本公開提供了與抗-WISP1抗體相關(guān)或源自抗-WISP1抗體的組合物和方法。更具體地，本公開提供了結(jié)合WISP1的全人抗體、這類抗體的WISP1-結(jié)合片段和衍生物及包含這類片段的WISP1-結(jié)合多肽。再進(jìn)一步地，本公開提供了編碼這類抗體、抗體片段和衍生物及多肽的核酸，包含這類多核苷酸的細(xì)胞，制備這類抗體、抗體片段和衍生物及多肽的方法，及使用這類抗體、抗體片段和衍生物及多肽的方法，包括治療或診斷患有WISP1相關(guān)障礙或病癥的受試者的方法。本公開進(jìn)一步提供了用于治療或預(yù)防各種癌癥或炎性疾病和心臟、骨/關(guān)節(jié)或肺的各種疾病的方法。

背景技術(shù)：

WNT1誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白1(WISP1)是WNT信號(hào)傳導(dǎo)途徑的靶基因。WNT信號(hào)傳導(dǎo)在肺發(fā)育中發(fā)揮作用，通過(guò)自分泌和旁分泌信號(hào)調(diào)節(jié)上皮和間質(zhì)發(fā)育兩者。簡(jiǎn)言之，WNT蛋白結(jié)合Frizzled(Fz)細(xì)胞表面受體。Fz受體是七次跨膜受體。除了Fz蛋白外，單次跨膜蛋白如低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5和6(LRP5，LRP6)、受體酪氨酸激酶(RTK)-樣孤兒受體1或2(Ror1，Ror2)和受體-樣酪氨酸激酶(Ryk)顯示為作為WNT信號(hào)傳導(dǎo)的共受體發(fā)揮功能。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的抑制導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的低磷酸化，這允許這種細(xì)胞骨架蛋白轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中。β-連環(huán)蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的LEC/TCF家族的后續(xù)結(jié)合將它們從轉(zhuǎn)錄阻遏物轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄激活物。

WNT構(gòu)成富半胱氨酸分泌配體的大家族，其對(duì)于廣泛的發(fā)育和生理過(guò)程是必要的。至少19個(gè)WNT成員在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)，且它們?cè)诎l(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出獨(dú)特的表達(dá)譜和明顯不同的功能。WNT通過(guò)激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)(包括β-連環(huán)蛋白-依賴性的和非β-連環(huán)蛋白-依賴性的途徑)控制各種細(xì)胞功能，包括增殖、分化、死亡、遷移和極性。WNT傳統(tǒng)上基于其誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞系C57MG的轉(zhuǎn)化的能力劃分成兩種不同類型。高轉(zhuǎn)化成員包括WNT1、WNT3、WNT3a和WNT7a，且中等轉(zhuǎn)化或非轉(zhuǎn)化成員包括WNT2、WNT4、WNT5a、WNT5b、WNT6、WNT7b和WNT1l。

WISP1表達(dá)在肺發(fā)育過(guò)程中改變。特別地，高WISP1表達(dá)在器官發(fā)生和呼吸樹形成(假腺期)過(guò)程中觀察到，而WISP1表達(dá)在上皮分化(小管期)過(guò)程中較低。人WISP1蛋白表達(dá)響應(yīng)于WNT1和WNT3a通過(guò)β-連環(huán)蛋白誘導(dǎo)。此外，WISP1在鼠和人肺細(xì)胞中通過(guò)TGF誘導(dǎo)。進(jìn)一步地，盡管WISP1顯示為增加細(xì)胞增殖，但誘導(dǎo)分化可能需要另外的要素(例如，TGF-β)。

升高的WISP1表達(dá)已經(jīng)在幾種疾病中描述，包括肝細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌、肺癌和乳腺癌。WISP1表達(dá)也與心臟、骨和肺的非惡性疾病相關(guān)。提高的WISP1水平在試驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎的滑膜和軟骨中發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)性心肌梗塞后的邊緣區(qū)和非梗塞區(qū)的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，和在試驗(yàn)性和人特發(fā)性肺纖維化(IPF)的肺泡上皮中發(fā)現(xiàn)。

WISP1在人IPF肺中的肺泡上皮表面處上調(diào)，且強(qiáng)的核β-連環(huán)蛋白免疫反應(yīng)性在纖維化灶及增殖性細(xì)支氣管和肺泡損傷內(nèi)的成纖維細(xì)胞中觀察到；這是在正常肺中未觀察到的現(xiàn)象。對(duì)于WNT信號(hào)傳導(dǎo)途徑在IPF發(fā)病機(jī)理中的重要性的進(jìn)一步支持源自基質(zhì)溶解因子(MMP7)(β-連環(huán)蛋白-LEF1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的靶基因)缺陷的小鼠受到保護(hù)而免于博來(lái)霉素誘導(dǎo)的纖維化的觀察。值得注意的是，WISP1在小鼠中介導(dǎo)肺纖維化且WISP1(用小鼠抗-WISP1抗體)的藥理學(xué)中和在體內(nèi)明顯地減弱博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。

IPF是由于肺泡上皮損傷和纖維化灶的激活而發(fā)生的纖維增殖性障礙。因此，本領(lǐng)域中需要有效的、強(qiáng)結(jié)合的全人抗體產(chǎn)品，其可以結(jié)合WISP1并且是多種肺和腫瘤疾病的有效治療。本公開初步實(shí)現(xiàn)了這種需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開提供了以至少10^-6M的結(jié)合親和力結(jié)合WISP1表位的IgG類的全人抗體，其具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合。優(yōu)選地，全人抗體具有重鏈和輕鏈兩者，其中該抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中稱為A9)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中稱為C7)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中稱為D3)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為E7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中稱為F7)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中稱為G3)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中稱為G4)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中稱為H1)及其組合。

本公開提供了Fab全人抗體片段，其具有來(lái)自重鏈的可變域區(qū)域和來(lái)自輕鏈的可變域區(qū)域，其中重鏈可變域序列與選自以下的氨基酸序列至少95％同一：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合。優(yōu)選地，全人抗體Fab片段具有重鏈可變域區(qū)域和輕鏈可變域區(qū)域兩者，其中該抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64及其組合。

本公開提供了單鏈人抗體，其具有來(lái)自重鏈的可變域區(qū)域和來(lái)自輕鏈的可變域區(qū)域及連接該重鏈和輕鏈可變域區(qū)域的肽接頭，其中重鏈可變域序列與選自以下的氨基酸序列至少95％同一：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合。優(yōu)選地，全人單鏈抗體具有重鏈可變域區(qū)域和輕鏈可變域區(qū)域兩者，其中單鏈全人抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64及其組合。

本公開進(jìn)一步提供了治療或預(yù)防各種癌癥或者心臟、骨/關(guān)節(jié)或肺的疾病的方法，其中這類疾病選自肝細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌、肺癌、乳腺癌、心肌梗塞、心絞痛、骨關(guān)節(jié)炎、肺纖維化、哮喘、囊性纖維化、支氣管炎和哮喘，該方法包括施用抗-WISP1多肽，其中全人抗體具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合；

其中Fab全人抗體片段具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合；和

其中單鏈人抗體具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合。

優(yōu)選地，全人抗體具有重鏈和輕鏈兩者，其中該抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中稱為WI1A5)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中稱為WI1E6)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中稱為WI1A6)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為WI2D9)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為WI2D9)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中稱為WIr1B11)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中稱為WIr1B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中稱為WIr1E2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中稱為WIrF8)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中稱為WIr1G10)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中稱為WIr1G5)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中稱為WIr2A2)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中稱為WIr2A6)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文中稱為WIr2A7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中稱為WIr2A9)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文中稱為WIr2B11)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中稱為WIr2B12)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中稱為WIr2B5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中稱為WIr2B8)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文中稱為WIr2B9)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中稱為WIr2C11)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文中稱為WIr2D10)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文中稱為WIr2D3)、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46(本文中稱為WIr2D5)、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48(本文中稱為WIr2D6)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文中稱為WIr2D9)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文中稱為WIr2E4)、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54(本文中稱為WIr2F6)、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56(本文中稱為WIr2G7)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文中稱為WIr2G8)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文中稱為WIr2H2)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文中稱為WIr2H3)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文中稱為WIr2H4)及其組合。優(yōu)選地，全人抗體Fab片段具有重鏈可變域區(qū)域和輕鏈可變域區(qū)域兩者，其中抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中稱為WI1A5)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中稱為WI1E6)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中稱為WI1A6)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為WI2D9)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為WI2D9)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中稱為WIr1B11)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中稱為WIr1B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中稱為WIr1E2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中稱為WIrF8)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中稱為WIr1G10)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中稱為WIr1G5)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中稱為WIr2A2)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中稱為WIr2A6)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文中稱為WIr2A7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中稱為WIr2A9)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文中稱為WIr2B11)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中稱為WIr2B12)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中稱為WIr2B5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中稱為WIr2B8)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文中稱為WIr2B9)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中稱為WIr2C11)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文中稱為WIr2D10)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文中稱為WIr2D3)、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46(本文中稱為WIr2D5)、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48(本文中稱為WIr2D6)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文中稱為WIr2D9)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文中稱為WIr2E4)、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54(本文中稱為WIr2F6)、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56(本文中稱為WIr2G7)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文中稱為WIr2G8)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文中稱為WIr2H2)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文中稱為WIr2H3)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文中稱為WIr2H4)及其組合。優(yōu)選地，全人單鏈抗體具有重鏈可變域區(qū)域和輕鏈可變域區(qū)域兩者，其中單鏈全人抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64及其組合。

優(yōu)選地，用于治療或預(yù)防各種癌癥或者心臟、骨/關(guān)節(jié)或肺的疾病的方法選自肝細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌、肺癌、乳腺癌、心肌梗塞、心絞痛、骨關(guān)節(jié)炎、肺纖維化、哮喘、囊性纖維化、支氣管炎和哮喘。

附圖說(shuō)明

圖1顯示IPF存活率低于大多數(shù)癌癥和其它致死性肺病。

圖2顯示W(wǎng)ISP-1在肺纖維化中的作用。更具體地，圖2是肺中響應(yīng)于損傷刺激由WISP-1誘導(dǎo)的纖維化過(guò)程的示意性圖示。

圖3和4顯示本文中所公開的各種抗-WISP-1抗體在人(h)和鼠(m)WISP1靶標(biāo)之間的交叉反應(yīng)性。

具體實(shí)施方式

本公開提供了以10^-6M或更小的結(jié)合親和力結(jié)合WISP1表位的IgG類的全人抗體，其具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合。優(yōu)選地，全人抗體具有重鏈和輕鏈兩者，其中該抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中稱為WI1A5)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中稱為WI1E6)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中稱為WI1A6)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為WI2D9)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中稱為WI2D9)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中稱為WIr1B11)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中稱為WIr1B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中稱為WIr1E2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中稱為WIrF8)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中稱為WIr1G10)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中稱為WIr1G5)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中稱為WIr2A2)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中稱為WIr2A6)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文中稱為WIr2A7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中稱為WIr2A9)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文中稱為WIr2B11)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中稱為WIr2B12)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中稱為WIr2B5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中稱為WIr2B8)、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38(本文中稱為WIr2B9)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中稱為WIr2C11)、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42(本文中稱為WIr2D10)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文中稱為WIr2D3)、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46(本文中稱為WIr2D5)、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48(本文中稱為WIr2D6)、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50(本文中稱為WIr2D9)、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52(本文中稱為WIr2E4)、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54(本文中稱為WIr2F6)、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56(本文中稱為WIr2G7)、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58(本文中稱為WIr2G8)、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60(本文中稱為WIr2H2)、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62(本文中稱為WIr2H3)、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64(本文中稱為WIr2H4)及其組合。

本公開提供了Fab全人抗體片段，其具有來(lái)自重鏈的可變域區(qū)域和來(lái)自輕鏈的可變域區(qū)域，其中重鏈可變域序列與選自以下的氨基酸序列至少95％同一：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合。優(yōu)選地，全人抗體Fab片段具有重鏈可變域區(qū)域和輕鏈可變域區(qū)域兩者，其中該抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64及其組合。

本公開提供了單鏈人抗體，其具有來(lái)自重鏈的可變域區(qū)域和來(lái)自輕鏈的可變域區(qū)域及連接該重鏈和輕鏈可變域區(qū)域的肽接頭，其中重鏈可變域序列與選自以下的氨基酸序列至少95％同一：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合。優(yōu)選地，全人單鏈抗體具有重鏈可變域區(qū)域和輕鏈可變域區(qū)域兩者，其中單鏈全人抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64及其組合。

本公開進(jìn)一步提供了用于治療或預(yù)防各種癌癥或者心臟、骨/關(guān)節(jié)或肺的疾病的方法，其中這類疾病選自肝細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌、肺癌、乳腺癌、心肌梗塞、心絞痛、骨關(guān)節(jié)炎、肺纖維化、哮喘、囊性纖維化、支氣管炎和哮喘，該方法包括施用抗-WISP1多肽，其中該抗-WISP1多肽選自以至少10^-6M的結(jié)合親和力結(jié)合WISP1表位的IgG類的全人抗體、具有來(lái)自重鏈的可變域區(qū)域和來(lái)自輕鏈的可變域區(qū)域的Fab全人抗體片段、具有來(lái)自重鏈的可變域區(qū)域和來(lái)自輕鏈的可變域區(qū)域及連接該重鏈和輕鏈可變域區(qū)域的肽接頭的單鏈人抗體及其組合；

其中全人抗體具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合；

其中Fab全人抗體片段具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合；和

其中單鏈人抗體具有與選自以下的氨基酸序列至少95％同一的重鏈可變域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63及其組合，且具有與由以下組成的氨基酸序列至少95％同一的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64及其組合。

優(yōu)選地，全人抗體具有重鏈和輕鏈兩者，其中該抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64及其組合。優(yōu)選地，全人抗體Fab片段具有重鏈可變域區(qū)域和輕鏈可變域區(qū)域兩者，其中該抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64及其組合。優(yōu)選地，全人單鏈抗體具有重鏈可變域區(qū)域和輕鏈可變域區(qū)域兩者，其中單鏈全人抗體具有選自以下的重鏈/輕鏈可變域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45/SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47/SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49/SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51/SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53/SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55/SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57/SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59/SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61/SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63/SEQ ID NO.64及其組合。

優(yōu)選地，用于治療或預(yù)防各種癌癥或者心臟、骨/關(guān)節(jié)或肺的疾病的方法，選自肝細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌、肺癌、乳腺癌、心肌梗塞、心絞痛、骨關(guān)節(jié)炎、肺纖維化、哮喘、囊性纖維化、支氣管炎和哮喘。

“抗原結(jié)合蛋白”是包含結(jié)合至抗原的部分和，任選地，允許抗原結(jié)合部分采取促進(jìn)抗原結(jié)合蛋白與抗原結(jié)合的構(gòu)象的骨架或框架部分的蛋白質(zhì)?？乖Y(jié)合蛋白的例子包括抗體、抗體片段(例如，抗體的抗原結(jié)合部分)、抗體衍生物和抗體類似物?？乖Y(jié)合蛋白可以包含，例如，具有移植的CDR或CDR衍生物的可選的蛋白質(zhì)骨架或人工骨架。這些骨架包括，但不限于抗體衍生的骨架(包含引入以例如使抗原結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的突變)以及完全合成的骨架(包含，例如，生物相容性聚合物)。參見，例如，Korndorfer等人，2003，Proteins：Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，Volume 53，Issue 1：121-129；Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654。此外，可以使用肽抗體模擬物(“PAM”)以及基于抗體模擬物的骨架(利用纖維連接蛋白組分作為骨架)。

抗原結(jié)合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)?！懊庖咔虻鞍住笔撬木垠w分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每個(gè)四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基端部分包括主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的羧基端部分限定主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。人輕鏈分類為K或λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，并分別定義抗體同種型為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)約12或更多個(gè)氨基酸的“J”區(qū)連接，并且重鏈還包括約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“D”區(qū)。通常參見，F(xiàn)undamental Immunology，第7章(Paul，W.編輯，第二版，Raven出版社，N.Y.(1989))(通過(guò)引用結(jié)合其全部?jī)?nèi)容用于所有目的)。每個(gè)輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)，使得完整的免疫球蛋白具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

天然存在的免疫球蛋白鏈的可變區(qū)表現(xiàn)出相同的總體結(jié)構(gòu)：由通過(guò)三個(gè)高變區(qū)(也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR)連接的相對(duì)保守的框架區(qū)(FR)。從N端至C端，輕鏈和重鏈都包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸的指定按照Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services，PHS，NIH，NIH出版號(hào)91-3242，1991中的定義命名。免疫球蛋白鏈中氨基酸的其它編號(hào)系統(tǒng)包括IMGT.RTM.(國(guó)際ImMunoGeneTics信息系統(tǒng)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.29：185-203；2005)和AHo(Honegger和Pluckthun，J.Mol.Biol.309(3)：657-670；2001)。

可以從含有具有變化的抗原特異性的免疫球蛋白的來(lái)源比如血清或血漿獲得抗體。如果將這樣的抗體進(jìn)行親和純化，它們可以針對(duì)特定的抗原特異性富集。通常由少于約10％的對(duì)特定抗原具有特異性結(jié)合活性的抗體制備這類富集的抗體制劑。使這些制劑進(jìn)行若干輪親和純化可以提高對(duì)抗原具有特異性結(jié)合活性的抗體的比例。以這種方式制備的抗體通常稱為“單特異性的”。單特異性抗體制劑可以由約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的對(duì)特定抗原具有特異性結(jié)合活性的抗體構(gòu)成。

除非另有說(shuō)明，“抗體”是指完整的免疫球蛋白或與完整抗體為特異性結(jié)合而競(jìng)爭(zhēng)的其抗原結(jié)合部分。可以通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)完整抗體的酶促或化學(xué)切割產(chǎn)生抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合部分包括，特別是，F(xiàn)ab、Fab′、F(ab′)₂、Fv、域抗體(dAb)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)、四抗體(tetrabodies)和含有至少足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白的部分的多肽。

Fab片段為具有V_L、V_H、C_L和C_H1結(jié)構(gòu)域的單價(jià)片段；F(ab′)₂片段為具有通過(guò)在鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的2個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；Fd片段具有V_H和C_H1結(jié)構(gòu)域；Fv片段具有抗體單臂的V_L和V_H結(jié)構(gòu)域；并且dAb片段具有V_H結(jié)構(gòu)域、V_L結(jié)構(gòu)域或者V_H或V_L結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合片段(美國(guó)專利號(hào)6,846,634、6,696,245，美國(guó)申請(qǐng)公開號(hào)20/0202512、2004/0202995、2004/0038291、2004/0009507、2003/0039958和Ward等人，Nature 341：544-546，1989)。

單鏈抗體(scFv)為其中V_L和V_H區(qū)通過(guò)接頭(例如，合成的氨基酸殘基的序列)連接以形成連續(xù)的蛋白鏈(其中該接頭足夠長(zhǎng)以允許蛋白鏈自身回折并形成單價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體(參見，例如Bird等人，1988，Science 242：423-26和Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83)。雙抗體為包含2條多肽鏈的二價(jià)抗體，其中每條多肽鏈包含由接頭連接的V_H和V_L結(jié)構(gòu)域，該接頭太短而不允許相同鏈上的2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)，因此使得每個(gè)結(jié)構(gòu)域與在另一多肽鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)(參見，例如Holliger等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48和Poljak等人，1994，Structure 2：1121-23)。如果雙抗體的兩條多肽鏈?zhǔn)窍嗤?，那么由其配?duì)產(chǎn)生的雙抗體將具有2個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。具有不同序列的多肽鏈可以用于形成具有2個(gè)不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙抗體。類似地，三抗體和四抗體分別為包含3條和4條多肽鏈并分別形成3個(gè)和4個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(其可以是相同的或不同的)的抗體。

可以利用Kabat等人(同上)、Lefranc等人(同上)和/或Honegger和Pluckthun(同上)描述的系統(tǒng)確定給定抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和框架區(qū)(FR)?？梢詫⒁粋€(gè)或多個(gè)CDR共價(jià)或非共價(jià)地整合到分子中以使其成為抗原結(jié)合蛋白。抗原結(jié)合蛋白可以使CDR作為較大多肽鏈的部分并入，可以共價(jià)地將CDR連接至另一多肽鏈，或可以非共價(jià)地并入CDR。CDR允許抗原結(jié)合蛋白特異性地結(jié)合特定的目標(biāo)抗原。

抗原結(jié)合蛋白可以具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如果存在多于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，那么結(jié)合位點(diǎn)可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有兩個(gè)相同的結(jié)合位點(diǎn)，而“雙特異性”或“雙功能”抗體具有兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)。

術(shù)語(yǔ)“人抗體”包括具有源自人免疫球蛋白序列的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)和恒定區(qū)的所有抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所有的可變域和恒定域源自人免疫球蛋白序列(全人抗體)。這些抗體可以以多種方式制備，其實(shí)例如下文所述，包括通過(guò)用目標(biāo)抗原對(duì)小鼠(其經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)來(lái)源于人重鏈和/或輕鏈編碼基因的抗體)進(jìn)行免疫。

人源化抗體的序列與來(lái)源于非人物種的抗體的序列不同在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、刪除和/或添加，以使得在施用于人類受試者時(shí)，人源化抗體與非人物種的抗體相比較少可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和/或誘導(dǎo)較不嚴(yán)重的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方式中，非人物種抗體的重鏈和/或輕鏈的框架和恒定域中的某些氨基酸突變以產(chǎn)生人源化抗體。在另一實(shí)施方式中，來(lái)自人抗體的恒定域與非人物種的可變域融合。在另一實(shí)施方式中，改變非人抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基以降低非人抗體在施用于人類受試者時(shí)可能的免疫原性，其中改變的氨基酸殘基對(duì)于抗體與其抗原的免疫特異性結(jié)合不是關(guān)鍵的，或?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行的改變是保守性改變，使得人源化抗體與抗原的結(jié)合不會(huì)比非人抗體與抗原的結(jié)合明顯更差。如何制備人源化抗體的例子可以在美國(guó)專利號(hào)6,054,297、5,886,152和5,877,293中找到。

術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指的是含有來(lái)自一個(gè)抗體的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域和來(lái)自一個(gè)或多個(gè)其它抗體的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)CDR來(lái)源于人抗-WISP1抗體。在另一實(shí)施方式中，所有的CDR來(lái)源于人抗-WISP1抗體。在另一實(shí)施方式中，來(lái)自多于一個(gè)人抗-WISP1抗體的CDR混合并在嵌合抗體中匹配。例如，嵌合抗體可以包含來(lái)自第一人抗PAR-2抗體的輕鏈的CDR1，來(lái)自第二人抗-WISP1抗體的輕鏈的CDR2和CDR3，以及來(lái)自第三抗-WISP1抗體的重鏈的CDR。其它組合是可能的。

此外，框架區(qū)可以來(lái)源于相同抗-WISP1抗體中的一個(gè)、來(lái)自一個(gè)或多個(gè)不同抗體(比如人抗體)或來(lái)自人源化抗體。在嵌合抗體的一個(gè)例子中，重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)自特定物種或者屬于特定抗體類別或子類的抗體相同、同源或來(lái)源于該抗體，而鏈的其余部分與來(lái)自另一物種或者屬于另一抗體類別或子類的抗體相同、同源或來(lái)源于該抗體。也包括這些抗體的表現(xiàn)出所需生物活性(即，特異性結(jié)合WISP1的能力)的片段。

“中和抗體”或“抑制性抗體”為抑制WISP1-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的抗體。在各種實(shí)施方式中，抗原結(jié)合蛋白降低WISP1-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本說(shuō)明書的教導(dǎo)并使用本領(lǐng)域已知技術(shù)容易地制備抗體片段或類似物。片段或類似物的優(yōu)選氨基端和羧基端存在于功能域的邊界附近?？梢酝ㄟ^(guò)將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共或?qū)Ｓ行蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)比較識(shí)別結(jié)構(gòu)域和功能域。計(jì)算機(jī)化的比較方法可用于識(shí)別在已知結(jié)構(gòu)和/或功能的其它蛋白質(zhì)中存在的序列基序或預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。識(shí)別折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法是已知的。參見，Bowie等人，1991，Science 253：164。

“CDR移植抗體”是包含來(lái)源于特定物種或同種型的抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR和相同或不同物種或同種型的另一抗體的框架的抗體。

“多特異性抗體”是識(shí)別在一個(gè)或多個(gè)抗原上的超過(guò)一個(gè)表位的抗體。這種類型的抗體的子類為“雙特異性抗體”，其識(shí)別在相同或不同抗原上的2個(gè)不同的表位。

如果抗原結(jié)合蛋白以100納摩爾或更小的解離常數(shù)結(jié)合抗原(例如，人WISP1)，那么該抗原結(jié)合蛋白“特異性地結(jié)合”該抗原。

“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“抗原結(jié)合區(qū)”或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”為含有與抗原相互作用并造成抗原結(jié)合蛋白對(duì)抗原的特異性和親和力的氨基酸殘基(或其它部分)的抗原結(jié)合蛋白的部分。對(duì)于特異性地結(jié)合其抗原的抗體，這包括其CDR域中至少一個(gè)的至少一部分。

“表位”為分子的被抗原結(jié)合蛋白(例如，抗體)結(jié)合的部分。表位可以包括分子的非鄰近部分(例如在多肽中，在多肽的一級(jí)序列中非連續(xù)的但在多肽的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下彼此足夠接近以被抗原結(jié)合蛋白結(jié)合的氨基酸殘基)。

兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽序列的“百分同一性”通過(guò)利用GAP計(jì)算機(jī)程序(GCG Wisconsin Package的部分，版本10.3(Accelrys，圣地亞哥，加利福尼亞州)使用其默認(rèn)參數(shù)比較該序列來(lái)確定。

術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在全文中可互換地使用并包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、用核苷酸類似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸類似物)產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物及其雜合體。核酸分子可以為單鏈或雙鏈的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子包含編碼抗體或其片段、衍生物、突變蛋白或變體的連續(xù)開放閱讀框。

如果兩個(gè)單鏈多核苷酸的序列可以按反平行定向?qū)R以使得一個(gè)多核苷酸中的每個(gè)核苷酸與另一多核苷酸中的其互補(bǔ)核苷酸相對(duì)的而沒(méi)有引入空位和在任一序列的5′或3′端沒(méi)有未配對(duì)的核苷酸，那么這兩個(gè)單鏈多核苷酸是彼此的“互補(bǔ)序列”。如果兩個(gè)多核苷酸可以在中等嚴(yán)格條件下彼此雜交，那么一個(gè)多核苷酸與另一多核苷酸互補(bǔ)。因此，多核苷酸可以與另一多核苷酸互補(bǔ)而不是其互補(bǔ)序列。

“載體”為可以用于將與其連接的另一核酸引入細(xì)胞中的核酸。一種類型的載體為“質(zhì)?！保渲傅氖蔷€性或環(huán)狀雙鏈DNA分子，可以將另外的核酸片段連接至該雙鏈DNA分子中。另一類型的載體為病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，其中可將另外的DNA片段引入到病毒基因組中。某些載體能夠在其所引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，包含細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞中后被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，且由此與宿主基因組一起復(fù)制。“表達(dá)載體”為可以直接指導(dǎo)選定多核苷酸的表達(dá)的載體類型。

如果調(diào)控序列影響核苷酸序列的表達(dá)(例如，表達(dá)的水平、時(shí)機(jī)或位置)，那么該核苷酸序列“可操作地連接”于調(diào)控序列?！罢{(diào)控序列”為影響其可操作地連接的核酸的表達(dá)(例如，表達(dá)的水平、時(shí)機(jī)或位置)的核酸。調(diào)控序列可以，例如，直接在所調(diào)節(jié)的核酸上，或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)其它分子(例如，結(jié)合于該調(diào)控序列和/或該核酸的多肽)的作用施加其影響。調(diào)控序列的例子包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，聚腺苷酸化信號(hào))。調(diào)控序列的另外的例子在，例如，Goeddel，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.和Baron等人，1995，Nucleic Acids Res.23：3605-06中描述。

“宿主細(xì)胞”為可以用于表達(dá)核酸(例如，本發(fā)明的核酸)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如，大腸桿菌，或其可以是真核細(xì)胞，例如，單細(xì)胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物細(xì)胞(例如，煙草或番茄植物細(xì)胞)、動(dòng)物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞、猴細(xì)胞、倉(cāng)鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)或雜交瘤。宿主細(xì)胞的例子包括COS-7系猴腎細(xì)胞(ATCC CRL 1651)(參見Gluzman等人，1981，Cell23：175)、L細(xì)胞、C127細(xì)胞、3T3細(xì)胞(ATCC CCL 163)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或其衍生物如Veggie CHO和相關(guān)細(xì)胞系(其在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng))(參見Rasmussen等人，1998，Cytotechnology 28：31)或CHO株DX-B11(其為DHFR缺陷的)(參見Urlaub等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20)、HeLa細(xì)胞、BHK(ATCC CRL 10)細(xì)胞系、來(lái)源于非洲綠猴腎細(xì)胞系CV1的CV1/EBNA細(xì)胞系(ATCC CCL 70)(參見McMahan等人，1991，EMBO J.10：2821)、人胚腎細(xì)胞(比如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431細(xì)胞，人Colo205細(xì)胞、其它轉(zhuǎn)化的靈長(zhǎng)類細(xì)胞系、正常二倍體細(xì)胞、來(lái)源于原代組織、原代外植體的體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat細(xì)胞。通常，宿主細(xì)胞是可用多肽編碼核酸(其隨后可以在宿主細(xì)胞中表達(dá))轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞。短語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”可以用于表示已經(jīng)用待表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞也可以為包含核酸，但除非將調(diào)控序列引入到該宿主細(xì)胞中以使該調(diào)控序列可操作地與該核酸連接，該核酸不以所需的水平表達(dá)的細(xì)胞。應(yīng)該理解，術(shù)語(yǔ)宿主細(xì)胞不僅僅指特定的受試細(xì)胞，還指這種細(xì)胞的后代或潛在的后代。因?yàn)樵诤罄m(xù)的世代中可能由于例如突變或環(huán)境影響而出現(xiàn)一些變化，因此實(shí)際上這類后代可能與親代細(xì)胞不相同，但仍然包含在本文使用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。

可以利用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生本公開的多肽。在一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)重組DNA方法將編碼多肽的核酸序列(例如，cDNA)插入到重組表達(dá)載體中并且在促進(jìn)表達(dá)的條件下表達(dá)DNA序列來(lái)產(chǎn)生該多肽。

可以化學(xué)合成編碼本文公開的各種多肽中任何一種的核酸。可以選擇密碼子使用以改善在細(xì)胞中的表達(dá)。這類密碼子選擇取決于選擇的細(xì)胞類型。已經(jīng)開發(fā)了用于大腸桿菌和其它細(xì)菌以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的專用的密碼子使用模式。參見，例如：Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003，100(2)：438-42、Sinclair等人，Protein Expr.Purif.2002(1)：96-105、Connell N D.Curr.Opin.Biotechnol.2001，12(5)：446-9、Makrides等人，Microbiol.Rev.1996，60(3)：512-38和Sharp等人，Yeast.1991，7(7)：657-78。

用于核酸操作的一般技術(shù)在，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2ed.，1989或F.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience：NewYork，1987)及其定期更新中描述，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于本文中。編碼多肽的DNA可操作地連接至源自哺乳動(dòng)物、病毒或昆蟲基因的合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件。這些調(diào)控元件包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。在宿主中復(fù)制的能力(通常由復(fù)制起點(diǎn)賦予)和幫助識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因另外地并入。

重組DNA也可以包括可以用于純化蛋白質(zhì)的任何類型的蛋白質(zhì)標(biāo)簽序列。蛋白質(zhì)標(biāo)簽的例子包括，但不限于組氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽或GST標(biāo)簽。用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的合適的克隆和表達(dá)載體可以在Cloning Vectors：A Laboratory Manual，(Elsevier，N.Y.，1985)中找到。

利用適合于宿主細(xì)胞的方法將表達(dá)構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞中。本領(lǐng)域已知將核酸引入宿主細(xì)胞中的多種方法，包括但不限于：電穿孔，采用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染，基因槍法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和感染(其中載體是傳染劑)。合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。合適的細(xì)菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性有機(jī)體，例如，大腸桿菌或芽孢桿菌屬。酵母，優(yōu)選來(lái)自酵母屬物種，比如釀酒酵母，也可用于產(chǎn)生多肽。各種哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達(dá)重組蛋白。Luckow和Summers綜述了在昆蟲細(xì)胞中用于產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)(Bio/Technology，6：47，1988)。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子包括內(nèi)皮細(xì)胞、COS-7猴腎細(xì)胞、CV-1、L細(xì)胞、C127、3T3、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)、人胚腎細(xì)胞、HeLa、293、293T和BHK細(xì)胞系。純化的多肽通過(guò)培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)以表達(dá)重組蛋白來(lái)制備。對(duì)于許多應(yīng)用，本文公開的許多多肽的小尺寸使得在大腸桿菌中表達(dá)成為優(yōu)選的表達(dá)方法。然后從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物純化蛋白質(zhì)。

本文公開的蛋白質(zhì)也可以使用細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生。為了此類目的，必須修飾編碼多肽的核酸以允許進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生mRNA并且允許利用在特定的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(真核的，比如哺乳動(dòng)物或酵母無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，或原核的，比如，細(xì)菌無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng))中的mRNA無(wú)細(xì)胞翻譯。WISP1-結(jié)合多肽也可以通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生(例如，通過(guò)在Solid Phase Peptide Synthesis，2^nded.，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，111中描述的方法)。也可以通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生對(duì)蛋白質(zhì)的修飾。本公開的多肽可以通過(guò)蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域公知的蛋白質(zhì)分離/純化方法進(jìn)行純化。非限制性例子包括萃取、重結(jié)晶、鹽析(例如，用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附色譜、離子交換色譜、疏水性色譜、正相色譜、反相色譜、凝膠過(guò)濾、凝膠滲透色譜、親和色譜、電泳、逆流分布或這些的任意組合。純化后，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種，包括但不限于，過(guò)濾和透析，使多肽交換到不同的緩沖液中和/或濃縮。

純化的多肽優(yōu)選至少85％純，更優(yōu)選至少95％純，并且最優(yōu)選至少98％純。無(wú)論純度的確切數(shù)值如何，多肽都足夠純以用作藥物產(chǎn)品。

多肽的翻譯后修飾

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以進(jìn)一步包括翻譯后修飾。示例性的蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、SUMO化、生物素化或者多肽側(cè)鏈或疏水性基團(tuán)的添加。結(jié)果，修飾的可溶性多肽可含有非氨基酸成分，例如脂質(zhì)、多糖或單糖和磷酸類。糖基化的優(yōu)選形式是唾液酸化，其將一個(gè)或多個(gè)唾液酸部分與多肽結(jié)合。唾液酸部分改善溶解性和血清半衰期，同時(shí)還降低該蛋白質(zhì)的可能的免疫原性。參見Raju等人，Biochemistry.2001，31；40(30)：8868-76。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可溶性多肽的修飾形式包括將所述可溶性多肽連接至非蛋白質(zhì)性的聚合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該聚合物為聚乙二醇(″PEG″)、聚丙二醇或聚氧化烯類，如美國(guó)專利號(hào)4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述的方式。

PEG是可在市場(chǎng)上買到或可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法通過(guò)乙二醇的開環(huán)聚合制備(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，Vol.3，138-161頁(yè))的水溶性聚合物。術(shù)語(yǔ)“PEG”廣泛地用于涵蓋任何聚乙二醇分子而不考慮大小或在PEG末端的修飾，并且可以由下式表示：X-O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂OH(1)，其中n為20至2300，并且X為H或末端修飾，例如：C_1-4烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的PEG在一端以羥基或甲氧基封端，即，X為H或CH₃(″甲氧基PEG″)。PEG可以包含結(jié)合反應(yīng)所需的進(jìn)一步的化學(xué)基團(tuán)，其由分子的化學(xué)合成產(chǎn)生，或者是使分子的部分具有最佳距離的間隔物。另外，這種PEG可以由一條或多條連接在一起的PEG側(cè)鏈組成。具有多于一條PEG側(cè)鏈的PEG被稱為多臂或枝化PEG。枝化PEG可以通過(guò)，例如，將聚環(huán)氧乙烷添加到各種多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨糖醇)而制備。例如，四臂的枝化PEG可以由季戊四醇和環(huán)氧乙烷制備。例如，EP-A0473084和美國(guó)專利號(hào)5,932,462描述了枝化PEG。PEG的一種形式包括由賴氨酸的伯氨基基團(tuán)連接的兩個(gè)PEG側(cè)鏈(PEG2)(Monfardini等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。

相對(duì)于未修飾的結(jié)合多肽的清除率，PEG修飾的多肽的血清清除速率可以降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。PEG修飾的多肽的半衰期(t_1/2)相對(duì)于未修飾蛋白質(zhì)的半衰期增加。相對(duì)于未修飾的結(jié)合多肽的半衰期，PEG結(jié)合多肽的半衰期可以增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，或者甚至1000％。在一些實(shí)施方式中，在體外測(cè)定蛋白質(zhì)半衰期，比如，在緩沖鹽水溶液中或在血清中。在其它實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)半衰期是體內(nèi)半衰期，比如在動(dòng)物的血清或其它體液中的蛋白質(zhì)半衰期。

治療性制劑和施用方式

本公開特征用于治療人類癌癥和非癌癥炎性疾病如IPF的方法，包括施用抗-WISP1抗體。施用的技術(shù)和劑量根據(jù)特定多肽的類型和待治療的特定病癥而不同，但可以由技術(shù)人員容易地確定。通常，管理機(jī)構(gòu)要求用作治療劑的蛋白質(zhì)試劑進(jìn)行配制以具有可接受的低水平熱原。因此，治療性制劑與其它制劑的區(qū)別通常在于：其基本上是無(wú)熱原的，或者至少含有的熱原不超過(guò)由適當(dāng)?shù)墓芾頇C(jī)構(gòu)(例如，F(xiàn)DA)確定的可接受水平。

本公開的治療性組合物可以以單位劑量形式與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑一起施用。作為非限制性的例子，可以腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、皮下)、口服或通過(guò)吸入施用。此外，可以采用任何基因治療技術(shù)(使用編碼本發(fā)明多肽的核酸)，例如裸DNA遞送、重組基因和載體、基于細(xì)胞的遞送，包括患者細(xì)胞的離體操作，等。

該組合物可以是用于口服施用的丸劑、片劑、膠囊、液體或持續(xù)釋放片劑，或者用于靜脈內(nèi)、皮下或腸胃外施用的液體，或者用于局部施用的凝膠、洗劑、軟膏、霜?jiǎng)┗蛘呔酆衔锘蚱渌掷m(xù)釋放媒介的形式。

在例如″Remington：The Science and Practice of Pharmacy″(20^thed.，ed.A.R.Gennaro A R.，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.)中可以找到本領(lǐng)域公知的用于制備制劑的方法。用于腸胃外施用的制劑可以，例如，含有賦形劑、無(wú)菌水、鹽水、聚烷撐二醇比如聚乙二醇、植物來(lái)源的油或氫化萘類。生物相容性的、可生物降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的釋放。納米顆粒制劑(例如，可生物降解的納米顆粒、固體脂質(zhì)納米顆粒、脂質(zhì)體)可用于控制化合物的生物分布。其它潛在有用的腸胃外遞送體系包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入式輸注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。制劑中化合物的濃度根據(jù)多種因素變化，包括待施用藥物的劑量和施用途徑。

多肽可任選地作為藥學(xué)上可接受的鹽施用，比如在制藥工業(yè)中常用的無(wú)毒的酸加成鹽或金屬?gòu)?fù)合物。酸加成鹽的例子包括有機(jī)酸，比如乙酸、乳酸、撲酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸，或三氟乙酸等；聚合酸，比如單寧酸、羧甲基纖維素等；和無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等。金屬?gòu)?fù)合物包括鋅、鐵等等。在一個(gè)實(shí)例中，多肽在乙酸鈉存在的情況下配制以提高熱穩(wěn)定性。

用于吸入用途的制劑包括具有可接受的賦形劑的吸入裝置。

用于口服用途的制劑也可以作為可咀嚼片劑，或作為硬明膠膠囊(其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合)或作為軟明膠膠囊劑(其中活性成分與水或油介質(zhì)混合)提供。

治療有效劑量是指產(chǎn)生用于施用目的的治療效果的劑量。確切的劑量取決于待治療的病癥，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用已知技術(shù)確定。通常，多肽以每天約0.01μg/kg至約50mg/kg，優(yōu)選每天0.01mg/kg至約30mg/kg，最優(yōu)選每天0.1mg/kg至約20mg/kg施用。多肽可以每天(例如，每天一次、二次、三次或四次)或優(yōu)選以較低頻率(例如、每周、每?jī)芍堋⒚咳?、每月或每季?給予。此外，如本領(lǐng)域已知的，根據(jù)年齡以及體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、藥物相互作用和疾病的嚴(yán)重程度做出調(diào)整可能是必要的，并且將由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。

示例性用途

WISP1結(jié)合多肽可單獨(dú)或與一種或多種另外的治療如化療、放療、免疫療法、外科手術(shù)介入或這些方法的任何組合聯(lián)合施用。如上所述的，長(zhǎng)期治療在其它治療策略的情況下作為輔助療法同樣是可能的。

在這些方法的某些實(shí)施方式中，可以一起(同時(shí)地)或在不同時(shí)間(依次地)施用一種或多種多肽治療劑。此外，多肽治療劑可以與用于治療癌癥或抑制血管生成的另一類型的化合物一起施用。

在某些實(shí)施方式中，可以單獨(dú)使用本發(fā)明的所述抗-WISP1抗體。

在某些實(shí)施方式中，為了診斷的目的，可以標(biāo)記或不標(biāo)記結(jié)合多肽或其片段。通常診斷分析需要檢測(cè)由結(jié)合多肽與WISP1的結(jié)合產(chǎn)生的復(fù)合物的形成。與抗體類似，可以直接標(biāo)記結(jié)合多肽或片段?？梢圆捎枚喾N標(biāo)記，包括，但不限于：放射性核素、熒光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑和配體(如，生物素、半抗原)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多合適的免疫分析法(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)3,817,827、3,850,752、3,901,654和4,098,876)。在未標(biāo)記時(shí)，結(jié)合多肽可以用于分析中，比如凝集分析。未標(biāo)記的結(jié)合多肽也可以與另外(一種或多種)合適的試劑結(jié)合使用，該試劑可以用于檢測(cè)結(jié)合多肽，比如，與結(jié)合多肽反應(yīng)的標(biāo)記抗體或其它合適的試劑(例如，標(biāo)記的蛋白A)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以用于酶免疫分析法中，其中所述多肽與酶偶聯(lián)。當(dāng)包含WISP1蛋白的生物樣品與所述結(jié)合多肽組合時(shí)，在結(jié)合多肽和WISP1蛋白之間發(fā)生結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，含有表達(dá)WISP1蛋白的細(xì)胞(例如，內(nèi)皮細(xì)胞)的樣品與所述抗體組合，并且在結(jié)合多肽和攜帶被該結(jié)合多肽識(shí)別的WISP1蛋白的細(xì)胞之間發(fā)生結(jié)合。這些結(jié)合的細(xì)胞可以與未結(jié)合的試劑分離并且可以測(cè)定特異地結(jié)合細(xì)胞的結(jié)合多肽-酶偶聯(lián)物的存在，例如，通過(guò)將樣品與酶的底物(其在受到酶的作用時(shí)產(chǎn)生顏色變化或其它可檢測(cè)的變化)接觸。在另一實(shí)施方式中，所述結(jié)合多肽可以是未標(biāo)記的，并且可以加入識(shí)別所述結(jié)合多肽的第二標(biāo)記多肽(例如，抗體)。

在某些方面，還可以制備用于檢測(cè)生物樣品中WISP1蛋白的存在的試劑盒。這些試劑盒將包括與WISP1蛋白或所述受體的部分結(jié)合的WISP1結(jié)合多肽，以及一種或多種適于檢測(cè)結(jié)合多肽和受體蛋白或其部分之間的復(fù)合物的存在的輔助試劑。本發(fā)明的多肽組合物可以單獨(dú)地或與對(duì)于其它表位特異性的另外的抗體組合以凍干形式提供。結(jié)合多肽和/或抗體(其可以是標(biāo)記或未標(biāo)記的)可以與輔助成分(例如，緩沖劑如Tris、磷酸鹽和碳酸鹽，穩(wěn)定劑，賦形劑，殺生物劑和/或惰性蛋白質(zhì)，例如，牛血清白蛋白)一起包括在試劑盒中。例如，結(jié)合多肽和/或抗體可以作為與輔助成分的凍干混合物提供，或輔助成分可以單獨(dú)地提供用于由使用者組合。一般地，這些輔助材料重量基于活性結(jié)合多肽或抗體的量以小于約5％重量存在，且通?；诙嚯幕蚩贵w濃度以至少約0.001％重量的總量存在。當(dāng)采用能夠與結(jié)合多肽結(jié)合的第二抗體時(shí)，這種抗體可以在試劑盒中提供，例如在單獨(dú)的小瓶或容器中。第二抗體(如果存在)通常是標(biāo)記的，并且可以以與上文描述的抗體制劑相似的方式配制。

使用標(biāo)準(zhǔn)的一字母或三字母的縮寫表示多肽序列。除非另有說(shuō)明，每條多肽序列具有左側(cè)的氨基端和右側(cè)的羧基端；各單鏈核酸序列和各雙鏈核酸序列的頂部鏈具有左鍘的5′端和右鍘的3′端。還可以通過(guò)解釋特定多肽序列與參考序列如何不同來(lái)描述該特定多肽序列。

除非另有說(shuō)明，以下術(shù)語(yǔ)應(yīng)該理解為具有下面的意思：

術(shù)語(yǔ)“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”各自指包含通過(guò)肽鍵彼此接合的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的分子。這些術(shù)語(yǔ)包含，例如，天然和人工蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段和蛋白質(zhì)序列的多肽類似物(比如突變蛋白、變體和融合蛋白)以及翻譯后或者以其它方式共價(jià)或非共價(jià)地修飾的蛋白質(zhì)。肽、多肽或蛋白質(zhì)可以為單體的或多聚的。

多肽(例如，抗體)的“變體”包括其中相對(duì)于另一多肽序列，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基插入氨基酸序列中、從氨基酸序列刪除和/或被置換的氨基酸序列。公開的變體包括，例如，融合蛋白。

多肽的“衍生物”為已經(jīng)進(jìn)行化學(xué)修飾的多肽(例如，抗體)，例如，通過(guò)與另一化學(xué)部分(比如，聚乙二醇或白蛋白，例如，人血清白蛋白)偶聯(lián)、磷酸化和糖基化。除非另有說(shuō)明，除了包括兩條全長(zhǎng)重鏈和兩條全長(zhǎng)輕鏈的抗體之外，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括其衍生物、變體、片段或突變蛋白，其例子在下文有描述。

“抗原結(jié)合蛋白”是包含與抗原結(jié)合的部分和，任選地，允許抗原結(jié)合部分采取利于抗原結(jié)合蛋白與抗原結(jié)合的構(gòu)象的骨架或框架部分的蛋白質(zhì)。抗原結(jié)合蛋白的例子包括抗體、抗體片段(例如，抗體的抗原結(jié)合部分)、抗體衍生物和抗體類似物?？乖Y(jié)合蛋白可以包括，例如，具有移植的CDR或CDR衍生物的可替代的蛋白質(zhì)骨架或人工骨架。這些骨架包括，但不限于，抗體來(lái)源的骨架(包含引入以例如使抗原結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的突變)以及完全合成的骨架(包含，例如，生物相容性聚合物)。參見，例如，Korndorfer等人，2003，Proteins：Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，Volume 53，Issue 1：121-129；Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654。此外，可以使用肽抗體模擬物(“PAM”)以及基于抗體模擬物的骨架(利用纖維連接蛋白組分作為骨架)。

抗原結(jié)合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)?！懊庖咔虻鞍住笔撬木垠w分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每個(gè)四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基端部分包括主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的羧基端部分限定主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。人輕鏈分類為κ或λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，并分別定義抗體同種型為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。優(yōu)選地，本文公開的抗EGFR抗體的特征在于在重鏈VH和輕鏈VL氨基酸序列中的其可變域區(qū)域序列。優(yōu)選的抗體為A6，其為k IgG抗體。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)約12或更多個(gè)氨基酸的“J”區(qū)連接，其中重鏈還包括約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“D”區(qū)。通常參見，F(xiàn)undamental Immunology，第7章(Paul，W.編輯，第二版.Raven出版，N.Y.(1989))。每個(gè)輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)，使得完整的免疫球蛋白具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

“多特異性抗體”是識(shí)別在一個(gè)或多個(gè)抗原上的超過(guò)一個(gè)表位的抗體。該類型抗體的子類為“雙特異性抗體”，其識(shí)別在相同或不同抗原上的2個(gè)不同的表位。

如果抗原結(jié)合蛋白以1納摩爾或更小的解離常數(shù)結(jié)合抗原(例如，人WISP1)，那么其“特異性地結(jié)合”該抗原。

“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“抗原結(jié)合區(qū)”或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”為含有與抗原相互作用并造成抗原結(jié)合蛋白對(duì)抗原的特異性和親和力的氨基酸殘基(或其它部分)的抗原結(jié)合蛋白的部分。對(duì)于特異性地結(jié)合其抗原的抗體，這包括其CDR結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)的至少一部分。

“表位”為分子的被抗原結(jié)合蛋白(例如，被抗體)結(jié)合的部分。表位可以包括分子的非鄰近部分(例如在多肽中，在多肽的一級(jí)序列中不鄰近但在多肽的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下彼此足夠接近從而能夠被抗原結(jié)合蛋白結(jié)合的氨基酸殘基)。

兩條多核苷酸或兩條多肽序列的“百分同一性”通過(guò)利用GAP計(jì)算機(jī)程序(GCG Wisconsin Package的部分，版本10.3(Accelrys，圣地亞哥，加利福尼亞州))使用其默認(rèn)參數(shù)比較序列來(lái)確定。

“宿主細(xì)胞”為可以用于表達(dá)核酸的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如，大腸桿菌，或其可以是真核細(xì)胞，例如，單細(xì)胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物細(xì)胞(例如，煙草或番茄植物細(xì)胞)、動(dòng)物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞、猴細(xì)胞、倉(cāng)鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)或雜交瘤。宿主細(xì)胞的例子包括COS-7系猴腎細(xì)胞(ATCC CRL 1651)(參見Gluzman等人，1981，Cell 23：175)、L細(xì)胞、C127細(xì)胞、3T3細(xì)胞(ATCC CCL 163)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或其衍生物如Veggie CHO和相關(guān)細(xì)胞系(其在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng))(Rasmussen等人，1998，Cytotechnology 28：31)或CHO菌株DX-B11(其是DHFR缺陷的)(參見Urlaub等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20)、HeLa細(xì)胞、BHK(ATCC CRL 10)細(xì)胞系、源于非洲綠猴腎細(xì)胞系CV1的CV1/EBNA細(xì)胞系(ATCC CCL 70)(McMahan等人，1991，EMBO J.10：2821)、人胚腎細(xì)胞(如293、293EBNA或MSR 293)、人表皮A431細(xì)胞、人Colo205細(xì)胞、其它轉(zhuǎn)化的靈長(zhǎng)類細(xì)胞系、正常二倍體細(xì)胞、來(lái)源于原代組織、原代外植體的體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat細(xì)胞。通常，宿主細(xì)胞是可以用多肽編碼核酸(其隨后可以在宿主細(xì)胞中表達(dá))轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞。短語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”可以用于表示已經(jīng)用待表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞也可以為包含核酸但除非將調(diào)控序列引入到該宿主細(xì)胞中以使得該調(diào)控序列可操作地與該核酸連接，否則該核酸不以所需的水平表達(dá)的細(xì)胞。應(yīng)該理解，術(shù)語(yǔ)宿主細(xì)胞不僅僅指特定的受試細(xì)胞，還指這種細(xì)胞的后代或潛在的后代。因?yàn)槟承└淖兛赡苡捎诶缤蛔兓颦h(huán)境影響而在后續(xù)的世代中出現(xiàn)，因此實(shí)際上，這些后代可能與親代細(xì)胞不相同，但仍然包括在本文使用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。

抗原結(jié)合蛋白

抗原結(jié)合蛋白(例如，抗體、抗體片段、抗體衍生物、抗體突變蛋白和抗體變體)為結(jié)合WISP1的多肽。

包含一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合蛋白的寡聚體可以用作WISP1拮抗劑。寡聚體可以為共價(jià)連接或非共價(jià)連接的二聚體、三聚體或更高級(jí)的寡聚體的形式。考慮使用包含兩個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合蛋白的寡聚體，一個(gè)例子是同源二聚體。其它寡聚體包括異源二聚體、同源三聚體、異源三聚體、同源四聚體、異源四聚體等。

一個(gè)實(shí)施方式涉及包含通過(guò)在與抗原結(jié)合蛋白融合的肽部分之間的共價(jià)或非共價(jià)相互作用連接的多個(gè)抗原結(jié)合蛋白的寡聚體。這類肽可以是肽接頭(間隔物)，或具有促進(jìn)低聚化的性質(zhì)的肽。亮氨酸拉鏈和來(lái)源于抗體的某些多肽屬于能夠促進(jìn)與其連接的抗原結(jié)合蛋白的低聚化的肽，如下文更詳細(xì)描述的。

在特定實(shí)施方式中，寡聚體包含兩個(gè)至四個(gè)抗原結(jié)合蛋白。寡聚體的抗原結(jié)合蛋白可以是任何形式的，如上述形式的任何一種，例如，變體或片段。優(yōu)選地，寡聚體包含具有WISP1結(jié)合活性的抗原結(jié)合蛋白。

在一個(gè)實(shí)施方式中，寡聚體使用源自免疫球蛋白的多肽制備。例如，Ashkenazi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535、Byrn等人，1990，Nature 344：677和Hollenbaugh等人，1992″Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins″，Current Protocols in Immunology，Suppl.4，第10.19.1-10.19.11頁(yè)已經(jīng)描述了包含與抗體來(lái)源的多肽的各個(gè)部分(包括Fc結(jié)構(gòu)域)融合的某些異源多肽的融合蛋白的制備。

一個(gè)實(shí)施方式涉及通過(guò)將抗-WISP1抗體的WISP1結(jié)合片段與抗體的Fc區(qū)融合產(chǎn)生的包含兩個(gè)融合蛋白的二聚體?？梢酝ㄟ^(guò)例如，將編碼融合蛋白的基因融合體插入合適的表達(dá)載體中，在用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因融合體和使表達(dá)的融合蛋白非常像抗體分子一樣的組裝，由此在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵以產(chǎn)生二聚體來(lái)制備該二聚體。

術(shù)語(yǔ)“Fc多肽”包括源自抗體Fc區(qū)的多肽的天然和突變蛋白形式。也包括含有促進(jìn)二聚化的鉸鏈區(qū)的這種多肽的截短形式。包含F(xiàn)c部分的融合蛋白(以及由其形成的寡聚體)具有如下優(yōu)勢(shì)：易于通過(guò)在蛋白A或蛋白G柱上的親和色譜純化。

制備低聚抗原結(jié)合蛋白的另一方法包括使用亮氨酸拉鏈。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域?yàn)榇龠M(jìn)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域存在于其中的蛋白質(zhì)的低聚化的肽。亮氨酸拉鏈最初在幾種DNA結(jié)合蛋白中識(shí)別(Landschulz等人，1988，Science 240：1759)，并且此后在多種不同的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。已知的亮氨酸拉鏈中有二聚化或三聚化的天然存在的肽及其衍生物。WO 94/10308中描述了適于產(chǎn)生可溶性低聚蛋白的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的例子，并且Hoppe等人，1994，F(xiàn)EBS Letters 344：191中描述了來(lái)源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉鏈。Fanslow等人，1994，Semin.Immunol.6：267-78中描述了修飾的亮氨酸拉鏈的使用，該修飾的亮氨酸拉鏈允許與其融合的異源蛋白質(zhì)穩(wěn)定地三聚化。在一種方法中，在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)包含與亮氨酸拉鏈肽融合的抗WISP1抗體片段或衍生物的重組融合蛋白，并從培養(yǎng)物上清液回收形成的可溶性低聚抗-WISP1抗體片段或衍生物。

可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的抗原結(jié)合片段。這些片段的例子包括，但不限于Fab和F(ab′)₂片段。

本公開提供了結(jié)合WISP1的單克隆抗體。單克隆抗體可以利用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)產(chǎn)生，例如，通過(guò)使在完成免疫方案后從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中收集的脾細(xì)胞永生化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)使脾細(xì)胞永生化，例如，通過(guò)使脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤。在產(chǎn)生雜交瘤的融合過(guò)程中使用的骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選為不產(chǎn)生抗體的，具有高融合效率和酶缺陷的(這使得該骨髓瘤細(xì)胞不能在僅支持期望的融合細(xì)胞(雜交瘤)生長(zhǎng)的某些選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng))。在小鼠融合中使用的合適的細(xì)胞系的例子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；在大鼠融合中使用的細(xì)胞系的例子包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和48210?？捎糜诩?xì)胞融合的其它細(xì)胞系為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。

針對(duì)WISP1的抗原結(jié)合蛋白可以在體外或體內(nèi)用于，例如，檢測(cè)WISP1多肽的存在的分析中。也可以采用該抗原結(jié)合蛋白通過(guò)免疫親和色譜純化WISP1蛋白。阻斷性抗原結(jié)合蛋白可以用于本文公開的方法中。可以使用作為WISP1拮抗劑發(fā)揮作用的抗原結(jié)合蛋白治療任何WISP1誘導(dǎo)的病癥，包括但不限于各種癌癥。

抗原結(jié)合蛋白可以在體外過(guò)程中使用，或體內(nèi)施用以抑制WISP1誘導(dǎo)的生物活性。因此，可以治療由WISP1的蛋白水解活化(直接或間接地)引起或惡化的病癥，本文提供了其實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療方法，包括對(duì)需要的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用有效降低WISP1誘導(dǎo)的生物活性的量的WISP1阻斷抗原結(jié)合蛋白。

抗原結(jié)合蛋白包括抑制WISP1的生物活性的全人單克隆抗體。

可以通過(guò)許多常規(guī)技術(shù)的任何一種制備抗原結(jié)合蛋白。例如，它們可以從天然表達(dá)該抗原結(jié)合蛋白的細(xì)胞純化(例如，抗體可以從產(chǎn)生該抗體的雜交瘤純化)，或利用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)在重組表達(dá)體系中產(chǎn)生。參見，例如，Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，Kennet等人.(編輯)，Plenum出版社，紐約(1980)和Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Land(編輯)，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約(1988)。

可以使用本領(lǐng)域已知的任何表達(dá)系統(tǒng)制備本發(fā)明的重組多肽。通常，用包含編碼所需多肽的DNA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?？梢圆捎玫乃拗骷?xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如，大腸桿菌或芽孢桿菌。高等真核細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物來(lái)源的已建立細(xì)胞系。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子包括COS-7系猴腎細(xì)胞(ATCC CRL 1651)(Gluzman等人，1981，Cell 23：175)、L細(xì)胞、293細(xì)胞、C127細(xì)胞、3T3細(xì)胞(ATCC CCL 163)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、BHK(ATCC CRL 10)細(xì)胞系和如McMahan等人，1991，EMBO J.10：2821所述的源自非洲綠猴腎細(xì)胞系CV1的CV1/EBNA細(xì)胞系(ATCC CCL 70)。Pouwels等人，(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，1985)描述了用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的合適的克隆和表達(dá)載體。

轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以在促進(jìn)多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)，并且多肽通過(guò)常規(guī)蛋白質(zhì)純化過(guò)程回收。一種這樣的純化過(guò)程包括使用親和色譜，例如在WISP1的全部或部分(例如，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)與其結(jié)合的基質(zhì)上。本文考慮使用的多肽包括基本上沒(méi)有污染的內(nèi)源物質(zhì)的基本上同源的重組哺乳動(dòng)物抗-WISP1抗體多肽。

可以通過(guò)許多已知技術(shù)中的任何一種制備抗原結(jié)合蛋白并針對(duì)所需的性質(zhì)進(jìn)行篩選。某些技術(shù)包括分離編碼目標(biāo)抗原結(jié)合蛋白(例如，抗-WISP1抗體)的多肽鏈(或其部分)的核酸，和通過(guò)重組DNA技術(shù)操作該核酸。例如，核酸可以與另一目標(biāo)核酸融合，或被改變(例如，通過(guò)誘突或其它常規(guī)技術(shù))以添加、刪除或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。

單鏈抗體可以通過(guò)經(jīng)由氨基酸橋(短肽接頭)連接重鏈和輕鏈可變域(Fv區(qū))片段而得到單一多肽鏈來(lái)形成。這樣的單鏈Fv(scFv)通過(guò)將編碼肽接頭的DNA在編碼兩個(gè)可變域多肽(V_L和V_H)的DNA之間融合來(lái)制備。取決于在兩個(gè)可變域之間的柔性接頭的長(zhǎng)度，得到的多肽可以本身回折以形成抗原結(jié)合單體，或其可以形成多聚體(例如，二聚體、三聚體或四聚體)(Kortt等人，1997，Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001，Biomol.Eng.18：95-108)。通過(guò)將不同的包含V_L和V_H的多肽組合，可以形成結(jié)合不同表位的多聚scFv(Kriangkum等人，2001，Biomol.Eng.18：31-40)。為產(chǎn)生單鏈抗體而開發(fā)的技術(shù)包括在美國(guó)專利4,946,778；Bird，1988，Science 242：423；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879；Ward等人，1989，Nature 334：544和de Graaf等人，2002，Methods Mol.Biol.178：379-87中描述的那些技術(shù)。

已知用于從目標(biāo)抗體衍生不同亞類或同種型的抗體(即，亞類轉(zhuǎn)換)的技術(shù)。因此，例如，可以從IgM抗體衍生IgG抗體，反之亦然。這些技術(shù)允許制備具有給定抗體(親本抗體)的抗原結(jié)合性質(zhì)，但也展示與不同于親本抗體的抗體同種型或亞類相關(guān)的生物學(xué)性質(zhì)的新抗體?？梢圆捎弥亟MDNA技術(shù)。在這些過(guò)程中可以采用編碼特定抗體多肽的克隆的DNA，例如，編碼所需同種型的抗體的恒定域的DNA(Lantto等人，2002，Methods Mol.Biol.178：303-16)。此外，如果IgG4是需要的，那么在鉸鏈區(qū)中引入點(diǎn)突變(CPSCP-＞CPPCP)(Bloom等人，1997，Protein Science 6：407)以減輕形成H鏈內(nèi)二硫鍵(其可以導(dǎo)致IgG4抗體的異質(zhì)性)的趨勢(shì)也可能是理想的。

在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白對(duì)WISP1的結(jié)合親和力(K_a)為至少10⁶。在其它實(shí)施方式中，抗原結(jié)合蛋白表現(xiàn)的K_a為至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹或至少10¹⁰。在另一實(shí)施方式中，該抗原結(jié)合蛋白表現(xiàn)的K_a與本文實(shí)施例中描述的抗體的K_a基本上相同。

在另一實(shí)施方式中，本公開提供了對(duì)WISP1具有低解離速率的抗原結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗原結(jié)合蛋白的K_off為1×10^-4至10^-1或更小。在另一實(shí)施方式中，該K_off為5×10^-5至10^-1或更小。在另一實(shí)施方式中，該K_off與本文描述的抗體的K_off基本上相同。在另一實(shí)施方式中，該抗原結(jié)合蛋白以與本文描述的抗體基本上相同的K_off結(jié)合WISP1。

在另一方面，本公開提供抑制WISP1的活性的抗原結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗原結(jié)合蛋白的IC₅₀為1000nM或更低。在另一實(shí)施方式中，該IC₅₀為100nM或更低；在另一實(shí)施方式中，該IC₅₀為10nM或更低。在另一實(shí)施方式中，該IC₅₀與在本文實(shí)施例中描述的抗體的IC₅₀基本上相同。在另一實(shí)施方式中，該抗原結(jié)合蛋白以與本文描述的抗體基本上相同的IC₅₀抑制WISP1的活性。

在另一方面，本公開提供了結(jié)合在細(xì)胞表面上表達(dá)的人WISP1的抗原結(jié)合蛋白，且在如此結(jié)合時(shí)，其抑制細(xì)胞中的WISP1信號(hào)傳導(dǎo)活性而不導(dǎo)致細(xì)胞表面上WISP1量的顯著下降?？梢允褂萌魏螠y(cè)定或估算細(xì)胞表面上和/或內(nèi)部的WISP1量的方法。在其它實(shí)施方式中，抗原結(jié)合蛋白與WISP1表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致少于約75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％或0.1％的細(xì)胞表面WISP1內(nèi)化。

在另一方面，本公開提供了在體外或體內(nèi)(例如，當(dāng)施用于人類受試者時(shí))具有至少一天的半衰期的抗原結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原結(jié)合蛋白的半衰期為至少三天。在另一實(shí)施方式中，抗原結(jié)合蛋白的半衰期為四天或更長(zhǎng)。在另一實(shí)施方式中，該抗原結(jié)合蛋白的半衰期為八天或更長(zhǎng)。在另一實(shí)施方式中，抗原結(jié)合蛋白被衍生化或修飾以使得其相比于未衍生化或未修飾的抗原結(jié)合蛋白具有更長(zhǎng)的半衰期。在另一實(shí)施方式中，抗原結(jié)合蛋白含有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變以增加血清半衰期，比如在WO00/09560中所述，該文獻(xiàn)通過(guò)引入并入本文。

本公開進(jìn)一步提供了多特異性抗原結(jié)合蛋白，例如，雙特異性抗原結(jié)合蛋白，比如，通過(guò)兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)域結(jié)合WISP1的兩個(gè)不同表位，或結(jié)合WISP1的表位和另一分子的表位的抗原結(jié)合蛋白。此外，本文公開的雙特異性抗原結(jié)合蛋白可以包含來(lái)自本文描述的抗體之一的WISP1結(jié)合位點(diǎn)和來(lái)自本文描述抗體中另一種(包括通過(guò)引用其它公開文獻(xiàn)在本文中描述的那些)的第二WISP1結(jié)合區(qū)域?？蛇x地，雙特異性抗原結(jié)合蛋白可以包含來(lái)自本文描述的抗體之一的抗原結(jié)合位點(diǎn)和來(lái)自本領(lǐng)域已知的另一WISP1抗體或來(lái)自通過(guò)已知的方法或本文描述的方法制備的抗體的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)。

本領(lǐng)域已知許多用于制備雙特異性抗體的方法。這些方法包括如Milstein等人，1983，Nature 305：537描述的雜種-雜交瘤的使用和抗體片段的化學(xué)偶聯(lián)(Brennan等人，1985，Science 229：81；Glennie等人，1987，J.Immunol.139：2367；美國(guó)專利號(hào)6,010,902)。此外?？梢酝ㄟ^(guò)重組手段產(chǎn)生雙特性抗體，例如，通過(guò)利用亮氨酸拉鏈部分(即，來(lái)自Fos和Jun蛋白，其優(yōu)先形成異源二聚體；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547)或如美國(guó)專利號(hào)5,582,996中描述的其它“鎖-鑰”相互作用的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。另外的有用技術(shù)包括美國(guó)專利號(hào)5,959,083和5,807,706中描述的那些技術(shù)。

在另一方面，該抗原結(jié)合蛋白包括抗體的衍生物。衍生化的抗體可以包含賦予該抗體所需的性質(zhì)(比如，在特定用途中增加的半衰期)的任何分子或物質(zhì)。衍生化的抗體可以包含，例如，可檢測(cè)(或標(biāo)記)的部分(例如，放射性的、比色的、抗原性的或酶性的分子)，可檢測(cè)的珠(例如，磁珠或電子致密(例如，金)珠)或者結(jié)合另一分子(例如，生物素或鏈霉親和素)的分子，治療或診斷部分(例如，放射性的、細(xì)胞毒性的或在藥學(xué)活性的部分)，或者增加抗體對(duì)特定用途(例如，施用于受試者如人類受試者，或其它體內(nèi)或體外用途)的適用性的分子?？梢杂糜诳贵w衍生化的分子的例子包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)制備白蛋白連接的和聚乙二醇化的抗體衍生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體與轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)或TTR變體綴合或以其他方式連接。TTR或TTR變體可以用例如選自以下的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾：葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種漸進(jìn)的慢性衰弱的臨床綜合征，其具有未知的病因?qū)W和最終結(jié)果。纖維化疾病通常與由重復(fù)的肺損傷或停止正常修復(fù)過(guò)程的失敗導(dǎo)致的進(jìn)行性瘢痕形成相關(guān)。更具體地，IPF最初特征在于肺泡上皮細(xì)胞損傷和接著過(guò)度的成纖維細(xì)胞遷移、激活和增殖，伴隨細(xì)胞外基質(zhì)沉積和重建。當(dāng)足夠比例的IPF肺變成瘢痕性呼吸衰竭伴隨發(fā)生其它并發(fā)癥時(shí)，IPF存活率低于大多數(shù)癌癥和其它致死性肺病(圖1)。IPF癥狀包括持續(xù)性咳嗽、進(jìn)行性重度呼吸急促和運(yùn)動(dòng)能力下降。多達(dá)200,000名美國(guó)人患有這一預(yù)期存活期3-5年的疾病。隨著人口增長(zhǎng)，且診斷和治療變得更為可用，這一疾病的發(fā)生率和流行率預(yù)計(jì)提高。在美國(guó)，延長(zhǎng)壽命的唯一選擇是肺移植。

IPF表現(xiàn)為是由肺泡上皮損傷和纖維化病灶激活導(dǎo)致的纖維增殖性障礙。導(dǎo)致纖維化病灶出現(xiàn)的基礎(chǔ)機(jī)制是不清楚的。但是，當(dāng)前的證據(jù)表明駐留型成纖維細(xì)胞的局部增殖和分化的作用，以及循環(huán)干細(xì)胞的募集。

非受理論的限制，WISP 1的自分泌和旁分泌效應(yīng)可以在肺泡上皮II型(ATII)細(xì)胞和肺中的間質(zhì)成纖維細(xì)胞的界面處啟動(dòng)并使纖維化過(guò)程保持(圖2)。無(wú)論WISP1是否誘導(dǎo)增殖，體內(nèi)ECM沉積最可能在疾病中由ATII細(xì)胞微環(huán)境決定。

值得注意的是，可得的數(shù)據(jù)支持WISP1牽涉到纖維化和IPF中：1.WISP1通過(guò)β-連環(huán)蛋白和TGF-β誘導(dǎo)；2.高β-連環(huán)蛋白水平在纖維化病灶和增殖性細(xì)支氣管病變內(nèi)的IPF成纖維細(xì)胞中觀察到；3.WISP1在人IPF肺中上調(diào)；和4.博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化用阻斷WISP1的鼠抗體處理顯著降低肺纖維化。總的說(shuō)來(lái)，這一證據(jù)表明WISP1在IPF中的重要作用。

優(yōu)選地，本文中公開的抗-WISP1抗體吸入用于氣溶膠遞送以直接肺部施用。一般地，吸入的氣溶膠施用需要非常小的劑量以實(shí)現(xiàn)有效的肺水平。與局部遞送組合，系統(tǒng)暴露量最小化。通過(guò)這一方法，吸入途徑可以用作確保安全和有效的手段來(lái)治療IPF。

所有鑒別的mAb使用ELISA篩選與重組人和鼠WISP1蛋白(可從R&D Systems或Sino Biologies商購(gòu))具有交叉反應(yīng)性。使用OctetRed儀，評(píng)估公開的mAb針對(duì)重組人WISP1蛋白的親和力并基于親和力數(shù)據(jù)分級(jí)。所公開的克隆顯示出針對(duì)人WISP1的至少單數(shù)位納摩爾的親和力。

優(yōu)選地，所公開的抗體通過(guò)吸入施用，但完全I(xiàn)gG抗體的霧化可以證明由于其分子大小(～150kDa)的限制。為最小化可商購(gòu)的霧化裝置，較小的Fab片段可能是需要的。在這種情況下，我們也可能需要從親本IgG分子生成Fab片段。

實(shí)施例1

這一實(shí)施例闡明本文公開的各種抗-WISP-1抗體在人(h)和鼠(m)之間的交叉反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，96-孔Ni-NTA板，捕獲1μg/μL重組人WISP1/His或鼠WISP1/His(對(duì)照：PBS)。室溫下孵育30min。用PBS-Tween(PBST)洗滌3次。添加在Casein中稀釋的IgG(約1g/ml)并伴隨振搖孵育30min。板用PBST洗滌3次，然后添加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)的山羊抗-人Fc(Casein中1∶500)，然后添加3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為底物并顯色30min。2M H₂SO₄用于終止反應(yīng)且OD在450nm下讀取。交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù)顯示于圖3和4中。

實(shí)施例2

這一實(shí)施例闡明本文中公開的各種抗-WISP-1抗體的結(jié)合親和力。簡(jiǎn)言之，抗-人Fc抗體(GE，BR-1008-39)使用標(biāo)準(zhǔn)NHS/EDC偶聯(lián)方法固定在CM5傳感芯片上至大約1000RU?？贵w(約10g/ml)以10μl/min的速率捕獲60s。重組人WISP1/His在運(yùn)行緩沖液(HBS-EP)中系列稀釋。所有測(cè)量用30μL/min的流速進(jìn)行。表面用3M MgCl₂再生60s。1∶1(Langmuir)結(jié)合模型用于擬合數(shù)據(jù)。下表顯示結(jié)合親和力。

序列表

序列表

<110> Sorrento Therapeutics, Inc.

<120> 結(jié)合WISP1的抗體療法

<130> WISP1-1A

<160> 64

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Arg Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Asp Asn Gly Lys Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Asn Asp Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Gly Ala Gly

20 25 30

Phe Pro Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Pro Pro Lys Val

35 40 45

Leu Ile Asp Gly Asn Asn Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Val

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Tyr Asp Ser Gly

85 90 95

Leu Asp Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 3

<211> 115

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Gln Ala Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ile Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser

85 90 95

Asn Thr Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Thr Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Leu Ser Gly Asp Thr Leu Thr Asp Leu

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Phe Glu Asp Gly Glu Ile Val Tyr Gly Asp Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Val Thr Glu Asp Pro Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Lys Arg Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Lys Asp Ile Pro Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Ser Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

100 105 110

Leu

<210> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Trp Leu Asn Pro Gly Ser Gly Lys Thr Gly Asn Ala Gln Asn Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Phe Met Thr Trp Asp Thr Ser Lys Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asp Phe Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Arg Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Arg Ser

20 25 30

Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Phe Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Thr

85 90 95

Trp Ile Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

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1 5 10 15

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Pro

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Leu

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<213> 智人

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

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65 70 75 80

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Gly Gly Phe Asp Phe Glu Asp Gly Glu Ile Val Tyr Gly Asp Lys Phe

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