專利名稱：免疫學(xué)單純皰疹病毒抗原及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于治療和預(yù)防單純皰疹病毒(HSV)感染的分子、組合物和方法。更具體地，本發(fā)明鑒定可用于開發(fā)刺激或提高HSV特異性免疫的方法、分子和組合物的HSV蛋白表位。
本發(fā)明的背景1型和2型HSV的完整已知DNA序列有大約160kb，編碼約85個基因，每個基因編碼至少一種蛋白。這些蛋白中的免疫學(xué)表位是未知的，每個表位應(yīng)長約9-12個氨基酸并能引起對病毒感染的有效T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
在人體中需要細(xì)胞免疫應(yīng)答來限制復(fù)發(fā)性HSV感染的嚴(yán)重性。HSV特異性CD4T細(xì)胞可對病毒感染細(xì)胞具有細(xì)胞毒性(M.Yasukawa等，1991，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)，1461341-1347；M.Yasukawa等，1984，免疫學(xué)雜志，1332736-42)。HSV特異性T細(xì)胞還可降低HSV感染的HLA匹配細(xì)胞中HSV復(fù)制的滴度，產(chǎn)生具有抗病毒或免疫調(diào)節(jié)活性的淋巴因子，或提供特異性B細(xì)胞輔助提高抗病毒抗體應(yīng)答。涉及HSV特異性T細(xì)胞的抗原特異性的文獻(xiàn)包括A.G.Langenberg等，1995，Ann.Int.Med.122889-898；A.Mikloska等，1998，J.Gen.Virol.，79353-361；J.W.Torseth等，1987，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，611532-1539；M.Yasukawa等，1985，免疫學(xué)雜志，1342679-2687。
但仍然需要鑒定能夠?qū)SV感染引起有效免疫應(yīng)答的特異性表位。這些信息可導(dǎo)致鑒定出對HSV感染的防止和治療有用的更為有效的免疫原性抗原。
本發(fā)明概要本發(fā)明提供HSV抗原、含有HSV抗原的多肽、編碼這些多肽的多核苷酸、含有這些多核苷酸的載體和重組病毒、呈遞這些多肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)、抗HSV的免疫細(xì)胞、以及藥物組合物。這些藥物組合物既可用于預(yù)防也可用于治療。本發(fā)明的抗原可被從皰疹損傷回收的T細(xì)胞識別。本發(fā)明還提供方法，包括用于防止和治療HSV感染、殺傷HSV感染細(xì)胞、抑制病毒復(fù)制、增強(qiáng)抗病毒和/或免疫調(diào)節(jié)性淋巴因子的分泌以及增強(qiáng)HSV特異性抗體產(chǎn)生的方法。用于防止和治療HSV感染、增強(qiáng)抗病毒和/或免疫調(diào)節(jié)性淋巴因子的分泌、增強(qiáng)HSV特異性抗體產(chǎn)生和廣義地講用于刺激和/或提高HSV特異性免疫的方法，包括給對象施用本發(fā)明的多肽、多核苷酸、重組病毒、APC、免疫細(xì)胞或組合物。用于殺死HSV感染細(xì)胞和抑制病毒復(fù)制的方法包括用本發(fā)明的免疫細(xì)胞接觸HSV感染細(xì)胞。本發(fā)明的免疫細(xì)胞是經(jīng)本發(fā)明的抗原或呈遞本發(fā)明抗原的APC刺激的免疫細(xì)胞。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生這些免疫細(xì)胞的方法。該方法包括用經(jīng)修飾呈遞本發(fā)明抗原的APC，優(yōu)選樹突細(xì)胞，接觸免疫細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該免疫細(xì)胞是T細(xì)胞如CD4+或CD8+T細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有HSV多肽的組合物。該多肽可包含UL19、UL21、UL49或UL50蛋白或它們的片段，或選自如下序列的多肽UL19的第1078-1319位氨基酸；UL21的第148-181位氨基酸；UL49的第105-190或177-220位氨基酸；UL50的第118-312位氨基酸；糖蛋白E(gE；US8)的第1-273位氨基酸；VP16的第185-197、209-221或430-449位氨基酸；以及上述多肽的替代變體。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸和含有該多核苷酸的組合物。此外，本發(fā)明提供經(jīng)遺傳修飾表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的重組病毒和含有該重組病毒的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該病毒是牛痘病毒、金絲雀痘病毒、HSV、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒。本發(fā)明的組合物可是藥物組合物。該組合物可選擇性地含有藥物學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。
本發(fā)明還提供鑒定感染性生物如病毒、細(xì)菌或寄生蟲的免疫原性表位的方法。在一個實(shí)施方案中，該方法包括制備所述生物基因組的隨機(jī)片段的集合。該方法還包括表達(dá)由該集合的片段編碼的多肽，并回收表達(dá)的多肽。優(yōu)選地，該多肽表達(dá)為不溶性包涵體。在一個實(shí)施方案中，該多肽以融合蛋白形式表達(dá)，例如采用pUEX載體表達(dá)不溶性β-半乳糖苷酶融合蛋白。然后分析表達(dá)的多肽引起細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。引起細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力指示存在免疫原性表位。
可用基因組片段的亞片段重復(fù)以上步驟。該方法可進(jìn)一步包括基因組片段的測序。在一個實(shí)施方案中，所述分析包括進(jìn)行T細(xì)胞增殖測定。該分析可采用來自己暴露于感染性生物的對象的免疫細(xì)胞來進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該細(xì)胞來源于主動侵染部位，如皮膚或子宮頸，或來源于感染對象的血液。
本發(fā)明還提供通過本發(fā)明方法鑒定的免疫原性表位、含有這些表位的多肽、以及編碼這些多肽的多核苷酸。適合的感染性生物包括細(xì)菌、寄生蟲和病毒。病毒的例子包括雙鏈和單鏈的DNA和RNA病毒。因?yàn)椴恍枰锏暮怂嵝蛄行畔?，所以本發(fā)明的方法提供了對抗多種感染性生物包括那些表現(xiàn)出極大變異性的感染性生物的策略。
附圖簡要說明
圖1A是表示0.67-0.73圖距單位區(qū)間的HSV基因組結(jié)構(gòu)的示意圖。邊界是近似的。圖中還顯示了HSV-1×HSV-2雜交類型重組病毒(intertypic recombinant viruse，IRV)。HSV-2 DNA用實(shí)線表示；HSV-1 DNA用虛線表示，不確定區(qū)域用多線條表示。還顯示了用于表達(dá)克隆的HSV-2 BamH I w片段。
圖1B是顯示T細(xì)胞克隆(TCC)對所標(biāo)明IRV的增殖應(yīng)答的柱形圖。數(shù)據(jù)表示為與單純培養(yǎng)基相比的[3H]胸苷摻入的Δcpm，每種情況中培養(yǎng)基[3H]胸苷摻入的cpm量均少于500cpm。
圖2是免疫印跡圖，其顯示了IRV DX32的UL49基因產(chǎn)物(VP22)的HSV病毒表型的確定。模擬感染細(xì)胞和病毒株DX32、HSV-1或HSV-2感染細(xì)胞的裂解物經(jīng)SDS-PAGE分離后，進(jìn)行印跡，然后用VP22特異性單克隆抗體(mAb)進(jìn)行探測。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(kD)顯示于右側(cè)。
圖3A顯示了采用TCC 4.2E1由HSV-2的VP22中的不同肽表位引起的T細(xì)胞增殖的柱形圖?？乖蔬f細(xì)胞(APC)是自體EBV-LCL?？乖?0ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及3uM的肽。數(shù)據(jù)表示為與單純培養(yǎng)基相比的[3H]胸苷摻入的Δcpm，每種情況中培養(yǎng)基的[3H]胸苷摻入cpm均少于500cpm。
圖3B顯示了采用TCC 1.L3D5.10.8由HSV-2的VP22中的不同肽表位引起的T細(xì)胞增殖的柱形圖。APC是自體PBMC?？乖?0ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及1uM的肽。數(shù)據(jù)表示為與單純培養(yǎng)基相比的[3H]胸苷摻入的Δcpm，每種情況下培養(yǎng)基的[3H]胸苷摻入的cpm均少于500cpm。
圖3C顯示了采用TCC ESL4.9由HSV-2的VP22中不同的肽表位引起的T細(xì)胞增殖的柱形圖。APC是自體PBMC。抗原包括10ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及1uM的肽。數(shù)據(jù)表示為與單純培養(yǎng)基相比的[3H]胸苷摻入的Δcpm，每種情況下培養(yǎng)基的[3H]胸苷摻入的cpm均少于500cpm。
圖4是顯示T細(xì)胞克隆BM.17應(yīng)答HSV-2 VP16的437-449肽的HLA限制成分的線形圖。增殖應(yīng)答對病毒肽濃度作圖?？乖蔬f細(xì)胞是自體的(實(shí)心圓)、HLA DQB1*0501純合的(空心三角)、或HLA DQB1*0201純合的(正方形)EBV-LCL。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供對防止和治療HSV感染有用的HSV抗原。本文公開了經(jīng)證實(shí)可被皰疹損傷來源的T細(xì)胞識別的抗原和/或其組成表位。在一些實(shí)施方案中，對本發(fā)明抗原具有特異性的T細(xì)胞顯示出對病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。負(fù)責(zé)T細(xì)胞特異性的免疫原性抗原的鑒定有利于開發(fā)改善的抗病毒治療和預(yù)防策略。含有本發(fā)明的抗原或編碼該抗原的多核苷酸的組合物提供了用于防止和治療HSV感染的有效定向疫苗。定義本申請中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語除非特別規(guī)定否則具有本領(lǐng)域通用的意義。當(dāng)在本申請中使用時，以下詞或詞匯具有規(guī)定的意義。
本文中，“多肽”包括從天然原料中分離的、通過重組技術(shù)產(chǎn)生的或化學(xué)合成的蛋白、蛋白片段、和肽。本發(fā)明的多肽典型地含有至少約8個氨基酸。
本文中，“HSV多肽”除非另作說明否則包括HSV-1和HSV-2。對HSV蛋白或多肽的氨基酸的引述基于A.Dolan等(A.Dolan等，1998，病毒學(xué)雜志，72(3)2010-2021)所述的關(guān)于HSV-2的基因組序列信息。
本文中，“替代變體”是指在指明的氨基酸序列中有一或多個氨基酸替換或缺失的分子，該分子仍保持了被免疫細(xì)胞識別的能力。測定分子是否可被免疫細(xì)胞識別的一種方法是增殖分析，其描述于D.M.Koelle等，1994，病毒學(xué)雜志，68(5)2803-2810。
本文中，“載體”是指能向宿主細(xì)胞遞送并優(yōu)選表達(dá)一或多個目的基因或序列的結(jié)構(gòu)。載體的例子包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、與陽離子縮合試劑結(jié)合的DNA或RNA表達(dá)載體、包在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體，以及某些真核細(xì)胞例如生產(chǎn)細(xì)胞。
本文中，“表達(dá)控制序列”是指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)控制序列可以是啟動子例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子或增強(qiáng)子。該表達(dá)控制序列可操作地與待轉(zhuǎn)錄的核酸序列連接。
術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚體，并且除非另行限定，包括可以以類似天然存在核苷酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。
本文中，“抗原呈遞細(xì)胞”或“APC”是指能處理抗原并將抗原呈遞給淋巴細(xì)胞的細(xì)胞。APC的例子包括但不限于巨噬細(xì)胞、Langerhans樹突細(xì)胞、小結(jié)樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、纖維原細(xì)胞和纖維細(xì)胞。樹突細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞的優(yōu)選類型。在許多非淋巴組織中發(fā)現(xiàn)樹突細(xì)胞，但其可通過輸入淋巴或血流遷移至淋巴器官的T依賴性區(qū)域。在非淋巴器官中，樹突細(xì)胞包括Langerhans細(xì)胞和間質(zhì)樹突細(xì)胞。在淋巴和血液中，它們分別包括輸入淋巴面紗細(xì)胞和血液樹突細(xì)胞。在淋巴器官中，它們包括淋巴樹突細(xì)胞和交錯突細(xì)胞。本文中，除非另行說明，這些細(xì)胞類型和其祖細(xì)胞均被稱作“樹突細(xì)胞”。
本文中，“經(jīng)修飾”以呈遞表位是指通過天然或重組方法操作以呈遞表位的抗原呈遞細(xì)胞(APC)。例如，該APC可通過暴露于單獨(dú)的或作為攜帶肽的混合物一部分的分離抗原來修飾，或通過遺傳修飾以表達(dá)包含一或多個表位的多肽。
本文中，“藥物學(xué)上可接受的鹽”是指維持母體化合物所期望的生物活性并且不會賦予任何不期望的毒性效果的鹽。這樣的鹽的例子包括但不限于，(a)與無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成鹽；和與有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、3-羥-2-萘甲酸、褐藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸形成的鹽；(b)含有多價金屬陽離子如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等的鹽；或(c)與由N，N’-二-苯甲基乙二胺或乙二胺形成的有機(jī)陽離子構(gòu)成的鹽；或(d)(a)和(b)或(c)的組合，例如單寧酸鋅鹽；等。優(yōu)選的酸加成鹽是三氟乙酸鹽水和乙酸鹽水。
本文中，“藥物學(xué)上可接受載體”包括任何與活性成分結(jié)合時可保持該成分的生物活性并且不與對象的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的物質(zhì)。例子包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)藥用載體例如磷酸緩沖鹽溶液、水、乳劑如油/水乳劑、和各種類型的潤濕劑。對于氣溶膠或非腸道注射優(yōu)選的稀釋劑是磷酸緩沖鹽水或生理(0.9％)鹽水。
含有這些載體的組合物的配制可采用熟知的常規(guī)方法(見例如Remington制藥科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第43章，第14版，Mack出版公司，Easton PA 18042，美國)。
本文中，“佐劑”包括有利于刺激免疫應(yīng)答的本領(lǐng)域常用佐劑。佐劑的例子包括但不限于輔助肽；鋁鹽，例如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁；Freund氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco實(shí)驗(yàn)室，Detroit，MI)；Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(Smith-Kline Beecham)；QS-21(Aquilla)；MPL或3d-MPL(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)；LEIF；鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽；酰化酪氨酸的不溶性懸浮液；?；?；陽離子或陰離子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球體；單磷酰脂A和quil A；胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺或免疫刺激復(fù)合物，包括細(xì)胞因子(例如GM-CSF或白介素-2，-7或-12)以及免疫刺激性DNA序列。在一些實(shí)施方案中，例如與多核苷酸疫苗一起使用時，佐劑如輔助肽或細(xì)胞因子可通過編碼佐劑的多核苷酸來提供。
本文中，“一”(不定冠詞)除非明確另行指出否則是指至少一個。HSV多肽在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的單純皰疹病毒(HSV)多肽，其中該多肽包含UL19(主要衣殼抗原，VP5)、UL21、UL49(VP22)或UL50蛋白或它們的片段。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自如下多肽的分離的HSV多肽UL19的第1078-1319位氨基酸；UL21的第148-181位氨基酸；UL49的第105-190或177-220位氨基酸；UL50的第118-312位氨基酸；糖蛋白E(gE；US8)的第1-273位氨基酸；VP16的第185-197、209-221或430-449位氨基酸；以及以上多肽的替代變體。氨基酸殘基參考A.Dolan等，1998，病毒學(xué)雜志，72(3)2010-2021中所述的HSV-2基因組的蛋白質(zhì)。
該多肽可是融合蛋白。在一個實(shí)施方案中，該融合蛋白是可溶的。本發(fā)明的可溶性融合蛋白可適于向?qū)ο笞⑸浜鸵鹈庖邞?yīng)答。在某些實(shí)施方案中，多肽可是含有多個本文所述多肽的融合蛋白，或是含有至少一個本文所述多肽和非相關(guān)序列的融合蛋白。例如，融合伴侶可參與提供T輔助表位(免疫學(xué)融合伴侶)，優(yōu)選人識別的T輔助表位，或有助于以高于原來重組蛋白的產(chǎn)量表達(dá)蛋白質(zhì)(表達(dá)增強(qiáng)子)。某些優(yōu)選的融合伴侶既是免疫學(xué)融合伴侶又是表達(dá)增強(qiáng)性融合伴侶?？蛇x擇其它融合伴侶以增加蛋白的可溶性或使蛋白能導(dǎo)向所期望的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室。更進(jìn)一步地，融合伴侶包括有利于蛋白純化的親和標(biāo)簽。
一般可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括化學(xué)偶聯(lián)制備融合蛋白。優(yōu)選地，融合蛋白在表達(dá)系統(tǒng)中以重組蛋白的形式表達(dá)，以允許產(chǎn)生相對非融合蛋白更高水平的產(chǎn)量。簡單地說，編碼多肽成分的DNA序列可獨(dú)立地組裝，然后連入合適的表達(dá)載體。編碼一個多肽成分的DNA序列的3’端在有或無肽接頭的情況下與編碼第二個多肽成分的DNA序列的5’端連接，以便這些序列的閱讀框相符合。這就允許翻譯成保留了兩個組成多肽的生物學(xué)活性的單一融合蛋白質(zhì)。
可采用肽接頭序列將第一和第二個多肽成份分開足夠長的距離，以保證每個多肽都折疊成它的二級和三級結(jié)構(gòu)。這樣的肽接頭序列可采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)并入融合蛋白。合適的肽接頭序列可根據(jù)如下因素選擇(1)能采取柔性伸展構(gòu)象；(2)不能形成可影響第一和第二多肽的功能性表位的二級結(jié)構(gòu)；以及(3)缺乏可與多肽功能性表位反應(yīng)的疏水或帶電荷殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly，Asn和Ser殘基。其它接近中性的氨基酸例如Thr和Ala也可在接頭序列中使用?？捎行У赜米鹘宇^的氨基酸序列包括那些在如下文獻(xiàn)中公開的序列Maratea等，1985，基因(Gene)4039-46；Murphy等，1986，美國科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838258-8262；美國專利4,935,233和美國專利4,751,180。該接頭序列一般可長1到約50個氨基酸。當(dāng)?shù)谝粋€和第二個多肽含有可用來分開功能性結(jié)構(gòu)域和防止立體干擾的非必需N端氨基酸區(qū)域時，則不需要接頭序列。
該連接的DNA序列可操作地連接到適合的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件上。負(fù)責(zé)DNA表達(dá)的調(diào)控元件位于編碼第一個多肽的DNA序列的5’端。同樣地，終止翻譯所需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號存在于編碼第二個多肽的DNA序列的3’端。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明多肽和非相關(guān)免疫原性蛋白的融合蛋白。優(yōu)選地，該免疫原性蛋白能引起記憶應(yīng)答。這樣的蛋白例子包括破傷風(fēng)、結(jié)核和肝炎蛋白(見例如Stoute等，1997，New Engl.J.Med.，336869)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫學(xué)融合伴侶來源于蛋白D，一種革蘭氏陰性細(xì)菌流感嗜血桿菌B(Haemophilus influenza B)的表面蛋白(WO91/18926)。優(yōu)選地，蛋白D衍生物含有該蛋白的約頭三分之一(例如最初的100-110個N端氨基酸)，而且蛋白D衍生物可以是脂化的。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，在N端包括脂蛋白D融合伴侶的頭109個殘基，以給多肽提供另外的外源性T細(xì)胞表位并增加在大腸桿菌中的表達(dá)水平(因此其起到表達(dá)增強(qiáng)子的作用)。脂類尾保證抗原最好地呈遞給抗原呈遞細(xì)胞。其它融合伴侶包括流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血球凝集素)。盡管可采用包括T輔助表位的不同片段，但典型地采用N端的81個氨基酸。
在另一個實(shí)施方案中，免疫學(xué)融合伴侶是被稱作LYTA的蛋白或其部分(優(yōu)選C端部分)。LYTA來源于肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，該菌合成稱作酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；基因43265-292，1986)。LYTA是一種自溶素，其專一降解肽聚糖主鏈中的特定化學(xué)鍵。LYTA蛋白的C端結(jié)構(gòu)域可親合膽堿或一些膽堿類似物如DEAE。該性質(zhì)已被用來開發(fā)用于表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒。在氨基端含有C-LYTA片段的雜合蛋白的純化已有描述(見生物技術(shù)(Biotechnology)10795-798，1992)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可將LYTA的重復(fù)部分并入融合蛋白。發(fā)現(xiàn)在C末端區(qū)域從第178個殘基開始有一個重復(fù)部位。尤其優(yōu)選的重復(fù)部分包括第188-305位殘基。
在一些實(shí)施方案中，可能希望將治療試劑和本發(fā)明的多肽連接起來，或?qū)⒈景l(fā)明的一個以上多肽連接起來。例如，可將一種以上的試劑或多肽直接與本發(fā)明的第一個多肽連接，或者采用提供多個附著位點(diǎn)的接頭。另外可使用載體。一些分子尤其適合用于細(xì)胞間的運(yùn)輸和蛋白的運(yùn)送，這樣的分子包括但不限于VP22(Elliott和O’Hare，1997，細(xì)胞(cell)88223-233；也見Kim等，1997，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1591666-1668；Rojas等，1998，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)16370；Kato等，1998，F(xiàn)EBS Lett.427(2)203-208；Vives等，1997，生物化學(xué)雜志(J.Bio.Chem.)272(25)16010-7；Nagahara等，1998，Nature Med.4(12)1449-1452)。
載體可以多種方式攜帶試劑或多肽，包括直接共價連接或通過接頭基團(tuán)進(jìn)行共價連接。適合的載體包括蛋白質(zhì)例如白蛋白(例如Kato等的美國專利4,507,234)、肽和多糖例如氨基葡聚糖(例如Shih等的美國專利4,699,784)。載體還可通過非共價結(jié)合或包在例如脂質(zhì)體小泡中來攜帶試劑(例如美國專利4,429,008和4,873,008)。
一般地，本文所述的多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分離的。“分離的”多肽或多核苷酸是指從其原始環(huán)境中分離出來的多肽或多核苷酸。例如，如果一種天然存在的蛋白與天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物分離開，則該蛋白是分離的。優(yōu)選地，該多肽有至少約90％的純度，更優(yōu)選有至少約95％的純度，最優(yōu)選有至少約99％的純度。如果例如一個多核苷酸被克隆至非天然環(huán)境一部分的載體中，則該多核苷酸被認(rèn)為是分離的。
該多肽可從其天然存在的形式中分離、通過重組方式產(chǎn)生或化學(xué)合成。本文所述DNA序列編碼的重組多肽可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種表達(dá)載體中的任意一種容易地從DNA序列制備。表達(dá)可在任何已轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體的適合宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)，其中該表達(dá)載體含有編碼重組多肽的DNA分子。適合的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母和高等真核細(xì)胞。優(yōu)選地，所用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞系如COS或CHO。分泌重組蛋白或多肽至培養(yǎng)基的可溶性宿主/載體系統(tǒng)的上清可首先采用商業(yè)上可獲得的過濾器進(jìn)行濃縮。濃縮后，濃縮物可在合適的純化基質(zhì)例如親和基質(zhì)或離子交換樹脂上進(jìn)行純化。最后，可使用一個或多個反相HPLC步驟進(jìn)一步純化重組多肽。
具有少于約100個氨基酸(一般少于約50個氨基酸)的片段或其它變體也可通過合成方式采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，這種多肽可采用任何商業(yè)上可獲得的固相技術(shù)如Merrifield固相合成法合成，其中氨基酸被順序地添加到生長的氨基酸鏈上(Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.852146-2149)。多肽自動合成儀可從供應(yīng)商如Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City，CA)購得，并可按廠家說明進(jìn)行操作。
根據(jù)本發(fā)明使用的多肽變體可在指明的氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸替換、缺失、添加和/或插入，并使由此獲得的多肽保持對HSV或HSV感染細(xì)胞引起免疫應(yīng)答的能力。一般可通過修飾本文所述的一個多肽序列，然后采用已知的分析方法如本文所述的T細(xì)胞分析方法評價該修飾多肽的反應(yīng)性來識別這種變體。多肽變體與已知多肽間優(yōu)選有至少約70％的一致性，更優(yōu)選有約90％的一致性，最優(yōu)選有約95％的一致性。這些氨基酸替代包括但并不必然限于本領(lǐng)域稱作“保守”的氨基酸替代。
“保守”替代是指一種氨基酸被另一種具有相似性質(zhì)的氨基酸替代，以致肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)期該多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)沒有顯著改變。氨基酸替代一般可根據(jù)殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性質(zhì)、親水性質(zhì)和/或雙親性質(zhì)的相似性來進(jìn)行。例如帶負(fù)電荷的氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；親水值相似的有不帶電極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天門冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其它可表現(xiàn)出保守改變的氨基酸組合包括(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。變體也可或替代性地含有非保守變換。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，變體多肽通過5個或更少氨基酸的替換、缺失或添加而不同于天然序列。變體也可(或作為替代)通過例如缺失或添加對多肽的免疫原性、二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)影響極微的氨基酸來修飾。多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞和重組病毒本發(fā)明提供編碼本發(fā)明一個或多個多肽的多核苷酸。該多核苷酸可包含在載體中。該載體還可含有可操作地與本發(fā)明多核苷酸連接的表達(dá)控制序列。在一些實(shí)施方案中，該載體包括一個或多個編碼其它目的分子的多核苷酸。在一個實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的多核苷酸與另外的多核苷酸連接起來以編碼一個融合蛋白。
在某些實(shí)施方案中，可配制多核苷酸以允許其進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞并在其中表達(dá)。正如下文描述的，該制劑對于治療目的尤其有用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解有許多方式可實(shí)現(xiàn)多核苷酸在靶細(xì)胞中的表達(dá)，而且可使用任何合適的方法。例如，可將多核苷酸插入病毒載體，所述載體例如但不限于腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘或其它痘病毒(如鳥痘病毒)。用于將DNA插入這些載體的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。逆轉(zhuǎn)錄病毒還可轉(zhuǎn)移或包含篩選標(biāo)記基因(以幫助轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的鑒定或篩選)和/或使載體靶標(biāo)特異的靶向成分，例如編碼特定靶細(xì)胞受體的配體的基因。靶向還可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法采用抗體來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞。該轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可在生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法中使用。該方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞并回收所產(chǎn)生的多肽?；厥盏亩嚯目蓮呐囵B(yǎng)物上清中純化。
本發(fā)明的載體可用于體內(nèi)、離體或體外遺傳修飾細(xì)胞。遺傳修飾細(xì)胞的幾種方法是已知的，其包括直接或通過逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞用病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染、磷酸鈣沉淀、受體細(xì)胞與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、用含有DNA的脂質(zhì)體或微球體處理受體細(xì)胞、DEAE葡聚糖法、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、電穿孔、微注射以及許多技術(shù)人員已知的其它技術(shù)。見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Molecular cloning-A Laboratory Manual)(第二版)1-3，1989；和當(dāng)代分子生物學(xué)方法(Current Protocols in Molecular Biology)，F(xiàn).M.Ausubel等編，Green Publishing Associates公司和John Wiley&Sons公司(1994增補(bǔ))。
病毒載體的例子包括但不限于基于例如HIV、SIV、鼠源逆轉(zhuǎn)錄病毒、長臂猿的猿白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及其它病毒例如腺伴隨病毒(AAV)和腺病毒(Miller等，1990，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)104239；J.Kolberg 1992，NIH Res.443，和Cornetta等1991，Hum Gene Ther.2215)。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括基于如下病毒和其組合的病毒鼠源白血病病毒(MuLV)、長臂猿的猿白血病病毒(GaLV)、親嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)。見例如Buchscher等1992，病毒學(xué)雜志66(5)2731-2739；Johann等1992，病毒學(xué)雜志，66(5)1653-1640；Sommerfelt等1990，病毒學(xué)17658-59；Wilson等1989，病毒學(xué)雜志632374-2378；Miller等1991，病毒學(xué)雜志652220-2224；和Rosenberg和Fauci 1993，基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，第三版，W.E.Paul(編)，Raven Press，Ltd.，New York，及其中的參考文獻(xiàn)；Miller等1990，分子細(xì)胞生物學(xué)104239；R.Kolberg 1992，J.NIH Res.443；和Cornetta等1991，Hum Gene Ther.2215。
適于擴(kuò)增序列以便將其亞克隆至表達(dá)載體的體外擴(kuò)增技術(shù)是已知的。該體外擴(kuò)增方法的例子包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、Qβ復(fù)制酶擴(kuò)增以及其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(如NASBA)，可參見Sambrook等1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(第二版)1-3；以及美國專利4,683,202；PCR手冊方法和應(yīng)用指南(PCR ProtololsA Guide to Methods and Applications)(Innis等編)Academic Press公司，San Diego，CA 1990?？寺◇w外擴(kuò)增核酸的改進(jìn)方法在美國專利5,426,039中有描述。
本發(fā)明還提供經(jīng)遺傳修飾表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的重組微生物。該重組微生物可用作疫苗，并可采用本領(lǐng)域已知的減毒活疫苗制備技術(shù)制備。用作活疫苗的微生物的例子包括但不限于病毒和細(xì)菌。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該重組微生物是病毒。適合的病毒的例子包括但不限于牛痘病毒、金絲雀痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、HSV和腺病毒。組合物本發(fā)明提供對治療和防止HSV感染有用的組合物。該組合物可用于抑制病毒復(fù)制和殺死病毒感染細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，該組合物是藥物組合物。該組合物可包含治療或預(yù)防上有效量的本發(fā)明多肽、多核苷酸、重組病毒、APC或免疫細(xì)胞。有效量是指足以通過例如激活T細(xì)胞引起或提高免疫應(yīng)答的量。T細(xì)胞激活的一種測量方法是增殖分析，其描述于D.M.Koelle等，1994，病毒學(xué)雜志，65(5)2803-2810。在一些實(shí)施方案中，該組合物是疫苗。
該組合物可選擇地包括載體，例如藥物學(xué)上可接受的載體。藥物學(xué)上可接受載體部分地是由施用的特定組合物以及施用該組合物的特定方法決定的。因此，本發(fā)明藥物組合物的適合制劑有非常多的種類。適用于非腸道施用例如通過關(guān)節(jié)內(nèi)(關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑施用的制劑和載體包括等滲無菌注射水溶液以及水和非水無菌懸液，其中等滲無菌注射水溶液可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使該制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)，水和非水無菌懸液可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、脂質(zhì)體、微球體和乳化劑。
本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步含有一種或多種佐劑。佐劑的例子包括但不限于輔助肽、明礬、Freund氏佐劑、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺或免疫刺激復(fù)合物，包括細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，例如和多核苷酸疫苗一起使用時，佐劑如輔助肽或細(xì)胞因子可通過編碼該佐劑的多核苷酸來提供。疫苗制備一般可參見例如M.F.Powell和M.J.Newman編“疫苗設(shè)計(jì)(亞單位和佐劑方法)(Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach))”Plenum Press(NY，1995)。屬于本發(fā)明范疇的藥物組合物和疫苗還可含有其它成分，這些成分可以是有生物活性的也可是沒有活性的。例如，其它病毒抗原的一個或多個免疫原性部分可通過并入融合肽或作為獨(dú)立成分存在于該組合物或疫苗中。
藥物組合物或疫苗可含有編碼一個或多個本發(fā)明多肽的DNA，以便該多肽可原位產(chǎn)生。如上所述，該DNA可存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種遞送系統(tǒng)的任意一種中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。許多基因遞送技術(shù)是本發(fā)明領(lǐng)域所熟知的，例如描述于Rolland，1998，Crit. Rev. Therap.Drug Carrier Systems15143-198及其引用的參考文獻(xiàn)中的基因遞送技術(shù)。合適的核酸表達(dá)系統(tǒng)含有為在患者中表達(dá)所必需的DNA序列(例如合適的啟動子和終止信號)。細(xì)菌遞送系統(tǒng)涉及施用在其細(xì)胞表面表達(dá)多肽的免疫原性部分或分泌這種表位的細(xì)菌(例如Bacillus-Calmette-Guerrin)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA可采用病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如牛痘或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或腺病毒)導(dǎo)入，該病毒表達(dá)系統(tǒng)可涉及使用非致病性(缺陷型)可復(fù)制病毒。適合的系統(tǒng)公開于例如Fisher-Hoch等，1989，美國科學(xué)院院刊86317-321；Flexner等，1989，Ann.My Acad.Sci.56986-103；Flexner等，1990，疫苗(Vaccine)817-21；美國專利4,603,112，4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國專利4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91102805；Berkner，1988，生物技術(shù)(Biotechniques)6616-627；Rosenfeld等，1991，科學(xué)(Science)252431-434；Kolls等，1994，美國科學(xué)院院刊91215-219；Kass-Eisler等，1993，美國科學(xué)院院刊9011498-11502；Guzman等，1993，Circulation 882838-2848；和Guzman等，1993，Cir.Res.731202-1207。將DNA插入這些表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。該DNA還可以是“裸露的”，見例如Ulmer等，1993，科學(xué)2591745-1749中所述以及Cohen，1993，科學(xué)2591691-1692的綜述。裸DNA的攝取可通過將該DNA包被在可有效轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的生物可降解珠上來增加。
盡管在本發(fā)明的藥物組合物中可采用任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的適合載體，但載體的類型將根據(jù)施用方式改變。本發(fā)明的組合物可配制成適于任何合適的施用方式，包括例如局部、口服、鼻腔、靜脈內(nèi)、顱骨內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)施用。對于非腸道施用例如皮下注射，載體優(yōu)選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖劑。對于口服施用，可采用以上任意一種載體或固體載體例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可將生物可降解微球體(例如聚(乳酸-乙醇酸))作為載體用于本發(fā)明藥物組合物。適合的生物可降解微球體公開于例如美國專利4,897,268和5,075,109。
這些組合物還可含有緩沖物(例如中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、螯合劑例如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(例如氫氧化鋁)和/或防腐劑。作為替代，本發(fā)明組合物可制備成凍干物。也可采用熟知的技術(shù)將組合物的成分裝入脂質(zhì)體。
在本發(fā)明疫苗中可使用任何各種佐劑。大多數(shù)佐劑含有設(shè)計(jì)用于防止抗原快速代謝的物質(zhì)例如氫氧化鋁或礦物油，以及免疫應(yīng)答刺激物例如脂質(zhì)A、百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)來源的蛋白。多種適合的佐劑可通過商業(yè)途徑獲得，例如Freund氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco實(shí)驗(yàn)室，Detroit，MI)；Merk佐劑65(Merk and Company，Inc.，Rahway，NJ)；鋁鹽如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁；鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽；?；野彼岬牟蝗苄詰乙?；?；牵魂栯x子或陰離子衍生化多糖；聚磷腈生物可降解微球體；單磷?；珹和quilA。細(xì)胞因子如GM CSF或白介素-2、-7和-12也可用作佐劑。
在本文提供的疫苗中，佐劑組合物優(yōu)選設(shè)計(jì)成誘導(dǎo)主要是Th1型的免疫應(yīng)答。高水平的Th1型細(xì)胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)傾向于促進(jìn)誘導(dǎo)對施用抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。相反，高水平的Th2型細(xì)胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TNF-β)傾向于促進(jìn)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。在使用本文提供的疫苗后，患者將維持包括Th1-和Th2-型應(yīng)答的免疫應(yīng)答。在應(yīng)答主要是Th1-型應(yīng)答的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，Th1-型細(xì)胞因子的水平將比Th-2型細(xì)胞因子的水平有更大程度的增加。采用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)可容易地估計(jì)這些細(xì)胞因子的水平。關(guān)于細(xì)胞因子家族的綜述參見Mosmann和Coffman，1989，Ann.Rev.Immunol.7145-173。
用于引起主要是Th-1型的應(yīng)答的優(yōu)選佐劑包括例如單磷酰脂A(優(yōu)選3-去-O-?；瘑瘟柞Ｖ珹(3D-MPL))和鋁鹽的組合。MPL佐劑可獲自Ribi ImmunoChem Research公司(Hamilton，MT)(見美國專利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也可誘導(dǎo)主要是Th1型的應(yīng)答。這樣的寡核苷酸是人們熟知的，并描述于例如WO 96/02555中。另一種優(yōu)選佐劑是皂角苷，優(yōu)選QS21，其可單獨(dú)使用或和其它佐劑聯(lián)合使用。例如，一種增強(qiáng)系統(tǒng)包含單磷酰脂A和皂角苷衍生物的組合，例如WO 94/00153中所描述的QS21和3D-MPL的組合，或WO 96/33739中所描述的較小反應(yīng)原性組合物(其中QS21被膽固醇抑制)。其它優(yōu)選制劑包括水包油乳劑和維生素E。一種尤其有效的佐劑制劑涉及溶于水包油乳劑的QS21、3D-MPL和維生素E，其描述于WO 95/17210。另一種可用佐劑是AS-2(Smith-Kline Beecham)。本文提供的任何疫苗均可采用聯(lián)合抗原、免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑與適合載體或賦形劑的熟知技術(shù)來制備。
本文所述組合物可作為持續(xù)釋放制劑(即可在施用后實(shí)現(xiàn)組成成分的緩慢釋放的制劑如膠囊或海綿)的一部分來施用。該制劑一般可采用熟知技術(shù)制備，并通過例如口服、直腸或皮下植入，或在需要的靶位置植入的方式施用。持續(xù)釋放制劑可含有多肽、多核苷酸或抗體，這些物質(zhì)分散在載體基質(zhì)中和/或包含在限速膜包裹的貯藏室中。在這些制劑中使用的載體是生物適合的，并且還可以是生物可降解的；優(yōu)選地，該制劑提供相對恒定的活性成分釋放水平。包在持續(xù)釋放制劑中的活性成分的量取決于植入位點(diǎn)、釋放的速率和期望的持續(xù)時間以及待治療或防止的疾病的性質(zhì)。
在藥用組合物和疫苗中可使用任意各種遞送載體以利于產(chǎn)生靶向HSV感染細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答。遞送載體包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和其它可改造成有效APC的細(xì)胞。這些細(xì)胞可以但不必定進(jìn)行遺傳修飾以增強(qiáng)呈遞抗原的能力，改善T細(xì)胞應(yīng)答的激活和/或維持，使其本身具有抗病毒作用和/或與受者在免疫學(xué)上相容(即匹配的HLA單倍體型)。APC一般可分離自多種生物液體和器官，包括腫瘤和腫瘤周圍組織，而且其可以是自體的、同種異體的、同種的或異種的細(xì)胞。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案采用樹突細(xì)胞或其祖細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞。樹突細(xì)胞是高效的APC(Banchereau和Steinman，自然(Nature)392245-251，1998)，并且已證明該細(xì)胞作為生理學(xué)佐劑可有效地引起預(yù)防性或治療性免疫(見Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50507-529，1999)。通常，樹突細(xì)胞可根據(jù)其典型形狀(在原位置為星性，在體外具有可見的顯著細(xì)胞質(zhì)突起(樹突))和按標(biāo)準(zhǔn)分析確定的B細(xì)胞(CD19和CD20)、T細(xì)胞(CD3)、單核細(xì)胞(CD14)和自然殺傷細(xì)胞(CD56)分化標(biāo)記的缺乏來鑒定。當(dāng)然，樹突細(xì)胞可進(jìn)行改造以表達(dá)通常不出現(xiàn)在體內(nèi)或離體樹突細(xì)胞上的特異性細(xì)胞表面受體或配體，而且本發(fā)明也包括該修飾的樹突細(xì)胞。作為樹突細(xì)胞的替代物，可在疫苗中使用攜帶分泌小泡抗原的樹突細(xì)胞(稱作外來體)(Zitvogel等，1998，Nature Med.4594-600)。
樹突細(xì)胞和祖細(xì)胞可獲自外周血、骨髓、腫瘤浸潤細(xì)胞、腫瘤周圍組織浸潤細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾、皮膚、臍帶血或任何其它適合的組織或體液。例如，樹突細(xì)胞可通過向獲自外周血的單核細(xì)胞培養(yǎng)物中加入細(xì)胞因子組合例如GM-CSF、IL-4、IL-3和/或TNF-α進(jìn)行離體分化。此外，可通過向培養(yǎng)基添加GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或其它誘導(dǎo)樹突細(xì)胞成熟和增殖的化合物的組合來分化獲自外周血、臍帶血或骨髓的CD34陽性細(xì)胞。
樹突細(xì)胞可方便地劃分為“未成熟”和“成熟”細(xì)胞，這樣就允許以一種簡單的方式區(qū)分兩種極為特征化的表型。然而，該命名不應(yīng)理解為排除了所有可能的中間分化階段。未成熟樹突細(xì)胞的特征是，它是具有高抗原攝取和加工能力的APC，并與Fcγ受體、甘露糖受體和DEC-205標(biāo)記的高表達(dá)相關(guān)聯(lián)。成熟表型的典型特征是這些標(biāo)記表達(dá)較低，而負(fù)責(zé)T細(xì)胞激活的細(xì)胞表面分子如MHC I類和II類分子、粘連分子(如CD54和CD11)和共刺激分子(如CD40、CD80和CD86)則高表達(dá)。一般可用編碼多肽(或其部分或其它變體)的多核苷酸轉(zhuǎn)染APC，以便該多肽或其免疫原性部分在該細(xì)胞表面表達(dá)。該轉(zhuǎn)染可離體進(jìn)行，然后如本文所述，含有該轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合物和疫苗可用于治療目的。另外，可給患者施用靶向樹突或其它抗原呈遞細(xì)胞的基因遞送載體，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染在體內(nèi)發(fā)生。例如，一般可采用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行樹突細(xì)胞的體內(nèi)和離體轉(zhuǎn)染，如WO 92/24447中所述的方法或Mahvi等，1997，免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)(Immunology and CellBiology)75456-460中所描述的基因槍法。樹突細(xì)胞的抗原裝載可通過樹突細(xì)胞或祖細(xì)胞與腫瘤多肽、DNA(裸露的或在質(zhì)粒載體中)或RNA；或與表達(dá)抗原的重組細(xì)菌或病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒載體)一起孵育來實(shí)現(xiàn)。在裝載之前，多肽可與提供T細(xì)胞輔助的免疫學(xué)伴侶(例如載體分子)共價連接。此外，可單獨(dú)或在該多肽存在時用非連接的免疫學(xué)伴侶刺激樹突細(xì)胞。組合物的施用處理包括預(yù)防和治療?？赏ㄟ^在一個時間點(diǎn)或多個時間點(diǎn)一次直接注射來實(shí)行預(yù)防或治療。也可在多個部位幾乎同時施用。
患者或?qū)ο蟀ú溉閯游锶缛?、牛、馬、犬、貓、豬和羊類動物。
典型地，組合物通過如下途徑進(jìn)行體內(nèi)施用非腸道途徑(如靜脈內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi))或其它傳統(tǒng)直接途徑例如口腔/舌下、直腸、口、鼻、局部(如透皮或眼內(nèi))、陰道、肺、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)、或鼻內(nèi)途徑，或直接進(jìn)入特定組織。
組合物的施用可采用任何合適的方式，并常常和藥物學(xué)上可接受載體一起施用。給患者施用本發(fā)明所述細(xì)胞的適合方法是現(xiàn)成的，而且盡管有不止一種途徑可用來施用特定的細(xì)胞組合物，但通常某個特定途徑會比其它途徑提供更快速和更有效的反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，施用給患者的劑量應(yīng)足以在一段時間內(nèi)為該患者引起有益的治療反應(yīng)，或抑制感染或感染導(dǎo)致的疾病。因此，給患者施用的該組合物的量應(yīng)足以引起針對特異抗原的有效免疫應(yīng)答和/或減輕、降低、治愈或至少部分緩解疾病或感染引起的癥狀和/或并發(fā)癥。足以實(shí)現(xiàn)該目的的量定義為“治療有效劑量”。
該劑量將取決于生產(chǎn)的組合物的活性和患者的疾病，以及待治療患者的體重或表面面積。劑量的大小還取決于特定病人中伴隨特定組合物施用的不良副作用的存在與否、性質(zhì)和程度。在決定疾病如HSV感染的治療和預(yù)防中待施用組合物的有效量時，醫(yī)師需要評價抗病毒免疫應(yīng)答的產(chǎn)生、疾病的進(jìn)程和任何治療相關(guān)的毒性。
例如，含有HSV蛋白亞基的疫苗或其它組合物可每劑量包含1-10,000微克HSV蛋白。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中每劑量包含10-1000微克HSV蛋白，在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中每劑量包含10-100微克HSV蛋白。優(yōu)選地，可這樣選擇劑量一個單獨(dú)劑量就足夠，或者是在幾個月療程中施用幾個劑量。對于含有HSV多核苷酸或肽的組合物，每劑施用相似的量。
在一個實(shí)施方案中，可在52周內(nèi)施用1至10個劑量。優(yōu)選地，按1個月的間隔施用6個劑量，之后可周期性地給予加強(qiáng)疫苗接種。不同的方式可能適合不同的病人。適當(dāng)劑量是指當(dāng)按上述方式施用時可提高抗病毒免疫應(yīng)答并且超過基礎(chǔ)(即未處理)水平至少10-50％的組合物的量。該疫苗還應(yīng)該能夠引起可導(dǎo)致接種患者比未接種患者有改善的臨床表現(xiàn)的免疫應(yīng)答。一般地，對于含有一種或多種多肽的藥物組合物和疫苗，每種多肽在劑量中的量的范圍是從每kg宿主體重約100ug到5mg。優(yōu)選地，該量的范圍是從每劑量約10ug到約1000ug。施用的適當(dāng)體積將隨患者的身體大小、年齡和免疫狀態(tài)的不同而改變，但典型地在約0.1ml到約5ml之間，最通常的是體積小于約1ml。
含有免疫細(xì)胞的組合物優(yōu)選從獲自組合物待施用對象的免疫細(xì)胞制備?；蛘呖蓮腍LA相容性供體制備該免疫細(xì)胞。采用本領(lǐng)域已知常規(guī)技術(shù)從對象或供體獲得該免疫細(xì)胞，將其暴露于經(jīng)修飾呈遞本發(fā)明表位的APC，離體增殖，然后施用給對象。離體治療的方法描述于Rosenberg等，1990，New England J.Med.9570-578。此外，組合物可含有經(jīng)修飾呈遞本發(fā)明表位的APC。
正如本文所述，免疫細(xì)胞一般可通過體外生長獲得足夠用于過繼免疫治療的量。將單個抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞擴(kuò)增至幾十億個細(xì)胞并保留其體內(nèi)抗原識別的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域所熟知的。典型地，這種體外培養(yǎng)條件是采取抗原進(jìn)行間歇式刺激，通常該刺激在細(xì)胞因子(如IL-2)和非分裂飼養(yǎng)細(xì)胞存在下進(jìn)行。如上所述，可使用本文提供的免疫反應(yīng)性多肽富集和快速擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞培養(yǎng)物，以便產(chǎn)生足夠量的細(xì)胞用于免疫治療。具體地，抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、纖維原細(xì)胞和/或B細(xì)胞可采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用免疫反應(yīng)性多肽刺激(pulse)，或用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)染。例如，可用含有適合在重組病毒或其它表達(dá)系統(tǒng)中增加表達(dá)的啟動子的多核苷酸轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞。治療中使用的培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞必須能夠廣泛地生長和分布，并且能夠在體內(nèi)長期存活。研究顯示通過用添加IL-2的抗原重復(fù)刺激可誘導(dǎo)培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞體內(nèi)生長并以相當(dāng)大的數(shù)量長期存活(見，例如Cheever等，1997，免疫學(xué)評論(Immunological Reviews)157177)。
通過本文所述或其它本領(lǐng)域已知的許多途徑進(jìn)行的用藥可簡單地采用注射針、導(dǎo)液管或相關(guān)裝置在一個單一的時間點(diǎn)或多個時間點(diǎn)通過直接施用來完成。被鑒定抗原的體外測試可使用常規(guī)技術(shù)來證實(shí)鑒定的HSV抗原的體內(nèi)效力。例如，一種技術(shù)使用小鼠攻擊模型。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白這些方法均是常規(guī)的，而且可使用其它模型。
當(dāng)待測化合物或組合物制備好后，通過一系列注射免疫小鼠或其它對象。例如，可在幾個月的療程內(nèi)進(jìn)行多達(dá)10次的注射，典型地劑量間間隔1到4周。在該系列注射的最后一次后，用已建立的通用致死病毒劑量攻擊該對象。對照組接受安慰劑，而實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行主動接種。此外，研究可設(shè)計(jì)采用亞致死劑量?？蛇x擇包括劑量-應(yīng)答研究。本研究中待測量的終點(diǎn)包括死亡和經(jīng)例如脊髓步態(tài)(spinal cord gait)證實(shí)的嚴(yán)重神經(jīng)學(xué)損傷。也可將存活者殺死以進(jìn)行關(guān)鍵器官的定量病毒培養(yǎng)，這些器官包括脊髓、腦和注射位置?？蓽y量碾碎的組織樣品中存在的病毒量。也可在原先感染的動物中測試組合物降低疾病復(fù)發(fā)的能力以證實(shí)其作為治療疫苗的效力。
可通過計(jì)算IC50確定效力，該值顯示了為防止50％的對象死亡每千克體重所需要的疫苗微克數(shù)。IC50取決于使用的攻擊劑量。此外，可計(jì)算LD50，它反映了殺死一半接受了特定劑量疫苗的對象所需要的感染單位數(shù)。死亡后病毒滴度的測定證實(shí)免疫系統(tǒng)限制了病毒復(fù)制。
測試的下一階段可是陰道接種攻擊。對于急性保護(hù)研究，可采用小鼠進(jìn)行。由于豚鼠既可用于急性保護(hù)研究又可用于疾病復(fù)發(fā)防止研究，所以提供了一種用于外推至人的生理學(xué)上更為相關(guān)的對象。在這種類型的攻擊中，施用非致死劑量，豚鼠對象產(chǎn)生愈合和復(fù)發(fā)的損傷。測量可包括急性疾病改善和損傷復(fù)發(fā)。依據(jù)希望研究防止還是治療，可在接種前或后用疫苗或其它組合物進(jìn)行干涉。方法本發(fā)明提供治療和/或防止對象HSV感染的方法。該方法包括給對象施用本發(fā)明的組合物。該組合物可用作治療或預(yù)防性疫苗。在一個實(shí)施方案中，HSV是HSV-2。作為替代，HSV是HSV-1。本發(fā)明還提供用于抑制HSV復(fù)制、殺傷HSV感染細(xì)胞、增加具有抗病毒和/或免疫調(diào)節(jié)活性的淋巴因子的分泌以及增強(qiáng)皰疹特異性抗體產(chǎn)生的方法。該方法包括用針對本發(fā)明抗原的免疫細(xì)胞接觸HSV感染細(xì)胞，例如按本文給出的實(shí)施例中所描述進(jìn)行。該接觸可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是T細(xì)胞。T細(xì)胞包括CD4和CD8 T細(xì)胞。本發(fā)明的組合物還可用作抗免疫病理疾病例如眼病(如皰疹性角膜炎)的致耐受劑(tolerizing agent)。
此外，本發(fā)明提供制備抗HSV的免疫細(xì)胞的方法。該方法包括用抗原呈遞細(xì)胞接觸免疫細(xì)胞，其中該抗原呈遞細(xì)胞經(jīng)修飾呈遞本發(fā)明多肽所包含的抗原。優(yōu)選地，該抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。該細(xì)胞可通過例如肽裝載或用編碼該多肽的核酸序列進(jìn)行的遺傳修飾來修飾。在一個實(shí)施方案中，該免疫細(xì)胞是T細(xì)胞。T細(xì)胞包括CD4和CD8 T細(xì)胞。此外還提供通過該方法制備的免疫細(xì)胞。該免疫細(xì)胞可用于體外或體內(nèi)抑制HSV復(fù)制、殺傷HSV感染細(xì)胞、增加具有抗病毒和/或免疫調(diào)節(jié)活性的淋巴因子的分泌、增強(qiáng)皰疹特異性抗體的產(chǎn)生，或用于治療或防止對象的HSV感染。
本發(fā)明提供鑒定與感染性生物相關(guān)的免疫原性表位的方法。在一個實(shí)施方案中，該方法包括制備該生物基因組隨機(jī)片段的集合。該制備可包括消化該全基因組，盡管以完整基因組開始并不是必須的。該消化優(yōu)選包括用一種或多種限制酶接觸該基因組以獲得具有所需長度范圍的隨機(jī)片段集合。作為替代方法，可將含有目的基因組的材料超聲破碎、霧化或其它處理，然后從合適大小的凝膠片段中分離。
設(shè)計(jì)該消化和限制酶的選擇，以獲得比T細(xì)胞表位平均長度更長的基因組片段，即長度大于約30個核苷酸。優(yōu)選地，該片段足夠小以至于遺傳終止位點(diǎn)稀少，例如長約200到約500堿基對。在目的生物的基因組序列或限制性圖譜已知時，可分析基因組以鑒定限制性位點(diǎn)，如果用合適的限制酶消化，則可獲得期望數(shù)目的適當(dāng)長度片段。還可選擇限制酶以使其位點(diǎn)與所用克隆載體中的位點(diǎn)相容。
然后該隨機(jī)片段可用于表達(dá)該片段所編碼的多肽。該片段可單個地表達(dá)，或優(yōu)選作為多肽庫單獨(dú)或以融合蛋白的形式表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可從作為起始物的DNA或RNA表達(dá)多肽。例如，可通過首先從RNA片段制備cDNA，然后用此cDNA表達(dá)多肽，實(shí)現(xiàn)從RNA病毒表達(dá)多肽。優(yōu)選地，多肽表達(dá)成不溶性包涵體。以不溶性包涵體形式表達(dá)多肽允許多肽以APC容易加工和呈遞的形式大量表達(dá)。表達(dá)成包涵體的蛋白易于純化，提供了一種表達(dá)和加工的高度有效的方法，而且有利于該方法在未測序生物中應(yīng)用。
可從含有基因組片段的載體表達(dá)多肽。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該載體是質(zhì)粒例如pUEX載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可使用其它能從插入片段表達(dá)多肽的載體。優(yōu)選地，多肽表達(dá)為融合蛋白。一個優(yōu)選的融合蛋白例子是不溶性β-半乳糖苷酶融合蛋白。在一個實(shí)施方案中，該表達(dá)包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了含有基因組片段的載體的宿主細(xì)胞。在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，片段以兩個方向三種不同的閱讀框方式連入表達(dá)載體。
該方法還包括回收表達(dá)的多肽。例如，可通過收集培養(yǎng)宿主細(xì)胞的上清回收培養(yǎng)宿主細(xì)胞表達(dá)的多肽?；厥盏亩嚯目蛇M(jìn)一步采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從上清中純化。表達(dá)為不溶性包涵體的多肽的回收可采用例如不溶性包涵體的超聲處理、溶菌酶裂解和去污劑輔助分離，參見Neophytou等，1996，美國科學(xué)院院刊，932014-2018。
該方法還包括分析表達(dá)多肽引起免疫應(yīng)答的能力。引起免疫應(yīng)答的能力反映了多肽中免疫原性表位的存在。在一個實(shí)施方案中，該免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫應(yīng)答。該分析可包括進(jìn)行測量T細(xì)胞刺激或激活的實(shí)驗(yàn)。T細(xì)胞的例子包括CD4和CD8 T細(xì)胞。
T細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)的一個例子是T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，參見例如以下實(shí)施例1或D.M.Koelle等，1994，病毒學(xué)雜志68(5)2803-2810。該T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)可包括例如用抗原呈遞細(xì)胞和針對該病毒的T細(xì)胞接觸表達(dá)多肽，然后測量T細(xì)胞的增殖?？赏ㄟ^測量3H-胸苷的摻入或其它增殖標(biāo)記確定T細(xì)胞增殖。與響應(yīng)對照抗原的T細(xì)胞增殖相比，如果在暴露于測試抗原的T細(xì)胞中檢測到增殖增加，則該增殖分析反映了T細(xì)胞刺激。增殖增加的一個示例性標(biāo)準(zhǔn)是，與對照細(xì)胞培養(yǎng)物相比，測試物的沉淀核酸制備物中摻入的3H-胸苷的液體閃爍計(jì)數(shù)每分鐘計(jì)數(shù)值(cpm)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加。另一個T細(xì)胞刺激或激活實(shí)驗(yàn)的例子是細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)。以下的實(shí)施例1中提供細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)的一個例子。
可對多肽庫進(jìn)行該分析以鑒定含有活性成分的庫。然后可進(jìn)一步分析逐漸縮小的原庫子集以分離目標(biāo)多肽。可純化含有目標(biāo)片段的物質(zhì)如含有病毒插入片段的質(zhì)粒，并對該病毒片段測序。根據(jù)獲得的序列信息，可制備合成多肽用于進(jìn)一步測試和驗(yàn)證鑒定的抗原。片段的測序還可導(dǎo)致新基因的識別。
可重復(fù)上述方法步驟，其中制備基因組片段的亞片段?？蓪χ饾u縮小的片段進(jìn)行表達(dá)和測試以確定最小表位。
可將本發(fā)明方法應(yīng)用于多種感染性微生物，包括細(xì)菌、寄生蟲和病毒。優(yōu)選的病毒含有無內(nèi)含子的DNA或大多為編碼序列的DNA。病毒的例子包括雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒、雙鏈RNA病毒和單鏈RNA病毒。雙鏈DNA病毒的例子包括但不限于Epstein-Barr病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、單純皰疹病毒-1(HSV-1)、HSV-2、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、人皰疹病毒6(HHV-6)、HHV-7、HHV-8、痘病毒和腺病毒。單鏈DNA病毒的例子包括但不限于細(xì)小病毒。雙鏈RNA病毒的例子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒和呼腸弧病毒。單鏈RNA病毒的例子包括但不限于副粘病毒、粘病毒和黃病毒。
因?yàn)樵摲椒ú恍枰锏暮怂嵝蛄行畔?，所以它提供了一種對抗表現(xiàn)出極大生物學(xué)變異性的感染性生物(如HIV和HCV)的策略。對于顯示出高變異性的病毒，利用特定病人特定部位(如血、皮膚、子宮頸)來源的病毒核酸物質(zhì)資源，或在特定地理學(xué)區(qū)域或病人群體中傳播的代表性病毒株是有利的，這些病毒可能與已知核酸序列的原型株不同。
本發(fā)明還提供一種診斷方法。該診斷方法可用于鑒定懷疑患有皰疹感染的病人的免疫學(xué)反應(yīng)性，以及預(yù)測對象對特定治療過程的反應(yīng)性。該方法包括將對象的T細(xì)胞在存在適當(dāng)APC的情況下暴露于本發(fā)明的抗原，并通過例如測量IFNγ、增殖或細(xì)胞毒性來檢測免疫反應(yīng)性。適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ斠妼?shí)施例。
實(shí)施例以下實(shí)施例用于闡述本發(fā)明并幫助普通技術(shù)人員操作和使用本發(fā)明。這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1HSV-2內(nèi)膜(tegument)蛋白中病毒表位的鑒定該實(shí)施例顯示采用全長病毒DNA的表達(dá)克隆鑒定T細(xì)胞抗原的方法。本文描述了通過表達(dá)克隆發(fā)現(xiàn)的可被損傷浸潤T細(xì)胞識別的5種HSV表位。還描述了通過表達(dá)克隆以外的其它方法發(fā)現(xiàn)的VP16中的幾個表位。病毒和細(xì)胞在Vero細(xì)胞(D.M.Kollele等，1993，J.Clin.Invest.，91961-968)中生長和滴定HSV-1的E115株(S.L.Spruance和F.S.Chow，1980，J.Infect.Dis.，142671-675.)、HSV-2的333株(S.Kit等，1983，Biochim.Biophys.Acta.，741158-170)、雜交型重組病毒RS1G31(M.F.Para等，1983，病毒學(xué)雜志，451223-1227)、DX32(V.G.Preston等，1978，病毒學(xué)雜志，28499-517)和RP-2(D.M.Koelle等，1994，病毒學(xué)雜志，682803-2810)。Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞傳代細(xì)胞系(EBV-LCL)(D.M.Kollele等，1993，見上)包括來源于患生殖器皰疹的供體的自體細(xì)胞系、HLA DPB1*0402純合的AMAI、HLA DQB10501純合的HOM2、HLA DQB1*0201純合的MAT以及HLA DPB1*2001純合的ARENT(J.G.Bodmer等，1996，組織抗原(Tissue Antigens)49297-321)。
經(jīng)Institutional Review Board同意后獲取HSV特異性T細(xì)胞。大多數(shù)克隆的獲得未經(jīng)抗原的第二次體外刺激。供體1、2和4的編號同以前所述(D.M.Kollele等，1994，病毒學(xué)雜志，682803-2810)，并分別是損傷來源克隆1.L3D5.10.8、2.3和4.2E1的來源；克隆2.3和4.2E1以前已有描述(D.M.Kollele等，1994，見上)。另外的損傷來源克隆來自供體ES以及供體RH和KM，其中克隆ESL2.20、ESL3.335、ESL4.34和ESL4.9獲自ES供體的第二、第三、第四個損傷樣品(相互之間間隔一年)?？寺?.3、4.2E1、ESL2.20、RH.13、和KM.17直接來源于皰疹小泡液體(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169956-961)。為了獲得CD4 TCC ESL4.9，進(jìn)行了復(fù)發(fā)性生殖器HSV-2損傷的活組織檢查，并按前人所述(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09)在存在無環(huán)鳥苷時用PHA和IL-2(Schiaperelli Biosystems，Columbia，MD)擴(kuò)增大量損傷浸潤細(xì)胞。16天后，按1細(xì)胞/孔的密度克隆細(xì)胞(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169956-961)。以前描述的VP-16特異性克隆1A.B.25、ESL3.334和ESL4.34(D.G.Doherty等，1996，人類免疫學(xué)(HumanImmunol.)47149；K.R.Jerome等，1998，病毒學(xué)雜志，72436-441；D.M.Kollele等，1997，人類免疫學(xué)，53195-205)同樣來源于粗培養(yǎng)物。
一些克隆采用抗原第二次體外刺激獲得。為從供體1獲得另外的TCC(D.M.Kollele等，1994，病毒學(xué)雜志，682803-2810)，從克隆1A.B.25(見上)取樣時的復(fù)發(fā)6年后得到的(癥狀第5天)4個2mm活檢組織的每一個制備PHS處理的粗培養(yǎng)物。16天后，在2ml T細(xì)胞培養(yǎng)基中用10ug/ml HSV-2 VP22 105-190(見下)和等量輻射(3300rad)過的自體PBMC刺激來自一個活檢培養(yǎng)物的1.5×106個粗淋巴細(xì)胞(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169956-961)。從第6天開始加入IL-2(32U/ml)。按前人所述(D.M.Kollele等，1994，見上)在第12天從該細(xì)胞系分離TCC 1.L3D5.10.8。為產(chǎn)生PBMC來源的TCCSB.17和BM.17，在25孔板中用4ug/ml桿狀病毒來源的全長VP16，刺激HSV-2血清反應(yīng)陽性供體SB和BM的1.5×106PBMC 12天；以1細(xì)胞/孔克隆應(yīng)答細(xì)胞。最后一次刺激后10-14天使用TCC和細(xì)胞系。
除了ARENT外所有的細(xì)胞系均是支原體陰性。DNA探針測試(Genprobe，San Diego，CA)顯示ARENT最初為支原體陽性，在使用前用10ug/ml環(huán)丙沙星(S.M.Gignac等，1991，Leukemia 5162-165)處理兩周，測試反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮浴Ａ魇郊?xì)胞計(jì)數(shù)鼠mAb與人CD4(克隆SRCI 12T4D11)和CD8(識別人CD8α鏈的克隆SFC 21Thy2D3)(Coulter，Hialeah，F(xiàn)L)結(jié)合用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。免疫印跡按前人所述方法(R.A.Ashley等，1988，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.26662-667)制備HSV感染的Vero細(xì)胞裂解物，10％SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用PBS-0.05％Tween20-1％脫脂干奶粉封閉印跡。依次與1∶100稀釋的UL49基因產(chǎn)物VP22特異mAb P43(G.D.Elliott等，1992，J.Gen.Viol.，73723-736)、親和純化的羊抗鼠IgM-過氧化物酶偶聯(lián)(Sigma，St.Louis.，MO)、以及TMB底物系統(tǒng)(Kirkegaard和Perry，Gaithersberg，MD)一起孵育，并且每步間在PBS-Tween中洗滌(3次×5分鐘)，以檢測抗原。病毒DNA文庫和克隆對于亞基因組DNA，從Bgl II i片段中亞克隆HSV-2的HG-52株的BamH I w片段，并凝膠純化。病毒DNA用Sma I消化，然后用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)平BamH I末端，并且通過酚抽提和乙醇沉淀純化DNA片段。對于整個病毒DNA，用HSV-2的HG52株感染匯合成片的Vero細(xì)胞。通過蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提和異丙醇沉淀從3個150cm2細(xì)胞培養(yǎng)物中制備總核酸。獲得的物質(zhì)用Range H處理，并重復(fù)抽提和沉淀。部分(1ug)HG52的DNA用Sma I或Alu I消化，按如上所述合并和回收80％的消化產(chǎn)物用于創(chuàng)建表達(dá)文庫。
采用pUEX載體進(jìn)行表達(dá)克隆(G.M.Bressan等，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1510056)。用Sma I線形化pUEX-1、-2和-3 DNA，以小牛腸磷酸酶去磷酸化，并凝膠純化。將大約100ng載體與500ng DNA片段連接，取10％的乙醇沉淀的反應(yīng)混合物在1mm小玻璃管中通過電穿孔(BTX，San Diego，CA)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Electromas株(GIBCO)。在1ml SOC培養(yǎng)基中復(fù)蘇1小時后，一部分(每個100ul)凍存為甘油儲存物，一部分(250ul)在氨芐青霉素平板上30℃滴定，一部分(250ul)直接用于蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生融合蛋白文庫。每個轉(zhuǎn)化分離出數(shù)千個氨芐青霉素抗性克隆。為擴(kuò)增基因組文庫，甘油儲存物在2YT-氨芐青霉素中30℃生長過夜，之后重新凍存。
通過分離UL49的262堿基對Sma I-Stu I片段、UL50的583堿基對Sma I片段、或UL50的397堿基對Sma I-Stu I片段，分別進(jìn)行VP22105-190、UL50 118-312、和UL50 118-250的驗(yàn)證性亞克隆。將片段克隆入合適的線形化凝膠純化的pUEX載體中，在大腸桿菌DH5I中表達(dá)蛋白。通過測序證實(shí)構(gòu)建物?？乖?08-109pfu/ml的全病毒制備物用UV失活30分鐘(A.Mikloska和A.L.Cunningham，1998，J.Gen.Virol.，79353-361)，按1∶100的最終稀釋度使用。按已有方法(D.M.Kollele等，1997，人類免疫學(xué)，53195-205)合成VP22肽，以2mg/ml儲存在DMSO中。均在桿狀病毒中表達(dá)的UL48肽和全長VP16肽獲自Chiron公司(ChironCorporation，Emeryville，CA)，UL48肽長13個氨基酸，并與HSV-2的VP16第1-416位氨基酸有4個氨基酸重疊。
在2YT氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中30℃生長至對數(shù)期(OD6000.4-0.6)的細(xì)胞中，42℃誘導(dǎo)細(xì)菌來源的蛋白抗原表達(dá)2小時。按已有方法(P.I.Neophytou等，1996，美國科學(xué)院院刊，932014-2018)，但省去凝膠純化步驟，進(jìn)行蛋白純化。50ml細(xì)菌培養(yǎng)物(文庫)或5-10ml培養(yǎng)物(庫和克隆)在200-400ul PBS(無Ca無Mg)中產(chǎn)生細(xì)顆粒懸液。在1％SDS中60℃溶解蛋白10分鐘后，通過BCA(Pierce，Rockford，IL)測定蛋白濃度。在一些實(shí)驗(yàn)中，用PBS和PBS/10mM EDTA洗滌熱誘導(dǎo)細(xì)菌，加熱至56℃ 10分鐘，在用作抗原之前用PBS洗滌。
在鑒定了病毒DNA的活性文庫之后，對于亞基因組病毒DNA片段，抗原鑒定采用了30-60個克隆，而對于全長病毒DNA則使用了2,000-3,000個克隆。對于較不復(fù)雜的文庫，將每個克隆的1ml培養(yǎng)物加工成6-8個克隆的庫?；钚詭熘械拿恳粋€克隆以及含有已知病毒DNA片段的驗(yàn)證性亞克隆均制備成5ml培養(yǎng)物。采用組合方法(P.I.Neophytou等，1996，美國科學(xué)院院刊，932014-2018)篩選全病毒DNA的文庫。將轉(zhuǎn)化細(xì)菌的擴(kuò)增文庫甘油儲存物在氨芐青霉素平板上滴定；在96孔板中加入20-30克隆/孔，于旋轉(zhuǎn)振蕩器上30℃培養(yǎng)過夜。按1∶100將培養(yǎng)物稀釋至1ml，并按上述方法誘導(dǎo)融合蛋白的合成。按排和列將培養(yǎng)物部分(每份400ul)收集在一起用于蛋白純化并在淋巴增殖實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行評價。如果一排和一列以上的評價結(jié)果是陽性，則采用陽性排和一個陽性列交叉的孔從5-10ml培養(yǎng)物中制備蛋白以明確地鑒定陽性孔。用陽性孔的稀釋培養(yǎng)液接種氨芐青霉素平板，獲得細(xì)菌的培養(yǎng)物(n＝96個克隆)。按(12個細(xì)菌克隆的)庫的形式評價這些克隆，然后評價單個克隆。淋巴細(xì)胞功能性分析實(shí)驗(yàn)在96孔U型底平板中進(jìn)行三個重復(fù)增殖分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)孔中加入200ul T細(xì)胞培養(yǎng)基，其中含有104個克隆的T細(xì)胞、作為抗原呈遞細(xì)胞的105個輻射過的(3300rad)PBMC或2.5×104個輻射過的(8000rad)EBV-LCL以及抗原(D.M.Kollele等，1997，人類免疫學(xué)，53195-205)。當(dāng)將加熱殺死的細(xì)菌作為抗原時，每孔加入相當(dāng)于(失活前)105cfu的細(xì)菌以及慶大霉素(20ug/ml)。72小時后，每孔加入1uCi[3H]胸苷，18小時后收獲細(xì)胞，并通過液體閃爍計(jì)數(shù)計(jì)算胸苷的摻入量。標(biāo)準(zhǔn)偏差小于平均值的10％。結(jié)果以平均cpm或Δcpm(Δcpm等于測試抗原的平均cpm減去對照抗原的平均cpm)的形式給出。對于全病毒抗原，對照抗原是模擬感染細(xì)胞裂解物，而對于重組蛋白制備物則是pUEX2來源的β-半乳糖苷酶。為測定粗培養(yǎng)的損傷來源T細(xì)胞的反應(yīng)性，融合蛋白或?qū)φ咋?半乳糖苷酶的使用量是10ug/ml。 HSV-2的糖蛋白B和D以及VP16的使用量是1ug/ml，并且實(shí)驗(yàn)按已有方法(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09)進(jìn)行。為測定HLA限制性座位，按已有方法(D.M.Kollele等，1994，病毒學(xué)雜志，682803-2810)使用HLA DR特異性mAb L243(V.G.Preston等1978，病毒學(xué)雜志，28499-517)、HLA DP特異性mAb B7.21(A.J.Watson等，1983，自然(Nature)，304358-360)、或HLA DQ特異性mAb SpV-L3(H.Spits等，1984，Eur.J.Immunol.，14299-304)。
按已有方法(D.M.Kollele等，1993，J.Clin.Invest.，91961-968)采用4小時51Cr釋放進(jìn)行三個重復(fù)細(xì)胞溶解分析。按已有方法(W.W.Kwok等，1996，J.Exp.Med.，1831253-1258)，在洗滌之前將靶EBV-LCL用HSV-3以30的感染復(fù)數(shù)感染18小時，或用1.0uM肽刺激90分鐘。效應(yīng)物與靶細(xì)胞的比為20∶1。自發(fā)釋放少于28％。DNA測序?qū)υ诩?xì)菌中產(chǎn)生活性蛋白的質(zhì)粒中病毒插入片段進(jìn)行兩個方向的完全測序(Taq DyeDeoxy FS試劑盒，Perkin-Elmer ABI，F(xiàn)oster City，CA)，起始引物是CATGGCTGAATATCGACGGT(SEQ ID NO1；插入片段的5’末端)和CTAGAGCCGGATCGATCCGGTC(SEQ ID NO2；插入片段的3’末端)，然后按需要設(shè)計(jì)內(nèi)部引物。HLA分型按血清學(xué)方法或在DNA水平上通過反向點(diǎn)印跡雜交，對II類等位基因進(jìn)行HLA DR和DQ分型(E.Mickelson等，1993，組織抗原，4186-93)。HLA DP分型通過測序進(jìn)行(HLA DP試劑盒，Perkin ElmerABI)。結(jié)果T細(xì)胞表位的精確定位為減少用于表達(dá)克隆的文庫復(fù)雜性，選擇已用HSV-1×HSV-2雜交型重組病毒(IRV)進(jìn)行了部分作圖的TCC識別抗原。除VP16之外，0.7圖距單位附近的HSV DNA編碼T細(xì)胞抗原。用IRV DX32改善TCC4.2E1和2.3的表位作圖(D.M.Kollele等，1994，病毒學(xué)雜志，682803-2810)(圖1A)。該基于HSV-2的病毒在0.7圖距單位附近含有一個HSV-1 DNA塊(V.G.Preston等，1978，病毒學(xué)雜志，28499-517)。通過與HSV-2型特異的和VP-16特異的(D.M.Kollele等，1994，病毒學(xué)雜志，682803-2810)T細(xì)胞克隆1A.B.25反應(yīng)顯示，UL48基因產(chǎn)物具有HSV-2表型。UL49(圖2)和UL50基因產(chǎn)物(M.V.Williams，1987，病毒學(xué)(Virology)，156282-292；F.Wohlrab，1982，病毒學(xué)雜志，43935-942)也具有HSV-2表型。因此，IRV DX32中存在的HSV-2 DNA包括UL48、UL49、UL50，并很可能包括居間的UL49.5。因?yàn)門CC 4.2E1和2.3與RS1G31和DX32反應(yīng)，而不與RP2反應(yīng)(圖1B)，所以最有可能識別UL49、UL49.5或UL50。通過表達(dá)克隆確定T細(xì)胞抗原選擇HSV-2的Bamm HI w片段用于表達(dá)克隆，因?yàn)槠浜蠻L49、UL49.5和大部分UL50的編碼序列(A.Cress和S.J.Triezenberg，1991，基因(Gene)，103235-238；G.D.Elliott和D.M.Meredith，1992，J.Gen.Virol.，73723-736；N.J.Maitland等，1982，Infect.Immun.，38834-842)。70％-90％的隨機(jī)克隆含有插入片段；它們均是病毒來源的。篩選對每一種TCC最有效的文庫(pUEX1對TCC 4.2E1，pUEX3對TCC 2.3)(表1)，并通過庫和單個克隆的隨后測試，檢測單個反應(yīng)性細(xì)菌克隆(表2)?？寺?.1.3編碼引起TCC 4.2E1增殖的融合蛋白。該克隆含有UL49的反向80bp Sma I片段，對于β-半乳糖苷酶而言正向并符合閱讀框的預(yù)測編碼第105-190位氨基酸的HSV-2 UL49DNA的262bp Sma I片段，以及UL49的246bp Sma I片段(該片段正向但不符合閱讀框，這是由于在262bp Sma I片段與242bp Sma I片段的接頭處有一個C殘基的缺失)?？寺?.19含有編碼UL50的118-312位氨基酸的583 bp Sma I片段，該片段之后是UL49的反向80和96bpSma I片段。
表1.鑒定引起HSV特異的TCC增殖([3H]胸苷摻入的平均cpm)的蛋白文庫。自體EBV-LCL(克隆4.2E1和2.3)或PBMC作為APC，并且文庫來源的融合蛋白抗原按1∶300稀釋。數(shù)據(jù)為[3H]胸苷摻入的平均cpm。
1文庫名稱列出了表達(dá)載體、HSV-2限制性片段的名稱或全長病毒DNA的株系、以及用以消化病毒DNA的限制性酶。2105輻射過的(3300rad)自體PBMC與模擬感染細(xì)胞裂解物或UV-處理的HSV-2抗原。
T細(xì)胞抗原的鑒定通過定向亞克隆和重疊的肽來證實(shí)。將編碼HSV-2 UL49第105-190位氨基酸的262bp Sma I片段亞克隆至pUEX3中，產(chǎn)生質(zhì)粒49.262.12。該蛋白刺激TCC 4.2E1(表2)。只有HSV-2VP22的肽105-126(GGPVGAGGRSHAPPARTPKMTR；SEQ ID NO3)具有刺激作用(圖3)。將編碼UL50的第118-312和118-250位氨基酸的DNA片段亞克隆至pUEX3中。這些片段表達(dá)的融合蛋白是有活性的(表2)。表2.HSV-2反應(yīng)性TCC的抗原特異性。使用1∶900稀釋的細(xì)菌來源的重組融合蛋白抗原。使用自體EBV-LCL(克隆4.2E1)或PBMC作為APC。<p>[實(shí)施例352]和[實(shí)施例353]
5-{3-氯-4-(甲硫基)苯基}-2，2-二甲基-4-苯基-3(2H)-呋喃酮步驟1制備1-{3-氯-4-(甲硫基)苯基}-2-苯基-乙烷酮
首先0℃下在2-氯硫代茴香醚(3.0g)在120ml二氯甲烷中的攪拌溶液內(nèi)緩慢添加2.8g的氯化鋁和3.0g的苯基乙?；取Ｔ谠摐囟认聰嚢璺磻?yīng)混合物12小時。將反應(yīng)溶液傾倒在冰和鹽酸水溶液上。所得溶情況下，HSV-2 DNA的單個Alu I片段的插入均符合閱讀框并且是正向的。肽作圖說明第187-206位氨基酸(圖3C)刺激TCC ESL4.9。融合蛋白作為粗損傷浸潤T細(xì)胞的探針在用于探測損傷浸潤T細(xì)胞的粗培養(yǎng)物的HSV抗原組中增加了新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞抗原。首先獲得的標(biāo)本是獲自患者1臀部HSV-2復(fù)發(fā)第5天(病毒培養(yǎng)物陽性)的一組四個活檢標(biāo)本(每個2mm)(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09；D.M.Kollele等，1994，病毒學(xué)雜志，682803-2810)。所有四個活檢標(biāo)本顯示了與VP22105-190的反應(yīng)性，但不與β-半乳糖苷酶、糖蛋白B或D、或VP16反應(yīng)。用VP22 105-190融合蛋白重復(fù)刺激原初粗培養(yǎng)物一個周期后獲得TCC。TCC 1.L3D5.10.8(圖3B)對VP22(105-190)和組成肽的增殖應(yīng)答說明在VP22中存在第三個T細(xì)胞表位，其包含在第125-146位氨基酸中。在內(nèi)膜蛋白VP16中鑒定另外的T細(xì)胞表位VP16中的三個表位(表3)均是HSV-2型特異的，它們以前已獲得了鑒定(K.R.Jerome等，1998，病毒學(xué)雜志，72436-441)，并且從7個患者中的4個(57％)的生殖器HSV-2損傷浸潤淋巴細(xì)胞的粗培養(yǎng)物中檢測到對全長VP16的增殖應(yīng)答(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09)。采用了兩個策略在VP16中搜尋其它肽表位。第一個策略涉及篩選與HSV-2的重組VP16反應(yīng)的從損傷小泡液體回收的克隆組，隨后用肽進(jìn)行表位作圖。含有第185-197位氨基酸的肽以及含有重疊的209-221和213-225的肽分別對TCC RH.13和KM.7具有刺激作用(表3)。所有其它的VP16肽均是陰性的(＜500cpm)。第二個策略涉及使用PBMC作為起始物和用重組桿狀病毒來源的VP16進(jìn)行第二次體外刺激。來自于兩個個體的克隆(BM.17和SB.17)識別同一個肽(第437-493位氨基酸)以及β-gal-VP16融合蛋白和全病毒。按序列數(shù)據(jù)推測，所有這三個新鑒定的VP16表位均是不同類型共有的，HSV-1和HSV-2全病毒制備物均具有該表位(A.Cress和S.J.Triezenberg，1991，基因(Gene)，103235-238)。表3.HSV-2 VP16中損傷或PBMC來源的CD4 TCC識別的表位。數(shù)據(jù)是與培養(yǎng)基比較獲得的[3H]胸苷摻入的Δcpm，在所有情況中培養(yǎng)基的cpm均少于500cpm。
1VP16 1-492(來自桿狀病毒)的使用量是1ug/ml。β-gal-VP16180-492按1∶1,000稀釋使用。2肽的使用量是1uM。na＝未獲得nd＝未做HLA限制對識別0.7圖距單位附近編碼的抗原的TCC進(jìn)行HLA限制的詳細(xì)測定。VP22 105-126特異的TCC 4.2E1的增殖可被抗DP的mAb抑制84％，而抗DR或抗DQ mAb的抑制少于20％。TCC 4.2E1來自于DPB1*2001/DPB1*0402雜合供體。攜帶DPB1*2001而不是攜帶DPB1*0402的同種異體EBV-LCL呈遞抗原(表4)，說明為DPB1*2001所限制。UL50特異的TCC 2.3的增殖被抗DR的mAb抑制，而不被抗DP或抗DQ的mAb抑制。該克隆來自DRB1*0301/BRB1*0701雜合供體。來自DRB1*0301供體的同種異體PBMC呈遞抗原，這與抗原性肽與該等位基因產(chǎn)物的結(jié)合一致。然而，并不能排除通過連鎖的DR基因產(chǎn)物DRw52或DRw53進(jìn)行的呈遞。其它HLA限制研究總結(jié)在表5中。表4.損傷來源的CD4 TCC 4.2E1和2.3的限制性HLA等位基因的確定?？乖且?∶900稀釋的β-gal融合蛋白(表2)。數(shù)據(jù)是與培養(yǎng)基比較獲得的[3H]胸苷摻入Δcpm，在所有情況中培養(yǎng)基的cpm均少于500cpm。
1通過mAb的抑制確定的II類HLA座位的HLA型。2與使用相同APC的pUEX2對照蛋白(1∶1000稀釋)比較，該對照蛋白在每種情況中均產(chǎn)生少于500cpm的[3H]胸苷摻入。表5.損傷來源的內(nèi)膜特異性CD4 TCC的溶細(xì)胞活性，及確切特異性和HLA限制的總結(jié)。結(jié)果是特異釋放百分比，其中效應(yīng)物與靶之比除ESL4.34(10∶1)外為20∶1。Auto＝自體EBV-LCL作為靶細(xì)胞；allo＝同種異體EBV-LCL，其在相關(guān)HLA座位(如已知)或HLA DR和DQ不匹配。
auto＝自體allo＝同種異體na＝由于未進(jìn)行表位作圖和制備合成抗原肽所以未獲得nd＝未做1顯示CTL分析中用于攜帶所選TCC的靶標(biāo)的肽(1uM)。2HLA限制性座位和/或等位基因的最大程度鑒定。對象RH和KM進(jìn)行血清學(xué)分型；而其它對象在DNA水平上分型。3對于HLA DRB1*0402和DRBl*1301而言對象是雜合的，而且限制性等位基因還未確定。4對于HLA DRB1*0301和DRB1*1102而言對象是雜合的，而且限制性等位基因還未確定。
我們詳細(xì)研究了TCC BM.17的HLA限制。TCC BM.17和相似克隆SB.17的增殖被抗DQ的mAb的抑制90％，而僅被抗DR或抗DP的mAb抑制不足25％。供體BM和SB是HLA DQB1*0201/0501雜合的。在高濃度肽存在的情況下，DQB1*0201和DQB1*0501純合的EBV-LCL表現(xiàn)出向TCC BM.17呈遞抗原。然而，DQB1*0501的純合細(xì)胞比DQB1*0201的純合細(xì)胞呈遞肽的效率要高得多(圖4)。因此，VP16 431-449中的三個不同的但相互重疊的表位由HLA DQB1*0302、DQB1*0201和DQB1*0501呈遞。內(nèi)膜特異性CD4 T細(xì)胞克隆的CTL活性用EBV-LCL靶細(xì)胞測試具有新近和以前鑒定的特異性的CD4 TCC的細(xì)胞毒活性(表5)。測試的所有克隆表現(xiàn)出對裝載肽的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。對感染HSV-2的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性表現(xiàn)出較大的變異性。VP22特異的TCC 4.2E1有細(xì)胞溶解活性，而來自其它供體的VP22特異TCC則無。在測試的7個VP16特異T細(xì)胞克隆中，6個顯示出對HSV-2感染靶細(xì)胞的大于10％的細(xì)胞毒性。單個UL21和UL50特異的TCC對于病毒感染的靶細(xì)胞沒有細(xì)胞溶解活性。討論HSV特異性T細(xì)胞選擇性地浸潤復(fù)發(fā)的生殖器HSV-2損傷(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169956-961)。有CD4和CD8介導(dǎo)的成分參與的局部CTL活性與病毒的清除相關(guān)(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09)。局部HSV特異性T細(xì)胞識別的抗原是多樣的，而且在許多情況中是未知的(D.M.Kollele等，1994，病毒學(xué)雜志，682803-2810)。該實(shí)施例闡明了內(nèi)膜蛋白VP22和UL21以及病毒的dUTPase的識別，并提供了關(guān)于內(nèi)膜蛋白VP16的新信息。
本文描述的表達(dá)克隆系統(tǒng)對HSV是有效的。由于HSV基因組中內(nèi)含子很少，故可直接使用基因組雙鏈DNA。使用同樣的HSV-2株HG52(A.Dolan等，1998，病毒學(xué)雜志，72；2010-2021)篩選候選損傷來源的TCC和制備蛋白文庫。供體中的HSV-2株系和HG52之間相對低程度的株系變異性很少導(dǎo)致體內(nèi)識別表位的遺漏；自體分離物的使用將利于在具有較高株系變異性的病毒中應(yīng)用。
值得注意的是，用來自兩個供體的損傷浸潤TCC在兩個獨(dú)立的表達(dá)克隆實(shí)驗(yàn)中均檢測到與VP22的反應(yīng)性。在對第一套獲得的損傷浸潤淋巴細(xì)胞粗培養(yǎng)物的篩選過程中也檢測到VP22的反應(yīng)性。來自三個患者的其它10個克隆對于公開的UL49、UL21和UL50片段的反應(yīng)性是陰性的。
對于損傷浸潤C(jī)D4 T細(xì)胞，內(nèi)膜抗原可能是合適的靶標(biāo)，因?yàn)檫@些抗原很豐富。VP16和VP22大量存在在HSV-1中每個病毒粒體包含大約1.6×103個分子的VP16(Y.Zhang和J.L.C.McKnight，1993，病毒學(xué)雜志，671482-1492)和2.5-2.8×103個分子的VP22(J.Leslie等，1996，病毒學(xué)，22060-68)。對于UL21可獲得的信息較少(J.D.Baines等，1994，病毒學(xué)雜志682929-2936；J.A.Blaho等，1994，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26917401-17410)。病毒dUTPase是報(bào)道為HSV特異性CD4 T細(xì)胞應(yīng)答靶標(biāo)的第一個非病毒顆粒成分。和VP16及VP22一樣，該酶位于HSV-2(而非HSV-1)感染細(xì)胞的細(xì)胞核(F.Wohlrab等，1982，病毒學(xué)雜志，43935-942)。體內(nèi)抗原呈遞可在感染細(xì)胞中dUTPase的內(nèi)源合成后或感染細(xì)胞碎片的dUTPase抗原清除之后發(fā)生。dUTPase特異性TCC 4.2E1對HSV感染細(xì)胞的裂解說明至少在體外可發(fā)生內(nèi)源抗原的呈遞。
因?yàn)镃端與VP22融合表達(dá)的多肽可被共轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，所以以VP22融合形式表達(dá)蛋白作為佐劑制備物的一種形式可能是有意義的。這可通過VP22中異源表位的表達(dá)來測試。正如免疫共沉淀所顯示的那樣，HSV-1的VP16和VP22在感染細(xì)胞中以強(qiáng)的非共價形式結(jié)合。這些蛋白共定位于細(xì)胞的核周區(qū)域(G.Elliott等，1995，病毒學(xué)雜志，697932-7941；G.D.Elliott等，1992，J.Gen.Virol.，73723-736)。這種結(jié)合可能在刺激CD4 T細(xì)胞對VP16的明顯高水平的應(yīng)答中起作用。
總之，表達(dá)克隆允許發(fā)現(xiàn)新的HSV T細(xì)胞抗原。抗原特異性CD4 T細(xì)胞在損傷處的原位富集，允許通過抗原的第二次體外刺激無偏差地研究抗原庫。HSV基因組的有利特點(diǎn)允許直接使用全病毒DNA文庫。內(nèi)膜蛋白可與膜糖蛋白一起用作人類HSV疫苗候選者。實(shí)施例2其它HSV-2病毒表位的鑒定采用以上實(shí)施例1所述的表達(dá)克隆方法鑒定其它的HSV-2 T細(xì)胞抗原。結(jié)果揭示了兩個其它抗原。一個位于UL19的第1078-1319位氨基酸。UL19也被稱為主要衣殼抗原或VP5。另一個抗原是US8的第1-273位氨基酸，US8也稱為糖蛋白E。該US8抗原經(jīng)來源于子宮頸樣品的T細(xì)胞鑒定。實(shí)施例3全長UL49和UL50的效力該實(shí)施例顯示了全長UL49和UL50蛋白可有效刺激T細(xì)胞增殖。數(shù)據(jù)說明了大腸桿菌和Cos-7細(xì)胞中表達(dá)的全長UL49的抗原性，和Cos-7細(xì)胞中表達(dá)的全長UL50的抗原性。這些結(jié)果證實(shí)了上文描述的抗原是準(zhǔn)確鑒定的。
為了在原核系統(tǒng)中表達(dá)HSV-2的全長UL49蛋白，通過PCR從制備的HSV-2的HG52株DNA克隆該基因，使用的引物是該基因5’端的GGAAGATCTACCTCTCGCCGCTCCGTCA(SEQ ID NO4)和該基因3’端的CCGGAATTCTTGTCTGTCGTCTGAACGCG(SEQ ID NO5)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Bgl II和EcoR I消化后克隆在TA克隆載體pcR2.1-Topo(Invitrogen)的Bgl II和EcoR I位點(diǎn)中。然后將該基因亞克隆至載體pTrcHisB(Invitrogen)，之后亞克隆至pGEX-2T(Pharmacia)。與發(fā)表的序列(Dolan 1998)比較，HSV-2 UL49克隆的序列有一個編碼突變第244位氨基酸由絲氨酸突變成脯氨酸。該表達(dá)蛋白的預(yù)測氨基酸序列還缺失起始甲硫氨酸。UL49含有來源于載體pGEX2T的N端融合域。該質(zhì)粒命名為pGEX2T-UL49HSV2。
為產(chǎn)生原核表達(dá)的全長USV-2 UL49，用pGEX2T-UL49HSV2或?qū)φ湛召|(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。對數(shù)生長期的細(xì)菌在LB氨芐青霉素培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)至OD600為0.4。向一些試管加入β-D-硫代吡喃半乳糖異丙苷(IPTG)至0.3mM。細(xì)菌在37℃振蕩培養(yǎng)1.5小時。離心收集細(xì)菌并用含1mM EDTA的PBS洗滌3次，加熱至65℃10分鐘，再用PBS洗滌兩次以上，然后以大約1×109細(xì)菌/ml重懸在T細(xì)胞培養(yǎng)基中。使用熱殺死細(xì)菌懸液作為測試抗原。
為了在真核系統(tǒng)中表達(dá)HSV-2的全長UL49蛋白，采用具有閱讀校對功能的高保真DNA聚合酶通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)單獨(dú)重新擴(kuò)增該基因。采用相同的引物和模板。該基因直接克隆至pEGFP-C1(Clontech)的Bgl II和EcoR I位點(diǎn)。對整個UL49基因測序，結(jié)果與發(fā)表的序列一致。表達(dá)蛋白的預(yù)測氨基酸序列與病毒UL49的預(yù)測序列除了第1位氨基酸起始甲硫氨酸缺失外均一致。而且來源于載體pEGFP-C1的N端融合域預(yù)測也將表達(dá)。該質(zhì)粒命名為pEGFP-C1-UL49HSV2。
為了制備真核表達(dá)的HSV-2的全長UL49，用pEGFP-C1-UL49HSV2質(zhì)粒DNA或pEGFP-C1載體對照DNA通過脂轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞。48小時后，刮下細(xì)胞并超聲破碎，然后分離上清和沉淀相。使用9.4cm2培養(yǎng)皿的細(xì)胞產(chǎn)生300微升上清。將由一個9.4cm2培養(yǎng)皿產(chǎn)生的沉淀重懸在300微升培養(yǎng)基中。上清和沉淀制備物用作測試抗原。
為了在真核系統(tǒng)中表達(dá)HSV-2的全長UL50蛋白，采用具有閱讀校對功能的高保真熱穩(wěn)定DNA聚合酶通過PCR從HSV-2的HG52株DNA制備的DNA克隆該基因，所用引物是該基因5’端的TAAGGTACCTATGAGTCAGTGGGGGCCC(SEQ ID NO6)和該基因3’端的AAACTGCAGGAGGCGCGGTCTAGATGC(SEQ ID NO7)。該靶DNA作為BglII i片段的克隆，克隆至pUC9中。該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)KpnI和PstI消化后，克隆至同樣消化的pcDNA3.1-myc-his-B(Invitrogen)中。對載體和插入片段的接頭處序列進(jìn)行證實(shí)。該質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-myc-his-B-UL50HSV2。該表達(dá)蛋白的預(yù)測氨基酸序列與病毒UL50的預(yù)測序列一致。來源于載體pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也預(yù)測表達(dá)。為了將真核表達(dá)的HSV-2的全長UL50制備為測試抗原，完全按上述針對UL49的方法使用Cos-7系統(tǒng)。UL50的對照抗原通過pcDNA3.1-myc-his-B轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞制備。
將這些測試抗原加入含有200微升T細(xì)胞培養(yǎng)基的分析孔(96孔，U型底)中，每孔含有1×105個輻射過的自體外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以及1×104損傷來源的CD4+T細(xì)胞克隆，其中對UL49該T細(xì)胞克隆是ESL 4.9，而對UL50是克隆2.3(Kollele等，1994和1998以及最初的專利申請文獻(xiàn))。進(jìn)行兩次或三次重復(fù)分析。三天后，按實(shí)施例1中所述測量3H胸苷摻入量。
結(jié)果用刺激指數(shù)(測試抗原的3H胸苷摻入平均cpm/培養(yǎng)基對照的3H胸苷摻入平均cpm)以及Δcpm(測試抗原的3H胸苷摻入平均cpm-培養(yǎng)基對照的3H胸苷摻入平均cpm)來表示。按實(shí)施例1的描述和標(biāo)示，進(jìn)行陽性和陰性對照抗原操作。表6.在大腸桿菌BL21中原核表達(dá)的全長HSV-2 UL49的抗原性
表7.在CoS-7細(xì)胞中真核表達(dá)的全長HSV-2 UL49的抗原性
表8在CoS-7細(xì)胞中真核表達(dá)的全長HSV-2 UL50的抗原性
這些結(jié)果顯示HSV-2蛋白UL49和UL50當(dāng)以全長蛋白形式表達(dá)時保留了它們的免疫原性。在原核和真核系統(tǒng)中均進(jìn)行了UL49的研究，在真核系統(tǒng)中進(jìn)行了UL50的研究。實(shí)施例4全長UL21的效力為了在真核系統(tǒng)中表達(dá)HSV-2的全長UL21蛋白，采用具有閱讀校對功能的高保真熱穩(wěn)定DNA聚合酶，通過PCR從制備自HSV 2型HG52株DNA的DNA克隆該基因，所用引物在該基因5’端是CTGGGATCCATGGAGCTCAGCTATGCCACC(SEQ ID NO8)，和在該基因3’端是CGCGAATTCTCACACAGACTGGCCGTGCTG(SEQ ID NO9)。該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和EcoRI消化后，克隆至同樣消化的pGEX-5T中。從該質(zhì)粒，用BamHI和XhoI將其切下，并克隆至同樣消化的pcDNA3.1-myc-his-C(Invitrogen)。對載體和插入片段的接頭處序列進(jìn)行了證實(shí)。該質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-myc-his-C-UL21HSV2。該表達(dá)蛋白的預(yù)測氨基酸序列與病毒UL21的預(yù)測序列一致。預(yù)測來源于載體pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也將表達(dá)。為了將真核表達(dá)的HSV-2全長UL21制備為測試抗原，完全按針對UL49的所述方法使用Cos-7系統(tǒng)。UL21的對照抗原通過pcDNA3.1-myc-his-B轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞制備。
將UL21測試抗原加入含有200微升T細(xì)胞培養(yǎng)基的分析孔(96孔，U型底)中，每孔含有1×105個輻射過的自體外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以及1×104損傷來源的攜帶CD4的T細(xì)胞克隆ESL 2.20(Kollele等，1994和1998以及上面的實(shí)施例1)。分析進(jìn)行三次重復(fù)。三天后，按實(shí)施例1中所述測量3H胸苷摻入量。結(jié)果用刺激指數(shù)(測試抗原3H胸苷摻入的平均cpm/培養(yǎng)基對照3H胸苷摻入的平均cpm)以及Δcpm(測試抗原3H胸苷摻入的平均cpm-培養(yǎng)基對照3H胸苷摻入的平均cpm)來表示。按所示方法進(jìn)行陽性和陰性對照抗原操作；細(xì)節(jié)可參見實(shí)施例1。結(jié)果陳述于表9。
表9.在Cos-7細(xì)胞中真核表達(dá)的全長HSV-2 UL21的抗原性
實(shí)施例4群體中抗原的普遍性本實(shí)施例通過說明群體中對這些抗原應(yīng)答的普遍性來支持本發(fā)明抗原的防止和治療用途的實(shí)用性。為達(dá)到該目的，調(diào)查了7個通過型特異性血清學(xué)證明為HSV-2感染的個體。這些個體與HSV-2損傷處回收的指標(biāo)T細(xì)胞克隆的來源個體不同。
對于每個測試對象，分離PBMC并在24孔板中以2×106細(xì)胞/孔接種于2ml T細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后用1∶500稀釋的UV滅活HSV-2 333株體外刺激5天。此時加入40單位/ml重組人IL-2，再作用5至6天，產(chǎn)生短期HSV特異性細(xì)胞系，稱作B1細(xì)胞系。
按如下方法評價對每種HSV-2蛋白的反應(yīng)性。在96孔圓型底微量滴定板上進(jìn)行增殖分析，每種情況重復(fù)三次。每孔中加入1×105輻射過(3300 rad)的自體PBMC作為抗原呈遞細(xì)胞。每孔還加入1×104B1細(xì)胞。然后加入下列對照物質(zhì)培養(yǎng)基、1∶500稀釋的UV處理模擬病毒制備物、1∶500稀釋的UV處理HSV-2 333株、終濃度達(dá)到每ml 4微克的HSV-2糖蛋白B或D或VP16蛋白(純化的)。對UV處理HSV-2的應(yīng)答預(yù)期為陽性，用作細(xì)胞變異性和總體特異性的陽性對照。以前顯示糖蛋白B和D以及VP16是HSV特異性T細(xì)胞的靶位點(diǎn)(D.M.Kollele等，1994，病毒學(xué)雜志，68(5)2803-2810)。
對于新發(fā)現(xiàn)的抗原UL21、UL49、UL50，其全長基因的克隆和在真核Cos-7系統(tǒng)中的表達(dá)上面均已描述過，同樣基于空載體的對照抗原的制備上面也已描述過。對于新發(fā)現(xiàn)的抗原gE2(US8)，采用具有閱讀校對功能的高保真熱穩(wěn)定DNA聚合酶，通過PCR從制備自HSV2型HG52株DNA的DNA克隆該全長基因，所用引物在該基因5’端是CGGGGTACCTGCTCGCGGGGCCGGGTTGGTG(SEQ ID NO10)，在3’端是TGCTCTAGAGCCTTACCAGCGGACGGACGG(SEQ ID NO11)。該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)ACC65I和XhaI消化后，克隆至同樣消化的pcDNA3.1-myc-his-B(Invitrogen)中。該質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-myc-his-B-US8。對載體和插入片段的接頭處序列進(jìn)行了證實(shí)。該表達(dá)蛋白的預(yù)測氨基酸序列與病毒US8的預(yù)測序列一致。預(yù)測來源于載體pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也將表達(dá)。為了制備真核表達(dá)的全長HSV-2 US8，按以上所述使用Cos-7系統(tǒng)。對于4種新抗原(UL21、UL49、UL50和US8)的每一種以及對照，在三個重復(fù)增殖分析中按1∶20的最終稀釋度使用感染的Cos-7細(xì)胞超聲破碎后的上清和沉淀。
如果刺激指數(shù)(測試抗原3H胸苷摻入的平均cpm/培養(yǎng)基對照3H胸苷摻入的平均cpm)大于或等于4.0，則記為陽性反應(yīng)。對于UV HSV-2抗原，相關(guān)的對照抗原是UV模擬病毒。對于gB2、gD2和VP16，對照是培養(yǎng)基。對于在Cos-7細(xì)胞中表達(dá)的新抗原，對照抗原是用對照空載體轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的上清或沉淀。結(jié)果顯示于表10。已證明每一種新發(fā)現(xiàn)的抗原與至少一個研究對象有反應(yīng)性。大體上說，觀察到與UL49的反應(yīng)性具有更高頻率，而且類似于對已知抗原gB2和gD2的反應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)支持，除了最初在其中描述該T細(xì)胞反應(yīng)性的指標(biāo)對象外，其他人類個體能夠與這些HSV來源的抗原蛋白發(fā)生反應(yīng)。
表10.在一組7個隨機(jī)挑選的HSV-2感染的有免疫能力的成人中已知和新發(fā)現(xiàn)的HSV-2抗原的抗原性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在前面的描述中公開的概念和具體的實(shí)施方案可以容易地作為修飾或設(shè)計(jì)其它實(shí)施方案以執(zhí)行本發(fā)明相同目的的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，這些相當(dāng)?shù)膶?shí)施方案并不偏離在所附權(quán)利要求中給出的本發(fā)明的精神和范圍。
序列表<110>華盛頓大學(xué)(申請人/受讓人)David M.Koelle(僅為發(fā)明人)Lawrence Corey(僅為發(fā)明人)<120>免疫學(xué)單純皰疹病毒抗原及其使用方法<130>30967.3 WOU1<150>60/095,724<151>1998-08-07<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>20<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>1catggctgaa tatcgacggt<210>2<211>22<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>2ctagagccgg atcgatccgg tc<210>3<211>22<212>PRT<213>單純皰疹病毒<400>3Gly Gly Pro Val Gly Ala Gly Gly Arg Ser His Ala Pro Pro Ala Arg15 10 15Thr Pro Lys Met Thr Arg20<210>4<211>28<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>4ggaagatcta cctctcgccg ctccgtca<210>5<211>29<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>5ccggaattct tgtctgtcgt ctgaacgcg<210>6<211>28<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>6taaggtacct atgagtcagt gggggccc<210>7<211>27<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>7aaactgcagg aggcgcggtc tagatgc<210>8<211>30<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>8ctgggatcca tggagctcag ctatgccacc<210>9<211>30<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>9cgcgaattct cacacagact ggccgtgctg<210>10<211>31<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>10cggggtacct gctcgcgggg ccgggttggt g<210>11<211>30<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>11tgctctagag ccttaccagc ggacggacgg
權(quán)利要求
1.含有分離的單純皰疹病毒(HSV)多肽和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物，其中所述多肽包含UL19、UL21、UL49、或UL50蛋白或其片段。
2.含有分離的HSV多肽和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物，其中所述多肽含有選自如下序列的氨基酸序列(a) UL19的第1078-1319位氨基酸；(b) UL21的第148-181位氨基酸；(c) UL49的第105-190或177-220位氨基酸；(d) UL50的第118-312位氨基酸；(e) 糖蛋白E(gE)的第1-273位氨基酸；(f) VP16的第185-197、209-221或430-449位氨基酸；和(g) (a)-(f)的替代變體。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述多肽是融合蛋白。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述融合蛋白是可溶性的。
5.編碼含有選自下組的氨基酸序列的多肽的多核苷酸(a) UL19的第1078-1319位氨基酸；(b) UL21的第148-181位氨基酸；(c) UL49的第105-190或177-220位氨基酸；(d) UL50的第118-312位氨基酸；(e) 糖蛋白E(gE)的第1-273位氨基酸；(f) VP16的第185-197或209-221位氨基酸；和(g) (a)-(f)的替代變體。
6.含有權(quán)利要求5的多核苷酸的載體。
7.用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.生產(chǎn)HSV多肽的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞并回收由此產(chǎn)生的多肽。
9.通過權(quán)利要求8的方法產(chǎn)生的HSV多肽。
10.含有編碼HSV多肽的多核苷酸和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物，其中所述多肽包含UL19、UL21、UL49、或UL50蛋白或其片段。
11.含有權(quán)利要求5的多核苷酸和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
12.經(jīng)遺傳修飾表達(dá)UL19、UL21、UL49、或UL50蛋白或其片段的重組病毒。
13.經(jīng)遺傳修飾表達(dá)權(quán)利要求5的多肽的重組病毒。
14.權(quán)利要求12或13的病毒，其是牛痘病毒、金絲雀痘病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒或腺病毒。
15.含有權(quán)利要求14的病毒和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
16.權(quán)利要求1-4、10-11或15之任一項(xiàng)的藥物組合物，其還包含佐劑。
17.制備抗HSV的免疫細(xì)胞的方法，其包括用抗原呈遞細(xì)胞接觸免疫細(xì)胞，其中所述抗原呈遞細(xì)胞經(jīng)修飾呈遞UL19、UL21、UL49或UL50蛋白或如下多肽中包含的表位(a) UL19的第1078-1319位氨基酸；(b) UL21的第148-181位氨基酸；(c) UL49的第105-190或177-220位氨基酸；(d) UL50的第118-312位氨基酸；(e) 糖蛋白E(gE)的第1-273位氨基酸；(f) VP16的第185-197或209-221位氨基酸；和(g) (a)-(f)的替代變體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述免疫細(xì)胞是T細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述T細(xì)胞是CD4+或CD8+T細(xì)胞。
20.通過權(quán)利要求17-19之任一項(xiàng)的方法制備的免疫細(xì)胞。
21.殺死HSV感染細(xì)胞的方法，其包括用權(quán)利要求20的免疫細(xì)胞接觸HSV感染細(xì)胞。
22.抑制HSV復(fù)制的方法，其包括用權(quán)利要求20的免疫細(xì)胞接觸HSV感染細(xì)胞。
23.治療對象的HSV感染的方法，其包括給對象施用 1-4、10-11或15-16之任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求20的免疫細(xì)胞。
24.防止對象HSV感染的方法，其包括給對象施用權(quán)利要求1-4、10-11或15-16之任一項(xiàng)的組合物。
25.增強(qiáng)抗病毒或免疫調(diào)節(jié)性淋巴因子分泌的方法，其包括用權(quán)利要求20的免疫細(xì)胞接觸HSV感染細(xì)胞。
26.增強(qiáng)HSV特異性抗體產(chǎn)生的方法，其包括用權(quán)利要求20的免疫細(xì)胞接觸對象的HSV感染細(xì)胞。
27.治療或防止對象的HSV感染的方法，其包括給對象施用經(jīng)修飾呈遞UL19、UL21、UL49或UL50蛋白或如下多肽中包含的表位的抗原呈遞細(xì)胞(a) UL19的第1078-1319位氨基酸；(b) UL21的第148-181位氨基酸；(c) UL49的第105-190或177-220位氨基酸；(d) UL50的第118-312位氨基酸；(e) 糖蛋白E(gE)的第1-273位氨基酸；(f) VP16的第185-197或209-221位氨基酸；和(g) (a)-(f)的替代變體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞用能介導(dǎo)所述表位表達(dá)的病毒、肽或微球體修飾。
29.權(quán)利要求1-28之任一項(xiàng)的方法，其中所述HSV是HSV-2。
全文摘要
本發(fā)明提供對防止和治療HSV感染有用的HSV抗原。本文公開了經(jīng)證實(shí)可被皰疹損傷或子宮頸來源的T細(xì)胞識別的抗原和/或其組成表位。對本發(fā)明抗原具有特異性的T細(xì)胞顯示出對攜帶病毒編碼的肽表位的細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性,在許多情況下,顯示對感染HSV的細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性。負(fù)責(zé)T細(xì)胞特異性的免疫原性抗原的鑒定提供了改善的抗病毒治療和預(yù)防策略。含有本發(fā)明抗原或編碼本發(fā)明抗原的多核苷酸的組合物提供了用于防止和治療HSV感染的有效定向疫苗。
文檔編號C07K19/00GK1348463SQ99810454
公開日2002年5月8日 申請日期1999年8月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月7日
發(fā)明者D·M·科勒, L·克雷 申請人:華盛頓大學(xué)