驗中,測試了具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104變體對抗結(jié)腸腫瘤細胞的細胞毒性。使用正常人捐獻者的外周血單核細胞,人源化SC104抗體變體和嵌合SC104抗體,但不是人同種型對照,具有有效的對抗C170腫瘤細胞的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性活性(圖13)。使用來自其他人捐獻者的外周血單核細胞獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。圖14顯示了使用人補體, 相同組的人源化SC104抗體變體和嵌合SC104抗體,而不是人同種型對照,具有有效的對抗 Colo205腫瘤細胞的補體依賴性細胞毒性活性。此外,所有其他具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體變體具有有效的對抗Colo205腫瘤細胞的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性和補體依賴性細胞毒性活性(數(shù)據(jù)未顯示)。與有差別的直接細胞殺滅數(shù)據(jù)一致,與IQLR 衍生的SC104抗體變體相比,1U6A衍生的SC104抗體變體顯示出更高的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性和補體依賴性細胞毒性活性。鑒于不同SC104抗體變體相似的結(jié)合活性,免疫介導(dǎo)的細胞毒性活性中的這種等級是出乎意料的(表6)。實施例6免疫組織化學(xué)實驗方案使用免疫組織化學(xué)篩選含有來自10-12名不同捐獻者的每種腫瘤類型樣品的多腫瘤人組織微矩陣對生物素化人源化SC104抗體變體的結(jié)合。生物素化的人IgG1同種型用于陰性對照染色。將該組織微矩陣切片接受一系列的不同抗原恢復(fù)策略,包括溫度、壓力和PH的改變。此外,進行一抗的連續(xù)稀釋,以獲得噪聲比最佳的可能信號。通過基于染色強度和陽性細胞百分比的四步等級中的視覺觀察,將抗體的免疫反應(yīng)性分級。人源化SC104抗體變體結(jié)合各種人癌癥類型分析來自不同人病人的各種不同癌癥類型與具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化 SC104抗體(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)的結(jié)合。人源化SC104抗體,而不是人同種型對照,結(jié)合了人結(jié)腸癌組織,證明了所用的結(jié)合條件的特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。表7概括了在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)了陽性膜染色(75% )。令人驚訝地,在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)了陽性染色(70% ),卵巢癌(25% )和肺癌(16. 7% )中程度較低。相反,在分析的有限樣品大小的腎癌中,沒有觀察到染色。這些結(jié)果表明具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體對于指出結(jié)直腸、 胰腺、卵巢和肺惡性腫瘤的腫瘤診斷是有用的。此外,可以設(shè)想具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體對于人的結(jié)直腸、胰腺、卵巢和肺癌的治療性處理是有用的??梢栽谑竽[瘤異種移植模型中評價這種體內(nèi)抗腫瘤功效。
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實施例7SC104抗體的效應(yīng)子功能增強可以通過提高抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性或補體依賴性細胞毒性或通過結(jié)合抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性和補體依賴性細胞毒性來增強抗體的效應(yīng)子功能。ADCC 增強使用抗體Fc區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化修飾,將SC104抗體變體和嵌合SC104工程化,以增強抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)活性。標(biāo)準(zhǔn)方法包括例如抗體Fc區(qū)的蛋白質(zhì)工程化或糖-工程化。作為蛋白質(zhì)工程化的實例,按照Lazar等,2006 (Lazar,Dang等,2006)所述的,在恒定重鏈序列中產(chǎn)生突變。具體地,將S122D、S181A、I215E突變引入Fc序列SEQ ID NO 52中,以形成SEQ ID N0:53。按照實施例2中所述的,在CHO細胞中表達,并通過蛋白A色譜純化后,在ADCC試驗中測試各種具有增強的Fc-區(qū)SEQ ID NO :52的人源化抗體和嵌合抗體。按照實施例5中所述的,測量了 ADCC功能。作為糖工程化的實例,根據(jù)Zhou等(Zhou,Shankara等,2008),用 kifunensin (0. 25 μ g/ml)將產(chǎn)生人源化SC104抗體變體或嵌合SC104抗體的CHO細胞培養(yǎng)8至10天。隨后,按照實施例2中所述的來純化抗體,并且按照實施例5中所述的來測量ADCC功能。糖工程化的另一個實例使用了Shinkawa T.等,2003 (J Biol Chem 278 =3466-73) 中所述的Potelligent 方法。如同標(biāo)準(zhǔn)恒定區(qū)主鏈上的IgG1那樣表達人源化抗體變體的可變輕鏈和重鏈區(qū)。恒定重鏈的序列是GenBank P01857. 1,并且恒定輕鏈的序列是NCBI登錄號P01834。按照實施例5中所述的來測量ADCC功能。效應(yīng)子增強的SC104抗體變體和嵌合SC104抗體具有提高的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性在一系列的實驗中,使用蛋白質(zhì)工程化或糖工程化來提高具有低預(yù)測的免疫原性的嵌合SC104抗體和SC104抗體變體的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性。與未修飾的抗體相比,F(xiàn)c-工程化的(SEQ ID NO 53)或kifunensin處理過的SC104人源化抗體變體和嵌合SC104抗體顯示出提高的對抗Colo205腫瘤細胞的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性。圖 15顯示出通過kifunensin處理的具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)明顯提高殺滅人結(jié)腸癌細胞WiDr (ATCC登錄號CCL-218)的實例。圖 16顯示了通過Potelligent 處理的具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :94,恒定重鏈的序列和恒定輕鏈的序列分別是GenBank P01857. 1和 NCBI登錄號P01834)明顯提高殺滅人結(jié)腸癌細胞Colo201 (ATCC登錄號CCL-224)的實例。實施例8預(yù)防性鼠異種移植HD9腫瘤模型將雌性BALB/c裸鼠皮下接種2 X IO6個人結(jié)腸癌Η ^9細胞(ATCC登錄號ΗΤΒ-38)。 腫瘤細胞接種同一天(第0天),基于體重,將小鼠隨機分成兩個處理組(n = 10/組)。每組用介質(zhì)對照(PBS,10mg/kg)或人源化SC104抗體(10mg/kg)通過腹腔內(nèi)處理。每周給予介質(zhì)對照和人源化SC104抗體兩次,持續(xù)四周。使用以下公式每周計算腫瘤體積三次體積 (mm3)=長度 X 直徑 2X π/6。
在研究過程中,由于過度的體重減輕,必須剔出一些小鼠,導(dǎo)致介質(zhì)對照(n = 6) 和抗體(n = 9)處理組的小鼠數(shù)量減少。在研究終止時(第27天),從所有小鼠尸檢中去除腫瘤,清潔皮膚并稱重。治療性鼠異種移植Colo201腫瘤模型將雌性無胸腺裸鼠皮下接種5X106個人結(jié)腸癌Colo201細胞(ATCC登錄號 CCL-224)。腫瘤體積達到 IlOmm3后(第0天),將小鼠隨機分成兩個處理組(n= 10/組)。 每組用介質(zhì)對照(PBS,10mg/kg)或人源化的Potelligent 工程化(按照實施例7中所述的)的SC104抗體(10mg/kg)通過腹腔內(nèi)處理。每周給藥介質(zhì)對照和人源化Potelligent 工程化SC104抗體兩次,持續(xù)38天。使用以下公式每周計算腫瘤體積兩次體積(mm3)= 1/2 (a2Xb),其中“a”是最小的直徑,“b”是最大的直徑。具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體在體內(nèi)的有效抗腫瘤功效與預(yù)防性肌四腫瘤模型中的介質(zhì)對照處理相比,用具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)處理帶有腫瘤的小鼠導(dǎo)致了明顯減小的腫瘤體積和腫瘤重量(圖17)。此外,在治療性Colo201處理模型中,具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化Potelligent .-工程化SC104抗體(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :94)顯示出明顯的抗腫瘤活性(圖18)??梢栽O(shè)想具有較低預(yù)測的免疫原性的人源化SC104抗體變體作為單一治療或結(jié)合其他治療性抗腫瘤劑(例如,化療、小分子或生物制劑),對于人的結(jié)直腸癌的治療是有用的。表1. SC104 的 CDR 序列
權(quán)利要求
1.一種Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FR1)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū)(FR3)、第三個 CDR(CDR3)和第四個框架區(qū)(FR4),其中(i)FRl的序列是 XJQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVXfYS^yCjSEQ ID N0:%),其中 X1是Q或EX2是S或T &是I、L或V X4是S或T或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列;(ii)CDRl的序列是SGYSWH(SEQID NO 96)或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;(iii)FR2的序列是 WIRQX5PGKGL)(6WX7G(SEQ ID NO :97),其中 X5是S或PX6是Q或E X7是M或I或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選至少與其90%相同的序列;(iv)CDR2的序列是 HIHX8SGRPITX9PSIJ(1(iS(SEQ ID NO :98),其中 &是F、Y或WX9是N或DX1。是K、L、H、F、R 或 S或與其至少90 %相似的序列,優(yōu)選至少與其90 %相同的序列,(v)FR3 的序列是 RXn)(12ISX13)(14TAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :99),其中父工工是乂或IX12是T或S X13是R或K X14是E或D或與其至少90 %或至少95 %相似的序列,優(yōu)選至少與其90 %或至少95 %相同的序列, 附帶條件是位置6的殘基必須是R或K ;(vi)CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,(vii)FR4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQID NO :101),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。
2.一種Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個CDR,其中框架區(qū)的序列與序列qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgysx3swi RQPPGKGLQWIGRVTISX13ETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCARWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :102)至少 90%相同,優(yōu)選至少95%相同;其中&是I、L或V,并且X13是R或K ;并且⑶Rl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;CDR2 的序列是 HIHX8SGRPirX9PSLX1(lS(SEQ ID NO :98),其中 &是F、Y或W X9是N或DX1。是K、L、H、F、R 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列; CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FRl的序列選自QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS(SEQIDNO103)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIT(SEQIDNO104)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLS(SEQIDNO105)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLT(SEQIDNO106)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVS(SEQIDNO107)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVT(SEQIDNO108)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIS(SEQIDNO109)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT(SEQIDNO110)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLS(SEQIDNO111)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLT(SEQIDNO112)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVS(SEQIDNO113)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVT(SEQIDNO114)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS(SEQIDNO115)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIT(SEQIDNO116)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLS(SEQIDNO117)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLT(SEQIDNO118)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVS(SEQIDNO119)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVT(SEQIDNO120)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIS(SEQIDNO121)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT(SEQIDNO122)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLS(SEQIDNO123)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLT(SEQIDNO124)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSTGYSVS(SEQ ID NO :125)禾口 EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVT(SEQ ID NO :126)。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的¥11抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中⑶Rl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO 96)。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的VH抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR2的序列選自WIRQS PGKGLQffIG(SEQ ID NO 127), WIRQSPGKGLQWMG (SEQ ID NO 128), WIRQSPGKGLEffIG(SEQ ID NO 129), WIRQSPGKGLEffMG(SEQ ID NO 130), WIRQPPGKGLQffIG(SEQ ID NO: 131), WIRQPPGKGLQffMG(SEQ ID NO 132), WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :133)禾口WIRQPPGKGLEWMG(SEQ ID NO :134)。
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的VH抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDR2的序列選自 HIHFSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO 135),HIHFSGRPTYNPSLKS(SEQ ID NO: 136),HIHFSGRPTYNPSLLS (SEQ IDNO 137),HIHFSGRPTYNPSLHS (SEQ ID NO: 138),HIHFSGRPTYNPSLFS(SEQ ID NO 139),HIHFSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO: 140), HlHffSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO 141), HIHffSGRPTYNPSLKS(SEQ ID NO: 142), HIHffSGRPTYNPSLLS(SEQ ID NO 143), HIHffSGRPTYNPSLHS(SEQ ID NO: 144), HIHffSGRPTYNPSLFS (SEQID NO 145), HIHffSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO :146),HIHYSGRPTYNPSLSS (SEQIDNO :147),HIHYSGRPTYNPSLKS(SEQIDNO 148),HIHYSGRPTYNPSLLS (SEQIDNO:149),HIHYSGRPTYNPSLHS(SEQIDNO150),HIHYSGRPTYNPSLFS(SEQIDNO:151),HIHYSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO152),HIHFSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO:153),HIHFSGRPTYDPSLKS(SEQIDNO154),HIHFSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO155),HIHFSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO156),HIHFSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO 157),HIHFSGRPTYDPSLRS (SEQIDNO 158),HlHffSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO159),HIHffSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO160),HIHffSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO161),HIHffSGRPTYDPSLHS (SEQIDNO162),HIHffSGRPTYDPSLFS (SEQIDNO163),HIHffSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO164),HIHYSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO165),HIHYSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO166),HIHYSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO167),HIHYSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO168),HIHYSGRPTYDPSLFS(SEQ ID NO 169)和 HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQ ID NO :170)。
7.如權(quán)利要求1至6任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR3的序列選自RVTISR ETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :171),RVTISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SE Q ID NO 172), RVTISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :173),RVTISKDTAKNQFSL KLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :174),RVSISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID N0: 175), RVSISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :176),RVSISKETAKNQFSLKLTSMTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :177),RVSISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :178),RITIS RETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :179),RIITSRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(S EQ ID NO :180), RITISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :181),RIITSKDTAKNQFS LKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :182), RISISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 183),RISISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :184),RISISKETAKNQFSLKLTSMTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO 185)和 RISISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :186)。
8.如權(quán)利要求1至7任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDR3的序列是 KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)。
9.如權(quán)利要求1至8任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR4的序列是 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :101)。
10.如權(quán)利要求1至9任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,進一步包含恒定結(jié)構(gòu)域。
11.如權(quán)利要求10所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中恒定結(jié)構(gòu)域具有序列ASTKNPDVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 52);或ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 92);或ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 53)
12.—種\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FRl)、 第一個⑶R (⑶Rl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個⑶R (⑶R2)、第三個框架區(qū)(FR3)、第三個CDR(CDR3)和第四個框架區(qū)(FR4),其中(i)FRl的序列是 EX13VLTQSPGTLSLSX14GERATLSC (SEQ ID NO :187)其中,X13是I或N,X14是A或P,或與其至少90 %或至少95 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90 %或至少95 %相同的序列,(ii)CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQID NO :188),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,(iii)FR2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQID NO :189),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列,(iv)CDR2的序列是DTSNLAS(SEQ ID NO 190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,(v)FR3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(15DFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :191),其中,X15是T或N或與其至少90 %或至少95 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90 %或至少95 %相同的序列,(vi)CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQID NO 192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,(vii)FR4的序列是reQGTKLEIKR(SEQID NO :193),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。
13.一種\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個CDR,其中框架區(qū)的序列與序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAP RLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO :194)至少 90%相同, 優(yōu)選至少95%相同,并且CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列;⑶R2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少 80%相同的序列;CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列。
14.如權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FRl的序列選自 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO 195), EIVLTQSPGTLSLSAGERATLSC(SEQ ID NO: 196), ENVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO 197)和 ENVLTQSPGTLSLSAGERATLSC(SEQ ID NO :198)。
15.如權(quán)利要求12至14任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDRl的序列是 SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)。
16.如權(quán)利要求12至15任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR2的序列是 WYQQKPGQAPPLLIY(SEQ ID NO :189)。
17.如權(quán)利要求12至16任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDR2的序列的序列是 DTSNLAS(SEQ ID NO :190)。
18.如權(quán)利要求12至17任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR3的序列的序列是 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO 199)或 GIPDRFSGSGSGNDFTLTISRVEPEDF AVYYC(SEQ ID NO :200)。
19.如權(quán)利要求12至18任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDR3的序列的序列是 FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)。
20.如權(quán)利要求12至19任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR4的序列的序列是 FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO :193)。
21.如權(quán)利要求12至20任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,進一步包含恒定結(jié)構(gòu)域。
22.如權(quán)利要求21所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中恒定結(jié)構(gòu)域具有序列TVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :93)。
23.一種抗體,其包含如權(quán)利要求1至9任一項所述的Vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域和權(quán)利要求12至 20任一項所述的\結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
24.如權(quán)利要求23所述的抗體,其中Vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或\結(jié)合結(jié)構(gòu)域進一步包含恒定結(jié)構(gòu)域。
25.如權(quán)利要求M所述的抗體,其中Vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域的恒定結(jié)構(gòu)域具有以下序列ASTK NPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 52);或ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDff LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no :9 ;或ast knpdvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqt yicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpdvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevk fnwyvdgvevhnaktkpreeqynatyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapeektiskakgqprepqvytl ppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvm healhnhytqkslslspgk(seq id no :53)。
26.如權(quán)利要求m或權(quán)利要求25所述的抗體,其中\(zhòng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的恒定結(jié)構(gòu)域具有序列 tvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltl skadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no :9;3)。
27.一種vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(fr1)、第一個cdr(cdrl)、第二個框架區(qū)(fr2)、第二個cdr(cdr2)、第三個框架區(qū)(fr3)、第三個 cdr(cdr3)和第四個框架區(qū)(fr4),其中(i)FRl的序列是 EVQU!QWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSXw)(19(SEQ ID NO :201),其中父^是1、1^或vxw是s或t或與其至少90 %或至少95 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90 %或至少95 %相同的序列,(ii)CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,(iii)fr2的序列是 wirqppgkglewx2cig(seq id no :202),其中x2tl是m或i或與其至少90 %相似的序列,優(yōu)選與其相同的序列,(iv)CDR2的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98),其中X21 是 F、Y 或 W知是n或d&3是1(、1^、!1、卩、1 或 s或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,(v)FR3 的序列是 RXm)(25IS)(26DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :203),其中xm是v或ixm是s或tx26是r或k或與其至少90 %或至少95 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90 %或至少95 %相同的序列, 前提條件是位置6的殘基必須是R或K,(vi)CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,(vii)FR4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQID NO :101),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。
28.一種Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個cdr,其中框架區(qū)的序列與序列evqlqqwgagllkpsetlsltcavygysx18sw irqppgkglewigrvtisx26dtsknqfslklssvtaadtavyycarwgqgtlvtvss(seq id no :204)至少90%相同,優(yōu)選至少95%相同,其中乂18是I、L或V,而)^6是1 或K,并且⑶Rl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列;CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98),其中 X21 是 F、Y 或 W 知是N或D &3是1(、1^、!1、卩、1 或 S或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列;和 CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。
29.如權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FRl的序列選自EV QLQQffGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSIS(SEQ ID NO 205),EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSIT(SE Q ID NO 206),EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSLS(SEQ ID NO 207),EVQLQQffGAGLLKPSETL SLTCAVYGYSLT(SEQ ID NO 208),EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSVS(SEQ ID NO :209)和 E VQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSVT(SEQ ID NO :210)。
30.如權(quán)利要求27至四任一項所述的¥11抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDRl的序列是 SGYSffH(SEQ ID NO 96)。
31.如權(quán)利要求27至30任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR2的序列是 WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :133)或 WIRQPPGKGLEWMG(SEQ ID NO :134)。
32.如權(quán)利要求27至31任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中⑶R2的序列選自 HIHFSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO 135),HIHFSGRPTYNPSLKS(SEQ ID NO: 136),HIHFSGRPTYNPSLLS(SEQ ID NO 137),HIHFSGRPTYNPSLHS(SEQ ID NO: 138),HIHFSGRPTYNPSLFS(SEQ ID NO 139), HIHFSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO: 140), HlHffSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO :141), HIHffSGRPTYNPSLKS(SEQ ID NO:142), HIHffSGRPTYNPSLLS(SEQIDNO 143),HIHffSGRPTYNPSLHS (SEQIDNO144),HIHffSGRPTYNPSLFS(SEQIDNO:145),HIHffSGRPTYNPSLRS (SEQIDNO146),HIHYSGRPTYNPSLSS(SEQIDNO :147),HIHYSGRPTYNPSLKS (SEQIDNO 148),HIHYSGRPTYNPSLLS (SEQIDNO:149),HIHYSGRPTYNPSLHS(SEQIDNO 150),HIHYSGRPTYNPSLFS(SEQIDNO:151),HIHYSGRPTYNPSLRS (SEQIDNO ;152),HIHFSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO153),HIHFSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO 154),HIHFSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO155),HIHFSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO156),HIHFSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO157),HIHFSGRPTYDPSLRS (SEQIDNO158),HlHffSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO159),HIHffSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO 160),HIHffSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO161),HIHffSGRPTYDPSLHS (SEQIDNO 162),HIHffSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO163),HIHffSGRPTYDPSLRS (SEQIDNO ;164),HIHYSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO165),HIHYSGRPTYDPSLRS (SEQIDNO 166),HIHYSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO167),HIHYSGRPTYDPSLHS (SEQIDNO168),HIHYSGRPTYDPSLFS(SEQ ID NO :169)和 HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQ ID NO :170)。
33.如權(quán)利要求27至32任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR3的序列選自RVTI SRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :218),RVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR( SEQ ID NO 219),RVSISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 220),RVSISKDTSKNQFS LKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 221), RITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 222),RITISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO223),RISISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :224),RISISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :225)。
34.如權(quán)利要求27至33任一項所述的¥11抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDR3的序列是 KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)。
35.如權(quán)利要求27至34任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR4的序列是 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :101)。
36.如權(quán)利要求27至35任一項所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,進一步包含恒定結(jié)構(gòu)域。
37.如權(quán)利要求36所述的Vh抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中恒定結(jié)構(gòu)域具有序列ASTKNPDVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 52);或 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO :9 ;或ASTKNPDVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO :53)。
38.一種VL抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域順次包含第一個框架區(qū)(FR1)、第一個CDR(CDRl)、第二個框架區(qū)(FR2)、第二個CDR(CDR2)、第三個框架區(qū)(FR3)、第三個 CDR(CDR3)和第四個框架區(qū)(FR4),其中(i)FRl的序列是 EX23VLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :211),其中,X23是I或N,或與其至少90%或至少95%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%或至少95%相同的序列;(ii)CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQID NO 188),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,(iii)FR2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQID NO :189),或與其至少90%相似的序列, 優(yōu)選與其至少90%相同的序列,(iv)CDR2的序列是DTSNLAS(SEQ ID NO 190),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,(v)FR3 的序列是 GIPDRFSGSGSGX24DFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID N0:211),其中XM是T或N或與其至少90 %或至少95 %相似的序列,優(yōu)選與其至少90 %或至少95 %相同的序列,(vi)CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQID NO 192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列,(vii)FR4的序列是FGGGTKVEIKR(SEQID NO :193),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列。
39.一種\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含框架序列以及位于框架序列內(nèi)的第一個、第二個和第三個CDR,其中框架區(qū)的序列與序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAP RLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO :213)至少 90%相同, 優(yōu)選至少95%相同,并且CDRl的序列為SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188),或與其至少90%相似的序列,優(yōu)選與其至少90%相同的序列,⑶R2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :140),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少 80%相同的序列;和CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192),或與其至少80%相似的序列,優(yōu)選與其至少80%相同的序列。
40.如權(quán)利要求38或權(quán)利要求39所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FRl的序列選自 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :214)或 ENVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO: 215)。
41.如權(quán)利要求38至40任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDRl的序列是 SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)。
42.如權(quán)利要求38至41任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR2的序列是 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)。
43.如權(quán)利要求38至42任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDR2的序列的序列是 DTSNLAS(SEQ ID NO :190)。
44.如權(quán)利要求38至43任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR3的序列的序列是 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :216)或 GIPDRFSGSGSGNDFTLTISRLEPEDF AVYYC(SEQ ID NO :217)。
45.如權(quán)利要求38至44任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中CDR3的序列的序列是 FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)。
46.如權(quán)利要求38至45任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中FR4的序列的序列是 FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO :193)。
47.如權(quán)利要求38至46任一項所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,進一步包含恒定結(jié)構(gòu)域。
48.如權(quán)利要求47所述的\抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中恒定結(jié)構(gòu)域具有序列TVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGE C(SEQ ID NO :93)。
49.一種抗體,其包含如權(quán)利要求27至35任一項所述的Vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域和如權(quán)利要求 38至46任一項所述的\結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
50.如權(quán)利要求49所述的抗體,其中Vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或\結(jié)合結(jié)構(gòu)域進一步包含恒定結(jié)構(gòu)域。
51.如權(quán)利要求50所述的抗體,其中Vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域的恒定結(jié)構(gòu)域具有序列ASTKNPDV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 52);或 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 92);或ASTKNPD VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO :53)。
52.如權(quán)利要求50或權(quán)利要求51所述的抗體,其中\(zhòng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的恒定結(jié)構(gòu)域具有序列 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC(SEQ ID NO :93)。
53.一種包含兩個輕鏈和兩個重鏈的抗體,其中輕鏈的序列如SEQ ID NO :7中所示,而重鏈的序列如SEQ ID NO 50中所示。
54.一種包含兩個輕鏈和兩個重鏈的抗體,其中輕鏈的序列如SEQ ID NO :7中所示,而重鏈的序列如SEQ ID NO 94中所示。
55.如權(quán)利要求23至沈或49至M任一項所述的抗體,其中抗體具有降低的巖藻糖水平。
56.一種治療受試者癌癥的方法,其中癌癥選自結(jié)直腸、卵巢、胰腺、前列腺和肺,該方法包括將治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至陽任一項的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體給藥于受試者。
57.一種檢測樣品中癌細胞存在的方法,該方法包括將細胞樣品接觸根據(jù)權(quán)利要求1 至55任一項的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體并檢測結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體與細胞的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有抗腫瘤活性的人源化抗體及其結(jié)合結(jié)構(gòu)域。特別地,該人源化抗體特異性結(jié)合并直接殺滅人結(jié)腸腫瘤細胞,并且在體外使用抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)試驗以及在體內(nèi)使用鼠腫瘤模型呈現(xiàn)出有效的對抗人結(jié)腸癌細胞的免疫介導(dǎo)的細胞毒性活性。
文檔編號A61K39/395GK102395604SQ201080011960
公開日2012年3月28日 申請日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者A·G·多伊爾, A·W·克拉克, M·波利亞德, N·A·金茨勒, P·A·延尼格斯 申請人:賽福倫澳大利亞私人有限公司