i)向具有針對抗原活化的T細胞的患者施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，

其中步驟i)的所述加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段(time frame)內(nèi)施用。

免疫系統(tǒng)對身體提供針對病原體和腫瘤細胞的保護。為了正常工作，它必須區(qū)分“自己”和“異己”(病原體/腫瘤)。免疫系統(tǒng)檢測病原體(包括細菌、病毒、寄生蟲、真菌和毒素)并與其斗爭。為了使得區(qū)分“自己”和“異己”，所有的自身蛋白和異源蛋白(及其組分)必須通過樹突細胞(dendritic cell，DC)篩選。一些病原體直接感染DC，然后可篩選其性質(zhì)(無害的或危險的)。如果病原體侵入其他組織(例如，血管內(nèi)皮細胞、B細胞、巨噬細胞等)，但沒有侵入DC，這些組織經(jīng)歷程序性細胞死亡并且死細胞物質(zhì)被樹突細胞攝入(“抗原轉(zhuǎn)移”)，然后可篩選其性質(zhì)。

樹突細胞(以及其他細胞)包含病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的傳感器。PAMP是具有病原體特性的組分(例如，細菌的細胞壁組分，或某些病毒的雙鏈RNA)。一旦自身或異源蛋白質(zhì)直接或間接地進入DC，其被分解成片段(肽)，然后其在MHC-I和MHC-II的情況下被呈遞到DC的表面上。在MHC-I環(huán)境中下肽被CD8⁺T細胞識別，在MHC-II環(huán)境中下肽被CD4⁺T細胞識別，這兩者均通過該過程被活化。如果沒有提供額外的信號，該T細胞活化是自限的(self-limiting)并導(dǎo)致T細胞耐受。

如果蛋白質(zhì)和所產(chǎn)生的肽來自于病原體，DC將病原體的PAMP識別為“危險的”，并產(chǎn)生多種額外的信號。這些額外的信號導(dǎo)致DC“成熟”(例如，表面分子CD80、CD86、CD40、CD83的上調(diào))并且DC現(xiàn)在可為T細胞提供強烈的炎性共信號(inflammatory co-signal)(Paul W.E.2012)。隨著產(chǎn)生某些病原體(例如，寄生蟲)Th2信號(例如IL-4、IL-5)，產(chǎn)生了其他病原體(病毒、細胞內(nèi)細菌)Th1信號(例如IL-2、IL-12)。以下這些額外的信號強烈地形成對在MHC-I或MHC-II的情況下在DC上識別的肽(“抗原”)的T細胞應(yīng)答：Th2信號導(dǎo)致產(chǎn)生Th2CD4⁺T細胞，這主要幫助B細胞產(chǎn)生抗體。Th1信號(例如LPS、雙鏈RNA、CpG DNA)導(dǎo)致產(chǎn)生細胞毒性CD8⁺T細胞，但也誘導(dǎo)Th1CD4⁺(細胞毒性)T細胞應(yīng)答。通常認為僅DC能夠指導(dǎo)初始T細胞成為效應(yīng)T細胞(初級反應(yīng)，“致敏(priming)”)(Paul W.E.2012)。因此，僅DC能夠致敏CD8⁺T細胞變?yōu)榧毎拘约毎蛑旅鬋D4⁺T細胞變?yōu)檩o助細胞或細胞毒性細胞。通常認為無論感染的類型和途徑如何，T細胞(并且特別是CD8⁺T細胞)的致敏必須由DC產(chǎn)生(Paul W.E.2012)。

存在幾個DC亞群。在小鼠中，XCR1⁺DC專門針對死細胞物質(zhì)的吸收且其在MHC-I環(huán)境中下呈遞到CD8⁺T細胞，在人中，這些是(XCR1⁺)CD141⁺(BDCA3⁺)DC(van Montfoor等，2014，Gurka等，2015)。在小鼠和人中SIRPα⁺DC專門針對可溶性物質(zhì)的吸收且其在MHC-II環(huán)境中下呈遞到CD4⁺T細胞(Gurka等，2015)。除了這些“常規(guī)的DC”之外，還存在皮膚DC(例如朗格漢斯細胞)、單核細胞來源的DC和漿細胞樣DC(Merad等，2013)。DC亞群的功能看來均不是獨特的和專有的，例如SIRPα⁺DC還可將抗原呈遞到CD8⁺T細胞(Bachem等，2012)，盡管不是最優(yōu)的(suboptimally)。此外，其他細胞類型(例如，巨噬細胞)可將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到XCR1⁺DC，其隨后降解蛋白質(zhì)并將獲得的肽呈遞到CD8⁺T細胞(Backer等，2010)。雖然XCR1⁺DC專門用于致敏CD8⁺T細胞，但是由XCR1⁺DC降解的任何材料也將在MHC-II環(huán)境中下被呈遞，并因此還致敏CD4⁺T細胞(例如，Hartung等，2015)。XCR1⁺DC在致敏CD8⁺T細胞中的突出作用在遺傳缺乏XCR1⁺DC的動物模型Batf3-KO小鼠中變得更加明顯(Hildner等，2008)。

設(shè)計以誘導(dǎo)預(yù)防性或治療性CD8⁺T細胞免疫應(yīng)答之現(xiàn)代的基于蛋白質(zhì)的疫苗利用抗原加工和呈遞的生物學(xué)。因為可溶性蛋白質(zhì)無法高效地被XCR1⁺DC攝入，所以使用單克隆抗體或表面受體配體將蛋白質(zhì)抗原靶向至DC表面上表達的分子(Tacken等，2011，Caminschi等，2012，Hartung等，2015)。靶向的蛋白質(zhì)內(nèi)化到DC中，降解，并在MCH-I和MCH-II的情況下呈遞。因為這些蛋白質(zhì)性疫苗(proteinacious vaccine)不產(chǎn)生誘導(dǎo)CD8⁺效應(yīng)T細胞所需的額外信號，(靶向)蛋白質(zhì)的應(yīng)用通過添加Th1“佐劑”來補充(Dubensky等，2010)。這些佐劑是純化的病原體PAMP(例如，LPS)或模擬PAMP的化合物，例如聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)，其模擬某些病毒的雙鏈RNA。存在多種誘導(dǎo)DC的Th1應(yīng)答的PAMPS及其類似物：例如在小鼠中的LPS、CpG或聚I：C或在人中的聚I：C、RIG-I激動劑、TLR8激動劑等。所有Th1佐劑的共同之處在于當(dāng)與蛋白質(zhì)性抗原一起應(yīng)用時，其在體內(nèi)有效地誘導(dǎo)強大的Th1應(yīng)答、特別是強大的CD8⁺細胞毒性應(yīng)答的能力。

用于誘導(dǎo)CD8⁺效應(yīng)T細胞的另一些疫苗方法，例如基于DNA或基于RNA的疫苗或者病毒或細菌疫苗接種系統(tǒng)不一定必需添加佐劑，因為它們含有在DC中誘導(dǎo)Th1信號所需的PAMP。這些疫苗接種系統(tǒng)被認為是“自佐劑的(self-adjuvanted)”。

當(dāng)前知識表明在同一溶液中疫苗接種抗原應(yīng)當(dāng)與佐劑一起施加，理想地甚至物理連接以在CD4⁺和CD8⁺T細胞中誘導(dǎo)有效的Th1應(yīng)答(Cohn等，2014)。這種假設(shè)是基于觀察到在沒有佐劑時施加蛋白質(zhì)抗原會導(dǎo)致T細胞耐受(Probst等，2005，Lischke等，2012)。

某些感染(特別是病毒感染)在宿主中誘導(dǎo)強烈的急性CD8⁺T細胞應(yīng)答。在過去，使用非活疫苗(non-Iife vaccine)一直難以誘導(dǎo)相似的應(yīng)答。任何類型的基于肽/蛋白質(zhì)或基于核酸的疫苗接種(含佐劑的或自佐劑的)僅誘導(dǎo)相當(dāng)?shù)偷某跫塁D8⁺T細胞應(yīng)答，將抗原特異性CD8⁺T細胞的頻率最大限度地提高至所有CD8⁺T細胞的百分之幾。對于基于DC的疫苗也是如此，其中在體外生成的DC在體外以多種方式加載抗原，再注射(經(jīng)常反復(fù)地)到宿主中(Palucka等，2013)。這種方法是基于正確的假設(shè)，即成熟的活化DC需要致敏初始CD8⁺T細胞，以及基于錯誤的假設(shè)，即將致敏的CD8⁺T細胞進一步擴增并分化為細胞毒性細胞需要成熟的活化DC。出人意料地，我們已經(jīng)表明，不需要這種擴增階段DC(參見實施例3和7至10)。

用基于例如腺病毒、α-病毒等的非復(fù)制病毒疫苗接種系統(tǒng)也可觀察到有限的CD8⁺初級T細胞應(yīng)答(Robert-Guroff 2007)。用活疫苗接種系統(tǒng)(例如基于腺病毒的疫苗)甚至觀察到有限的初級CD8+T細胞應(yīng)答(Barnes等，2012)。只要在這些類型的疫苗接種后施加異源加強(heterologous boost)，則可提高該低頻率。

另外，在用于治療癌癥的治療性疫苗中使用的致敏和加強方案在過去相當(dāng)無效(Kastenmüller等，2014)。因此，有必要極力增強任何初始的CD8⁺T細胞應(yīng)答以克服這些限制從而開發(fā)有效的預(yù)防性疫苗或開發(fā)針對多種感染的治療性疫苗，或針對癌癥和腫瘤的治療性疫苗。

本發(fā)明解決了這個問題。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物，其用于延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述細胞毒性免疫應(yīng)答針對包含抗原之蛋白質(zhì)，所述方法包括以下步驟：

i)向具有針對抗原活化的T細胞的患者施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，

其中步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用。

“細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答”理解為針對給定的抗原可引發(fā)的Th1型細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答。這與主要針對Th2抗原呈遞途徑且主要導(dǎo)致產(chǎn)生Th2型(中和)抗體和免疫反應(yīng)之經(jīng)典疫苗的應(yīng)答形成對比。

“延長”的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答理解為與通過用抗原致敏(例如通過如用于針對如下文中所述包含抗原之蛋白質(zhì)誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法中所述的遞送系統(tǒng))獲得的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答相比，發(fā)生更長時間的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答。例如，應(yīng)答可被延長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

在一個優(yōu)選的實施方案中，延長的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答理解為與通過用抗原“致敏”(例如通過針對如下文中所述包含抗原之蛋白質(zhì)誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法中所述的遞送系統(tǒng))獲得的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答相比，另外增強的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答。例如，所述應(yīng)答的特征可在于與在用抗原致敏患者后存在的抗原特異的CD8⁺T細胞相比，其為抗原特異的CD8⁺T細胞的2倍或更多倍、3倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更多倍或者20倍或更多倍增強。此外，所述應(yīng)答的特征可在于與抗原特異的初始CD8⁺T細胞相比，其為抗原特異的CD8⁺T細胞的100倍或更多倍、1000倍或更多倍、100.000倍或更多倍或10⁶倍或更多倍增強。用于確定抗原特異的CD8⁺T細胞的方法是技術(shù)人員已知的，并且在例如實施例中描述。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白(IL-2mutein)，更優(yōu)選所述方法還包括施用白介素2(IL-2cx)或復(fù)合的白介素15(IL-15cx)，最優(yōu)選地，所述方法還包括施用白介素2(IL-2cx)，如下所述。在ADAS與復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白，更優(yōu)選白介素2(IL-2cx)或復(fù)合的白介素15(IL-15cx)，最優(yōu)選白介素2(IL-2cx)組合的這樣的一些實施方案中，所述應(yīng)答的特征可在于：與在用抗原致敏患者后存在的抗原特異性CD8⁺T細胞相比，其為抗原特異性CD8⁺T細胞的4倍或更多倍、10倍或更多倍、20倍或更多倍，或者100倍或更多倍增強。此外，在這樣的一些實施方案中，所述應(yīng)答的特征可在于與抗原特異的初始CD8⁺T細胞相比，其為抗原特異的CD8⁺T細胞的400倍或更多倍、1000倍或更多倍、100.000倍或更多倍或10⁶倍或更多倍增強。

根據(jù)本發(fā)明，“抗原依賴性擴增系統(tǒng)”或“ADAS”理解為涉及向具有針對抗原活化的T細胞的患者施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑的以上本發(fā)明的步驟i)，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化。特別地，在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的指定時間段內(nèi)進行ADAS。

如在實施例中所示(參見例如實施例6)，ADAS導(dǎo)致在患者中致敏后存在的抗原特異性細胞毒性T細胞的擴增。因此，ADAS系統(tǒng)還提供增強細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法。

因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物，其用于針對包含抗原之蛋白質(zhì)增強細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

i)向具有針對抗原活化的T細胞的患者施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，

其中步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后的0小時至14天的時間段內(nèi)施用。

根據(jù)本發(fā)明，“致敏”理解為針對給定抗原誘導(dǎo)初級的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答。通常在患者中體內(nèi)誘導(dǎo)這樣的致敏步驟；然而，也可能在體外在細胞的過繼轉(zhuǎn)移(adoptive transfer)之前引發(fā)這樣的應(yīng)答。

我們已經(jīng)開發(fā)了用于延長或增強對給定抗原特異的CD8⁺T細胞的細胞毒性的新系統(tǒng)。在本發(fā)明的一些實施例中，將模型抗原卵白蛋白(ovalbumin，OVA)或來自于OVA的肽SIINFEKL重組融合到指向DC表面上的趨化因子受體XCR1的抗體或XCR1-特異性趨化因子配體XCL1的C末端部分，并注射到宿主中。當(dāng)與Th1佐劑一起施用時，靶向的OVA誘導(dǎo)2％至5％水平的抗原特異性、細胞毒性CD8⁺T細胞(參見實施例1至5)。當(dāng)進行體內(nèi)細胞毒性測定以評估在該系統(tǒng)中CD8⁺T細胞致敏的程度時，我們出人意料地發(fā)現(xiàn)，不僅靶細胞被殺死，而且致敏的CD8⁺T細胞也被活化、擴增并進一步分化為細胞毒性效應(yīng)物。

根據(jù)該觀察，我們還開發(fā)了“抗原依賴性擴增系統(tǒng)”(Antigen-Dependent Amplification System，ADAS)。多種原代細胞的MHC-I可通過多種方法加載相關(guān)抗原，如在下文中詳細描述的。

為了檢查ADAS的效力的細胞需求，對多種淋巴細胞群(脾細胞、B細胞、T細胞和DC)體外加載SIINFEKL(SEQ ID NO：11)進行了比較并與第二佐劑(聚I：C，LPS、CpG或等同物)一起在最佳時間段內(nèi)注射到小鼠中(第5天)。該實驗確定所有表達MHC-I的這些淋巴細胞群能夠提供使CD8⁺T細胞繼續(xù)初始活化、擴增和功能分化為細胞毒性效應(yīng)細胞所必須的信號(圖3B)。而單獨的致敏在脾CD8T細胞群中在第10天導(dǎo)致1％至5％的抗原特異性CD8⁺T細胞，應(yīng)用ADAS將該頻率提高至約15％至25％。

我們還觀察到每當(dāng)患者中存在致敏的抗原特異性CD8⁺T細胞時，可出人意料地觀察到細胞之細胞毒性應(yīng)答的延長和增強(參見實施例6)，但最好的結(jié)果是使用靶向方法實現(xiàn)的(見圖6)。

因此，任何I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞均適于進行本發(fā)明的方法或用于本發(fā)明應(yīng)用的藥物。

我們已經(jīng)觀察到ADAS僅在用抗原致敏CD8⁺T細胞后的一定時間內(nèi)有效(參見實施例3)。當(dāng)在致敏后數(shù)天施加時，ADAS向新活化的CD8⁺T細胞提供其他活化/分化步驟。因此，我們已經(jīng)將ADAS確定為通過在指定的時間方案內(nèi)向患者施用以延長和增強持續(xù)的CD8⁺T細胞活化的方式。

為了檢查ADAS的效力的細胞需求，在體外對多種淋巴細胞群(脾細胞、B細胞、T細胞和DC)加載SIINFEKL(SEQ ID NO：11)進行了比較并與Th1細胞佐劑(聚I：C、LPS、CpG或等同物)一起在最佳的時間段內(nèi)注射到小鼠中(第5天)。本實驗確定所有表達MHC-I的這些淋巴細胞群能夠提供使CD8⁺T細胞繼續(xù)初始活化、擴增和功能分化為細胞毒性效應(yīng)細胞所必需的信號(圖3B)。然而單獨致敏在第10天在脾CD8⁺T細胞群中產(chǎn)生1％至5％的抗原特異性CD8⁺T細胞，應(yīng)用ADAS將該頻率提高至約15％至25％。

從所獲得的結(jié)果可以得出結(jié)論，在體內(nèi)ADAS將與能夠在淋巴細胞或者甚至非淋巴細胞的表面上提供足夠高密度的加載肽的MHC-I分子的任何系統(tǒng)一起工作。

除了在體外用肽外部加載的MHC-I分子，人們可以考慮這樣的系統(tǒng)，其中用整個包含抗原之蛋白質(zhì)在體外供給細胞，使細胞加工抗原并在MHC-I環(huán)境中下呈遞抗原肽。人們也可考慮這樣的系統(tǒng)，其中細胞在體外暴露于能夠感染細胞的病毒系統(tǒng)，導(dǎo)致在MHC-I環(huán)境中下表達大量的肽。此外，可用編碼給定的蛋白質(zhì)或肽序列的表達載體轉(zhuǎn)染帶有MHC-I的細胞，同樣導(dǎo)致在MHC-I環(huán)境中下肽的高效呈遞。

因為遞送至抗原呈遞細胞(APC)的全抗原將不僅在MHC-I環(huán)境中下呈遞到CD8⁺T細胞，而且在MHC-II環(huán)境中下呈遞到CD4⁺T細胞，ADAS也可用于增強CD4⁺T細胞應(yīng)答。對于這種特別的增強，用于ADAS的細胞必須還在細胞表面表達將加載有適當(dāng)肽的MHC-II分子。可通過外部暴露于合適的肽來完成這種加載，或可通過編碼給定的蛋白質(zhì)或肽序列的表達載體轉(zhuǎn)染帶有MHC-II的細胞，同樣導(dǎo)致在MHC-II環(huán)境中下肽的高效呈遞。

“肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)”理解為肽序列是包含抗原之蛋白質(zhì)序列的一部分(即，是包含抗原之蛋白質(zhì)序列的子序列)。在一個優(yōu)選的實施方案中，肽包含目的抗原或表位。

“加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞”理解為在細胞的表面上通過與MHC-I結(jié)合呈遞期望肽的細胞。

“包含抗原之蛋白質(zhì)”理解為包含目的抗原或表位的蛋白質(zhì)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及延長針對包含抗原之蛋白質(zhì)的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

i)向具有針對抗原活化的T細胞的患者施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，

其中步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用。

出人意料地發(fā)現(xiàn)，在指定的時間段內(nèi)ADAS的單獨應(yīng)用足以獲得細胞之細胞毒性應(yīng)答的強烈增強和延長。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞向所述患者施用僅一次。

因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，不再進一步施用ADAS。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在指定的時間段內(nèi)向患者施用僅一次，并且

-不再進一步施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞，或

-在針對抗原活化T細胞后0天至14天的時間段內(nèi)，不再進一步施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞。

識別初始小鼠中給定的抗原肽(例如，SIINFEKL)之CD8⁺T細胞的數(shù)目較低，且可以估計為大約200個CD8⁺T細胞。在體內(nèi)通過含有這樣的抗原肽(例如，OVA)的抗原致敏這些初始CD8⁺T細胞需要DC和Th1佐劑并且將在最佳條件下(即，將抗原靶向?qū)Ｂ欰PC，例如DC和B細胞)將SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的數(shù)目提高到約200.000。該CD8⁺T細胞數(shù)目的任何進一步的顯著提高(即，擴增)需要另外的刺激。不受理論的束縛，認為細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答所期望的延長和/或增強需要在MHC-I環(huán)境中下以同步方式呈遞抗原肽以及在炎性情況下通過施用Th1佐劑(或者所述系統(tǒng)是自佐劑的)提供的明顯更大數(shù)目的細胞。還認為通過在人中注入較小數(shù)目的帶有MHC-I的細胞(例如，小于1×10⁶或1×10⁷個細胞)，例如DC或其他抗原呈遞細胞或加載有肽的任何其他原代細胞，以及如過去已經(jīng)實現(xiàn)的將其局部注射(例如，s.c.)到淋巴結(jié)或腫瘤中可能滿足不了這些需求。這是迄今為止在臨床上測試的所有腫瘤疫苗接種方案中整體上未能實現(xiàn)大量抗原特異性細胞毒性CD8⁺T細胞的原因。

相反，可通過全身注射(例如，i.v.、i.p.或鞘內(nèi))大量加載有抗原肽的帶有MHC-I的原代細胞優(yōu)選有效地提供用于擴增CD8⁺T細胞的另外的刺激。通過全身應(yīng)用大量帶有MHC-I的原代細胞和所注射的細胞的廣泛免疫學(xué)可達性(immunological accessibility)確保了整個最近致敏的CD8⁺T細胞群所需的同步再活化。如果局部注射，加載MHC-I的細胞可能截留在組織中，因此不可廣泛地到達最近致敏的CD8⁺T細胞。結(jié)果，局部注射的帶有肽的細胞不可為循環(huán)中存在的最近致敏的CD8⁺T細胞的整個群體提供迅速且同步的再活化刺激。然而，如果通過加載MHC-I的原代細胞的全身應(yīng)用實現(xiàn)致敏的CD8⁺T細胞的整個群體的同步再活化，這導(dǎo)致最近致敏的CD8⁺T細胞的進一步大規(guī)模擴增。如通過我們的實驗所示，這種類型的刺激(ADAS)可在數(shù)天內(nèi)將抗原特異性CD8⁺T細胞的總數(shù)從200 000個細胞進一步擴增至2×10⁶和高達10×10⁶個細胞，表示10至50倍的擴增(參見實施例3、4和9)。在人免疫系統(tǒng)中可預(yù)期類似的需求。

可通過技術(shù)人員已知的方法，特別是使用多種施用途徑來施用細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是活細胞。通常來說，將細胞制備為細胞在水溶液(例如生理上可接受的水溶液，其優(yōu)選為經(jīng)緩沖的)中的混懸液。例如，這樣的溶液是具有生理鹽水濃度的生理上可接受的緩沖溶液。

施用可全身性(特別是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或通過鞘內(nèi)注射)進行，或者作為替代地，皮下，或通過施用到腫瘤中進行。然而，如上所述，特別優(yōu)選全身性施用(特別是靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)或鞘內(nèi)施用)細胞。

在一個最優(yōu)選的實施方案中，施用細胞是靜脈內(nèi)施用細胞。

在另一個實施方案中，例如，可通過注射到腫瘤組織中進行向腫瘤中的施用以實現(xiàn)高局部濃度的細胞。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞全身性(特別是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或通過鞘內(nèi)注射)施用，或者作為替代地，皮下，或者在患者患有腫瘤的情況下通過施用到腫瘤中來施用，其中特別優(yōu)選全身性施用(特別是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或鞘內(nèi)施用)細胞。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞靜脈內(nèi)施用。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的又一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞全身性和/或作為在生理上可接受的水溶液(其優(yōu)選為經(jīng)緩沖的)中的混懸液施用。

如從實施例可以看出，多種MHC-I呈遞細胞(例如脾細胞)適合用于該目的。因此，對于該目的，不需要使用樹突細胞。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞不是樹突細胞。

所述細胞優(yōu)選來自與患者相同的物種。因此，在患者為人的情況下，細胞的供體優(yōu)選為人。供體可以與患者不同，或者可以是患者本身。為了避免不希望的免疫應(yīng)答，供體是患者本身，即，步驟i)的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞從所述患者獲得。因此，優(yōu)選使用自體細胞。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞從所述患者獲得。

可通過本領(lǐng)域中已知的方法從患者中容易地獲得血液，并因此表示待用于產(chǎn)生本發(fā)明的加載肽之細胞的MHC-I呈遞細胞的優(yōu)選來源。在一個實施方案中，血液樣品可直接用于加載細胞。然而，優(yōu)選在加載細胞之前從血液樣品中除去不存在MHC-I的細胞(例如紅細胞)。特別地，外周血單個核細胞(PBMC)(例如單核細胞或淋巴細胞及其混合物)特別適合用于該目的。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，MHC-I呈遞細胞是血細胞，尤其是外周血單個核細胞(PBMC)，例如單核細胞或淋巴細胞。

通常來說，MHC-I呈遞細胞從供體獲得，所述供體優(yōu)選為患者，并將MHC-I呈遞細胞在體外培養(yǎng)僅2小時至3天，更優(yōu)選2小時至2天，甚至更優(yōu)選2小時至1天，并隨后根據(jù)本發(fā)明向患者施用。

如以下更詳細地描述進行所述培養(yǎng)以實現(xiàn)加載來自于包含抗原之蛋白質(zhì)的肽。如下文中所述，外部加載和內(nèi)部加載這兩種方法都可以。例如，通過在外部添加的肽的存在下進行培養(yǎng)可進行外部加載。在本實施方案中，在肽的存在下培養(yǎng)2小時至12小時可以是足夠的。在內(nèi)部加載方法(例如通過使用與包含抗原之蛋白質(zhì)融合的細胞穿透肽)的情況下，優(yōu)選需要更多時間以使細胞加工蛋白質(zhì)并在MHC-I環(huán)境中下呈遞所得的肽。在這樣的一些實施方案中，優(yōu)選培養(yǎng)約10小時至2天或3天。

因此，在一個更優(yōu)選的實施方案中，將從所述患者獲得的步驟i)的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在體外培養(yǎng)2小時至3天，更優(yōu)選為2小時至2天。

待施用的細胞的量可根據(jù)多種因素(例如抗原和患者)而變化。例如，較高量的待施用的細胞可受到最初可從患者獲得的用于產(chǎn)生加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞之細胞的量的限制。通常來說，可向人施用1×10⁶至4×10⁸個細胞或5×10⁸個細胞。例如，可向人患者施用1×10⁷、3×10⁷、5×10⁷、8×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸或5×10⁸個細胞。然而，如上所述，優(yōu)選施用較高量的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞，特別是至少1×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、5×10⁷或8×10⁷個細胞，特別地，其中所述患者是人。

特別優(yōu)選進行全身性(特別是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或通過鞘內(nèi)注射)施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞，以及向所述患者施用1×10⁶至4×10⁸、更優(yōu)選1×10⁷至4×10⁸個加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的又一個優(yōu)選實施方案中，向所述患者施用1×10⁶至4×10⁸、優(yōu)選1×10⁷至4×10⁸個加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞。

如以上和在實施例中所述，在0小時至14天的時間段內(nèi)向患者施用步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞導(dǎo)致增強和/或延長細胞之細胞毒性應(yīng)答。優(yōu)選地，在時間段內(nèi)所述細胞施用僅一次。

出人意料地，發(fā)現(xiàn)單次施用足夠并且優(yōu)選用于實現(xiàn)細胞之細胞毒性應(yīng)答所期望的增強和/或延長。如在實施例中可示出的，當(dāng)在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用時，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞是有效的，并且在小鼠中，在初始抗原刺激后5至9天的時間段內(nèi)達到最好的結(jié)果(實施例3)。

在人中，可以預(yù)期待被延長的最佳時間段，例如初始抗原刺激后5天至12天，更優(yōu)選5天至9天。

此外，優(yōu)選在致敏后一段時間后進行ADAS，即在初始抗原刺激48小時后或以上，更優(yōu)選72小時或以上(參見實施例3和11)。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，時間段是72小時至12天、優(yōu)選5天至12天、更優(yōu)選5天至9天。

在一個優(yōu)選的實施方案中，細胞和第二佐劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，時間段是針對抗原活化T細胞后48小時至14天，或72小時至14天。

例如，所述施用在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天進行。

在一個優(yōu)選的實施方案中，時間段是針對抗原活化T細胞后3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，或5天至9天，例如4天、5天、6天、7天、8天或9天。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后48小時至14天，或72小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

例如，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用僅一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天、4天至9天或5至9天，例如4天、5天、6天、7天、8天或9天的時間段內(nèi)施用僅一次。

還出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過在活化的細胞毒性T細胞已恢復(fù)到記憶狀態(tài)后再次進行ADAS可再次增強和/或延長細胞的細胞毒性應(yīng)答(參見實施例10，圖10)。

“活化的細胞毒性T細胞已恢復(fù)到記憶狀態(tài)”理解為與在患者中用這樣的抗原致敏后5天相比，可檢測到10％或更少的抗原特異性CD8⁺T細胞。記憶T細胞是技術(shù)人員已知的并理解為已識別特定抗原并且在過去應(yīng)答于所述抗原且可快速并以更大的強度應(yīng)答于相同抗原的再攻擊(re-challenge)的T細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用多種表面標(biāo)志物區(qū)分初始T細胞和最近活化的“致敏”T細胞以及區(qū)分最近活化的“致敏”T細胞與記憶T細胞。在人中，合適的生物標(biāo)志物是例如CD25、CD45RA、CD45R0、CD62L、CCR7、ICOS和XCL1，例如在Paul W.E.(2012)中描述的。技術(shù)人員知曉生物標(biāo)志物模式在多種器官中不同。用于確定抗原特異性CD8⁺T細胞的方法是技術(shù)人員已知的并在例如實施例10中描述。

通常來說，活化的細胞毒性T細胞在針對抗原活化T細胞后3周后，優(yōu)選4周后，例如40天后恢復(fù)到記憶狀態(tài)。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)向所述患者施用僅一次，并且在針對抗原活化的T細胞恢復(fù)到記憶狀態(tài)后施用一次或更多次。在一個更優(yōu)選的實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞再施用僅一次，即，在針對抗原活化的T細胞恢復(fù)到記憶狀態(tài)后施用僅一次。在一個更優(yōu)選的實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后3周或更長時間，優(yōu)選4周或更長時間后施用。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后3周后，優(yōu)選4周或更長時間后再施用僅一次。例如，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后的3周至6個月或1年的時間段內(nèi)或4周至6個月或1年的時間段內(nèi)施用，優(yōu)選地，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后3周至6個月或1年的時間段內(nèi)或4周至6個月或1年的時間段內(nèi)施用僅一次。因此，如實施例10中所示，在針對抗原活化的T細胞恢復(fù)到記憶狀態(tài)后單次施用也是出乎意料地充分并且優(yōu)選的。

多種方法可用于獲得本發(fā)明步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞。

在一個優(yōu)選的實施方案中，例如實施例3中，可在體外通過外部加載包含目的抗原的肽(例如，如實施例中的SIINFEKL)實現(xiàn)。通常來說，在合適的流體(例如水溶液或介質(zhì))中將細胞與肽孵育一定時間，例如10分鐘至24小時或48小時，特別是20分鐘至12小時。

因為在MHC-I環(huán)境中下呈遞的肽的長度通常為8、9或10個氨基酸，即，在MHC-I環(huán)境中下結(jié)合肽需要該長度，用于外部加載的肽優(yōu)選具有該長度。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞通過將至少一種I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞與所述肽在體外進行孵育而獲得。

在體外外部加載細胞的情況下，可通過本領(lǐng)域中已知的方法來選擇肽序列。可通過本領(lǐng)域已知的方法進行體外外部加載細胞，例如，通過提供所述肽的水溶液，向細胞添加該溶液，細胞優(yōu)選在緩沖溶液或介質(zhì)中，將細胞與肽孵育以實現(xiàn)高飽和度的具有各自肽的MHC-I和/或MHC-II，以及任選地(例如，用水溶液)洗滌細胞。

在一個優(yōu)選的實施方案中，在體外將細胞加載一(1)種肽，其具有為包含抗原之蛋白質(zhì)的子序列的序列并且其包含抗原或表位。例如，可以在體外向細胞群添加包含這樣的肽的水溶液，所述細胞群優(yōu)選是從患者獲得的細胞群。

或者，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同加載肽的I類細胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞群的混合物，其中所述細胞加載有不同的肽。優(yōu)選地，所述細胞從患者獲得。

可通過將合適的細胞群(如PBMC細胞)與2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽的混合物孵育獲得這樣的細胞混合物，由此得到在MHC-I環(huán)境中下加載有不同肽的細胞。或者，單獨的細胞群，可以將例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種細胞群與不同的肽在體外孵育，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽。因此，由此得到各自加載不同肽的單獨的I類細胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞群?？梢詥为毷┯貌煌募虞d肽的I類細胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞群，或者可以制備不同的加載肽的I類細胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞群的混合物，然后可將其向患者施用。

在使用不同的肽的情況下，特別是如果使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽，這樣的肽可以來自相同或不同的包含抗原之蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，可使用來自一種腫瘤抗原的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽。這意味著，每種肽的序列是腫瘤抗原的子序列。這樣的不同的肽的序列可以是重疊或不重疊的。在另一個實施方案中，可以使用來自2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同腫瘤抗原的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽。在這樣的一個實施方案中，不同的腫瘤抗原都與相同或不同的腫瘤有關(guān)，優(yōu)選相同的腫瘤。在另一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用來自一種感染性病原體抗原的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽。這意味著，每種肽的序列都是病原體抗原的子序列。這樣的不同的肽的序列可以是重疊或不重疊的。在另一個實施方案中，可以使用來自2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同病原體抗原的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽。在這樣的一個實施方案中，不同的病原體的抗原與相同或不同的病原體相關(guān)，優(yōu)選與相同的病原體相關(guān)。

優(yōu)選地，選擇8、9或10個氨基酸的長度的肽序列，因為通過MHC-I呈遞的肽的通常為該長度。

HLA等位基因是極其多態(tài)性的。因此，加載的肽優(yōu)選是通過常見的HLA等位基因呈遞的肽。因此，在人中，特別優(yōu)選通過最常見的等位基因HLA-A2呈遞的肽?；蛘?，可使用通過HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35呈遞的肽，這些是白種人來源個體相關(guān)的等位基因。對于亞洲個體可以使用HLA-A24，且對于非洲個體可使用HLA-A30。

在Speiser和Romero(Seminars in Immunology 22(2010)144-154)及其參考文獻中描述了幾種適合的腫瘤相關(guān)的肽。其中大多數(shù)是HLA-A2限制性的，例如來自Melan-A/MART-1的肽，對于黑素細胞分化抗原為一種gp100表位和酪氨酸酶；對于前列腺為前列腺表面抗原和PSAP；對于黏膜腫瘤為癌胚抗原和MUC-1；對于乳腺癌為HER-2/neu；對于腎細胞癌為G250；兩種髓性白血病相關(guān)抗原共享PR1，在粒細胞中正常表達和在髓性白血病細胞中過表達的PR3和中性粒細胞彈性蛋白酶；多種腫瘤類型共享腫瘤特異性抗原MAGE-A和NY-ESO-1；和過表達的存活蛋白(survivin)和端粒酶。在Wu等(同上)中描述了合適的來自甲型流感的肽。

因此，在另一個實施方案中，來自于包含抗原之蛋白質(zhì)的肽是由MHC-I，優(yōu)選由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更優(yōu)選由等位基因HLA-A2呈遞的肽。在Wu等(PNAS，2011，108(22)：9178-9183)中描述和總結(jié)了用于鑒定這樣的肽的方法。例如，可使用Wu等(同上)的系統(tǒng)鑒定方法，或其中所描述的合適算法。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，來自于包含抗原之蛋白質(zhì)的肽的長度為8、9或10個氨基酸和/或是由MHC-I，優(yōu)選由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更優(yōu)選由等位基因HLA-A2呈遞的肽。

優(yōu)選加載到I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞上的肽包含目的抗原或表位以引起期望的應(yīng)答。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，至少一種肽包含所述抗原或表位。

因為包含抗原之蛋白質(zhì)可包含多于一個抗原或表位，所以細胞可加載可包含不同的抗原或表位的兩種或更多種不同的肽。此外，兩種或更多種肽可包含相同的抗原或表位，但可具有不同的長度。

或者，可在體外以多種方式通過用抗原“內(nèi)部”加載細胞進行加載，例如但不限于：在與Th1佐劑一起(再)施用到致敏的宿主之前進行電穿孔、轉(zhuǎn)染或體外感染(參見實施例1至5)。該方法導(dǎo)致致敏的CD8⁺T細胞強烈的擴增和擴展并觸發(fā)其進一步分化為細胞毒性細胞，如實施例中所示。

在ADAS中用肽外部加載MHC-I在人中具有某些限制，原因是在人群體中MHC-I分子的異質(zhì)性。結(jié)果，優(yōu)選來自于相同抗原的不同的肽(例如來自于黑素瘤的TRP-1的流感核蛋白)用于不同個體的ADAS。對于其全蛋白或長肽含有許多抗原性表位的ADAS，可通過“內(nèi)部”加載用于ADAS的帶有MHC-I的細胞來克服這個問題。為此，未加工的包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原或表位的片段被引入帶有MHC-I的細胞中，隨后它被酶促分解(“加工”)為多個不同的肽，其然后在MHC-I(和MHC-II)的情況下呈遞到表面上。

將未加工的包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段運輸?shù)郊毎锌捎眉夹g(shù)人員已知的多種物理或化學(xué)方法來實現(xiàn)，例如但不限于：電穿孔、脅迫內(nèi)吞(forced endocytosis)、注射和細胞穿透肽。

內(nèi)部加載帶有MHC-I的細胞的另一種方式是用編碼包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的核酸(例如DNA或RNA)對其進行加載?？赏ㄟ^任何化學(xué)、物理或生物學(xué)手段將核酸引入細胞中，例如但不限于：電穿孔、注射、轉(zhuǎn)染或感染重組修飾以攜帶編碼包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的核酸序列的生物體。一旦編碼的蛋白質(zhì)由細胞機器(cell machinery)表達，其在MHC-I(和MHC-II)的情況下被加工并呈遞到細胞表面上，且細胞變?yōu)楦鶕?jù)本發(fā)明加載肽的細胞。技術(shù)人員知曉合適的DNA和RNA構(gòu)建體和基于DNA或RNA的表達系統(tǒng)。例如，合適的RNA構(gòu)建體或基于RNA的表達系統(tǒng)優(yōu)選還包含允許進行翻譯的元件，因此，在目的細胞中表達蛋白質(zhì)。例如，合適的DNA構(gòu)建體或基于DNA的表達系統(tǒng)優(yōu)選還包含允許進行轉(zhuǎn)錄和翻譯的元件并因此在目的細胞中表達蛋白質(zhì)。任選地，這樣的系統(tǒng)還包含分別允許復(fù)制所述DNA或RNA構(gòu)建體或基于DNA或RNA的表達系統(tǒng)的合適元件。

例如，在I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞中，能夠表達目的蛋白質(zhì)的病毒系統(tǒng)和非病毒表達系統(tǒng)(在這種情況下，包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段)適合于該目的。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞通過以下獲得：

應(yīng)用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法將包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段，或編碼包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的核酸引入到至少一種I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞中，

對于核酸的情況，使至少一種細胞將所述包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段表達到至少一種I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞中，以及

在MHC-I環(huán)境中下，使至少一種細胞加工所述抗原并呈遞所述肽。

特別地，優(yōu)選以下的一些實施方案以獲得這樣的細胞：

a.將至少一種I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞與包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段孵育，以及

使至少一種細胞在MHC-I環(huán)境中下加工所述抗原并呈遞所述肽，

或

b.將至少一種I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞暴露于病毒系統(tǒng)，所述病毒系統(tǒng)在細胞中能夠(i)感染所述細胞和(ii)表達包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段，和

使至少一種細胞加工包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段，和

使至少一種細胞在MHC-I環(huán)境中下呈遞所述肽，

或

c.將至少一種I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞用DNA或RNA或者基于DNA或RNA的表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)染，所述表達系統(tǒng)包含編碼包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的核酸，和

使至少一種細胞表達并加工包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段，和

使至少一種細胞在MHC-I環(huán)境中下呈遞所述肽，

或

d.將至少一種I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞與包含細胞穿透肽(cell-penetrating peptide，CPP)和包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的化合物孵育，和

使至少一種細胞加工所述化合物，以及

使至少一種細胞在MHC-I環(huán)境中下呈遞所述肽。

包含細胞穿透肽(CPP)和包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的化合物理解為其中細胞穿透肽(CPP)與包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段化學(xué)連接的化合物，任選地通過合適的接頭。這樣的接頭可以是例如肽接頭，例如長度為1至50，優(yōu)選1至20，更優(yōu)選1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的肽接頭，然而，也可使用其他接頭。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述化合物是包含細胞穿透肽(CPP)和包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的融合蛋白，所述融合蛋白可任選地包含合適的肽接頭。在一個實施方案中，所述化合物是由細胞穿透肽(CPP)和包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段組成的融合蛋白，其中所述細胞穿透肽(CPP)和包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段通過肽鍵連接。在一個優(yōu)選的實施方案中，在化合物中，細胞穿透肽(CPP)位于包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的N末端或C末端。

在實施方案c的情況下，使用核酸。在許多情況下核酸代表自佐劑系統(tǒng)。因此，在這樣的一個實施方案中不必再額外施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑。

“細胞穿透肽”(CPP)(也被稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)、膜易位序列(membrane translocating sequence，MTS))理解為3至40個氨基酸的肽，其能夠滲透到幾乎任何細胞中。優(yōu)選地，所述細胞穿透肽是高度陽離子的和/或包含高含量的精氨酸和/或賴氨酸氨基酸。優(yōu)選的細胞穿透肽是R9，其是由9個精氨酸殘基組成的肽。這樣的肽被成功用于使脾細胞內(nèi)部加載長OVA肽(實施例7，圖7)。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述患者是人。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法用于預(yù)防性治療或治療腫瘤和/或感染，和/或其中所述患者是免疫受損的或免疫抑制的。

延長和/或增強細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答特別用于預(yù)防性治療或治療腫瘤。所述患者可以患有腫瘤，或者在預(yù)防性治療的情況下未患有腫瘤，但是要被保護免患相應(yīng)的感染或腫瘤疾病。因此，預(yù)防性治療優(yōu)選涉及針對所述腫瘤的免疫。

在一個優(yōu)選的實施方案中，腫瘤選自病毒誘導(dǎo)的癌癥，特別是乙型肝炎或丙型肝炎誘導(dǎo)的肝細胞癌、人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的癌癥(例如宮頸癌)、陰道癌、外陰癌、口咽癌、Epstein-Barr病毒誘導(dǎo)的癌癥、卡波西肉瘤和成人T細胞白血病(HTLV1)。

對于病毒誘導(dǎo)的癌癥，包含抗原之蛋白質(zhì)優(yōu)選是病毒的蛋白質(zhì)。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，腫瘤是白血病，其特別是選自：AML、CML、CMML和MDS。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，腫瘤是表達一種或更多種癌癥特異性抗原的實體癌，例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌(包括肺鱗狀細胞癌和非小細胞肺癌)、皮膚癌(例如黑素瘤)、膀胱癌、食管癌腺癌和鱗狀細胞癌、結(jié)直腸癌、腸腺癌、腎癌(包括腎細胞癌)、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌和肉瘤。

特別優(yōu)選用于腫瘤的預(yù)防性治療，特別是針對腫瘤的免疫接種。

在另一個實施方案中，延長和/或增強細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答特別用于預(yù)防性治療或治療感染。所述患者可患有感染，或者，在預(yù)防性治療的情況下未患有感染，但應(yīng)被保護免受相應(yīng)的感染。因此，預(yù)防性治療優(yōu)選涉及針對所述感染的免疫接種。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述感染是由病原體，特別是由感染性病原體引起的感染，所述感染性病原體選自細菌、病毒、寄生蟲和真菌。優(yōu)選地，感染性病原體選自瘧疾、結(jié)核病、利什曼原蟲和病毒，特別選自以下的病毒：正黏病毒、流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、慢病毒，特別是HI-病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、絲狀病毒、黃病毒和呼吸道病毒，更優(yōu)選地所述感染性病原體是選自以下的病毒：丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、乳頭瘤病毒、副黏病毒和呼吸道病毒。對病毒感染，所述包含抗原之蛋白質(zhì)優(yōu)選為病毒的蛋白質(zhì)。

合適的包含抗原之蛋白質(zhì)是技術(shù)人員已知的。包含抗原之蛋白質(zhì)的選擇取決于待考慮的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。對于預(yù)防性治療或治療非病毒誘導(dǎo)的腫瘤，所述包含抗原之蛋白質(zhì)是合適的腫瘤抗原。對于預(yù)防性治療或治療病原體的感染，所述包含抗原之蛋白質(zhì)是病原體的合適抗原。

例如，在腫瘤疾病的情況下，許多合適的包含抗原之蛋白質(zhì)和包含抗原的肽是已知的。此外，描述了作為疫苗的合適的肽，例如在Aranda等，OncoImmunology 2：12，e26621，2013年12月中總結(jié)的實體瘤，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、肉瘤、黑素瘤、食管鱗狀細胞癌、胃癌，肝細胞癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、腎細胞癌、前列腺癌、卵巢癌、婦科惡性腫瘤和多種其他腫瘤。在這些臨床試驗中特異性靶向的包含抗原之蛋白質(zhì)包括癌癥-睪丸抗原(如NY-ESO-1)、TTK蛋白激酶(也稱為MOS)、淋巴細胞抗原6復(fù)合物、locus K(LY6K，最知名的為URLC10)、胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白3(IGF2BP3，最知名的為IMP3)、環(huán)指蛋白(RNF43)和線粒體外膜的移位酶34(TOMM34)；癌胚抗原如磷脂酰肌醇聚糖-3；分化抗原例如melan-A(MLANA)和前黑色素體蛋白(PMEL，最知名的為gp100)；腫瘤限制性抗原，例如SYT-SSX融合(由于t(X；18)(P11；Q11)染色體易位，其由滑膜肉瘤選擇性地表達)；以及所謂的“共享的腫瘤相關(guān)抗原”(由惡性細胞過表達，但也由一種或幾種健康組織產(chǎn)生正常量的抗原)，包括血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1)和VEGFR2、存活蛋白、腎母細胞瘤1(Wilms tumor 1，WT1)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和p53。因此，在腫瘤的情況下，這樣的蛋白質(zhì)為合適的包含抗原之蛋白質(zhì)。Yamada等，Cancer Sci，2013，104(1)：15-21進一步總結(jié)了癌癥中的肽疫苗。

參與腫瘤疾病的合適的包含抗原之蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域中是已知的。例如在Tacken和Figdor(Tacken PJ，F(xiàn)igdor CG；Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo：Steps towards cost effective vaccines.Semin.Immunol.，2011，23(1)：12-20)中描述的，理想的腫瘤抗原是那些稱為共享的腫瘤特異性抗原，因為它們在多種組織型的腫瘤細胞中選擇性表達，但在表達MHC的正常組織中不選擇性表達。這種類型的抗原的實例是MAGE-A或NY-ESO-1抗原。這類抗原中多個成員根據(jù)腫瘤類型和疾病階段以可變的比例表達。因此，基于這些抗原的疫苗需要選擇表達靶抗原的帶有腫瘤的患者。認為對疫苗開發(fā)有價值的其他類別的腫瘤抗原是來自在腫瘤中過表達的致癌蛋白的那些。真正的非自體腫瘤抗原來自兩個主要來源：在致癌病毒來源(例如由HPV感染引起的宮頸癌)的腫瘤的情況下的病毒抗原，以及體細胞突變。

在患有感染的患者或針對感染性疾病(或感染)待預(yù)防性治療的患者中延長或擴增細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的情況下，可使用病原體的合適的包含抗原之蛋白質(zhì)，特別是選自以下的病原體：瘧疾、結(jié)核病、利什曼原蟲或病毒，特別是選自以下的病毒：正黏病毒、流感病毒、甲肝病毒、乙肝病毒，慢性丙肝病毒、慢病毒，特別是HI-病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、絲狀病毒、黃病毒或呼吸道病毒。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，包含抗原之蛋白質(zhì)為選自以下病毒的蛋白質(zhì)：丙肝病毒、乳頭瘤病毒、副黏病毒或呼吸道病毒。

病毒，特別是RNA病毒，通常表現(xiàn)出高突變率。然而，在特別是編碼非結(jié)構(gòu)和/或內(nèi)部蛋白質(zhì)的基因組區(qū)段中通常存在保守區(qū)域，這樣的區(qū)域編碼病毒聚合酶或核蛋白。這樣的區(qū)域不適合經(jīng)典的疫苗接種技術(shù)，因為這樣的保守蛋白不暴露于病毒外殼的表面上。與此相反，這樣的包含抗原之蛋白質(zhì)和/或包含在蛋白質(zhì)中的抗原可用于根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的藥物中。

在一個優(yōu)選的實施方案中，病毒的包含抗原之蛋白質(zhì)和/或包含在蛋白質(zhì)中的抗原是保守的。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，包含抗原之蛋白質(zhì)是非結(jié)構(gòu)蛋白和/或抗原包含在非結(jié)構(gòu)和/或內(nèi)部蛋白質(zhì)中。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，包含抗原之蛋白質(zhì)是RNA病毒的蛋白質(zhì)。

“非結(jié)構(gòu)”或“內(nèi)部”蛋白質(zhì)是不為病毒顆粒的外殼或包膜的一部分的蛋白質(zhì)。

在另一個實施方案中，步驟i)中包含在蛋白質(zhì)中的抗原是免疫顯性的。免疫顯性意味著盡管許多pMHC復(fù)合物可用于特定的病原體，T細胞應(yīng)答可再現(xiàn)地集中在一個或幾個關(guān)鍵的抗原，而這樣的抗原是一種這樣的關(guān)鍵抗原。

例如在Wu等(PNAS，2011，108(22)：9178-9183)中描述了合適的包含抗原之蛋白質(zhì)和甲型流感病毒的抗原，并且涵蓋NP(核蛋白)、堿性聚合酶1和M1。

另外，本方法對于預(yù)防性治療(例如免疫接種或治療腫瘤和/或感染，其中所述患者是免疫受損的或免疫抑制的)是特別有益的。

由于移植(例如骨髓移植)、化療(例如癌癥化療)、糖皮質(zhì)激素治療、白血病、AIDS、糖皮質(zhì)激素治療或免疫抑制治療，例如用于治療自身免疫病，患者可以是免疫受損的或免疫抑制的。這樣的患者將特別受益于本發(fā)明應(yīng)用的藥物和方法。

如實施例6中所示，本發(fā)明的方法或本發(fā)明應(yīng)用的藥物為針對給定抗原最初活化T細胞的多個不同的“致敏”步驟成功地延長并增強細胞之細胞毒性應(yīng)答。

特別地，采用遞送系統(tǒng)的方法包括：

(a)與抗原呈遞細胞表面上的受體結(jié)合的分子，

(b)與(a)的分子結(jié)合的所述包含抗原之蛋白質(zhì)，以及

其中在(a)的分子與所述受體結(jié)合后，(b)的蛋白質(zhì)被內(nèi)化并在抗原呈遞細胞中被加工，并且包含在蛋白質(zhì)中的抗原被呈遞到抗原呈遞細胞的表面上，這適于活化患者中抗原特異性的T細胞。例如，作為樹突細胞的抗原呈遞細胞(APC)證明是特別有用的。然而，B細胞也被成功地用作抗原呈遞細胞。

另外，在實施例6中成功的使用了抗原呈遞細胞表面上的多種受體。特別地，通過使用XCR1作為樹突細胞表面上的受體、樹突細胞表面上的DCIR2和B細胞表面上的CD19完成了成功的致敏(參見圖6)，隨后根據(jù)本發(fā)明增強和/或延長細胞之細胞毒性應(yīng)答。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，通過以下步驟針對所述抗原活化所述T細胞：

(1)向所述患者施用遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包含：

(a)與抗原呈遞細胞表面上的受體結(jié)合的分子，

(b)所述包含抗原之蛋白質(zhì)與(a)的分子結(jié)合，并且

其中(a)的分子與所述受體結(jié)合后，(b)的蛋白質(zhì)被內(nèi)化并在抗原呈遞細胞中被加工并且所述包含在蛋白質(zhì)中的抗原被呈遞到抗原呈遞細胞的表面上，從而在患者中活化T細胞，以及

(2)施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑。

另外，“致敏”或初始活化T細胞的其他方法是可能的，并且已成功使用。

例如，通過T細胞的過繼轉(zhuǎn)移進行T細胞活化是可能的，并且已成功使用。細胞的過繼轉(zhuǎn)移是技術(shù)人員已知的并且被理解為將細胞轉(zhuǎn)移回同一患者中或與具有轉(zhuǎn)移免疫功能和特征到新宿主目標(biāo)的新接受體宿主中。

因此，在這樣的一個實施方案中，通過以下針對所述抗原活化T細胞：

(1)用包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段在體外活化從所述患者獲得的一種或更多種T細胞，以及

(2)將在步驟(1)中獲得的一種或更多種T細胞再轉(zhuǎn)移給所述患者，以及

(3)任選地施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑。

在過繼轉(zhuǎn)移的情況下，在通過將在步驟(1)中獲得的一種或更多種T細胞再轉(zhuǎn)移到所述患者在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞；即，所述時間段是從將在步驟(1)中獲得的一種或更多種T細胞向所述患者過繼轉(zhuǎn)移計算的。

在過繼性T細胞療法中，抗原特異性CD8⁺T細胞(例如，針對CMV抗原或任何其他致病抗原的T細胞或針對指定的腫瘤抗原的T細胞)是從患者的PBMC中體外富集的。通過例如用來自該病原體(例如，CMV)或腫瘤的抗原肽或蛋白質(zhì)體外刺激PBMC后使用IFN-γ分泌捕獲，與磁性細胞分選相組合來實現(xiàn)這點。然后，通過添加全抗原或更通常是肽抗原進一步刺激富集的抗原特異性CD8⁺T細胞，然后在體外擴增。擴增后，然后再將活化的CD8⁺T細胞注入到患者以達到期望的作用(通過例如消除病原體或腫瘤來治療患者)。目前，重新注入的CD8⁺T細胞在體內(nèi)的壽命短，其分泌IFN-γ的能力有限，并且它們的細胞毒潛力是不理想的。我們已出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用ADAS過程可非常顯著地改進過繼T細胞治療的這一缺點，如實施例11中所示。

因此，細胞的過繼轉(zhuǎn)移是技術(shù)人員已知的方法。例如，來自從患者獲得的血液樣品的PBMC細胞可以在體外與包含目的抗原的肽一起孵育。然后通過IFN-γ分泌/產(chǎn)生來檢測PBMC細胞中的一種或更多種CD8⁺T細胞的活化。優(yōu)選地，通過本領(lǐng)域已知的方法將這樣的IFN-γ產(chǎn)生/分泌細胞進一步富集和/或培養(yǎng)和/或擴增。隨后，包含一種或更一種活化的T細胞的細胞探針例如通過注射再轉(zhuǎn)移至所述患者。

對于在過繼轉(zhuǎn)移前在體外針對抗原活化T細胞，可以向患者施用或不施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑，優(yōu)選向患者施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑。

在T細胞的過繼轉(zhuǎn)移之前在體外進行T細胞活化特別可用于預(yù)防性治療或治療免疫受損的或免疫抑制的患者。

或者，在一個實施方案中通過非靶向的方法和/或使用核酸的方法針對所述抗原活化T細胞。例如，可以表明即使用大量的非靶向包含抗原之蛋白質(zhì)，也可獲得充分致敏的抗原特異性T細胞，其隨后可根據(jù)本發(fā)明被擴增和延長(實施例6，圖6)。

以非靶向的方法施用包含抗原之蛋白質(zhì)的情況下，所述包含抗原之蛋白質(zhì)可以作為任選還包含可藥用賦形劑(例如任選地緩沖鹽水溶液)的合適制劑施用。這樣的制劑可含有合適的載體，例如脂質(zhì)體或納米顆粒。

因此，在這樣的一個實施方案中通過以下針對所述抗原活化T細胞：

(1)向所述患者施用遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)選自：

(a)含有包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的藥物組合物，優(yōu)選含有與包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段結(jié)合的載體(特別是納米顆粒或脂質(zhì)體)的藥物組合物，和

(b)核酸

其包含編碼所述包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的核酸序列，并且在所述患者中其能夠表達所述包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段，

優(yōu)選地其中

-所述核酸是DNA或RNA，和/或

-所述核酸是病毒系統(tǒng)，例如減毒病毒、非復(fù)制病毒系統(tǒng)、靶向病毒疫苗系統(tǒng)或非靶向病毒疫苗系統(tǒng)，或

-所述核酸是非病毒表達系統(tǒng)，

從而活化至少一種T細胞，

和

(2)施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑。

上面描述了關(guān)于核酸的遞送系統(tǒng)。合適的病毒系統(tǒng)(例如減毒病毒、非復(fù)制病毒系統(tǒng)、靶向病毒疫苗系統(tǒng)或非靶向病毒疫苗系統(tǒng)和非病毒表達系統(tǒng))是技術(shù)人員已知的，并且例如在Robert-Guroff等2007，Barnes等2012中公開。

在許多情況下，核酸代表自佐劑的系統(tǒng)。因此，在這樣的一個實施方案中不需要額外施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑。相反，遞送系統(tǒng)本身代表支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑和用于活化T細胞的遞送系統(tǒng)二者。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，抗原呈遞細胞選自樹突細胞、巨噬細胞和B細胞。例如，對于靶向樹突細胞特別是XCR1⁺(CD141⁺)樹突細胞和SIRPα⁺樹突細胞以及B細胞觀察到高效的致敏(參見實施例6)。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的一個更優(yōu)選的實施方案中，抗原呈遞細胞是樹突細胞(DC)，優(yōu)選地選自：XCR1⁺(CD141⁺)樹突細胞、SIRPα⁺樹突細胞、單核細胞來源的樹突細胞、皮膚樹突細胞(例如朗格漢斯細胞)和漿細胞樣樹突細胞(pDC)。例如，對于樹突細胞特別是XCR1⁺(CD141⁺)樹突細胞和SIRPα⁺樹突細胞觀察到高效的致敏(實施例6)。

對于遞送系統(tǒng)的一些優(yōu)選實施方案，在下文中詳細描述的誘導(dǎo)細胞之細胞毒性應(yīng)答的方法中提及。

在延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法(所述細胞毒性免疫應(yīng)答針對包含抗原之蛋白質(zhì))中，在步驟i)中施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑。

佐劑是這樣的藥劑，其改變其他藥劑的作用，而當(dāng)其本身施用時沒有任何直接作用。在藥理學(xué)上，佐劑是本身具有很少或不具有藥理學(xué)作用，但是，當(dāng)在同一時間給予時可提高其他藥物的療效或效力的藥物。在免疫學(xué)上，佐劑是這樣的藥劑，雖然本身不具有任何特定的抗原作用，但可以刺激免疫系統(tǒng)，提高對疫苗的應(yīng)答。本發(fā)明中使用的佐劑支持Th1應(yīng)答。“支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑”或“Th1佐劑”理解為能夠在DC中誘導(dǎo)IL-12，并通過響應(yīng)抗原反應(yīng)性CD8⁺和CD4⁺T細胞導(dǎo)致IL-2、INF-γ和TNF-α的分泌以及通過抗原反應(yīng)性細胞毒CD8⁺和CD4⁺T細胞產(chǎn)生細胞毒性分子顆粒酶B和穿孔蛋白的佐劑。支持Th1應(yīng)答的合適的優(yōu)選佐劑是本領(lǐng)域中已知的，并且是例如在Tacken和Figdor以及在Speiser和Romero中描述的(Tacken P.J.，F(xiàn)igdor C.G.；Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo：Steps towards cost effective vaccines.Semin.Immunol.(2011)，doi：10.1016/j.smim.2011.01.001；Speiser D.E.和Romero P.Seminars in Immunology，P.22(2010)144-154)。

樹突細胞(DC)能夠通過一大組“危險信號”識別受體(例如，toll樣受體、NOD樣受體)感測抗原是否是具有危險性或其是否無害。由“危險信號”識別受體(也稱為“模式識別受體”)識別的模式通常是微生物特有的分子結(jié)構(gòu)。這些可以是細胞壁組分(例如脂多糖、肽聚糖)或在微生物的情況下為核酸修飾物(例如，非甲基化CpG基序)，或者病毒DNA或病毒RNA(例如，雙鏈RNA)所特有的結(jié)構(gòu)特征和修飾物。此外，體內(nèi)死于凋亡的細胞釋放能引發(fā)“危險信號”識別受體(例如，高流動組蛋白B1(High Mobility Group Protein B1)、熱休克蛋白)的分子。這樣的危險信號是本發(fā)明的一些優(yōu)選Th1佐劑。

對于實施例，在實施例中成功地使用佐劑聚I：C作為Th1佐劑。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑選自：RIG-1激動劑；合成的或重組的TLR配體，特別是TLR8激動劑如瑞喹莫德(R848)或TLR3激動劑如聚ICLC和聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)；Montanide，如ISA51、ISA720；皂苷如Quil-A、ISCOM、QS-21、AS02和AS01；聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)、脂多糖LPS(LPS)和CpG寡脫氧核苷酸，更優(yōu)選地，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑選自：RIG-I激動劑，TLR8激動劑如瑞喹莫德(R848)和TLR3激動劑如聚ICLC和聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)。

聚ICLC由以聚-L-賴氨酸和羧甲基纖維素穩(wěn)定的聚IC組成并且強大地支持Th1應(yīng)答。

在小鼠中R848為TLR7的選擇性配體且在人中為TLR7和TLR8的選擇性配體并活化含有3(NLRP3)炎性體的NLR pryin結(jié)構(gòu)域。

對于聚ICLC和R848，在Tacken和Figdor(同上)及其中引用的參考文獻中提及。

Montanide(如ISA51和ISA720)是含有角鯊烯和二縮甘露醇-單油酸酯作為乳化劑的油包水型乳劑，如在Speiser和Romero及其中引用的參考文獻中所公開的。

皂苷(如Quil-A、ISCOM、QS-21、AS02和AS01)是從植物中分離的三萜糖苷，如在Speiser和Romero及其中引用的參考文獻中所公開的。

支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑的施用和加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞的施用可在空間上和時間上分開。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑在加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞復(fù)合體施用之前、同時或之后施用，優(yōu)選地，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑在加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞施用之前1天和之后3天的時間段內(nèi)施用，更優(yōu)選地，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑在施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞(a)同一天或(b)之后1天至3天、特別是在施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞之后1天的時間段內(nèi)施用。

在一個優(yōu)選的實施方案中，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑在施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞的同一天施用(參見實施例8)。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑與加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞作為單藥物組合物施用，或與加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在空間上分開施用。

例如，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑與加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞作為單藥物組合物施用，例如任選地包含可藥用賦形劑之水溶液中的細胞混懸液。在實施例8中，i.v.施用含有ADAS細胞和聚I：C的溶液。

對于針對給定抗原活化T細胞，使用或任選地使用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑，如上所述。

這樣的支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑可以是與本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的步驟i)中使用的佐劑相同或不同的佐劑。

因此，在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑選自RIG-I激動劑；合成的或重組的TLR配體，特別是TLR8激動劑如瑞喹莫德(R848)或TLR3激動劑如聚ICLC和聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)；Montanide，如ISA51、ISA720；皂苷，如Quil-A、ISCOM、QS-21、AS02和AS01；聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)、脂多糖LPS(LPS)和CpG寡脫氧核苷酸，優(yōu)選地，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑選自：RIG-I激動劑，TLR8激動劑如瑞喹莫德(R848)和TLR3激動劑如聚ICLC和聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)。

如實施例8中所示，出人意料地，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑的施用與遞送系統(tǒng)的施用可在空間和時間二者上分開。出人意料地，在施用遞送系統(tǒng)后一天施加佐劑聚I：C達到最佳結(jié)果。

例如，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑與所述遞送系統(tǒng)作為單藥物組合物施用，例如任選地包含可藥用賦形劑的水溶液。在實施例8中，i.v.施用含有MARX10-OVA和聚I：C的溶液。

或者，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑可與所述遞送系統(tǒng)在空間上分開施用。例如，可施用包含遞送系統(tǒng)的任選地含有可藥用賦形劑的藥物組合物(例如水溶液)以及可施用包含支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑的任選地含有可藥用賦形劑的另外的藥物組合物(例如水溶液)?？稍谙嗤臅r間或在不同的時間點施用這樣的組合物，如上所述。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑與所述遞送系統(tǒng)作為單藥物組合物施用，或與所述遞送系統(tǒng)在空間上分開施用。

在本發(fā)明應(yīng)用的藥物或本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑在施用所述遞送系統(tǒng)之前、同時或之后施用，優(yōu)選地，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑在施用所述遞送系統(tǒng)前1天和施用后3天的時間段內(nèi)施用，更優(yōu)選地，支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑在施用所述遞送系統(tǒng)(a)同一天或(b)之后1天至3天的時間段內(nèi)施用。

在我們使用ADAS的實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)通過ADAS帶來的CD8⁺T細胞的活化狀態(tài)的變化也使得這些CD8⁺T細胞對復(fù)合的IL-2(IL-2cx)的作用敏感，并因此進一步強烈地擴增細胞毒性CD8⁺T細胞并進一步提高其生物學(xué)效力(參見實施例4)。

因此，我們出人意料地觀察到，通過施加ADAS和復(fù)合的IL-2(IL-2cx)的組合在增強和延長細胞之細胞毒性應(yīng)答中具有強烈且意想不到的協(xié)同作用。特別地，在我們的實驗中出人意料地發(fā)現(xiàn)，與單獨的ADAS相比，ADAS和復(fù)合的IL-2的組合導(dǎo)致針對OVA抗原活化的T細胞的數(shù)目另外擴增約100倍。

因此，特別優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的ADAS與復(fù)合的IL-2的組合。

根據(jù)本發(fā)明，“復(fù)合的IL-2”或“IL-2cx”理解為與結(jié)合分子(特別是阻止其與高親和力IL-2受體鏈(CD25)結(jié)合的抗體或抗體片段)非共價結(jié)合的IL-2蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是人源化的或人的。在一個優(yōu)選的實施方案中，IL-2是人IL-2，更優(yōu)選人wt IL-2。IL-2可以使用適當(dāng)?shù)乃拗骱铣傻鼗蛑亟M地合成，更優(yōu)選重組地制備IL-2。在一個優(yōu)選的實施方案中，與未復(fù)合的IL-2與CD25的結(jié)合相比，復(fù)合的IL-2與CD25的結(jié)合降低至少35％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少90％或95％，例如100％。使用表面等離子體共振譜可將與CD25的結(jié)合確定為Kd值，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

對于其對預(yù)活化的CD8⁺T細胞的適當(dāng)?shù)淖饔?，IL-2必須與阻斷IL-2與高親和力受體鏈CD25結(jié)合的抗體復(fù)合，所述高親和力受體鏈CD25主要在調(diào)節(jié)性T細胞(T_reg)上表達。沒有這種阻斷，IL-2將主要作用于T_reg，這隨后將抑制CD8⁺T細胞的活化和分化為細胞毒性細胞。事實上，我們已觀察到非復(fù)合的IL-2沒有有益效果，或者甚至有不利的效果(未示出)。因此，復(fù)合的IL-2或能夠與CD122結(jié)合的突變的IL-2(其中分別與未復(fù)合的IL-2與CD25或野生型(wt)IL-2與CD25的結(jié)合相比，與CD25的結(jié)合降低，特別是降低至少35％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少90％或95％，例如100％)將實現(xiàn)觀察到的ADAS應(yīng)答的增強。使用表面等離子體共振譜可將與受體的結(jié)合確定為Kd值，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

復(fù)合的或突變的IL-2可仍然具有某些缺點，例如對T_reg的殘留活性或?qū)ρ芟到y(tǒng)的殘留毒性。因為IL-15與IL-2共有許多生物學(xué)功能，我們推斷，它可能替代IL-2cx用于另外擴增ADAS，特別是因為它對T_reg不起作用。已知IL-15需要與其受體復(fù)合來發(fā)揮生物活性。然而，由于IL-15與IL-2僅具有低的結(jié)構(gòu)相似性，其被不同地調(diào)節(jié)，并在體內(nèi)具有整體不同的生物學(xué)作用(Ring等，2012)，不清楚復(fù)合的IL-15(IL-15cx)在經(jīng)ADAS處理的個體中是否能夠進一步增強CD8⁺T細胞應(yīng)答。

出人意料地發(fā)現(xiàn)，在通過應(yīng)用ADAS和復(fù)合的IL-15(IL-15cx)的組合在增強和延長細胞之細胞毒性應(yīng)答中也觀察到協(xié)同作用(實施例9)。IL-2和IL-15的受體與IL-4和IL-7的受體共享“共同γ鏈”并作用于相同的細胞類型(NK細胞、活化和記憶的CD8⁺T細胞)。因此，可通過使用復(fù)合的白介素4(IL-4cx)或復(fù)合的白介素7(IL-7cx)來實現(xiàn)協(xié)同作用。

根據(jù)本發(fā)明，“復(fù)合的IL-15”或“IL-15cx”被理解這樣的復(fù)合體，其包含IL-15和可溶形式的其受體IL-15R(sIL-15R)(優(yōu)選由其組成)，其中sIL1-5R任選地包含在融合蛋白中，例如sIL-15R與抗體或其片段(例如Fc或包含F(xiàn)c的抗體或抗體片段)的融合蛋白。例如，實施例9中成功地使用sIL-15R-Fc。在復(fù)合體中IL-15優(yōu)選與可溶形式的其受體IL-15R(sIL-15R)非共價地結(jié)合。sIL-15R是技術(shù)人員已知的并在現(xiàn)有技術(shù)中進行了描述。優(yōu)選使用sIL-15R與抗體或其片段(例如Fc或包含F(xiàn)c的抗體或抗體片段)的這樣的融合蛋白，因為融合蛋白可允許在體內(nèi)進一步活化預(yù)活化的CD8⁺T細胞。IL-15優(yōu)選人IL-15。在另一個優(yōu)選的實施方案中，IL-15R是人IL-15R。在另一個優(yōu)選的實施方案中，IL-15優(yōu)選是wt IL-15，更優(yōu)選人wt IL-15。

根據(jù)本發(fā)明，“復(fù)合的IL-4”或“IL 4cx”理解為這樣的復(fù)合體，其包含IL-4和與IL-4特異性結(jié)合的抗體或其片段(優(yōu)選由其組成)。IL-4優(yōu)選是人IL-4。在另一個優(yōu)選實施方案中，IL-4優(yōu)選是wt IL-4，更優(yōu)選人wt IL-4。與IL-4特異性結(jié)合的抗體或其片段優(yōu)選單克隆抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體或其片段，例如scFV、scFV的多聚體(例如雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)或四抗體(tetrabody))、Fab、tandab或flexibody。在復(fù)合體中，IL-4優(yōu)選非共價結(jié)合于與IL-4特異性結(jié)合的抗體或其片段。

根據(jù)本發(fā)明，“復(fù)合的IL-7”或“IL-7cx”理解為這樣的復(fù)合體，其包含IL-7和與IL-7特異性結(jié)合的抗體或其片段(優(yōu)選由其組成)。IL-7優(yōu)選是人IL-7。在另一個優(yōu)選的實施方案中，IL-7優(yōu)選是wt IL-7，更優(yōu)選人wt IL-7。與IL-7特異性結(jié)合的抗體或其片段優(yōu)選單克隆抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體或其片段，例如scFV、scFV的多聚體(例如雙抗體、三抗體或四抗體)、Fab、tandab或flexibody。在復(fù)合體中IL-7優(yōu)選非共價結(jié)合于與IL-7特異性結(jié)合的抗體或其片段。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白。在一個更優(yōu)選的實施方案中，在向所述患者施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞后進行這樣藥劑的施用。

當(dāng)進一步施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)或復(fù)合的白介素15(IL-15cx)時，在實施例中觀察到強的協(xié)同作用。因此，特別優(yōu)選進一步施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)或復(fù)合的白介素15(IL-15cx)。

當(dāng)使用復(fù)合的IL-2時，在實施例中觀察到出人意料地強烈且有益的協(xié)同效應(yīng)。因此，在本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括向患者施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)。

IL-2突變蛋白理解為與wt IL-2蛋白相比被突變的IL-2蛋白(特別是人IL-2蛋白)，并且其與CD122結(jié)合，但是與wt IL-2蛋白相比，表現(xiàn)出與CD25的結(jié)合降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，與wt IL-2蛋白與CD25的結(jié)合相比，與CD25的結(jié)合降低至少35％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少90％或95％，例如100％。與CD25的結(jié)合可被確定為表示為Kd值的確定親和力(determining affinity)，特別是使用表面等離子體共振譜，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此外，可使用表面等離子體共振譜來確定與CD122的結(jié)合。在一個優(yōu)選的實施方案中，IL-2突變蛋白與CD122的結(jié)合為wt IL-2蛋白與CD122結(jié)合的至少10％，優(yōu)選至少35％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少90％或95％，例如100％或更多。本發(fā)明中應(yīng)用的特別優(yōu)選的IL-2突變蛋白在Carmenate，Journal of Immunology 2013中公開。特別地，可使用wt IL-2的R38、F42、Y45、E62突變蛋白，優(yōu)選wt IL-2的R38A、F42A、Y45A、E62A突變蛋白，其突變蛋白還可包含C125突變，例如C125S突變。根據(jù)本發(fā)明可使用的另一個特別優(yōu)選的IL-2突變蛋白在Klein等，2014中描述。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的一個更優(yōu)選實施方案中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白反復(fù)施用，特別是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更優(yōu)選其中復(fù)合的白介素素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白每1或2天施用，和/或在5天至1個月、甚至更優(yōu)選1至2周期間反復(fù)施用。

如上所述，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白，優(yōu)選復(fù)合的白介素2(IL-2cx)或復(fù)合的白介素15(IL-15cx)在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。還可以在針對抗原活化T細胞后14天后一次或更多次施用復(fù)合的IL-2白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白；但是，在0小時至14天的時間段內(nèi)至少施用一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(1L-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白在針對抗原活化T細胞后優(yōu)選48小時至14天，甚至更優(yōu)選3天至12天、5天至12天或5天至9天，或3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的時間段內(nèi)施用。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后48小時至9天、10天、11天、12天、13天或14天，甚至更優(yōu)選3天至8天或9天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。因此，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白在針對抗原活化T細胞后48小時至14天或48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8或9天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天的時間段內(nèi)優(yōu)選施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)或復(fù)合白介素15(IL-15cx)可每天或每兩天施用。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)或復(fù)合白介素15(IL-15cx)可在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一個實例中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)或復(fù)合的白介素15(IL-15cx)可在針對抗原活化T細胞后48小時、4天、6天和8天施用。

還可以在步驟i)的施用之后例如14天，優(yōu)選9天或8天的指定時間段后進行復(fù)合的IL-2、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白，優(yōu)選復(fù)合的IL-2或復(fù)合的白介素15(IL-15cx)的一次或更多次施用；但是，在所指定的時間段內(nèi)優(yōu)選至少施用一次。

復(fù)合的IL-2、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白的施用可通過多種施用途徑和使用合適的制劑進行。例如，可使用復(fù)合的IL-2、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白的水溶液，任選地還包含可藥用賦形劑，例如可藥用緩沖化合物。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個更優(yōu)選實施方案中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)，復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或鞘內(nèi)施用，或優(yōu)選通過注射施用到腫瘤中。

復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白優(yōu)選作為溶液和/或以1μg/kg體重至200μg/kg體重、更優(yōu)選1μg/kg體重至50μg/kg體重、甚至更優(yōu)選1μg/kg體重至20μg/kg體重的劑量施用。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物，其用于針對包含抗原之蛋白質(zhì)延長和/或增強細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

i)向具有針對抗原活化的T細胞的患者通過靜脈內(nèi)施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，并且其中所述加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞不是樹突細胞。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及針對包含抗原之蛋白質(zhì)延長和/或增強細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

i)向具有針對抗原活化的T細胞的患者施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑和通過全身性施用的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，并且其中所述加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞不是樹突細胞。

如上所述，全身性施用在延長和/或增強細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答中出乎意料地有效。用于全身性施用的優(yōu)選途徑是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或鞘內(nèi)施用，其中特別優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，向所述患者施用1×10⁶至4×10⁸個、更優(yōu)選1×10⁷至4×10⁸個加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞。因此，可施用大量的細胞。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的一個優(yōu)選實施方案中，加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞是血細胞，尤其是外周血單個核細胞(PBMC)。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，步驟i)的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用。

分別對于這樣的本發(fā)明的應(yīng)用的藥物和方法，相同的一些優(yōu)選的實施方案可用在上文和下文中描述的本發(fā)明的應(yīng)用的藥物和方法。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及藥物，其用于增強細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答(其針對包含抗原之蛋白質(zhì))的方法，并且涉及增強針對包含抗原之蛋白質(zhì)的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法。

在又一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及藥物，其用于延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法(所述細胞毒性免疫應(yīng)答針對包含抗原之蛋白質(zhì))，并且涉及延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答(其針對包含抗原之蛋白質(zhì))的方法。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及延長并增強針對包含抗原之蛋白質(zhì)的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，并且涉及延長并增強針對包含抗原之蛋白質(zhì)的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥盒(kit-of-parts)，其包含如上限定的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-1)呈遞細胞，以及

(i)選自以下的至少一種藥劑：復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)和IL-2突變蛋白，和/或

(ii)如上限定的遞送系統(tǒng)，

以及任選地還包含至少一種支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑。

對于本發(fā)明的藥盒，相同的一些優(yōu)選的實施方案應(yīng)用于本文中所描述的本發(fā)明的應(yīng)用的藥物和方法。

藥盒的部分優(yōu)選在不同的容器中。

特別地，加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞可包含在混懸液中，例如在水溶液中混懸的細胞以及任選還含有可藥用賦形劑。容器(例如小瓶)可含有包含加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物適于全身性使用，特別是適于靜脈內(nèi)施用。藥物組合物還可包含至少一種支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，或者可不包含至少一種支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑。

另外，選自復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)和IL-2突變蛋白的至少一種藥劑可包含在溶液(例如水溶液)中，或可以是干燥的或冷凍干燥的，并且任選地還包含可藥用賦形劑。容器(例如小瓶)可含有包含復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)和IL-2突變蛋白的藥物組合物。

此外，遞送系統(tǒng)可包含在溶液(例如水溶液)或混懸液中，或可以是干燥的或冷凍干燥的，并且任選地還包含可藥用賦形劑。容器(例如小瓶)可含有包含遞送系統(tǒng)的藥物組合物。所述藥物組合物可以還包含至少一種支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，或者可不包含至少一種支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑。

此外，至少一種支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑可包含在溶液(例如水溶液)中，或可以是干燥的或冷凍干燥的，并且任選地還包含可藥用賦形劑。因此，藥盒還可以含有包含至少一種支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑的藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物不包含遞送系統(tǒng)和/或不包含本發(fā)明的加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物，其用于誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

(A)(i)

(1)向所述患者施用遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包含

(a)與抗原呈遞細胞表面上的受體結(jié)合的分子，

(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)，并且

其中在(a)的分子與所述受體結(jié)合后，(b)的蛋白質(zhì)被內(nèi)化并在抗原呈遞細胞中被加工，并且包含在所述蛋白質(zhì)中的所述抗原被呈遞到抗原呈遞細胞的表面上，從而活化患者中的T細胞，以及

(2)施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑，

或者

(ii)

(1)用包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段在體外活化從所述患者獲得的一種或更多種T細胞，

(2)將一種或更多種在步驟(1)中獲得的T細胞再轉(zhuǎn)移至所述患者，以及

(3)任選施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑，

或者

(iii)

(1)向所述患者施用

包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段，

或者

核酸，其包含編碼包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的核酸序列，所述核酸能夠在所述患者中表達包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段，

從而活化至少一種T細胞，

和

(2)施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑，以及

(B)向所述患者施用至少一種再活化劑，所述再活化劑選自：

(a)加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，以及

(b)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白，

其中所述再活化劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用，優(yōu)選地其中所述再活化劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

(A)(i)

(1)向所述患者施用遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包含

(a)與抗原呈遞細胞表面上的受體結(jié)合的分子，

(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)，并且

其中在(a)分子與所述受體結(jié)合后，(b)的蛋白質(zhì)被內(nèi)化并在抗原呈遞細胞中被加工，并且包含在所述蛋白質(zhì)中的所述抗原被呈遞到抗原呈遞細胞的表面上，從而活化患者中的T細胞，以及

(2)施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑，

或者

(ii)

(1)用包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段在體外活化從所述患者獲得的一種或更多種T細胞，

(2)將一種或更多種在步驟(1)中獲得的T細胞再轉(zhuǎn)移至所述患者，以及

(3)任選施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑，

或者

(iii)

(1)向所述患者施用

包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段，

或者

核酸，其包含編碼包含抗原之蛋白質(zhì)或其包含所述抗原的片段的

核酸序列，所述核酸能夠在所述患者中表達所述包含抗原之蛋白

質(zhì)或包含所述抗原的其片段，

從而活化至少一種T細胞，

以及

(2)施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑，以及

(B)向所述患者施用至少一種再活化劑，所述再活化劑選自：

(a)加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，以及

(b)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、復(fù)合的白介素15(IL-15cx)、復(fù)合的白介素4(IL-4cx)、復(fù)合的白介素7(IL-7cx)或IL-2突變蛋白，

其中所述再活化劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用，優(yōu)選其中所述再活化劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，(B)(a)的再活化劑向患者施用僅一次。

對于用于誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法的藥物和誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，同樣優(yōu)選的一些實施方案適用于本文中所描述的延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法和本發(fā)明的延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，再活化劑(優(yōu)選(B)(a)的再活化劑的再活化劑)在針對抗原活化T細胞后72小時至12天，優(yōu)選5小時至12天，更優(yōu)選5天至9天的時間段內(nèi)施用。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，施用上述(A)(i)的遞送體系。在這一優(yōu)選實施方案中，“致敏”步驟(A)通過如實施例中所示特別有效的靶向方法實現(xiàn)。在這樣的一個實施方案中，遞送系統(tǒng)包含：(a)與抗原呈遞細胞表面上的受體結(jié)合的分子，和(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)，并且其中(a)的分子與所述受體結(jié)合后，(b)的蛋白質(zhì)被內(nèi)化并在抗原呈遞細胞中被加工并且包含在所述蛋白質(zhì)中的所述抗原被呈遞到所述抗原呈遞細胞的表面上，從而活化患者中的T細胞。在這樣的一個實施方案中，向患者施用支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的另外的佐劑。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述抗原呈遞細胞選自樹突細胞、巨噬細胞和B細胞。

在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述抗原呈遞細胞是樹突細胞。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，樹突細胞表面上的受體是交叉呈遞樹突細胞表面上的受體。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述樹突細胞表面上的受體是趨化因子(C基序)受體1(XCR1)、連接蛋白樣分子2、c型凝集素(CLEC)如CLEC9A，優(yōu)選地樹突細胞表面上的受體是XCR1。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，與遞送系統(tǒng)的(a)的抗原呈遞細胞表面上的受體結(jié)合的分子是所述受體的配體或針對所述受體的抗體或抗體片段，特別地其中所述受體是趨化因子(C基序)受體1(XCR1)，其中a)的分子是抗XCR1抗體或其片段或趨化因子(C基序)配體1(XCL1)或其功能活性變體，其特別地包含以下任意序列或由其組成：SEQ ID NO：7至10，優(yōu)選SEQ ID NO：8至10，更優(yōu)選SEQ ID NO：9或10，特別是SEQ ID NO：10。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，包含抗原之蛋白質(zhì)的抗原是免疫原、病原體來源的抗原或腫瘤抗原。

在本發(fā)明的應(yīng)用的藥物或方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述T細胞是CD8⁺T細胞或CD4⁺T細胞，優(yōu)選CD8⁺T細胞。

本發(fā)明的用于延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法的藥物和相應(yīng)的方法的一些優(yōu)選實施方案同樣適用用于本發(fā)明的誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法的藥物和相應(yīng)的方法。

在WO 2009/065561中已發(fā)現(xiàn)，可以選擇性地靶向在誘導(dǎo)Th1應(yīng)答中發(fā)揮主要作用的細胞。發(fā)現(xiàn)趨化因子(C基序)受體1(XCR1)存在于專職抗原呈遞細胞(特別是樹突細胞(DC))的表面上，并且可用于選擇性地將物質(zhì)遞送到這些細胞中。物質(zhì)向帶有XCR1的DC的靶向遞送使得在哺乳動物/人中誘導(dǎo)強大的Th1免疫反應(yīng)。目前的疫苗主要針對Th2抗原呈遞途徑且主要導(dǎo)致產(chǎn)生Th2型(中和)抗體和免疫反應(yīng)。特別地，通過靶向帶有XCR1的DC，可以針對給定的免疫原引發(fā)Th1型體液和細胞(細胞毒性)的免疫反應(yīng)?？梢灶A(yù)期NK細胞、CD8⁺T細胞和Th1CD4⁺T細胞參與該反應(yīng)，但是其他CD4⁺T細胞也可有助于這種類型的反應(yīng)?？梢詫⒆魟?單獨的或與免疫原或任何藥物化合物的組合)選擇性地靶向至帶有XCR1的抗原呈遞細胞(APC)。

在外周中，免疫系統(tǒng)一方面必須區(qū)分有害的外來物或自身抗原，另一方面必須區(qū)分危險的(病毒、細菌、真菌、寄生蟲、毒素樣)抗原?？乖籇C攝取并分解為肽(“加工”)。所得的肽在MHC-I類或MHC-II類的情況下被“呈遞”至T淋巴細胞(T細胞)。在MHC-II類的情況下，T細胞的CD4⁺亞群識別抗原，在MHC-I類的情況下，T細胞的CD8⁺亞群識別抗原。伴隨著抗原的攝取，DC能夠通過一大組“危險信號”識別受體(例如，toll樣受體、NOD樣受體)感測抗原是否具有危險性或它是否無害。通過“危險信號”識別受體(也稱為“模式識別受體”)所識別的模式通常是微生物特有的分子結(jié)構(gòu)。在微生物的情況下，這些可以是細胞壁組分(例如，脂多糖、肽聚糖)或核酸修飾物(例如，非甲基化的CpG基序)或者病毒DNA或病毒RNA特有的結(jié)構(gòu)特征和修飾物(例如，雙鏈RNA)。另外，體內(nèi)死于凋亡的細胞釋放能夠觸發(fā)“危險信號”識別受體(例如，高速游動族蛋白B1、熱休克蛋白)的分子。

在危險的抗原的情況下，DC活化特異性應(yīng)答程序(“成熟”)?？乖怀蔬f至CD4⁺和CD8⁺T細胞，其同時從DC接收表明所述抗原的危險性質(zhì)的額外信號。結(jié)果，兩個T細胞亞群被活化、以長壽命廣泛擴增并發(fā)展為“效應(yīng)T細胞”。這些可以是為免疫系統(tǒng)的其他DC或B細胞或其他細胞提供“幫助”的CD4⁺T細胞，或者甚至可以是CD4⁺細胞毒性細胞。在CD8⁺T細胞亞群中，再次產(chǎn)生T輔助細胞，但是大部分的CD8⁺T細胞變成效應(yīng)細胞，其能夠通過分泌IFN-γ和其他可溶性因子，或通過殺傷感染的體細胞消除入侵的病原體。由于T細胞幫助B細胞，抗原特異性B細胞分化為針對抗原(病原體)分泌抗體的漿細胞。這些抗體通過許多機制(例如中和、改善抗原攝取、調(diào)理作用、補體結(jié)合)幫助對抗病原體。

一定數(shù)量的效應(yīng)CD4⁺和CD8⁺T細胞在針對病原體之免疫應(yīng)答的急性期存活下來，并成為長壽命的“記憶T細胞”。在重新暴露于相同的病原體(抗原)時，記憶T細胞和長壽命的漿細胞協(xié)同合作組織(orchestrate)非?？焖俚拿庖邞?yīng)答使免疫系統(tǒng)非常有效地消除病原體(抗原)。在重新暴露于相同的病原體后T細胞和B細胞免疫應(yīng)答的這種增強的能力稱為“免疫”，并且誘導(dǎo)免疫的抗原是“免疫原性的”。

總之，免疫系統(tǒng)的T細胞區(qū)室包含CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞。在初始的生物體中，僅幾百個CD4⁺或CD8⁺T細胞識別給定的抗原。只要它們還沒有遇到抗原，T細胞處于初始狀態(tài)并且不能發(fā)揮效應(yīng)物功能。初始CD4⁺和CD8⁺T細胞只能通過可溶性蛋白或多肽抗原由APC活化，在MHC的情況下，其被APC攝取、加工并“呈遞”到細胞表面上。初級抗原暴露的來源可以是可溶性蛋白或多肽或任何類型的疫苗，例如減毒的感染原、編碼期望抗原蛋白質(zhì)或肽的病毒或細菌載體，或編碼抗原蛋白質(zhì)或肽的DNA或RNA表達載體。在危險的信號的情況下，對抗原的初級暴露的結(jié)果是在幾天內(nèi)將存在“致敏的(primed)”CD4⁺和CD8⁺T細胞群。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)抗原被靶向到APC中時，它將被降解(“加工”)成肽并且這些肽在MHC-II(經(jīng)典呈遞)和MHC-I(“交叉呈遞”)的情況下被呈遞到APC的表面上。在MHC-II環(huán)境中下，初始CD4⁺T細胞識別其肽抗原，在MHC-I環(huán)境中下，初始CD8⁺T識別其肽抗原。它們被活化、增殖并獲得效應(yīng)物功能。如果肽在“危險信號”的情況下由DC呈遞，則擴增的CD8⁺T細胞將分化為細胞毒性T細胞。只有專職的APC能夠在初始CD8⁺T細胞中誘導(dǎo)這種細胞毒性功能(“致敏”、“初次免疫接種”)。一旦CD8⁺T細胞獲得其細胞毒性潛力，在MHC-I環(huán)境中下它們將能夠殺傷體內(nèi)表達相同肽的細胞。因此，它們將殺傷由給定感染原感染的細胞或腫瘤細胞。

由能夠呈遞抗原的細胞攝取的抗原不僅在MHC-I(“交叉呈遞”)的情況下呈遞，而且在MHC-II(“經(jīng)典呈遞”)的情況下呈遞。因此，任何與危險信號一起遞送到抗原呈遞細胞中的抗原將不但活化CD8⁺T細胞，而且活化CD4⁺T細胞。CD4⁺T細胞將分化為分泌TNF-α和IFN-γ的Th1T細胞，并且一些也將發(fā)展為細胞毒性T細胞。

可通過提供可溶性抗原或者通過將抗原直接或間接靶向到APC(B細胞、巨噬細胞、DC)中并且特別是初始宿主的XCR1⁺DC中來實現(xiàn)初級CD8⁺T細胞活化。通過在不是APC但在體內(nèi)可將抗原交給APC(特別是XCR1⁺DC)的細胞中提供抗原來實現(xiàn)間接靶向。當(dāng)抗原與“危險信號”(例如LPS、聚I：C、CpG等)一起施用時，這將誘導(dǎo)初級CD8⁺T細胞的細胞毒性免疫。

通過(在危險信號的存在下)宿主的抗原性再攻擊可預(yù)期類似的早期T細胞活化，所述宿主之前已用抗原致敏并且其抗原特異性CD8⁺T細胞和CD4⁺T細胞處于未活化的記憶狀態(tài)。

在其中帶有不能由宿主清除的低程度慢性感染(例如，CMV、HCV、HIV)的宿主中可以預(yù)期類似的T細胞活化。

抗原可靶向到APC中?？赏ㄟ^與APC上的表面結(jié)構(gòu)結(jié)合的單克隆抗體(mAb)或抗體片段，或通過與APC表面上的受體結(jié)合的任何配體來介導(dǎo)該靶向。這些配體可以是糖部分(sugar moiety)、趨化因子、可溶性蛋白配體或使抗原內(nèi)化到APC中的任何其他結(jié)構(gòu)。由任意DC攝取的抗原在MHC-I和MHC-II兩種情況下呈遞。相對于抗原應(yīng)用的其他模式，將抗原直接或間接地靶向到樹突細胞(DC)中基本上改善了交叉呈遞?？赏ㄟ^將抗原靶向到XCR1⁺DC中來實現(xiàn)最好的交叉呈遞，并因此致敏CD8⁺T細胞(Bachem等2010，J Exp Med 207，1273-1281，Bachem等，2012，F(xiàn)ront Immunol 3，214；Caminschi等，2013，Radford等，2013，Kreutz等2013)。

在危險信號(其也是第一佐劑)的情況下高效致敏CD8⁺T細胞之后，這些細胞毒性T細胞將占CD8⁺T細胞庫的約1％至5％，并表現(xiàn)出顯著的細胞毒性潛力。例如，所獲得的細胞毒性可為宿主提供針對抗原所來源之病原體的保護，并且這種保護水平對于新形成的癌性組織也是有效的(圖2B)。

然而，當(dāng)試圖針對給定的抗原建立長期免疫時或針抗迫在眉睫的感染提供高水平的細胞毒性保護時，或者針對已建立的腫瘤提供高水平的細胞毒性時，通過初次致敏初始CD8⁺T誘導(dǎo)的細胞毒性潛力或CD8⁺T細胞的再活化可能不夠。在這些情況下，必需進一步擴增已活化的抗原特異性CD8⁺T細胞。

識別在MHC-I環(huán)境中下表達的抗原后，CD8⁺T細胞被活化，從頭表達或強烈上調(diào)多種細胞表面分子，例如CD69、4-1BB、ICOS、CD25、CD40L、OX40并在小鼠中增殖至多約8天(在人中該時間段可以有所不同)。此后，初級活化的CD8⁺T細胞在約2至3周逐漸恢復(fù)到靜息的“記憶”狀態(tài)。同時，擴增的抗原特異性T細胞群強烈地縮小。一定比例的CD8⁺T細胞將在該縮小過程中存活下來，并且將成為記憶T細胞(Cui等，2010，Immunol.Rev.236，151-166)。

經(jīng)典的疫苗接種方案可分為初次致敏步驟，然后是一次或幾次“加強”。加強的原理是基于已經(jīng)歷初次活化的下調(diào)或已經(jīng)回復(fù)到靜息狀態(tài)的最初擴增的B細胞或T細胞的從頭活化。

本發(fā)明的另一個問題在于，與現(xiàn)有技術(shù)相比，提供了改進的藥物，其用于誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法和/或用于延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法。

通過本發(fā)明解決了該問題。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物，其用于誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

i)向患者施用遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包含：(a)與樹突細胞表面上的受體結(jié)合的分子，(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)和(c)第一佐劑，其中在(a)的分子與所述受體結(jié)合后，(b)的蛋白質(zhì)被內(nèi)化并在樹突細胞中被加工，并且包含在所述蛋白質(zhì)中的所述抗原被呈遞到樹突細胞的表面上，從而活化患者中的T細胞；以及

ii)向患者施用再活化劑，所述再活化劑選自：(d)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、(e)加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑，以及(f)(d)和(e)的組合，其中所述肽來自于步驟i)中所限定的包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使步驟i)中活化的T細胞再活化，

其中在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)施用步驟ii)的再活化劑。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物用于人。

所述患者優(yōu)選哺乳動物患者，更優(yōu)選人患者?；颊呖梢曰加懈腥净蚰[瘤，或者，在預(yù)防性治療的情況下，不患有感染或腫瘤，但是將被保護免受相應(yīng)的感染或腫瘤疾病。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，樹突細胞表面上的受體是樹突細胞表面上的人受體。

在短時間內(nèi)提供強的T細胞之細胞毒性的一種可能性可以是干擾通過抗原初次活化或再活化CD8⁺T細胞在數(shù)天內(nèi)變得有效的下調(diào)機制。為了阻止CD8⁺T細胞應(yīng)答的這種下調(diào)，我們推斷我們必須在初次活化或再活化的短時間段內(nèi)提供包括CD8+T細胞上的T細胞受體復(fù)合物和/或合適的生長因子的其他刺激。這個觀念違背了教導(dǎo)在短時間內(nèi)通過T細胞受體反復(fù)活化T細胞將導(dǎo)致“活化誘導(dǎo)的細胞死亡”的現(xiàn)有信條(Gorak-Stolinska等，2001，J Leukoc Biol 70，756-766)。

為了測試我們觀念，在支持Th-1應(yīng)答的第一佐劑(聚I：C、LPS、CpG或等同物)的存在下，通過將抗原靶向到XCR1⁺DC中而免疫接種(“致敏”)C57BL/6小鼠。對于用于這種初次免疫接種的抗原，我們使用模型抗原卵白蛋白(OVA)或來自于卵清蛋白的肽序列(SIINFEKL(SEQ ID NO：11))。已知該肽序列在由靶定的APC加工OVA后，在C57BL/6小鼠的MHC-I的情況下優(yōu)先呈遞。對于該初次免疫接種，蛋白質(zhì)OVA或肽SIINFEKL(SEQ ID NO：11)與XCR1特異性的單克隆抗體(mAb)或與XCR1結(jié)合的趨化因子配體XCL1重組融合，如先前所述(WO 200/065561)。在此致敏步驟之后的不同時間點(3至20天)，將小鼠再次暴露于抗原。我們沒有將蛋白質(zhì)或肽注入宿主中，因為我們預(yù)期任一過程將導(dǎo)致在MHC-I環(huán)境中下在宿主細胞上呈遞抗原肽，然后其將被已活化的抗原特異性CD8⁺T細胞殺傷(對比圖1A)，一個非常不期望的效果。相反，從C57BL/6小鼠分離同基因(syngeneic)脾細胞，在體外與肽SIINFEKL(SEQ ID NO：11)孵育(“加載”MHC-I)、洗滌并i.v.注射到之前已致敏的小鼠中。

出乎意料地，并且與目前的知識相反，當(dāng)CD8⁺T細胞在窄的時間段內(nèi)再次暴露于抗原后，我們用這種方案可實現(xiàn)抗原特異性CD8⁺T細胞數(shù)量的擴增。當(dāng)再次暴露非常早(在第3天)時，沒有觀察到擴增，當(dāng)在初始CD8⁺T細胞活化的第9天重新暴露于抗原時，觀察到非常有限的擴增(圖3)。將加載SIINFEKL的同基因脾細胞單獨注入到致敏的動物中不擴增致敏的CD8⁺T細胞群，只有當(dāng)共施用第二佐劑(聚I：C、LPS、CpG或等同物)以提供“危險”信號時，才能達到期望的效果。當(dāng)在最佳時間點注射加載肽的脾細胞時，抗原應(yīng)答性CD8⁺T細胞群擴增約10倍，從致敏后無擴增的0.2×10⁶個至擴增的2×10⁶個細胞(圖4)。這些表達高水平效應(yīng)分子(例如顆粒酶B、穿孔蛋白、TNF-α和IFN-γ)的擴增的CD8⁺T細胞參與CD8⁺T細胞防御感染原或根除腫瘤。在人中，初始T細胞活化增強的最佳時間段可與小鼠中的最佳時間段不同(初始CD8⁺T細胞活化后約第5至8天)。

當(dāng)比較不同的擴增時間點時，很明顯，在初始致敏后5至8天再次暴露于抗原得到最高程度的CD8⁺T細胞擴增和在CD8⁺T細胞中最高表達的細胞毒性效應(yīng)分子(TNF-α、IFN-γ、顆粒酶B、穿孔蛋白)。第5至8天是通過靜息CD8⁺T細胞識別抗原后的較早時間點，并且因此在這樣的時間點T細胞仍然被強烈地活化。因此，這種擴增并不代表經(jīng)典的加強系統(tǒng)。相反，這種類型的擴增了提供使T細胞繼續(xù)其初始活化和擴增階段的信號，而不是進入通常的下調(diào)和縮小階段。因為這種特殊的作用，當(dāng)與佐劑一起施用時，我們將這種擴增稱之為“抗原依賴性擴增系統(tǒng)”(ADAS)。

因此，根據(jù)本發(fā)明，“抗原依賴性擴增體系”或“ADAS”理解為涉及向患者施用再活化劑的本發(fā)明的第二步驟ii)，其中所述再生劑是加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑，并且其中所述肽來自于本發(fā)明的步驟i)中所限定的包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使步驟i)中活化的T細胞再活化。任選地，在ADAS中的再活化劑還包括復(fù)合的白介素2(IL-2cx)。

為了檢查ADAS的效力的細胞需求，對多種淋巴細胞群(脾細胞、B細胞、T細胞和DC)體外加載SIINFEKL(SEQ ID NO：11)進行了比較并在最佳的時間段內(nèi)(第5天)將其與第二佐劑(聚I：C、LPS、CpG或等同物)一起注射到小鼠中。本實驗確定所有表達MHC-I的這些淋巴細胞群均能夠提供繼續(xù)CD8⁺T細胞的初始活化、擴增和功能分化為細胞毒性效應(yīng)細胞所必需的信號(圖3B)。而在第10天的單獨致敏導(dǎo)致在脾CD8⁺T細胞群中產(chǎn)生1％至5％的抗原特異性CD8⁺T細胞，應(yīng)用ADAS將該頻率提高到約15％至25％。

從得到的結(jié)果可以得出結(jié)論，在體內(nèi)ADAS將與能夠在淋巴細胞或者甚至非淋巴細胞的表面上提供足夠高密度加載肽的MHC-I分子的任何系統(tǒng)一起起作用。除了在體外用肽外部加載MHC-I分子，人們可考慮這樣的系統(tǒng)，其中將細胞在體外與整個包含抗原之蛋白質(zhì)一起培養(yǎng)，使細胞加工抗原并在MHC-I環(huán)境中下呈遞抗原肽。人們也可考慮這樣的系統(tǒng)，其中將細胞在體外暴露于能夠感染細胞的病毒系統(tǒng)，導(dǎo)致在MHC-I環(huán)境中下表達大量的肽。此外，可用編碼給定蛋白質(zhì)或肽序列的表達載體轉(zhuǎn)染帶有MHC-I的細胞，同樣導(dǎo)致在MHC-I環(huán)境中下高效的肽呈遞。

因為遞送至APC的全抗原不僅在MHC-I環(huán)境中下遞送至CD8⁺T細胞，而且在MHC-II環(huán)境中下遞送至CD4⁺T細胞，ADAS還可用于增強CD4⁺T細胞應(yīng)答。對于這種特殊的擴增，用于ADAS的細胞必須在細胞表面上表達MHC-II分子，所述MHC-II分子將加載有適當(dāng)?shù)碾?。這種加載可通過外部暴露于合適的肽完成，或可通過編碼給定的蛋白質(zhì)或肽序列的表達載體轉(zhuǎn)染帶有MHC-II的細胞，同樣導(dǎo)致在MHC-II的情況下高效的肽呈遞。

雖然我們通過i.v.注射應(yīng)用ADAS，但是應(yīng)用加載肽的細胞的其他途徑也可以。這可通過皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)或通過直接注射到腫瘤組織中來完成。

因此，本發(fā)明的步驟ii)的再活化劑的施用可通過已知的施用方法進行，特別地選自：皮下(s.c.)、皮內(nèi)、i.v.、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)或通過直接注射到腫瘤組織中，更優(yōu)選通過i.v.或s.c.注射。

另外，本發(fā)明的步驟i)的遞送系統(tǒng)的施用可通過已知的施用方法進行，特別地選自皮下、皮內(nèi)、i.v.、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)或者通過直接注射到腫瘤組織中，更優(yōu)選通過i.v.和s.c.注射。

與樹突細胞表面上的受體結(jié)合的分子、(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)以及(c)第一佐劑優(yōu)選作為單藥物制劑或組合物施用。這樣的藥物制劑或組合物優(yōu)選為可還含有可藥用賦形劑(如緩沖化合物)的液體。這樣的藥物制劑優(yōu)選是滅菌的。

用于肌內(nèi)施用的步驟i)的遞送系統(tǒng)的劑量體積優(yōu)選多至約5mL，例如0.3mL至3mL、1mL至3mL、約0.5至1mL或約2mL。在各個劑量中活性成分的量應(yīng)足以提供治療或預(yù)防。在不同的一些實施方案中，待遞送的物質(zhì)的單位劑量應(yīng)為多至5μg物質(zhì)/kg體重，約0.2至3μg、約0.3至1.5μg、約0.4至0.8μg，或者約0.6μg。在作為替代的一些實施方案中，單位劑量可以是多至約6μg物質(zhì)/kg體重，約0.05至5μg，或約0.1至4μg。每劑蛋白質(zhì)的代表量為約1μg至約1mg，更優(yōu)選約5μg至約500μg，還更優(yōu)選為約10μg至約250μg，最優(yōu)選約25μg至約100μg。

在步驟ii)中待施用的包含加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑的再活化劑的細胞的數(shù)目可以改變，并且通常在1×10⁶至400×10⁶個細胞的范圍內(nèi)，優(yōu)選在1×10⁶至200×10⁶個細胞的范圍內(nèi)。

作為再活化劑的復(fù)合的IL-2優(yōu)選作為溶液施用和/或以1μg/kg體重至200μg/kg體重，更優(yōu)選1μg/kg體重至50μg/kg體重，甚至更優(yōu)選的1μg/kg體重至20μg/kg體重的范圍內(nèi)的劑量施用，其中所述量是指組合物中的IL-2含量。

雖然我們在抗原靶向到XCR1⁺DC后測試了ADAS的效果，但是人們可以從我們的結(jié)果中得出結(jié)論：可用ADAS過程來擴增通過體內(nèi)T細胞受體觸發(fā)而導(dǎo)致顯著初始活化(“致敏”)或再活化CD8⁺T細胞和/或CD4⁺T細胞的任何系統(tǒng)。

為了擴增T細胞和NK細胞群，在過去已經(jīng)使用了淋巴因子IL-2并且證明其是有效的，當(dāng)以“復(fù)合的”形式(即，與抗體結(jié)合)提供時，阻斷其與高親和力IL-2受體鏈(CD25)的結(jié)合(Boyman等，2006年，Science 311，1924-1927)。

我們在通過將抗原靶向XCR1⁺DC中進行T細胞活化的我們的系統(tǒng)中測試了復(fù)合的IL-2(IL-2cx)。與預(yù)期相反，在致敏T細胞應(yīng)答后，單獨應(yīng)用IL-2cx并不能顯著提高抗原特異性CD8⁺T細胞的數(shù)量(圖4)。在第5天單獨應(yīng)用ADAS將抗原特異性CD8⁺T細胞的數(shù)量從單獨致敏后的約0.2×10⁶提高至約2×10⁶個，因而提高約10倍，如上所述。然而，出人意料的是，當(dāng)在ADAS的情況下應(yīng)用時，IL-2cx將抗原特異性CD8⁺T細胞的擴增非常強烈地增強至約100×10⁶至200×10⁶個抗原特異性CD8⁺，即約50至100倍。這種高度協(xié)同效應(yīng)表明當(dāng)以復(fù)合的形式應(yīng)用IL-2時，ADAS為IL-2的生物效應(yīng)創(chuàng)建了有利條件。ADAS和IL-2cx的組合將初始致敏放大到這樣的程度：現(xiàn)在所有脾臟免疫細胞的大部分由抗原特異性CD8⁺T細胞構(gòu)成。當(dāng)進一步檢查時，該大規(guī)模擴增的T細胞群表達顆粒酶B至約60％至70％，表明高細胞毒性潛力。

為了測試在不同條件下擴增的CD8⁺T細胞的細胞毒性能力，我們選擇了腫瘤模型，其中高侵襲性O(shè)VA轉(zhuǎn)染的腫瘤系(tumor line)皮下注射到同基因C57BL/6小鼠中，并使其生長6天以達到基本尺寸(約20mm²)。從第6天開始，小鼠組不處理，或者通過不同的方案處理。通過將OVA靶向到XCR1⁺DC中在第6天單獨致敏荷瘤小鼠對腫瘤的生長幾乎沒有任何影響(圖5)，如果不致敏小鼠但用IL-2cx單獨處理，同樣也是如此。出人意料的是，在第6天致敏小鼠，隨后用IL-2cx連續(xù)數(shù)天單獨處理顯著地降低腫瘤的生長直到第22天，表明在體內(nèi)誘導(dǎo)了相當(dāng)大的殺傷能力。然而，腫瘤在第22天左右恢復(fù)其生長，表明不是所有的腫瘤塊均可被去除。同樣，在致敏后第6天應(yīng)用ADAS非常顯著地降低了腫瘤的生長，但是，在約第18天重新開始生長(圖5)。有趣的是，在致敏后第6天與連續(xù)應(yīng)用IL-2cx相組合應(yīng)用ADAS明顯最有效地降低了腫瘤的尺寸，直到實驗結(jié)束(圖5)。所得的結(jié)果表明，在將抗原靶向到APC中后在給定的時間段內(nèi)單獨注射IL-2cx在控制腫瘤的生長中已非常有效。此外，結(jié)果表明，當(dāng)在通過抗原初始活化CD8⁺T細胞后的給定的時間段內(nèi)應(yīng)用ADAS，也針對表達該抗原的腫瘤誘導(dǎo)了強殺傷活性。ADAS和IL-2cx的組合對于控制侵襲性腫瘤的生長最有效(圖5)。雖然在本實驗中首先施用ADAS，隨后為IL-2cx，但是也可顛倒處理順序。在這種情況下，應(yīng)首先施用IL-2cx，然后在適當(dāng)?shù)臅r間施用ADAS。

在本發(fā)明的用于方法中的藥物的步驟i)的一個優(yōu)選實施方案中，WO 2009/065561中公開了XCR1為樹突細胞表面上的受體。如在WO 2009/065561中所公開的，抗XCR1抗體或其片段或者XCL1或其功能活性片段可優(yōu)選用作與樹突細胞表面上的受體結(jié)合的分子。WO 2009/065561的涉及其中XCR1是樹突細胞的表面上的受體的遞送系統(tǒng)的公開內(nèi)容通過引用并入本文并且其中公開的一些實施方案也適于用于本發(fā)明的應(yīng)用的藥物的步驟i)。

合適的包含抗原之蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

例如，在腫瘤疾病的情況下，許多合適的包含抗原之蛋白質(zhì)是已知的。此外，描述了作為疫苗的合適的肽，例如在Aranda等，OncoImmunology 2：12，e26621，2013年12月中總結(jié)的實體瘤，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、肉瘤、黑素瘤、食管鱗狀細胞癌、胃癌、肝細胞癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、腎細胞癌、前列腺癌、卵巢癌、婦科惡性腫瘤和多種其他腫瘤。在這些臨床試驗中特異性靶向的包含抗原之蛋白質(zhì)包括癌癥-睪丸抗原如NY-ESO-1、TTK蛋白激酶(也稱為MOS)、淋巴細胞抗原6復(fù)合物、locus K(LY6K，最知名的為URLC10)、胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白3(IGF2BP3，最知名的為IMP3)、環(huán)指蛋白(RNF43)和線粒體外膜的移位酶34(TOMM34)；癌胚抗原如磷脂酰肌醇聚糖-3；分化抗原如melan-A(MLANA)和前黑色素體蛋白(PMEL，最知名的為gp100)；腫瘤限制性抗原，例如SYT-SSX融合體(由于t(X；18)(P11；Q11)染色體易位，其由滑膜肉瘤選擇性地表達)；以及所謂的“共享的腫瘤相關(guān)抗原”(由惡性細胞過表達，但也由一種或幾種健康組織以正常量產(chǎn)生的抗原)，包括血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1)和VEGFR2、存活蛋白、腎母細胞瘤1(WT1)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和p53。因此，在腫瘤的情況下，這樣的蛋白質(zhì)為合適的包含抗原之蛋白質(zhì)。Yamada等，Cancer Sci，2013，104(1)：15-21進一步總結(jié)了癌癥中的肽疫苗。

在腫瘤患者或針對腫瘤待預(yù)防性地治療的患者中誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的情況下，可以使用參與腫瘤疾病的合適的包含抗原之蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。如例如在Tacken和Figdor(Tacken PJ，F(xiàn)igdor CG；Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo：Steps towards cost effective vaccines.Semin.Immunol.，2011，23(1)：12-20)中描述的，理想的腫瘤抗原是稱為共享的腫瘤特異性抗原的那些，因為它們在多種組織型的腫瘤細胞中選擇性地表達，但在表達MHC的正常組織中不選擇性地表達。這種類型的抗原的實例是MAGE-A或NY-ESO-1抗原。這類抗原中多個成員根據(jù)腫瘤類型和疾病階段以可變的比例表達。因此，基于這些抗原的疫苗需要選擇表達靶抗原的帶有腫瘤的患者。認為對疫苗開發(fā)有價值的其他類別的腫瘤抗原是來自于在腫瘤中過表達的致癌蛋白的那些。真正的非自體腫瘤抗原來自于兩個主要來源：在致癌病毒來源(例如由HPV感染引起的宮頸癌)的腫瘤的情況下的病毒抗原，以及體細胞突變。

在患有感染的患者或針對感染性疾病(或感染)待預(yù)防性治療的患者中誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的情況下，可使用合適的包含抗原之蛋白質(zhì)的病原體，特別是選自以下的病原體：瘧疾、結(jié)核病、利什曼原蟲或病毒，特別是選自以下的病毒：正黏病毒、流感病毒、甲肝病毒、乙肝病毒，慢性丙肝病毒、慢病毒，特別是HI-病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、纖維病毒、黃病毒或呼吸道病毒。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，包含抗原之蛋白質(zhì)選自以下病毒的蛋白質(zhì)：丙肝病毒、乳頭瘤病毒、副黏病毒或呼吸道病毒。

病毒(特別是RNA病毒)通常表現(xiàn)出高突變率。然而，在特別是編碼非結(jié)構(gòu)和/或內(nèi)部蛋白質(zhì)的基因組片段中通常存在保守區(qū)域，這樣的區(qū)域編碼病毒聚合酶或核蛋白。這樣的區(qū)域不適合經(jīng)典的疫苗接種技術(shù)，因為這樣的保守蛋白不暴露于病毒外殼的表面上。與此相反，這樣的包含抗原之蛋白質(zhì)和/或包含在所述蛋白質(zhì)中的所述抗原可用于在根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的藥物。

在一個優(yōu)選的實施方案中，病毒的包含抗原之蛋白質(zhì)和/或包含在所述蛋白質(zhì)中的抗原是保守的。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，包含抗原之蛋白質(zhì)是非結(jié)構(gòu)蛋白和/或所述抗原包含在非結(jié)構(gòu)和/或內(nèi)部蛋白質(zhì)中。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，包含抗原之蛋白質(zhì)是RNA病毒的蛋白質(zhì)。

“非結(jié)構(gòu)”或“內(nèi)部”蛋白質(zhì)是病毒顆粒的外殼或包膜的一部分的蛋白質(zhì)。

在另一個實施方案中，步驟i)中包含在蛋白質(zhì)中的抗原是免疫顯性的。免疫顯性意味著盡管許多pMHC復(fù)合物可用于特定的病原體，T細胞應(yīng)答可再現(xiàn)地集中在一個或幾個關(guān)鍵的抗原，并且這樣的抗原是一種這樣的關(guān)鍵抗原。

例如在Wu等(PNAS，2011，108(22)：9178-9183)中描述了合適的包含抗原之蛋白質(zhì)和甲型流感病毒的抗原，并且涵蓋NP(核蛋白)、堿性聚合酶1和M1。

步驟ii)涉及向患者施用再活化劑，所述再活化劑選自：(d)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、(e)加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑，和(f)(d)和(e)的組合，其中所述肽來自于步驟i)中所限定的包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使步驟i)中活化的T細胞再活化。

在一個實施方案中，在(e)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)施用。

在一個優(yōu)選的實施方案中，在(e)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在一個優(yōu)選的實施方案中，在(e)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至14天的時間段內(nèi)施用。

例如，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、72小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，在(e)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后3天至9天，甚至更優(yōu)選為4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在(e)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)、優(yōu)選48小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

例如，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、72小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用僅一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在(e)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在(d)的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)施用。

在(d)的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)優(yōu)選反復(fù)施用。還可以在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后14天后再施用復(fù)合的IL-2；但是，在0小時至14天的時間段內(nèi)至少施用一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在(d)的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，在(d)的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。因此，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可以每天或每兩天施用。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一個實例中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、4天、6天和8天施用。

還可以在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后例如14天，優(yōu)選為9或8天的指定時間后再施用復(fù)合的IL-2；但是，在指定的時間段內(nèi)至少施用一次。

在(f)的情況下，施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)與加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑的組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑之前、同時或之后施用。優(yōu)選地，所述加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑施用僅一次，并且所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。在這樣的一個實施方案中，復(fù)合的IL-2可在施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑之前、同時和/或之后施用。

對于作為替代的(f)，施用復(fù)合的IL-2以及加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑的相同的一些優(yōu)選實施方案分別適用于替代物(e)和(f)。

在一個實施方案中，在(f)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在一個優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至14天的時間段內(nèi)施用。

例如，在(f)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

例如，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用僅一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在(f)的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。還可以在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后14天后再施用復(fù)合的IL-2；但是，在0小時至14天的時間段內(nèi)至少施用一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。因此，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可每天或每兩天施用。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一個實例中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、4天、6天和8天施用。

還可以在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后例如14天，優(yōu)選9或8天的指定時間后再施用復(fù)合的IL-2；但是，在指定的時間段內(nèi)至少施用一次。

因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，

(A)所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天，優(yōu)選48小時至14天的時間段內(nèi)，更優(yōu)選3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用，甚至更優(yōu)選在48小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次，更具體地在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后3天至9天的時間段施用僅一次，甚至更具體地在4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用僅一次，以及

(B)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天，更優(yōu)選48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天，8天的時間段內(nèi)施用，最優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天，更優(yōu)選48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。

還可以在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后14天再施用復(fù)合的IL-2；然而，在0小時至14天的時間段內(nèi)至少施用一次。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。因此，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可每天或每兩天施用。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一個實例中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后48小時、4天、6天和8天施用。

還可以在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后例如14天，優(yōu)選9或8天的指定時間后再施用復(fù)合的IL-2；但是，在指定的時間段內(nèi)至少施用一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在(f)的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

所述加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和所述第二佐劑優(yōu)選作為單藥物制劑施用。這樣的藥物制劑優(yōu)選為可還含有可藥用賦形劑(如緩沖化合物)的液體。這樣的藥物制劑優(yōu)選是滅菌的。

在應(yīng)用的藥物的一個優(yōu)選實施方案中，

(x)所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)反復(fù)施用，特別是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更優(yōu)選其中所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)每1或2天施用，和/或在5天至1個月，甚至更優(yōu)選1至2周期間內(nèi)反復(fù)施用，和/或

(xx)來自于包含抗原之蛋白質(zhì)的肽的長度為8、9或10個氨基酸和/或為由MHC-I，優(yōu)選由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更優(yōu)選由等位基因HLA-A2呈遞的肽。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)反復(fù)施用，特別是施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更優(yōu)選其中所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)每1天或2天施用，和/或在5天至1個月期間反復(fù)施用。因此，如上所述，可在14天，或9或8天的時間段內(nèi)后再施用復(fù)合的IL-2。

如上所述，加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑優(yōu)選作為本發(fā)明應(yīng)用的藥物的步驟ii)的再活化劑施用。此外，所述肽來自于步驟i)中所限定的包含抗原之蛋白質(zhì)。

在一個實施方案中，如實施例中所述，可通過在體外用肽外部加載MHC-1分子來實現(xiàn)所述加載?；蛘?，可在體外將細胞與包含抗原的全蛋白質(zhì)一起培養(yǎng)，使細胞加工抗原并在MHC-I環(huán)境中下呈遞抗原肽，或其在體外暴露于能夠感染細胞的病毒系統(tǒng)，導(dǎo)致在MHC-I環(huán)境中下表達大量的肽或可用編碼給定蛋白質(zhì)或肽序列的表達載體轉(zhuǎn)染帶有MHC-I的細胞，同樣導(dǎo)致在MHC-I環(huán)境中下高效的肽呈遞。

用于確定在MHC-I環(huán)境中下用于加載細胞的肽的方法是本領(lǐng)域中公知的。例如，可使用在Wu等(PNAS，2011，108(22)：9178-9183)中所描述的方法。

在應(yīng)用用于加載(例如，通過在體外外部加載細胞)的限定的肽的情況下，可通過本領(lǐng)域中已知的方法選擇肽序列?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法在體外外部加載細胞，例如，通過提供肽的水溶液，向細胞添加所述溶液，其優(yōu)選在緩沖的溶液或介質(zhì)中，將細胞與肽一起孵育以實現(xiàn)高飽和度的具有各自肽的MHC-I和/或MHC-II，并且任選地(例如，用水溶液)洗滌所述細胞。

在一個優(yōu)選的實施方案中，在體外用序列為包含抗原之蛋白質(zhì)的子序列的一種肽加載細胞。例如，可在體外向細胞群(其優(yōu)選是患者的細胞群)添加包含一種這樣的肽的水溶液。

或者，可在步驟ii)中使用2、3、4、5、6、7、8、9，10或更多種不同的加載肽的細胞I類細胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞群的混合物，其中所述細胞用不同的肽加載，且其中所述細胞優(yōu)選為患者的細胞。

可通過將細胞群(如PBMC細胞)與2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽一起孵育獲得這樣細胞的混合物，從而獲得在MHC-I環(huán)境中下加載有不同肽的細胞?；蛘撸稍隗w外將單獨的細胞群(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個細胞群)與不同的肽(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽)一起孵育。因此，如此獲得各自加載有不同肽的單獨的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞群。在步驟ii)中可單獨施用不同的加載肽的I類細胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞群，或者可以制備不同的加載肽的I類細胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞群的混合物，其隨后可在步驟ii)中施用。

在使用不同肽的情況下，特別是如果使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽，這樣的肽可以來自于相同或不同的包含抗原之蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，可使用來自于一種腫瘤抗原的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽。這意味著，每個肽的序列是腫瘤抗原的子序列。這樣的不同的肽的序列可以是重疊或不重疊的。在另一個實施方案中，可使用來自于2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的腫瘤抗原的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的肽。在這樣的一個實施方案中，不同的腫瘤抗原都與相同或不同的腫瘤相關(guān)，優(yōu)選與相同的腫瘤相關(guān)。

優(yōu)選地，選擇8、9或10個氨基酸的長度的肽序列，因為通過MHC-I呈遞的肽通常是這個長度。

如在Wu等中進一步描述的，HLA等位基因是極其多態(tài)性的。因此，加載的肽優(yōu)選為由常見的HLA等位基因呈遞的肽。因此，在人中，特別優(yōu)選由最常見的等位基因HLA-A2呈遞的肽?；蛘?，可使用由HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35(其是白種人來源個體相關(guān)的等位基因)呈遞的肽。對于亞洲個體可使用HLA-A24且對于非洲個體可使用HLA-A30。

在Speiser和Romero(Seminars in Immunology 22(2010)144-154)及其中的參考文獻中描述了幾種合適的腫瘤相關(guān)肽。其中大多數(shù)是HLA-A2限制性的，例如來自于Melan-A/MART-1的肽，對于黑素細胞分化抗原為一種gp100抗原表位和酪氨酸酶；對于前列腺是前列腺表面抗原和PSAP；對于黏膜腫瘤是癌胚抗原和MUC-1；對于乳腺癌是HER-2/neu基因；對于腎細胞癌是G250；由兩種髓性白血病相關(guān)抗原共享的PR1，在粒細胞中正常表達和在髓性白血病細胞中過度表達的PR3和中性粒細胞彈性蛋白酶；多種腫瘤類型共享的腫瘤特異性抗原MAGE-A和NY-ESO-1；和過表達的蛋白質(zhì)存活蛋白和端粒酶。在Wu等(同上)中描述了合適的來自于甲型流感的肽。

因此，在另一個實施方案中，來自于包含抗原之蛋白質(zhì)的肽是由MHC-I，優(yōu)選由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更優(yōu)選由等位基因HLA-A2呈遞的肽。在Wu等(同上)中描述和匯總了用于鑒定這樣的肽的方法。例如，可使用Wu等(同上)的系統(tǒng)鑒定方法，或其中所描述的合適的算法。

因此，在另一個實施方案中，來自于包含抗原之蛋白質(zhì)的肽的長度為8、9或10個氨基酸并且是由MHC-I，優(yōu)選由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更優(yōu)選由等位基因HLA-A2呈遞的肽。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，樹突細胞表面上的受體是交叉呈遞樹突細胞表面上的受體。

交叉呈遞樹突細胞特別適合于在MHC-I環(huán)境中下呈遞肽。交叉呈遞DC能夠攝取可溶性蛋白或靶蛋白，對其進行加工，并在MHC-I環(huán)境中下呈遞。所有常規(guī)的DC均能夠進行抗原交叉呈遞。在小鼠中通過XCR1⁺DC，并且在人中通過在BDCA3⁺DC群中的XCR1⁺DC完成定量地最佳抗原交叉呈遞。因此，鼠交叉呈遞DC優(yōu)選通過XCR1⁺DC，且人交叉呈遞DC優(yōu)選通過BDCA3⁺DC群內(nèi)的XCR1⁺DC。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，樹突細胞表面上的受體是趨化因子(C基序)受體1(XCR1)、連接蛋白樣分子2、c型凝集素(CLEC)如CLEC9A。

C型凝集素為Ca⁺⁺-依賴性聚糖結(jié)合蛋白，其在糖基識別結(jié)構(gòu)域(CRD)中共享初級和次級結(jié)構(gòu)同源性。這些蛋白質(zhì)具有C-型凝集素折疊，其是與也存在于不與碳水化合物結(jié)合的許多蛋白質(zhì)中的具有高度可變蛋白質(zhì)序列的折疊。

例如在Caminschi等，2008，Blood 112，3264-3273中描述了人受體CLEC9A的序列。與CLEC9A結(jié)合是合適的分子是例如特異性單克隆抗CLEC9A抗體。

在Takai等，2003，Cancer Sci 94，655-667中描述了人受體連接蛋白樣分子2。與連接蛋白樣分子2結(jié)合的合適的分子是例如特異性抗連接蛋白樣分子2單克隆抗體。

在免疫系統(tǒng)中，所述遞送系統(tǒng)特別適合于影響Th1應(yīng)答以及任選還影響Th2應(yīng)答。

XCR1是趨化因子受體并且是迄今為止趨化因子受體的“C”亞家族的唯一成員。它也被稱為GPR5或CCXCR1。GPR5，先前作為作為孤兒G蛋白偶聯(lián)受體克隆得到，已在人中首次被識別，然后在小鼠中被識別為XCL1的單特異性受體，并且因此稱為XCR1。

XCR1的天然配體是XCL1，其也被稱為ATAC、淋巴細胞趨化因子(lymphotactin)或SCM-1。它是C家族趨化因子的唯一成員。在人中克隆了活化誘導(dǎo)的、T細胞來源的和趨化因子相關(guān)的細胞因子(ATAC)(Muller等，1995，Eur.J.Immunol.25，1744-1748)，并獨立地為在小鼠中的淋巴細胞趨化因子(Kelner等，1994，Science 266，1395-1399)和在人中的SCM-1(Yoshida等，1995，F(xiàn)EBS Lett.360，155-9)。根據(jù)對趨化因子的命名，ATAC/淋巴細胞趨化因子/SCM-1現(xiàn)在稱為“XCL1”。XCL1主要由活化的CD8⁺T細胞、Th1 CD4⁺T細胞和NK細胞分泌。在人中，已經(jīng)描述了命名為XCL2的XCL1的變體，其中在全長蛋白質(zhì)的28位和29位的氨基酸天冬氨酸和賴氨酸分別被組氨酸和精氨酸交換(Yoshida等，1996，F(xiàn)EBS Lett.395，82-8)，這也可用于本發(fā)明。在WO 2009/065561的實施例8中描述了產(chǎn)生生物活性形式的XCL1的示例性方法?？墒褂妙愃频姆椒ㄒ援a(chǎn)生其他生物活性形式的XCL1，例如，其他物種的那些。

在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，樹突細胞表面上的受體是XCR1。

人XCR1的氨基酸序列是已知的(NCBI；登錄號NP_001019815)：

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，a)的分子是針對受體的配體或針對受體的抗體或其抗體片段。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述受體是趨化因子(C基序)受體1(XCR1)且a)的分子是抗XCR1抗體或其片段或者趨化因子(C基序)配體1(XCL1)或其功能活性變體，特別是包含以下任意序列或由其組成：SEQ ID NO：7至10，優(yōu)選地，SEQ ID NO：8至10，更優(yōu)選SEQ ID NO：9或10，特別是SEQ ID NO：10。

幾個物種的XCL1(ATAC)的氨基酸序列(包括人：SEQ ID NO：1，GenBank登錄P47992；小鼠：SEQ ID NO：2，GenBank登錄P47993；和大鼠SEQ ID NO：3，GenBank登錄P51672)是已知的，并且示為SEQ ID NO：1至3(見下文)。此外，稱為K4.1HHV8的特異性XCLR1激動劑(SEQ ID NO：4，GenBank登錄AAB62672.1)(見下文)(其是病毒趨化因子樣蛋白質(zhì))也是已知的?？墒褂萌魏芜@些天然XCR1配體或任何其他天然XCR1配體。

或者，可使用任何天然XCL1的功能活性變體。術(shù)語變體包括通過一個或更多個氨基酸添加、缺失和/或替換得到的片段、變體，和分子，特別是蛋白質(zhì)，其包含任何天然XCL1或其部分，例如融合蛋白。融合蛋白的XCL1部分的側(cè)翼可以是氨基酸殘基C末端、N末端或C和N末端。

功能活性片段的特征在于是通過一個或更多個氨基酸的缺失從任何天然XCR1配體(特別是XCL1，尤其是SEQ ID NO：1至4的那些)得到的。所述缺失可以是C末端的、N末端的和/或內(nèi)部的。優(yōu)選地，通過至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60，更優(yōu)選至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30，甚至更優(yōu)選至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，更優(yōu)選至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，最優(yōu)選1、2、3、4或5個氨基酸缺失獲得的片段。本發(fā)明的功能活性片段的特征在于具有與其所來源的配體顯示的生物活性類似的生物活性，包括能夠與XCR1結(jié)合并介導(dǎo)(b)的蛋白質(zhì)的內(nèi)化。在本發(fā)明的情況下，如果無序列改變，片段的活性(結(jié)合以及內(nèi)化)達到XCL1活性的至少10％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少70％，還更優(yōu)選至少80％，尤其是至少90％，特別是至少95％，最優(yōu)選至少99％，則天然XCR1配體，特別是XCL1，尤其是SEQ ID NO：1至4的那些的片段是有功能活性的?？稍O(shè)計或獲得任何期望長度的這些片段，包括小至長度為約18至50個氨基酸。

天然XCR1配體(特別是XCL1，尤其是SEQ ID NO：1至4的那些)的功能活性片段的特征還可在于其他結(jié)構(gòu)特征。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，功能活性片段由SEQ ID NO：1至4中任一XCR1配體的至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，還更優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選99％的氨基酸組成?？赏ㄟ^一個或更多個氨基酸缺失從所述肽得到如上所定義的功能性活性片段。所述缺失可以在C末端、N末端和/或內(nèi)部。上述SEQ ID NO：1至4的序列比對示出似乎是保守的天然配體的結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在片段中應(yīng)維持這些結(jié)構(gòu)域。

保守的結(jié)構(gòu)域包括那些經(jīng)加工的N-末端的氨基酸(對于SEQ ID NO：1至3，加工的N-末端從非加工的N-末端的22位氨基酸開始；對于SEQ ID NO：4從27位氨基酸開始)1至2位(V/S G)、13-27(S/N L X T/S Q/A R L P V/P X K/R I/L K/I X T/G X Y，X=任意或無氨基酸；SEQ ID NO：5)，35至51(R/K A V I F I/V T K/H R/S G L/R K/R I/V C A/G D/S P；SEQ ID NO：6)以及在11和48位的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(同樣參見以上的比對)。如果只考慮相同的氨基酸，SEQ ID NO：1至4的序列的共有序列是XGXXXXXXXXXXCXXXLXXXRLPXXXXXXXXYXXXXXXXXXXAVIFXTXXGXXXCXXP(SEQ ID NO：7)，以及如果考慮相同的氨基酸和多數(shù)氨基酸(即，在4個序列中的3個中存在的氨基酸，斜線后列出替代氨基酸)，則為

(V/S)GX(E/A)(V/T)XXXXXXXC(V/E)X(S/N)LX(T/S)(Q/A)RLP(V/P)X(K/R)(I/L)(K/I)X(T/G)XYX(I/T)X(E/T)(G/V)XXXX(R/K)AVIF(V/I)T(K/H)(R/S)G(L/R)(K/R)XC(A/G)(D/S)P(SEQ IDNO：8)。如果只考慮相同的氨基酸，SEQ IDNO：1至3序列的共有序列是

VGXEVXXXXXCVXLXTQRLPVXXIKTYXIXEGXXRAVIFXTKRGLXXCADPXAXWVXXXXXXXDXXXXXXXXXXXTXPTXXQXSXXTAXTLTG(SEQ ID NO：9)，以及如果考慮相同的氨基酸和多數(shù)氨基酸(即，在3序列的2個中存在的氨基酸，斜線后列出替代的氨基酸)則為

VG(T/S)EV(L/S)X(E/K)(S/R)XCV(S/N)LXTQRLPV(Q/S)(K/R)IKTY(T/I)IXEG(A/S)(M/L)RAVIF(V/I)TKRGL(K/R)(I/V)CADP(Q/E)A(K/T)WV(K/R)X(A/V)(I/V)(K/R)(T/S)(V/M)D(G/R)(R/K)(A/S)(S/N)(T/A)(R/S)(K/N)(N/S)(M/K)(A/I)(E/Q)TXPT(G/Q)(A/T)Q(R/Q)S(T/A)(S/N)TA(V/I)TLTG(SEQ ID NO：10)。

因此，在本發(fā)明中應(yīng)用的一個優(yōu)選的遞送系統(tǒng)中，XCL1的功能活性變體，優(yōu)選功能活性片段包含以下任何序列或由其組成：SEQ ID NO：7至10，優(yōu)選SEQ ID NO：8至10，更優(yōu)選SEQ ID NO：9或10，尤其是SEQ ID NO：10。

在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，使用如上定義的XCL1變體，其中所述XCR1配體是SEQ ID NO：1至4中任一個的XCR1配體的功能活性變體，且其中所述變體與SEQ ID NO：1至4中任一個的XCR1配體具有至少50％的序列同一性的變體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述功能活性變體與SEQ ID NO：1至4中任一個的抗原具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，還更優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選99％的序列同一性。

例如可通過序列比對確定序列同一性的百分比。用于比較序列比對的方法是本領(lǐng)域中公知的。例如，在Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981或Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444-2448，1988中已描述了多種程序和比對算法。

NCBI基礎(chǔ)局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)可從幾個來源獲得，包括國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD)以及在互聯(lián)網(wǎng)上，用于與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。使用NCBI Blast 2.0將有缺口的blastp設(shè)置為默認參數(shù)可一般性表征任意SEQ ID NO：1至4的任意序列的抗原的變體。對于比較至少35個氨基酸的氨基酸序列，使用默認的BLOSUM62矩陣設(shè)為默認參數(shù)(空位存在罰分為11且每個殘基的空位罰分為1)以采用Blast 2序列功能。當(dāng)比對短肽(少于約35個氨基酸)時，利用Blast2序列功能進行比對，采用設(shè)置成默認參數(shù)的PAM30矩陣(缺口開放9，延長缺口1罰分)。Bethesda，Maryland的國家生物技術(shù)信息中心維護的網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上描述了用于在這樣短的窗口(例如15個氨基酸或更少)上確定序列同一性的方法。

或者，也可采用ClustalV比對算法使用來自DNAStar(Madison，WI，USA)的MegAlign軟件進行多序列的比對(Higgins et al.，1992，Comput.Appl.Biosci.8，189-91)。在上述比對中使用該軟件，并設(shè)置為以下默認參數(shù)：缺口罰分10，缺口長度罰分10。由于非常低的同源性，需要手動調(diào)整將SEQ ID NO：4加入比對。

通過在天然XCR1配體中的序列改變來獲得功能活性變體，其中，具有序列改變的XCR1配體保留未改變的XCR1配體的功能，例如具有與天然XCR1配體顯示的生物活性類似的生物活性，包括能夠與XCR1結(jié)合并介導(dǎo)步驟i)中(b)的蛋白質(zhì)的內(nèi)化。這樣的序列改變可包括但不限于：保守的替換、缺失、突變和插入。例如，如上所述可以評估功能活性變體的這些特性。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，應(yīng)用的XCL1的功能活性變體通過保守替換而來自于SEQ ID NO：1至4的任意序列之天然XCR1配體。保守替換是與其側(cè)鏈和化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的那些氨基酸家族中發(fā)生的替換。這樣的家族的實例是具有堿性側(cè)鏈、具有酸性側(cè)鏈、具有非極性脂肪族側(cè)鏈、具有非極性芳香側(cè)鏈、具有不帶電的極性側(cè)鏈、具有小側(cè)鏈、具有大側(cè)鏈等的氨基酸。在一個實施方案中，在肽中包含保守的替換。在另一個實施方案中，在肽中包含二個保守的替換或更少。在另一個實施方案中，在肽中包含三個保守的替換或更少。

保守的氨基酸替換的實例包括但不限于下面列出的那些：

根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的合適的單克隆抗XCR1抗體是例如在WO 2009/065561中公開的mAb 6F8或MARX10(Bachem等，2012，F(xiàn)ront Immunol 3，214)。

在一個優(yōu)選的實施方案中，可使用抗XCR1抗體或其功能活性片段作為與步驟i)中作為受體的XCR1結(jié)合的分子?？筙CR1抗體或其功能活性片段能夠與XCR1特異性結(jié)合。該抗體的功能活性片段的定義為類似于XCL1(見上文)的功能活性片段，即，功能活性片段(a)的特征在于通過一個或更多個氨基酸缺失(例如C-末端、N-末端和/或內(nèi)部缺失)來自于任何抗XCR1抗體，和(b)的特征在于與通過從其來源的抗XCR1抗體顯示的生物活性具有類似的生物活性，包括與XCL1結(jié)合的能力。天然抗體是免疫系統(tǒng)用來識別和中和外來物的蛋白質(zhì)。每個天然抗體具有兩個大的重鏈和兩個小的輕鏈，并且可以與不同抗原結(jié)合。本發(fā)明包括例如單克隆抗體和多克隆抗體、嵌合的、單鏈和人源化抗體以及Fab片段，F(xiàn)ab、Fab′、F(ab′)2′、Fv或Fab表達文庫的產(chǎn)物。還可修飾抗體或抗體組分以延長其生物半衰期或以其他方式使之更適合于靶向。可通過直接將XCR1或其片段注射到動物中或通過向動物(優(yōu)選非人)施用XCR1或其片段來獲得針對XCR1產(chǎn)生的抗體。然后這樣獲得的抗體將與XCR1結(jié)合。對于單克隆抗體的制備，可使用本領(lǐng)域中已知的提供通過連續(xù)的細胞系培養(yǎng)(例如，雜交瘤細胞系)產(chǎn)生抗體的任何技術(shù)。在WO 2009/065561中還詳細地描述了合適的單克隆抗體的生產(chǎn)。描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(U.S.專利4,946,778)可適用于產(chǎn)生XCR1的單鏈抗體。此外，也可使用轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生物(例如其他哺乳動物)來表達人源化的XCR1抗體。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選的實施方案中，

-(b)的包含抗原之蛋白質(zhì)與a)的分子處于融合蛋白中；和/或

-(b)的包含抗原之蛋白質(zhì)的抗原是免疫原、病原體來源的抗原或腫瘤抗原。

因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，(b)的包含抗原之蛋白質(zhì)與a)的分子處于融合蛋白中?？梢院铣蛇@樣的融合蛋白，例如合成地或重組地合成，優(yōu)選重組地合成。這樣的融合蛋白能夠高效地靶向到樹突細胞。例如，在實施例中成功地使用了抗體MARX10與OVA以及XCL1與OVA的融合蛋白。

免疫原是刺激免疫應(yīng)答的抗原。抗原是免疫系統(tǒng)中由T細胞上的特異性受體(T細胞受體)和B細胞上的特異性受體(B細胞受體)識別的物質(zhì)，通常為蛋白質(zhì)或多糖。這包括細菌、病毒和其他微生物的一部分(包衣、莢膜、細胞壁、鞭毛、纖毛和毒素)。在一般情況下，只有當(dāng)與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合時，脂質(zhì)和核酸才是抗原性的。非微生物的外源性(異己)抗原可包括花粉、蛋清(egg white)和來自移植的組織和器官或在輸注的血細胞表面上的蛋白質(zhì)。

抗原可被分類為內(nèi)源性的或外源性的。本發(fā)明的一個優(yōu)選抗原是外源性抗原。

在使用病原體來源的抗原的情況下，優(yōu)選病毒、細菌和/或真核寄生生蟲，所述藥物優(yōu)選用于針對此類病原體的感染誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答。

在使用腫瘤抗原的情況下，所述藥物優(yōu)選用于針對此類腫瘤誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答。

樹突細胞可通過MHC-I類分子呈遞外源性抗原，該過程稱為“交叉呈遞”。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，c)的第一佐劑和第二佐劑獨立地為支持Th-1介導(dǎo)的應(yīng)答的佐劑，優(yōu)選地其獨立地選自：合成的或重組的TLR配體，如聚ICLC和瑞喹莫德(R848)；Montanide，如ISAS1、ISA720；皂苷，如Quil-A、ISCOM、QS-21、AS02和AS01；聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)、脂多糖(LPS)和CpG寡脫氧核苷酸。

如果使用c)的第一佐劑和第二佐劑兩者，則它們可以彼此相同或彼此不同。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，所述再活化劑是加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑，其中所述細胞是血細胞，尤其是外周血單個核細胞(PBMC)，優(yōu)選與IL-2cx組合。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，T細胞是CD8⁺T細胞或CD4⁺T細胞，優(yōu)選CD8⁺T細胞。

特別地，CD8⁺T細胞的再活化對于獲得強烈的和增強的細胞毒性免疫應(yīng)答特別有利。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，時間段為72小時至9天，特別是5天至8天。

在一個優(yōu)選的實施方案中，只進行一次所述方法步驟i)和ii)。

然而，當(dāng)免疫系統(tǒng)再次穩(wěn)定下來后，可以用相同的遞送系統(tǒng)和相同再活化劑重復(fù)方法步驟。在如上所述根據(jù)本發(fā)明誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答后至少一個月，優(yōu)選之后至少兩個月后，通常是這種情況。

因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，在進行本發(fā)明的方法步驟后至少1、2或3個月后重復(fù)具有與根據(jù)步驟i)的相同的遞送系統(tǒng)和根據(jù)步驟ii)的相同的再活化劑的方法步驟。

或者，可用根據(jù)步驟i)的不同的遞送系統(tǒng)重復(fù)所述方法步驟，優(yōu)選其中所述不同的遞送系統(tǒng)包含不同的包含抗原之蛋白質(zhì)(b)和任選地與樹突細胞表面上的受體結(jié)合的不同的分子(a)。在這樣的一個實施方案中，沒有必要等到免疫系統(tǒng)再次穩(wěn)定。所以，因此可在用第一遞送系統(tǒng)第一次進行本發(fā)明的方法步驟后例如7天或14天用不同的遞送系統(tǒng)重復(fù)所述方法。在這樣的一個實施方案中，可在步驟ii)中使用相同或不同的再生劑。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物，其用于延長細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述細胞毒性免疫應(yīng)答針對包含抗原之蛋白質(zhì)，所述方法包括以下步驟：

i)向具有針對抗原活化的T細胞的患者施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而再活化的活化的T細胞，并任選地還施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)，

其中在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段施用步驟i)的再活化劑。

對于該實施方案，在適用的情況下，相同的一些優(yōu)選實施方案應(yīng)用于上述本發(fā)明應(yīng)用的藥物。

在一個實施方案中，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在另一個優(yōu)選實施方案中，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后48小時至14天的時間段施用。

例如，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天后施用。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后3天至9天，甚至更優(yōu)選為4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天后的時間段內(nèi)施用。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段施用僅一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后48小時至14天的時間段施用僅一次。

例如，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用僅一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在一個優(yōu)選的實施方案中，施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)與加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑的組合。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑之前、同時或之后施用。優(yōu)選地，所述加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑施用僅一次，并且所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。在這樣的一個實施方案中，復(fù)合的IL-2可在施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑之前、同時和/或之后施用。

對于所述組合，用于施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑的相同的一些優(yōu)選實施方案僅適用于施用所述細胞。

在一個實施方案中，在組合的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

在一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后48小時至14天的時間段施用。

例如，在組合的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后在3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

例如，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用僅一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段施用僅一次。

在組合的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。還可以在針對抗原活化T細胞后14天后進一步施用復(fù)合的IL-2；但是，在0小時至14天的時間段內(nèi)至少施用一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后48小至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。因此，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可每天或每兩天復(fù)施用。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一個實例中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在針對抗原活化T細胞后48小時、4天、6天和8天施用。

還可以在施用驟i)的遞送系統(tǒng)后的指定時間(例如，14天，優(yōu)選9或8天)后進一步施用復(fù)合的IL-2；但是，在指定的時間段至少施用一次。

因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，

(A)所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天，優(yōu)選48小時至14天的時間段內(nèi)，更優(yōu)選3天至9天，甚至更優(yōu)選4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用，甚至更優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后48小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次，更特別地在3天至9天的時間段一次施用僅一次，甚至更特別地在4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的時間段施用僅一次，以及

(B)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)在針對抗原活化T細胞后0小時至14天，更優(yōu)選48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段施用，最優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后0小時至14天，更優(yōu)選48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。

在組合的情況下，還可以在針對抗原活化T細胞后14天后進一步施用復(fù)合的IL-2；但是，在0小時至14天的時間段內(nèi)至少施用一次。

在又一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)反復(fù)施用。因此，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)優(yōu)選在針對抗原活化T細胞后48小時至9天，甚至更優(yōu)選3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的時間段內(nèi)施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可每天或每兩天施用。例如，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在針對抗原活化T細胞后48小時、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一個實例中，復(fù)合的白介素2(IL-2cx)可在針對抗原活化T細胞后0小時、48小時、4天、6天和8天施用。

還可以在針對抗原活化T細胞后的指定時間(例如，14天，優(yōu)選9或8天)后進一步施用復(fù)合的IL-2；但是，在指定的時間段內(nèi)至少施用一次。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，在組合的情況下，所述細胞和所述第二佐劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14小時，優(yōu)選48小時至14天的時間段內(nèi)施用僅一次。

雖然我們測試了將抗原靶向到XCR1⁺DC后ADAS的效果，人們可以從我們的結(jié)果得出這樣的結(jié)論，可用ADAS過程來擴增通過體內(nèi)T細胞受體觸發(fā)導(dǎo)致CD8⁺T細胞和/或CD4⁺T細胞之顯著的初始活化(“致敏”)或再活化任何系統(tǒng)。T細胞群也可在體外初始活化并隨后在體內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移，以使隨后ADAS可用于增強體內(nèi)的T細胞效應(yīng)器應(yīng)答。

因此，在一個實施方案中，可通過使用遞送系統(tǒng)進行如上所述在步驟i)應(yīng)用的藥物的方法獲得針對抗原活化的T細胞。

在另一個優(yōu)選實施方案中，可在體外獲得針對抗原活化的T細胞。為此，將優(yōu)選從待治療的患者獲得的T細胞與抗原或包含抗原之蛋白質(zhì)和APC共培養(yǎng)，并選擇抗原應(yīng)答性T細胞，例如，通過IFN-γ分泌測定并用生長因子擴增。或者，使用適當(dāng)?shù)乃木垠w或其類似物分選抗原特異性T細胞，在APC的存在下暴露于抗原并用生長因子擴增。

在應(yīng)用的藥物的一個優(yōu)選實施方案中，MHC-I呈遞細胞是血細胞，尤其是外周血單個核細胞(PBMC)。

MHC-I呈遞細胞優(yōu)選是從待治療的患者獲得的細胞。用于獲得這樣的細胞的方法是技術(shù)人員已知的。例如，可獲取血液，然后可分離PBMC細胞。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)施用、優(yōu)選反復(fù)施用，特別是施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更優(yōu)選其中所述復(fù)合的白介素2(IL-2cx)每天1或2天施用，和/或在5天至1個月，甚至更優(yōu)選1至2周的期間內(nèi)反復(fù)施用。

在應(yīng)用的藥物的另一優(yōu)選實施方案中，來自于包含抗原之蛋白質(zhì)的肽的長度為8、9或10個氨基酸和/或是由MHC-I，優(yōu)選由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更優(yōu)選由等位基因HLA-A2呈遞的肽。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，所述患者是哺乳動物，特別是人。

在應(yīng)用的藥物的另一個優(yōu)選實施方案中，誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法用于預(yù)防性治療或治療腫瘤和/或感染。

可提供應(yīng)用的藥物來保護免受感染(“預(yù)防性治療”)?；蛘撸@樣的藥物可用于治療目的。對病原體可能無法產(chǎn)生足夠Th1免疫應(yīng)答之受感染的個體可施用設(shè)計用于誘導(dǎo)和/或延長細胞之細胞毒性應(yīng)答的藥物，并因此將變得能夠抑制或根除感染(“治療”)。實例是瘧疾、結(jié)核病、利什曼原蟲、朊病毒病、正黏病毒以及特別是流感、甲型肝炎、乙型肝炎、慢性丙型肝炎、HIV和其他慢病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、絲狀病毒、黃病毒，并且特別是丙型肝炎病毒、乳頭瘤病毒、副黏病毒、多種呼吸道病毒等病毒，或在說明書中指明的任何其他感染。

所述疫苗也可用于保護健康個體免于發(fā)生具有已知抗原組分的腫瘤(例如黑素瘤、前列腺癌)(“預(yù)防性治療腫瘤”)?；蛘?，應(yīng)用的藥物可用于治療已發(fā)生腫瘤的患者。這樣的腫瘤的實例是人病毒誘導(dǎo)的腫瘤，特別是乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的腫瘤、HCV誘導(dǎo)的腫瘤、乙型肝炎病毒誘導(dǎo)的腫瘤和能在慢性感染后誘導(dǎo)腫瘤的其他病毒。此外，待治療的合適的腫瘤自發(fā)產(chǎn)生實體瘤(例如黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、腸的腺癌、肺癌)和白血病。

病原體或感染原是生物劑，尤其是對其宿主引起疾病或病癥的活微生物。根據(jù)本發(fā)明，病原體意指優(yōu)選病毒、細菌和/或真核寄生蟲。病原體來源的抗原是來自病原體的抗原。

抗原的交叉呈遞對于根除體內(nèi)的腫瘤也是至關(guān)重要。腫瘤細胞和腫瘤抗原必須被DC攝取、加工和呈遞以引發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答。由于根除大多數(shù)的腫瘤需要有效的細胞毒性的Th1T細胞應(yīng)答，所以腫瘤抗原的交叉呈遞是必不可少的。因此，對于有效的抗腫瘤應(yīng)答，交叉呈遞DC發(fā)揮突出的作用。如實施例5中所示，本發(fā)明應(yīng)用的藥物在腫瘤模型中顯示出出人意料的有益效果。

在一個實施方案中，應(yīng)用的藥物包含以下(優(yōu)選由以下組成)：(a)與樹突細胞表面上的受體結(jié)合的分子，和(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)。

在另一個實施方案中，應(yīng)用的藥物包含以下(優(yōu)選由以下組成)：(a)與樹突細胞表面上的受體結(jié)合的分子，(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)和(c)第一佐劑。

在又一個實施方案中，應(yīng)用的藥物包含以下(優(yōu)選由以下組成)：(A)(a)與樹突細胞表面上的受體結(jié)合的分子，(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)和(c)第一佐劑以及(B)(d)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、(e)加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑，或(f)(d)和(e)的組合，其中所述肽來自于如(a)中所限定的包含抗原之蛋白質(zhì)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥盒，其包含以下(優(yōu)選由其組成)：如上所定義的遞送系統(tǒng)和如上所定義的再活化劑。

在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥盒，其包含以下(優(yōu)選由以下組成)：(A)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)和(B)加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及延長針對包含抗原之蛋白質(zhì)的細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

ii)向具有針對抗原活化的T細胞的患者施用加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑，其中所述肽來自于包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使活化的T細胞再活化，并任選地還施用復(fù)合的白介素2(IL-2cx)，

其中步驟i)的再活化劑在針對抗原活化T細胞后0小時至14天的時間段內(nèi)施用。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細胞之細胞毒性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟：

i)向患者施用遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包含：(a)與樹突細胞表面上的受體結(jié)合的分子，(b)與(a)的分子結(jié)合的包含抗原之蛋白質(zhì)和(c)第一佐劑，其中在(a)的分子與所述受體結(jié)合后，(b)的蛋白質(zhì)被內(nèi)化并在樹突細胞中被加工，并且包含在所述蛋白質(zhì)中的所述抗原被呈遞到樹突細胞的表面上，從而活化患者中的T細胞；以及

ii)向患者施用再活化劑，所述再活化劑選自：(d)復(fù)合的白介素2(IL-2cx)、(e)加載肽的I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)呈遞細胞和第二佐劑，和(f)(d)和(e)的組合，其中所述肽來自于步驟

i)中所限定的包含抗原之蛋白質(zhì)，從而使步驟i)中活化的T細胞再活化，

其中步驟ii)的再活化劑在施用步驟i)的遞送系統(tǒng)后0小時至14天的時間段施用。

對于本發(fā)明的方法和本發(fā)明的藥盒，相同的一些實施方案應(yīng)用于本發(fā)明應(yīng)用的藥物。

附圖

圖1示出了將抗原靶向到XCR1⁺DC中后細胞毒活性的誘導(dǎo)。

圖2示出了通過誘導(dǎo)的細胞毒活性保護免受感染或免于接種癌細胞。

圖3示出了通過注射加載有抗原肽SIINFEKL(SEQ ID NO：11)的同基因淋巴細胞獲得的CD8⁺T細胞之細胞毒性的增強。

圖4示出了通過聯(lián)合應(yīng)用加載肽的細胞和復(fù)合的IL-2高度協(xié)同擴增細胞毒性CD8⁺T細胞。

圖5示出了抗原靶向和共同應(yīng)用加載肽的細胞和復(fù)合的IL-2在治療已建立的腫瘤中的協(xié)同效應(yīng)。

圖6示出了在使用多種模式的疫苗接種進行致敏后低頻率的細胞毒性CD8⁺T細胞可用ADAS強烈地擴增。(A)在第0天用200μg的可溶性非靶向卵白蛋白(OVA)或用5μg的mAb MARX10-OVA、DEC-205-OVA、33D1-OVA、MOPC21-OVA注射C57BL/6動物；在所有情況下，共同注射10μg的聚I：C作為佐劑。在第5天，獲取血樣并使用特異性四聚體通過流式細胞術(shù)確定SIINFEKL-特異性CD8⁺T細胞的頻率。(B)在第5天，用ADAS過程增強針對來自于OVA的肽SIINFEKL的免疫應(yīng)答(將10×10⁶個加載有SIINFEKL的同基因脾細胞與作為佐劑的50μg的聚I：C一起注射)。在第10天，將動物處死并使用四聚體在脾中測定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的頻率。(C)如(A)中所述對C57BL/6Batf3-KO動物進行免疫接種以及如(B)中所述進行ADAS處理，以及在第10天在脾中確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的頻率。

圖7(A)R9-SIINFEKL多肽不在外部與MHC-I溝結(jié)合：在37℃，5％的CO₂下，在RPMI 1640完全培養(yǎng)基中用1μM的SIINFEKL肽以5×10⁶個細胞/ml的密度將C57BL/6脾細胞孵育2小時，或用1μM的R9-SIINFEKL多肽以2×10⁶個細胞/ml的密度孵育4小時。將細胞洗滌兩次并用抗-SIINFEKL-H2K^bmAb(克隆25-D1.16)染色以確定肽加載到MHC-I溝的效率。此外，將細胞與多種譜系標(biāo)志物共染色來鑒定不同的脾細胞群并通過流式細胞術(shù)進行分析。(B)R9-SIINFEKL可用于將抗原運送到原代細胞的細胞質(zhì)區(qū)室，并因此使MHC-I加載衍生的肽：用多種不同濃度(1-30μM)的R9-SIINFEKL多肽以2×10⁶個細胞的密度如上將C57BL/6脾細胞孵育7小時。此后，將細胞洗滌兩次，用mAb 25D1.16染色以確定肽加載到MHC-I溝的效率，與譜系標(biāo)志物共染色，并通過流式細胞術(shù)進行分析。在30μM多肽時，觀察到顯著的細胞死亡(未示出)。(C)加載R9-SIINFEKL的原代細胞可用于進行ADAS：在第0天向C57BL/6小鼠i.v.注射10×10⁶個加載R9-SIINFEKL的(5μM，7小時)脾細胞，或注射10×10⁶個加載SIINFEKL的(2μM，2小時)脾細胞用于進行比較，或注射2μg的MARX10-OVA(全部具有10μg聚I：C)用于致敏，并在第5天確定CD8⁺T細胞的頻率和細胞毒性潛力(顆粒酶B、KLRG1，未示出)?；蛘?，用2μg的MARX10-OVA和10μg的聚I：C致敏C57BL/6小鼠并通過靜脈注射加載SIINFEKL的(2μM，2小時)脾細胞和50μg的聚I：C(陽性對照)在第5天進行ADAS。同時，用2μg的MARX10-OVA，或2μg的33D1-OVA，或2μg的1D3-OVA，或200μg的非靶向OVA(所有都與10μg的聚I：C一起)在第0天i.v.致敏C57BL/6小鼠，并通過i.v.注射加載R9-SIINFEKL的(5μM，7小時)同源系脾細胞和50μg的聚I：C進行ADAS。在第10天使用特異性四聚體通過流式細胞術(shù)確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的ADAS誘導(dǎo)的擴增。所有的CD8⁺T細胞顯示出指示細胞毒性(顆粒酶B、KLRG1，未示出)的標(biāo)志物。

圖8抗原的施用可與致敏步驟中佐劑的應(yīng)用分開：(A)在第0天用混合在一份溶液中的2μg的MARX10-OVA以及作為佐劑的10μg聚I：Ci.v.注射C57BL/6小鼠?；蛘撸诘?1天用10μg的聚I：C和在第0天用2μg的MARX10-OVA注射小鼠。或者，在第0天用2μg的MARX10-OVA和在第1天用10μg的聚I：C注射小鼠。在每個實驗組中，在第5天獲取血液樣本并使用特異性四聚體通過流式細胞術(shù)確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的頻率。(B)使(A)中描述的小鼠進行ADAS擴增過程(i.v.注射與50μg的聚I：C一起的外部加載有SIINFEKL的脾細胞)并通過流式細胞術(shù)確定脾中SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的頻率?？蓪⒖乖氖┯门c在ADAS過程中佐劑的應(yīng)用分開。

圖9通過將ADAS和施用復(fù)合的IL-15相組合高度協(xié)同擴增細胞毒性CD8⁺T細胞：在第0天用2μg的MARX10-OVA和10μg的聚I：C致敏C57BL/6動物并使用特異性四聚體和流式細胞術(shù)在第5天(致敏)分析脾中SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的總數(shù)。在第5天使一些致敏的動物僅進行ADAS(注射10×10⁶個加載SIINFEKL的脾細胞以及50μg聚I：C)，一些接收ADAS并在第6、7和8天i.p.注射IL-2cx(如在實施例4和5中所述)，另一些小鼠在第5天接受ADAS并在第6、7和8天i.p.注射復(fù)合的IL-15(IL-15cx)。在所有的ADAS處理組中，在第9天確定SIINFEKL特異性細胞毒性CD8⁺T細胞的總數(shù)。通過在37℃下將2μg的IL-15cx(Peprotech#210-15)與9.3μg的sIL 15R-Fc(R&D，#551-MR-100)孵育20分鐘產(chǎn)生用于1只小鼠的IL-15的劑量，添加PBS至500μl，并將該溶液i.p.注射。

圖10 ADAS可以抗原特異性方式擴增靜息的記憶CD8⁺T細胞：在第-1天向C57BL/6小鼠過繼轉(zhuǎn)移2,000或10,000個OT-I T細胞并在第0天用MARX10-OVA和10μg的聚I：C致敏。在第5天在所有動物中進行ADAS(注射10×10⁶加載SIINFEKL的脾細胞以及50μg聚I：C)，并在第10和40天分析動物(A)OT-I T細胞和(B)內(nèi)源性Thy1.1-陰性SIIFEKL-特異性CD8⁺T細胞的頻率。另一組小鼠在第69天再次進行ADAS并在第74天分析(A)OT-I T細胞和(B)內(nèi)源性SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的頻率。

圖11通過ADAS體內(nèi)擴增體外活化的抗原特異性CD8⁺T細胞：從OT-I小鼠中分離脾細胞，并在完全培養(yǎng)基中用1.4nM的SIINFEKL肽培養(yǎng)3天。此后，用PBS洗滌細胞并將5×10⁵個OT-I T細胞(如通過流式細胞術(shù)確定的)過繼轉(zhuǎn)移到初始C57BL/6小鼠中并在轉(zhuǎn)移后不同時間點用ADAS處理動物。示出的是在過繼轉(zhuǎn)移后第5天進行ADAS時，對轉(zhuǎn)移的CD8⁺T細胞的頻率的影響。在第9天使用流式細胞術(shù)確定血液中所有CD8⁺T細胞中過繼轉(zhuǎn)移的CD8⁺T細胞的比例。在這些實驗中，在血液中的頻率對應(yīng)于在動物的脾中的頻率。

實施例

實施例1

在抗原靶向到XCR1⁺DC中后細胞毒活性的誘導(dǎo)(圖1)

將模型抗原OVA重組融合至XCR1特異性mAb MARX10(Bachem等，2012)或重組融合至與XCR1受體特異性結(jié)合的趨化因子配體XCL1(Hartung等，2015)。當(dāng)將MARX10-OVA或XCL1-OVA以低水平i.v.注射到初始C57BL/6小鼠中時，所述抗原被靶向到XCR1⁺DC中。如果在佐劑(3μg LPS、CpG或10μg的聚I：C)存在的情況下發(fā)生這種抗原致敏，則會誘導(dǎo)顯著的細胞毒活性(示出了用聚I：C作為佐劑的數(shù)據(jù))。通過在第6天用靶細胞(脾淋巴細胞)i.v.注射已致敏的動物來檢測細胞毒活性，所述靶細胞先前在體外加載了SIINFEKL(SEQ ID NO：11)，一種來自于OVA的肽。在加載后用熒光團CFSE將靶細胞標(biāo)記至較高程度，同時用CFSE將非加載的對照脾淋巴細胞標(biāo)記至較低程度。如圖1A中所示，用OVA+佐劑致敏動物，導(dǎo)致消除幾乎所有加載SIINFEKL的靶細胞的細胞毒活性。圖1B示出了用靶向至XCR1⁺DC的不同量的抗原獲得的劑量響應(yīng)曲線。在使用MARX10-SIINFEKL或XCL1-SIINFEKL將免疫原性肽靶向到XCR1⁺DC中后獲得了相同的結(jié)果。

實施例2

通過誘導(dǎo)的細胞毒活性保護免受感染或免于接種癌細胞(圖2)

C57BL/6小鼠用MARX10-OVA(含有2μg的OVA)和佐劑(10μg的聚I：C)致敏或不進行處理。5天后，用1×10⁶CFU(=5×LD₅₀)的單核細胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)菌株感染所有小鼠，其中已將肽序列SIINFEKL(SEQ ID NO：11)重組工程化到該菌株中(Foulds等，2002，J.Immunol.168，1528-1532)。雖然所有未處理的小鼠在3至4天內(nèi)死亡，但是通過抗原致敏誘導(dǎo)的細胞毒性水平充分地保護所有動物免受疾病(圖2A)。

用MARX10-OVA或XCL1-OVA(各自含有0.16μg的OVA)和佐劑(3μgLPS)i.v.致敏C57BL/6小鼠，對照動物用PBS注射。7天后，用5×10⁵個EG.7細胞(一種工程化以表達OVA的侵襲性同基因腫瘤系)注射所有的動物(Moore等，1988)。而PBS處理的動物在14天后均顯示出強的腫瘤生長，所有經(jīng)免疫接種的動物在注射部位或其他地方均沒有任何腫瘤組織，這表明誘導(dǎo)的細胞毒性水平保護動物免于腫瘤接種(圖2B)。

實施例3

通過注射加載有抗原肽SIINFEKL(SEQ ID NO：11)的同基因淋巴細胞獲得CD8⁺T細胞之細胞毒性的增強(圖3)

在第-20、-15、-10、-7、-5或-3天，C57BL/6小鼠用MARX10-OVA(含有2μg OVA)和佐劑(聚I、CpG或LPS，示出的是使用10μg聚I：C的數(shù)據(jù))致敏。在第0天，用注射前在體外加載有SIINFEKL(SEQ ID NO：11)的10×10⁶個脾細胞(圖3A)i.v.注射已致敏的動物(“抗原依賴性擴增系統(tǒng)”，ADAS)。與加載肽的細胞一起注射佐劑(多種量的LPS或聚I：C)，示出的是使用50μg聚I：C的數(shù)據(jù)。第10天處死動物，并使用SIINFEKL特異性四聚體和流式細胞術(shù)在脾中確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的總數(shù)(圖3A)。結(jié)果表明，用于擴增抗原特異性CD8⁺T細胞的系統(tǒng)在初始抗原刺激后5至9天的窄時間段內(nèi)是有效的(圖3A)。

C57BL/6小鼠用MARX10-OVA(含有2μg的OVA)和佐劑(10μg的聚I：C)致敏。5天后，將在注射前在體外加載有SIINFEKL(SEQ ID NO：11)的10×10⁶個脾淋巴細胞或純化的T細胞、樹突細胞或B細胞i.v.注射到已致敏的動物中。與加載肽的細胞一起注射佐劑(50μg聚I：C)。在用MARX10-OVA致敏后第10天，將動物處死并使用SIINFEKL特異性四聚體和流式細胞術(shù)在脾中確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的總數(shù)。結(jié)果表明，可以用在細胞表面上表達MHC-I的多個細胞群實現(xiàn)細胞毒性CD8⁺T細胞應(yīng)答的增強。擴增的細胞表達高水平的效應(yīng)分子(TNF-α、IFN-γ、顆粒酶B)。

實施例4

通過共同應(yīng)用加載肽的細胞和復(fù)合的IL-2高度協(xié)同地擴增細胞毒性CD8⁺T細胞(圖4)

C57BL/6小鼠用MARX10-OVA(含有2μg OVA)和佐劑(10μg聚I：C)致敏。在致敏后的第1、2、3天，用通過在4℃下過夜孵育IL-2(2μg)和抗-IL-2mAb JES6-5H4(10μg，Sander等1993)獲得的復(fù)合的IL-2(IL-2cx)注射一組已致敏的小鼠并在第6天處死小鼠(“致敏的+IL-2cx”)。在第5天用加載SIINFEKL的脾細胞(10×10⁶)和佐劑(50μg聚I：C)注射另一組小鼠并在第10天處死(“致敏⁺ADAS”)。另一組小鼠在第5天用加載SIINFEKL的脾細胞(10×10⁶)和佐劑(50μg的聚I：C)注射以及在第6、7、8和9天用IL-2cx注射，并在第10天處死(“致敏+ADAS+IL-2cx”)。在每個實驗結(jié)束時，使用SIINFEKL特異性四聚體和流式細胞術(shù)在脾中確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的總數(shù)。實驗確定了ADAS和IL-2cx在抗原特異性細胞毒性CD8⁺T細胞的擴增中的高度協(xié)同作用。

實施例5

抗原靶向和共同應(yīng)用加載肽的細胞和復(fù)合的IL-2在治療已建立的腫瘤中的協(xié)同作用(圖5)

C57BL/6小鼠經(jīng)s.c.注射5×10⁵個EG.7細胞(一種工程化以表達OVA的侵襲性同基因腫瘤系(Moore等，1988)。在腫瘤注射后第6天，用MARX10-OVA(含有2μg OVA)和佐劑(10μg聚I：C)致敏小鼠，一組不進行處理。致敏后6天(第11天)，用加載SIINFEKL的脾細胞(10×10⁶)和佐劑(50μg的聚I：C)注射一組小鼠(“致敏+ADAS”)。在第12、13、14、15、16、17、18、19、21和23天僅用IL-2cx注射另一組已致敏的小鼠(“致敏+IL-2cx”)。在第11天用加載SIINFEKL的脾細胞(10×10⁶)和佐劑(50μg聚I：C)注射另一組致敏的小鼠，以及在第12、13、14、15、16、17、18、19、21和23天用IL-2cx注射(“致敏+ADAS+IL-2cx”)。第25天處死全部小鼠(一些對照動物必須更早處死，原因是其腫瘤直徑變得＞1cm)。所有數(shù)據(jù)代表每個處理組(n=6)中腫瘤尺寸的平均值(以mm²計)。結(jié)果表明用靶向的OVA單獨致敏注射腫瘤的小鼠并沒有效果。相反，單獨的IL-2cx或ADAS在約7至10天內(nèi)致敏的小鼠中可有效地強烈減小腫瘤塊，但此后就不能阻止腫瘤的生長。當(dāng)向致敏的動物應(yīng)用ADAS和IL-2cx的組合時，強烈減小了腫瘤塊并且完全控制腫瘤直到實驗結(jié)束(一些小鼠已經(jīng)完全沒有腫瘤組織)。

實施例6

多種免疫接種模式導(dǎo)致低頻率的致敏的抗原特異性CD8⁺T細胞。借助于ADAS過程這些通常可強烈地擴增并分化為殺傷CD8⁺T細胞。

Mab MARX10(Bachem等，F(xiàn)ront Immunol 2012，EP2641915A1)識別XCR1(XCR1⁺DC的譜系標(biāo)志物)，Mab DEC-205(NLDC-145，Kraal等，1986，從Biolegend獲得)識別在鼠XCR1⁺DC上表達的CD205分子，mAb 33D1(Nussenzweig等，1982，從ATCC獲得)識別SIRPα⁺DC上的DCIR2分子，mAb 1D3識別B細胞上的CD19(Krop等1996，從ATCC獲得)，mAb MOPC-21(Potter等，J Natl Cancer Inst 1961，從Biolegend獲得)不識別小鼠中的任何分子，因此被用作IgG1同種型對照。XCL1是XCR1的趨化因子配體并且可以用于在小鼠中和人中將抗原靶向至XCR1+DC(Hartung等，2015)。

通過質(zhì)譜鑒定mAb DEC-205、33D1、1D3、MOPC-21的重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合區(qū)并通過標(biāo)準重組技術(shù)將其接枝到mAb DEC-205的主鏈上，如對于mAb MARX10先前描述的(Hartung等，2015)。先前已對該主鏈進行修飾使其與Fc受體結(jié)合最小化。然后以這樣的方式修飾所有構(gòu)建體使OVA適于每個抗體的C末端融合蛋白，如先前對于mAb MARX10所描述的(Hartung等，2015)。如前所述生成XCL1-OVA(Hartung等，2015)。

在第0天用高量(200μg)的可溶性非靶向的OVA，或用5μg的mAb MARX10-OVA、DEC-205-OVA、33D1-OVA、MOPC21-OVA注射C57BL/6動物；在所有情況下，共同注射10μg聚I：C作為佐劑。在第5天，獲取血樣并使用加載有SIINFEKL且能夠與SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞結(jié)合的H-2K^b四聚體通過流式細胞術(shù)確定OVA特異性CD8⁺T細胞的頻率。如圖6A所示，所有的抗原應(yīng)用模式(非靶向或靶向到XCR1⁺DC、SIRPα⁺DC或B細胞)誘導(dǎo)SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的初始擴增(“致敏”)，導(dǎo)致在血液中所有CD8⁺T細胞中約2％至3％的頻率。在第5天，通過ADAS過程擴增針對來自于OVA的肽SIINFEKL的免疫應(yīng)答(注射10×10⁶個加載肽SIINFEKL的同基因脾細胞以及50μg聚I：C)。在第10天，將動物處死，并在脾中確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的頻率。此外，確定表示細胞毒性的幾種標(biāo)志物(KLRG1、穿孔蛋白、顆粒酶B，數(shù)據(jù)未顯示)。在所有的情況下，ADAS過程將SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的初始頻率提高約10倍(圖6B)并誘導(dǎo)指示細胞毒性T細胞的表型(未示出)。

同時，用非靶向的或靶向的OVA試劑致敏C57BL/6背景下的Batf3-KO動物(缺乏XCR1⁺DC的動物，Hildner等，2008)，如上。在第5天通過ADAS過程處理Batf3-KO動物，如上。在第10天，將所有動物處死并在脾中測定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的頻率。而致敏后接著進行ADAS在所有的C57BL/6動物中得到高頻率的SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞(圖6B)，在ADAS后在任何Batf3-KO動物中均沒有觀察到顯著的SIINFEKL特異性應(yīng)答(圖6C)。

從這些實驗可以得出若干結(jié)論。當(dāng)與Th1佐劑一起應(yīng)用時，使用高水平的非靶向蛋白進行免疫接種將導(dǎo)致初始頻率的抗原特異性細胞毒性CD8+T細胞，如我們和其他人先前所表明的(Hartung等，2015年)。將抗原靶向到DC中使這種初次免疫接種更加有效得多，因為只需要少量的抗原來達到相同的效果(Hartung等，2015，Caminschi等，2012)。出人意料地，甚至是將抗原靶向B細胞(在這種情況下通過CD19，一種在B細胞上特異性表達的表面分子)與將抗原靶向DC同樣有效。這種效果既可通過抗原從B細胞轉(zhuǎn)移到DC(Allan等，2006)，或通過靶向抗體與DC上Fc受體的“非特異性”結(jié)合來解釋。當(dāng)使用MOPC-21(一種不識別小鼠免疫系統(tǒng)中任何抗原的同種型對照抗體)，后者的作用最有可能是致敏效率的原因。這些結(jié)果與先前的結(jié)果完全一致，其中通過表面受體Siglec-1將抗原靶向邊緣的嗜金屬巨噬細胞(metallophilic macrophage)也導(dǎo)致產(chǎn)生低頻率的細胞毒性CD8⁺T細胞，但在Batf3-KO動物中不是如此(Backer等，2010)。我們用BAF3-KO動物的實驗與一般的假設(shè)一致，即初始T細胞的致敏必須通過DC發(fā)生。特別地，這些實驗表明這種最初的CD8⁺T細胞致敏需要XCR1⁺DC。因此，將抗原靶向到XCR1⁺DC中有望成為靶向蛋白抗原、編碼抗原的核酸，或者編碼抗原的病毒系統(tǒng)以實現(xiàn)良好的初級CD8⁺T細胞應(yīng)答(“致敏”)的最有效方式。

總之，這些結(jié)果表明，與應(yīng)用非靶向抗原相比，使用抗體或使用受體配體(例如，XCL1-OVA)將抗原靶向到常規(guī)DC、皮膚DC或其他DC，例如單核細胞來源的DC、pDC、巨噬細胞或其他細胞對于誘導(dǎo)初始的細胞毒性應(yīng)答更高效?？梢灶A(yù)期用蛋白質(zhì)抗原進行所有類型的致敏(例如但不限于：通過采用脂質(zhì)體、納米顆粒以及其他系統(tǒng)作為抗原載體(Saroja等，2011)將得到類似的結(jié)果，只要在Th1細胞佐劑的情況下應(yīng)用該蛋白即可。在文獻中也很好地證明可通過非蛋白免疫接種誘導(dǎo)類似低初始頻率的細胞毒性CD8⁺T細胞，例如但不限于：使用多種系統(tǒng)(靶向的或非靶向的)向身體應(yīng)用或注射DNA或基于DNA的疫苗，或RNA或基于RNA的疫苗(Saroja等，2011，Koup等，2011，Ulmer等，2012，Kramps等，2013)。使用病毒系統(tǒng)或減毒的病毒可實現(xiàn)相似的CD8⁺T細胞的致敏(Draper等，2010)。注射或應(yīng)用基于RNA或DNA的制劑或非復(fù)制型病毒系統(tǒng)或減毒的病毒并不一定需要額外的Th1佐劑，因為這些藥劑在多數(shù)情況下是自身佐劑的；即，這些藥劑本身還代表Th1佐劑。

很顯然，在基本上將疫苗遞送到體內(nèi)的所有方式中，初始CD8⁺細胞毒性應(yīng)答將相對較弱。在許多情況下這樣的弱應(yīng)答不足以預(yù)防感染、治療感染或根除癌性組織。因此，需要可強烈增強初始致敏的系統(tǒng)。

在我們的實驗中，我們表明在其中初始的CD8⁺細胞毒性應(yīng)答(致敏)不足以清除感染或腫瘤的所有情況下，可使用ADAS過程進行擴增。

此外，具有腫瘤組織或死細胞的患者的免疫接種將導(dǎo)致致敏CD8⁺T細胞區(qū)室(de Gruijl等，2008)，并因此將使這些細胞易受ADAS過程。

或者，可通過從患者中分離先前存在的腫瘤或病原體特異性CD8⁺T細胞，將其在體外活化并擴增，并注回到患者中來實現(xiàn)初級CD8⁺T細胞活化。這些過繼轉(zhuǎn)移的(再注射的)CD8⁺T細胞將被再活化，并通過ADAS過程進一步擴增并分化為細胞毒性T細胞。

在所有的情況下，可通過隨后注射復(fù)合的IL-2(實施例4、5)或復(fù)合的IL-15(參見實施例9)進一步協(xié)同增強ADAS擴增。

在我們的實驗中，我們使用聚I：C作為佐劑。使用所有類型的Th1佐劑(例如但不限于：聚I：C、RIG-I激動劑和TLR8激動劑)可以實現(xiàn)類似的結(jié)果。

實施例7

ADAS將抗原遞送到原代細胞的細胞質(zhì)區(qū)室中導(dǎo)致MHC-I有效地加載來自于抗原的肽

我們已經(jīng)證明，多種原代細胞(例如B細胞、T細胞、DC、脾細胞)的MHC-I外部加載來自于抗原的肽(例如，SIINFEKL)可用于ADAS。我們預(yù)期在同樣的方法也可用于將全蛋白質(zhì)引入原代細胞或在細胞內(nèi)表達蛋白質(zhì)的多種方法，如上所述。

為了進一步舉例說明這個觀念，我們已經(jīng)使用作為細胞穿透肽(cell-penetrating peptide，CPP，Milletti 2012，Bechara等，2013)的一段9個精氨酸殘基來將包含抗原的白質(zhì)(多肽)運送到原代細胞中。這37aa多肽(稱為R9-SIINFEKL)的完整序列是

RRRRRRRRRGYPYDVPDYALEQLESIINFEKLTEWTS(SEQ ID No.13)。

在MHC-I環(huán)境中下，在衍生的抗原肽(SIINFEKL)被呈遞到細胞表面上之前，R9-SIINFNEKL需要蛋白酶體的細胞內(nèi)加工。因此，該系統(tǒng)可作為將全蛋白引入到原代細胞的模型，所述全蛋白隨后被蛋白酶體加工成片段，其中一些片段在MHC-I環(huán)境中下隨后被呈遞細胞表面上。

該多肽不可直接在外部結(jié)合到MHC-I的溝中。為了證明這一點，在37℃下在完全培養(yǎng)基中，我們用1μM的多肽R9-SIINFEKL孵育C57BL/6小鼠的脾細胞4小時。同時，用可在外部直接于MHC-I結(jié)合的1μM的肽SIINFEKL將脾細胞孵育僅2小時。孵育后，洗滌細胞并使用在MHC-I H2K^b的情況下識別SIINFEKL的mAb 25D1.16通過流式細胞術(shù)進行分析(Porgador等，1997)。同時用SIINFEKL孵育脾細胞，在巨噬細胞、B細胞、T細胞、PDC和DC中得到強信號，如所預(yù)期的(因為SIINFEKL在外部與MHC-I結(jié)合)，用R9-SIINFEKL多肽沒有得到任何信號(圖7A)。該實驗直接證明了R9多肽不可直接裝入MHC-I溝中并充當(dāng)抗原。

在接下來的步驟中，以濃度提高的R9-SIINFEKL多肽(1-30μM)孵育脾細胞7小時。孵育和洗滌后，通過用mAb 25-D1.16染色確定加載SIINFEKL的MHC-I的量。如圖7B所示，所有經(jīng)檢測的原代脾細胞表現(xiàn)出劑量依賴性信號。雖然無法直接測量，但可以假設(shè)MHC-II也以類似的方式加載。該實驗表明，多肽一旦由CPP運送到原代細胞的細胞質(zhì)區(qū)室中后，將被加工并在MHC-I(和MHC-II)的情況下呈遞。

從該實驗中，可以推斷出同樣的過程也適用于全蛋白質(zhì)，其在MHC-I(和MHC-II)的情況下被呈遞之前也需要被加工。事實上，用全OVA已經(jīng)證明了MHC-I與SIINFEKL類似的加載，使用標(biāo)準重組技術(shù)以使一段9個精氨酸殘基N-末融合到所述全OVA上。在該實驗中，OVA被正確地加工并在MHC-I環(huán)境中下呈遞，如通過用mAb 25D1.16染色確定的(Mitsui等，2006)。因此，與文獻一致的我們的實驗表明利用CPP將未加工的多肽或蛋白質(zhì)引入到細胞中將有效地加載該細胞的MHC-I(和MHC-II)。

從該實驗中可以推斷出，任何類型的原代細胞內(nèi)部加載蛋白質(zhì)和未加工的肽將導(dǎo)致來自該材料的肽的有效MHC-I呈遞。

原代細胞這樣的內(nèi)部加載可類似地使用將肽或蛋白質(zhì)引入到細胞中其他方法實現(xiàn)，例如但不限于：電穿孔或通過多種方法(例如但不限于：轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、注射、彈道注射(ballistic injection)、感染)引入編碼肽和蛋白質(zhì)的核酸。

然后，我們測試了使用R9-SIINFEKL內(nèi)部加載的原代細胞的生物效價。為此，用5μM的R9-SIINFEKL將來自C57BL/6小鼠的脾細胞孵育7小時并洗滌。然后，在第0天將其i.v.注射到初始C57BL/6動物中并與i.v.注射加載SIINFEKL的脾細胞或i.v.注射MARX10-OVA進行比較。所有的制備物都與作為佐劑的聚I：C一起應(yīng)用。正如圖7C中可以看出，抗原遞送的所有方法誘導(dǎo)低頻率的SIINFEKL特異性細胞毒性CD8⁺T細胞，如用特異性四聚體和通過表型分析(表達顆粒酶B、KLRG1)評估的，MARX10-OVA是抗原遞送的最高效方法。

在下一步驟中，評估了加載R9-SIINFEKL的脾細胞在ADAS過程中其的能力。在該實驗中，用加載SIINFEKL的脾細胞由MARX10-OVA和ADAS致敏作為陽性對照，并產(chǎn)生約20％的SIINFEKL特異性細胞毒性CD8⁺T細胞(圖7C)。在用MARX10-OVA、33D1-OVA、1D3-OVA或高量的非靶向OVA致敏后，加載R9-SIINFEKL的脾細胞在ADAS過程中與加載SIIFEKL的脾細胞同樣有效(也比較圖7A)。該實驗表明，原代細胞任何類型的抗原有效的內(nèi)部加載對于ADAS都將是高效的。這種加載可用未加工的多肽、全蛋白質(zhì)或與編碼的肽或蛋白質(zhì)的核酸，或使用感染原或重組修飾以編碼期望多肽或蛋白質(zhì)的病毒或細菌載體系統(tǒng)進行。

實施例8

在致敏步驟和在ADAS過程二者中Th1佐劑的應(yīng)用可在時間上與抗原的應(yīng)用分開

目前一般認為，抗原必須與抗原一起應(yīng)用來實現(xiàn)宿主的免疫接種(Cohn等，2014)。因此，抗原通常與佐劑混合并一起應(yīng)用。目前一般認為，理想地，佐劑甚至應(yīng)與抗原物理上連接以達到最佳結(jié)果。因此，我們非常出人意料地認識到，在致敏和ADAS過程中抗原施用與佐劑遞送的分開產(chǎn)生良好的且甚至更好的免疫應(yīng)答。

在第0天C57BL/6小鼠靜脈內(nèi)注射混合在一份溶液中的2μgMARX10-OVA與作為佐劑的10μg聚I：C?；蛘?，小鼠在第-1天注射10μg的聚I：C并在第0天注射2μg MARX10-OVA?；蛘?，小鼠在第0天注射2μg MARX10-OVA并在第1天注射10μg的聚I：C。在每個實驗組中，在第5天獲取血液樣本并通過流式細胞術(shù)確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的頻率。如圖8A中可以看出的，在第0天抗原和佐劑的聯(lián)合施用產(chǎn)生所有CD8⁺T細胞的約2％的致敏頻率。相反，在施用抗原前一天施用佐劑則無效。非常出人意料的是，在第0天施用抗原且在第1天施用佐劑最有效，在第5天產(chǎn)生所有CD8⁺T細胞的約4％的頻率。

當(dāng)用ADAS過程(i.v.注射外部加載有SIINFEKL的脾細胞和50μg的聚I：C)處理所有的實驗組時，聯(lián)合應(yīng)用抗原和佐劑的組有約15％的SIINFEKL特異性細胞毒性CD8⁺T細胞。顯然，其中在抗原后1天應(yīng)用佐劑的組獲得最好的結(jié)果(約30％的SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞)。有趣的是，即使在抗原之前1天應(yīng)用聚I：C的組中，也只有低水平的SIINFEKL特異性T細胞(約5％)，這表明甚至在這一組中也實現(xiàn)了一定的致敏(其然后通過ADAS過程中實現(xiàn)的擴增變得可測量)。

這些實驗清楚地表明，在致敏的過程中可在時間上分開應(yīng)用抗原和佐劑。事實上，結(jié)果表明在施用抗原后一段時間應(yīng)用佐劑相對于組分的聯(lián)合應(yīng)用是有利的。我們的研究結(jié)果表明，甚至是在抗原的應(yīng)用后數(shù)天應(yīng)用佐劑也是有效的。在人中不能確定確切的時間段，需要估計為1至2天，可能多至3天。

實施例9

通過將ADAS與施用復(fù)合的IL-15相組合高度協(xié)同地擴增細胞毒性CD8⁺T細胞

我們已經(jīng)證明，在第0天用MARX10-OVA(2μg)和聚I：C(10μg)致敏后，在第1、2、和3天注射復(fù)合的IL-2(IL-2cx=與阻斷IL-2與其高親和力受體CD25結(jié)合的抗體復(fù)合的鼠IL-2)，在第6天并沒有顯著提高致敏的CD8⁺T細胞的數(shù)目。然而，當(dāng)在第0天用MARX10-OVA(2μg)和聚I：C(10μg)致敏動物并在第5天進行ADAS(與50μg的聚I：C一起注射加載有SIINFEKL的10×10⁶個脾細胞)時，在6、7、8和9天注射IL-2cx顯著地提高了第10天在脾中SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的數(shù)目(實施例4和圖4)。

不進行ADAS，在第6、7、8和9天注射IL-2cx基本上不提高脾中SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的數(shù)目(未示出)，但在降低腫瘤負荷方面有效。顯然，ADAS過程以這樣的方式再活化了致敏的CD8⁺T細胞，即，使其對IL-2cx的作用高度敏感，并且這導(dǎo)致細胞毒性CD8⁺T細胞的強烈擴增。然而，導(dǎo)致這種對IL-2cx敏感性高度增強的確切分子機制仍未確定。

C57BL/6動物在第0天用2μg MARX10-OVA和10μg聚I：C致敏并在第5天使其進行ADAS(注射10×10⁶個加載SIINFEKL的脾細胞和50μg聚I：C)。如前所述中，ADAS過程將SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的水平從第5天約200,000提高至ADAS后第10天的約2×10⁶細胞(圖9)。然后在第6、7和8天用復(fù)合的IL-15(IL-15cx)或IL-2cx(用于比較用)注射經(jīng)ADAS處理的動物(如上所述)。在第9天，使用流式細胞術(shù)在脾中確定SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的總數(shù)。如圖9中可以看出的，在ADAS過程后強烈擴增SIINFEKL特異性CD8⁺T細胞的數(shù)目方面，反復(fù)注射IL-15cx與反復(fù)注射IL-2cx類似地有效。可將IL-15cx(如IL-2cx)i.v.、s.c.、i.p.注射或注射到腫瘤中來達到這種效果。IL-15cx的注射也提高顆粒酶B的細胞水平和KLRG1的表達，表明提高的細胞毒性(未示出)。通過在37℃下將2μg的IL 15(Peprotech#210-15)與9.3μg的sIL-15R-Fc(R&D，#551-MR-100)孵育20分鐘產(chǎn)生1只小鼠的IL-15cx劑量，添加PBS至500μl并i.p.注射溶液。

出人意料地，因此該實驗揭示IL-15cx與IL-2cx的作用類似，可強烈提高ADAS-再活化的抗原特異性CD8⁺T細胞的水平。從該實驗可以推斷，其中注射IL-2cx對細胞毒性免疫應(yīng)答的增強有益的所有情況下(如上所述)，IL-15cx也將是有效的。

實施例10

ADAS過程可用于以抗原特異性的方式再活化和擴增記憶CD8⁺T細胞

對于在第0天用2μg MARX10-OVA和10μg聚I：C致敏的初始動物，我們可證明在第3天進行ADAS對于擴增應(yīng)答相當(dāng)無效，但在此后變得有效且至少直到第20天仍一定程度地繼續(xù)有效(實施例3和圖3)，并且在小鼠中在第4天至第9天最有效。

在這些實驗中，ADAS用于擴增新活化的初始抗原特異性CD8⁺T細胞。ADAS僅在CD8⁺T細胞初始活化后一定時間窗口內(nèi)發(fā)揮最佳作用的事實表明，這些T細胞必須處于特定的活化階段以便對ADAS擴增敏感。

因此，我們想知道對靜息記憶CD8⁺T細胞是否也可進行ADAS，其與新活化的CD8⁺T細胞相比具有明顯不同的活化狀態(tài)。為此，在第-1天用2,000或10,000的OT-I CD8⁺T細胞(其具有在H-2K^b的情況下呈遞的SIINFEKL特異性的T細胞受體)過繼轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠。這些轉(zhuǎn)移的OT-I T細胞帶有遺傳標(biāo)志物Thy1.1(CD90.1)，使其有可能與內(nèi)源性T細胞區(qū)分開(比較Dorner等，2009)。在第0天，用MARX10-OVA與10μg聚I：C一起致敏動物。在第5天進行ADAS(與50μg的聚I：C一起注射10×10⁶個加載SIINFEKL的脾細胞)，導(dǎo)致在過繼轉(zhuǎn)移的兩組動物中在第10天脾中所有CD8⁺T細胞的30％頻率的OT-I T細胞(圖10A)。在第40天分析了來自相同實驗組的動物，如所預(yù)期的，其OT-I CD8⁺T細胞的頻率已經(jīng)下降到1％至2％(圖10A)。在第69天，進行另一個ADAS擴增(與50μg的聚I：C一起注射10×10⁶個加載有SIINFEKL脾細胞)并在5天后(第74天)確定脾中OT-I T細胞的頻率。通過ADAS擴增，OT-I T細胞的頻率再次上升到脾中所有CD8⁺T細胞的30％-60％。

在用OT-I T細胞過繼轉(zhuǎn)移的所有動物中，我們還分析了內(nèi)源性CD8⁺T細胞的應(yīng)答，因為對于Thy 1.1標(biāo)志物，這些可被鑒定為CD8⁺T細胞陰性，但用SIINFEKL-四聚體可染色。如圖10B中所示，內(nèi)源性SIINFEKL反應(yīng)性CD8⁺T細胞顯示出與OT-I T細胞類似的行為。特別地，ADAS過程可高度擴增內(nèi)源性SIINFEKL-特異性記憶T細胞并且這些T細胞帶有所有典型的細胞毒性CD8⁺T細胞(顆粒酶B陽性、KLRG1表達，數(shù)據(jù)未顯示)的表型標(biāo)記。

這些實驗確定了ADAS過程可以抗原特異性方式再活化和大規(guī)模擴增靜息記憶CD8⁺T細胞，以使它們再次變成CD8⁺細胞毒性效應(yīng)物。由于ADAS過程產(chǎn)生其中應(yīng)答于IL-2cx和IL-15cx的T細胞的狀態(tài)，這兩種細胞因子制備物將進一步強烈增強記憶CD8⁺T細胞對ADAS的應(yīng)答。

總之，ADAS不僅可以在活化之后的一定時間窗口內(nèi)以抗原特異性方式擴增新活化的初始CD8⁺T細胞，還可以擴增靜息記憶CD8⁺T細胞，即記憶狀態(tài)的CD8⁺T細胞。

實施例11

ADAS對于體外活化的過繼轉(zhuǎn)移的CD8⁺T細胞也有效

在體外用肽SIINFEKL將OT-I小鼠的脾細胞活化3天，沒有佐劑。然而，CD8⁺T細胞的這種活化也可在Th1佐劑的存在下完成。培養(yǎng)后，第0天將細胞(此時由97％的OT-I CD8⁺T細胞構(gòu)成)轉(zhuǎn)移到同基因的C57BL/6小鼠中。在第0、1、2、3、4、5或6天的任一天應(yīng)用ADAS(i.v.注射10×10⁶個加載SIIFEKL的脾細胞和50μg聚I：C)。在1、2或3天ADAS對宿主動物中的過繼轉(zhuǎn)移的CD8⁺T細胞頻率沒有任何顯著效果。然而，在第4天應(yīng)用ADAS可以觀察到轉(zhuǎn)移的CD8⁺T細胞的明顯擴增，并且在第5天進行ADAS看到最佳擴增(圖11)。同時，表面標(biāo)志物KLRG1的表達(其指示轉(zhuǎn)移的CD8⁺T細胞向效應(yīng)細胞的成熟)由在ADAS第1天的30％-40％提高至第5和6天的80％-90％，這些數(shù)據(jù)使得得出結(jié)論，ADAS過程能夠強烈擴增體外活化和過繼轉(zhuǎn)移的抗原特異性CD8⁺T細胞群。與此同時，ADAS誘導(dǎo)這些CD8⁺T細胞進一步分化為細胞毒性效應(yīng)細胞。ADAS的最佳時間點在人中可以不同，因為在小鼠中的實驗不允許在人中進行精確的預(yù)測。因此，對過繼轉(zhuǎn)移的CD8⁺T細胞最佳的ADAS作用的時期可以更長。也可以預(yù)期ADAS不僅在過繼轉(zhuǎn)移后0小時至14天的短時間內(nèi)有效，而且當(dāng)過繼轉(zhuǎn)移的CD8⁺T細胞在已經(jīng)恢復(fù)到記憶狀態(tài)后長時間之后也有效。

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