專利名稱：：戊型肝炎病毒抗原、其抗原組合物、及其含有該抗原或抗原組合物的試劑盒和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種肝炎病毒抗原，尤其涉及一種戊型肝炎病毒抗原、其抗原組合物、及其含有該抗原或抗原組合物的試劑盒和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：HEV是一種無包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約7.2kb，有三個(gè)開放型讀碼框(0RF)，從5'端依次為非編碼區(qū)(NCR)、0RF1、0RF2、0RF3和3'端非編碼區(qū)及PolyA尾巴。其中0RF3與0RF1C末斷的一個(gè)氨基酸和0RF2的N端部分氨基酸重疊。0RF1編碼1690個(gè)氨基酸，主要是與病毒復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白。0RF2編碼660個(gè)氨基酸，為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。0RF3編碼123個(gè)氨基酸，功能尚不太清楚。目前國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)暫未對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確分類。Lu(LuL，LiCH，Hagedorn.2006.PhylogeneticanalysisofglobalhepatitisEvirussequences:geneticdiversity，subtypesandzoonosis.RevMedVirol16:5-36.)等對(duì)Genbank中421個(gè)HEV的核苷酸序列進(jìn)行了分析，HEV主要分為4個(gè)基因型，而且具有明顯的地域性。1型主要分布在亞洲和非洲等發(fā)展中國(guó)家，2型主要分布在墨西哥，3型主要在歐洲以及美洲等發(fā)達(dá)國(guó)家，4型主要在亞洲。中國(guó)即有1型，也有4型的流行。目前從豬等動(dòng)物中分離出了大量的HEV3型和4型的病毒株，認(rèn)為HEV3型和4型是人畜共患性，但1型和2型是否是人畜共患性傳染病尚需進(jìn)一步研究。戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的一種非甲非乙型病毒性肝炎。HE屬典型的自限型疾病，急性肝炎期約持續(xù)一到四周，一般不會(huì)發(fā)展成慢性肝炎。主要經(jīng)糞-口途徑傳播，既有散發(fā)，也有流行，在衛(wèi)生條件差的地區(qū)常引起大規(guī)模爆發(fā)流行，主要由水源污染所引起。感染率在1540歲青壯年最高，孕婦感染HEV后死亡率可達(dá)20%，尤其是懷孕三個(gè)月左右的孕婦致死率甚至高達(dá)25%，幸存者也有著較高的流產(chǎn)率和死胎率。接觸傳染的幾率較低，有可能存在垂直傳播和血液傳播。HE在亞洲、非洲和美洲等發(fā)展中國(guó)家人群中發(fā)生比較普遍，在一些地區(qū)可占到急性病毒性肝炎的50%，是導(dǎo)致發(fā)病和病死的重要因素。在一些非HE流行的國(guó)家的獻(xiàn)血員中HEV抗體陽(yáng)性率達(dá)15%。在非HE流行區(qū)的養(yǎng)豬者和與豬密切接觸的獸醫(yī)中，抗HEV抗體陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于普通獻(xiàn)血員。血清學(xué)和核酸檢測(cè)是戊型肝炎流行病學(xué)和臨床診斷的主要方法。其中前者主要是檢測(cè)血清中的抗HEV抗體IgM，IgG和IgA;核酸檢測(cè)主要是通過檢測(cè)血清，膽汁和糞便中的HEVRNA.，這些檢測(cè)可以互補(bǔ)用于幫助臨床區(qū)別新近感染和既往感染，以減少誤診?，F(xiàn)有的戊型肝炎病原學(xué)檢測(cè)主要有以下幾種方法1.免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)的方法主要針對(duì)抗HEV抗體，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)血清中的抗HEVIgM，IgG禾口IgA抗體?？笻EVIgG出現(xiàn)的較早，在急性期滴度升高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，目前其檢測(cè)主要采用間接ELISA法，利用重組的0RF2和0RF3抗原進(jìn)行檢測(cè)。世界范圍內(nèi)使用較為普遍的商業(yè)化試劑為Genelab公司和Abott公司的檢測(cè)試劑盒。他們均采用HEV1型和2型抗原為檢測(cè)抗原。但是，由于抗HEVIgG抗體持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，所以無法區(qū)別既往感染和近期感染。Chauetal認(rèn)為，IgA抗體也可以作為HEV近期或急性感染的標(biāo)識(shí)抗體，雖然其陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間與HEV診斷中的意義還有待臨床和流行病學(xué)研究的進(jìn)一步證實(shí)。但是，在急性期感染的診斷中，IgA的檢測(cè)可以作為IgM檢測(cè)的輔助試驗(yàn)，確證診斷。通常認(rèn)為，IgM作為急性感染最重要的標(biāo)志性抗體出現(xiàn)的要比IgG早。一個(gè)理想的IgM檢測(cè)試劑應(yīng)該具有以下特點(diǎn)靈敏，假陽(yáng)性率低，持續(xù)時(shí)間短，能夠區(qū)別近期感染和既往感染。目前國(guó)內(nèi)市面上廣泛應(yīng)用的商業(yè)化試劑是新加坡Genelab公司和北京的萬(wàn)泰公司所產(chǎn)。而大多數(shù)試劑所采用的抗原都是0RF2的C端和部分或全長(zhǎng)的0RF3抗原。另外，Zhangetal還報(bào)道了利用組合的單克隆抗體檢測(cè)血清中的HEV抗原的方法來診斷急性感染。其ELISA使用的是源于1型和4型的0RF2抗原。2.分子生物學(xué)檢測(cè)分子生物學(xué)檢測(cè)是指使用RT-PCR方法檢測(cè)血清，糞便，膽汁和組織等樣本中的HEVRNA.。然而，HEV病毒血癥持續(xù)時(shí)間很短，許多病人就醫(yī)時(shí)已經(jīng)錯(cuò)過病毒血癥或已接近末期，血液中的病毒RNA拷貝數(shù)很低，難以通過RT-PCR檢出，這種情況在醫(yī)藥衛(wèi)生條件不發(fā)達(dá)的發(fā)展中國(guó)家尤其突出，糞便排毒雖然持續(xù)時(shí)間略長(zhǎng)于病毒血癥，但樣品采集困難，易受污染且糞便中可能存在影響PCR的物質(zhì)。目前報(bào)道的RT-PCR在HE病人中檢出的陽(yáng)性率存在很大的差異，從30%到80%不等，這可能與樣品采集時(shí)間，保存情況，引物匹配，PCR條件和其他不確定因素有關(guān)。因此，目前檢測(cè)HEVRNA的RT-PCR診斷方法僅用于實(shí)驗(yàn)室研究，還沒有在臨床廣泛推廣應(yīng)用的商品化試劑。綜上，目前急需一種穩(wěn)定，快速，高靈敏度和特異性的HEV感染的診斷試劑和基因分型的試劑。為此，本發(fā)明人通過對(duì)HEV的0RF2和0RF3進(jìn)行分段表達(dá)，并經(jīng)檢測(cè)不通抗原片段的抗原性篩選出了最佳的檢測(cè)抗HEVIgM的抗原片段組合，獲得了靈敏度高，特異性強(qiáng)，可以盡早檢測(cè)樣品中出現(xiàn)的抗HEVIgM抗體的試劑盒，從而實(shí)現(xiàn)了在HEV感染的早期進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)診斷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種戊型肝炎病毒抗原，該抗原的抗原性較佳，特異性強(qiáng)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用如下技術(shù)方案—種戊型肝炎病毒抗原，其中所述抗原的抗原片段為pSl-6、pS4-6、pSl-l或pS4-l;所述pSl-6為1型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為351391到640660aa;所述pS4-6為4型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為365405到654674aa;所述pSl-1為1型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為120到90130aa;所述pS4-l為4型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為120到104144aa。優(yōu)選如下抗原片段所述pSl-6為1型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為371_660aa;所述pS4-6為4型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為385_674aa;所述pSl-1為1型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1-llOaa;所述pS4-l為4型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為l_124aa。本發(fā)明中，所述的1型HEV0RF2和4型HEV0RF2參見"1型與4型戊型肝炎病毒0RF2抗原性比較"(何鵬、張華遠(yuǎn)、王佑春和李卓的"1型與4型戊型肝炎病毒0RF2抗原性比較"，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志2006年3月第26巻第3期210-214)，其中1型HEV0RF2編碼660個(gè)氨基酸，4型HEV0RF2編碼674個(gè)氨基酸。如上述優(yōu)選的抗原片段具體如下pSl-6為編碼660個(gè)氨基酸的1型HEV0RF2中取371_660aa的片段；pS4-6為編碼674個(gè)氨基酸的4型HEV0RF2中取385_674aa的片段；pSl-l為編碼660個(gè)氨基酸的1型HEV0RF2中取l-110aa的片段；pS4-l為編碼674個(gè)氨基酸的4型HEV0RF2中取l-124aa的片段。本發(fā)明的另一目的在于提供一種戊型肝炎病毒抗原組合物，該抗原組合物抗原性強(qiáng)，特異性強(qiáng)，檢出時(shí)間早，更適于臨床應(yīng)用。本發(fā)明所述的抗原組合物為所述的抗原組合物為將pSl-6的C末端和pSl-l的N末端組合、pS4-6的C末端和pS4-l的N末端組合、pSl-6的C末端與pS4_l的N末端組合或pSl-l的N末端與pS4-6的C末端組合。優(yōu)選的，本發(fā)明所提供的抗原組合物為將pSl-6的C末端與pSl-l的N末端組合或?qū)S4-6的C末端與pS4-l的N末端組合而成的。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)戊型肝炎病毒IgM抗體的試劑盒，該試劑盒實(shí)現(xiàn)了在HEV感染的早期進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)診斷的目的，用于間接ELISA方法檢測(cè)HEVIgM抗體本發(fā)明所提供的試劑盒含有本發(fā)明所述的任一抗原或抗原組合物。本發(fā)明還提供所述的抗原或抗原組合物在檢測(cè)戊型肝炎病毒抗體中的應(yīng)用，即利用間接ELISA方法檢測(cè)樣本中HEVIgM抗體的體外方法。以下為本發(fā)明的詳細(xì)描述?，F(xiàn)已確認(rèn)的HEV基因組共存在3個(gè)開放讀碼框(0RF1-3)。0RF1(28-5106nt)編碼HEV病毒最大的蛋白，該蛋白約186kDa，包括至少4個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)。到目前為止只有很少實(shí)驗(yàn)室能夠表達(dá)完整的0RF1蛋白，分段表達(dá)的0RF1蛋白多用于功能學(xué)研究，目前0RF1片段僅在HEV抗體Western印跡檢測(cè)試劑中應(yīng)用，ELISA檢測(cè)試劑中很少使用。0RF2基因長(zhǎng)1980bp(約5147-7126nt)，編碼分子量約為72kDa的病毒衣殼蛋白。0RF2蛋白有一個(gè)111氨基酸的信號(hào)序列和三個(gè)可能用于分泌表達(dá)的潛在的羰基化位點(diǎn)。在HEV感染中0RF2蛋白抗體具有重要的意義，雖然HEV的感染極力仍未闡明，但作為HEV衣殼蛋白的0RF2蛋白在感染過程中很可能扮演著與宿主細(xì)胞膜上的受體結(jié)合并誘發(fā)病毒衣殼和進(jìn)入細(xì)胞的角色，因此目前一經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多數(shù)中和抗體都為抗0RF2蛋白抗體。目前用于抗體檢測(cè)的0RF2蛋白主要來源于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的完整0RF2蛋白和大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的0RF2蛋白片段，但不同的抗原表現(xiàn)出不同的抗體結(jié)合力，比如0RF2蛋白片段比0RF2蛋白全長(zhǎng)能更有效的結(jié)合恢復(fù)期病人血清中的抗HEV抗體。目前市場(chǎng)上所使用的試劑使用的抗原多為0RF2的C端片段，幾乎沒有使用其N端抗原的試劑。而且，其基因來源多為1型和2型。但是，在中國(guó)既有1型，也有4型，且4型的0RF2蛋白較1型的0RF2蛋白長(zhǎng)14個(gè)氨基酸。50RF3編碼HEV病毒的一個(gè)小磷酸化蛋白，分子量約為13.5kDa。它同被成為AMBP的肝細(xì)胞骨架蛋白相互作用。0RF3蛋白較小，其含有的抗原表位也相對(duì)較少，其C端，尤其是105-122aa據(jù)說抗原性較高，HE病人中針對(duì)該表位的抗體陽(yáng)性率較高，目前抗體診斷試劑中多包含0RF3蛋白的部分片段，其基因來源同0RF2，也多為1型和2型。而中國(guó)流行的4型HEV其0RF3蛋白較1型的0RF3蛋白短9個(gè)氨基酸。為了獲得檢測(cè)HEVIgM抗體的高靈敏度檢測(cè)方法，本發(fā)明人從患者的糞便樣品中釣出1型和4型的兩株病毒基因，將其在大腸桿菌中分段表達(dá)，比較兩個(gè)基因型間統(tǒng)一區(qū)域和基因型內(nèi)不通區(qū)域抗原片段的抗原性，篩選出最佳抗原，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。除非另外定義，這里所有的技術(shù)和科學(xué)名詞都表達(dá)的是在本發(fā)明涉及領(lǐng)域里熟練技術(shù)人員所理解的通常含義。這里所用的命名和在細(xì)胞培養(yǎng)，分子遺傳學(xué)，核酸化學(xué)，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。本發(fā)明的一方面，涉及兩個(gè)基因型HEV0RF2抗原的C末端和N末端抗原位點(diǎn)，其為所述抗原的抗原片段為pSl-6、pS4-6、pSl-l或pS4-1;所述pSl-6為1型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為351391到640660aa;所述pS4-6為4型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為365405到654674aa;所述pSl-l為1型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為120到90130aa;所述pS4-l為4型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為120到104144aa。優(yōu)選如下抗原片段所述pSl-6為1型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為371_660aa;所述pS4-6為4型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為385_674aa;所述pSl-l為1型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1-llOaa;所述pS4-l為4型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1-124aa。本發(fā)明的另一方面，涉及抗原組合物，戊型肝炎的一型和四型的0RF2抗原的兩端組合，即對(duì)應(yīng)亞型的N端和C端組合。具體為將所述的抗原組合物為將pSl-6的C末端和pSl-l的N末端組合、pS4-6的C末端和pS4-l的N末端組合、pSl_6的C末端與pS4_l的N末端組合或pSl-l的N末端與pS4-6的C末端組合。優(yōu)選將pSl-6的C末端與pSl-l的N末端組合或?qū)S4-6的C末端與pS4-l的N末端組合而成的。本發(fā)明的再一方面，涉及一種利用前述任一抗原組合物及其中的任何一種抗原用于間接ELISA方法檢測(cè)HEVIgM抗體的試劑盒。本發(fā)明涉及一種利用間接ELISA方法檢測(cè)樣本中HEVIgM抗體的體外方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明所提供的抗原或抗原組合物抗原性強(qiáng)、特異性強(qiáng)；2)本發(fā)明所提供的試劑盒靈敏度高，特異性強(qiáng)，可以盡早檢測(cè)樣品中出現(xiàn)的抗HEVIgM抗體的試劑盒，從而實(shí)現(xiàn)了在HEV感染的早期進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)診斷；3)本發(fā)明所提供的抗原或抗原組合物可應(yīng)用在檢測(cè)戊型肝炎病毒抗體中，從而利用間接ELISA方法檢測(cè)樣本中HEVIgM抗體的體外方法。圖l-A為純化后的融合多肽pSl-l到6的SDS-PAGE檢測(cè)；6圖1-B為純化后的融合多肽pS4-l到6的SDS-PAGE檢測(cè)；圖1-C為純化后的融合多肽pSl-9，pSl-7，pSl-8，pS4_9，pS4_7和pS4_8的SDS-PAGE檢測(cè)，其中M表示預(yù)染蛋白質(zhì)marker;圖2-A為免疫印跡分析已純化的融合多肽pS4-l到9的抗HEVIgM抗體反應(yīng)，圖中M表示預(yù)染蛋白質(zhì)marker;圖2-B為免疫印跡分析已純化的融合多肽pSl-9到1的抗HEVIgM抗體反應(yīng)，其中M表示預(yù)染蛋白質(zhì)marker,—抗為抗HEVIgM抗體反應(yīng)陽(yáng)性的猴子免疫血清；圖3-A、圖3-B、圖3_C和圖3-D為接種了人源的1型HEV感染的猴子的系列血清測(cè)多肽的HEVIgM反應(yīng);圖3-E和圖3-F為接種了人源的4型HEV感染的猴子的系列血清測(cè)多肽的HEVIgM反應(yīng)；圖3-G、圖3-H、圖3_I和圖3_J為接種了豬源的4型HEV感染的猴子的系列血清測(cè)多肽的HEVIgM反應(yīng);其中圖3-A-J中0周為接種前，接種后依次每周采血。其抗HEVIgM抗體用ELISA方法檢測(cè)，包被以下抗原1型的pSl-l，pSl-6和pSl-8，4型的pS4-l，pS4-6和pS4_8。其值使用S/CO表示，1作為陽(yáng)性臨界。圖4-A-J分別使用1型和4型的組合抗原pSH+pSl-6和pS4-l+pS4-6，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)圖3-A-J中的系列血中的抗HEVIgM反應(yīng)。圖5-A-C檢測(cè)急性肝炎患者系列血清中的IgM抗體。檢測(cè)方法是ELISA，包被抗原為1型和4型的單個(gè)抗原或組合抗原。405至lj654674aa20到90130aa;20到104144aa。具體實(shí)施例方式以下為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的實(shí)施例是為了進(jìn)一步描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1本實(shí)施例涉及兩個(gè)基因型HEV0RF2抗原的C末端和N末端抗原位點(diǎn)，其為所述pSl-6為1型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為351391到640660aa;所述pS4-6為4型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為365所述pSl-l為1型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1所述pS4-l為4型HEV0RF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1本實(shí)施例的具體實(shí)施方案為首先從臨床患者糞便樣本中釣出基因，經(jīng)測(cè)序分析分別屬于l型和4型。經(jīng)Bios皿生物軟件(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制開發(fā))分析其等電點(diǎn)和親水性，并根據(jù)文獻(xiàn)(PandaSK，ThakralD，RehmanS.2007.H印atitisEVirus.Rev.Med.Viroll7:151—180.)報(bào)道，按著兩個(gè)基因型對(duì)應(yīng)的原則(除了N端的一對(duì)抗原外，其他的基本位置相同)將0RF2蛋白分成六段；同理，將0RF3蛋白分成三段，其具體分段位置及命名見表1。表1.重組HEV-pBVILl融合蛋白及其對(duì)抗HEV1型和4型戊型肝炎病毒抗血清的免疫反應(yīng)7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>a抗HEVIgM抗體反應(yīng)陽(yáng)性b抗HEVIgM抗體反應(yīng)陰性或者檢測(cè)不到?？笻EVIgM抗體反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性dl型HEV比4型HEV0RF2全長(zhǎng)短14個(gè)氨基酸，同時(shí)，0RF3比后者長(zhǎng)9個(gè)氨基酸。所有抗原片段都克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pBVILl(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院構(gòu)建，參見ZL00100695.9)成功進(jìn)行表達(dá)(除了pS4_2，經(jīng)再次克隆進(jìn)pThioHis成功表達(dá))。經(jīng)常用的離子交換層析純化并凍干。其濃度測(cè)定使用商業(yè)化BCA試劑(VigorousBiotechnologyBeijingCo丄td，Beijing,China)，純度經(jīng)常規(guī)薄層掃描確定。將凍干的蛋白用碳酸鹽緩沖液以0.5mg/ml的濃度溶解，取8iU進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和免疫印跡分析。其中前者結(jié)果顯示所有抗原均呈現(xiàn)清晰條帶(圖l-A-C)，其分子量大小與預(yù)期一致，條帶單一，即成功表達(dá)純化后的蛋白基本無其他雜蛋白。后者WesternBlot檢測(cè)，其操作過程為常規(guī)操作，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Hybond-CExtra,0.45ym;AmershamBiosciences,LittleChalfont，Buckinghamshire，UK)，5X脫脂牛奶的，pH7.4的PBS封閉1.5h，一抗為試驗(yàn)感染的猴子陽(yáng)性血清的混合體，1:500稀釋。二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗人IgM抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.SantaCruz，CA)。所有的孵育液均為含1X牛奶的PBST。最后NBT/BCIP(Dingguo，beijing，China)顯色。結(jié)果分析顯示如圖2-A-B和表l。免疫印跡結(jié)果顯示各段抗原和抗體的結(jié)合能力是明顯不同的pSl-l，pSl-6，pSl-8，pSl-9，pS4-l，pS4-6，pS4-8和pS4_9是兩個(gè)基因型中對(duì)應(yīng)位置結(jié)合能力都比較強(qiáng)的抗原片段。其他抗原片段或者沒有反應(yīng)，或者反應(yīng)很弱，或者兩個(gè)基因型間不一致。進(jìn)一步將所有的抗原片段包被ELISA板。檢測(cè)的系列血清來源于十只試驗(yàn)感染的猴子，其中編號(hào)為JEll，JE12，JE47，JE48的猴子的攻擊毒株為人源的1型HEV;JE13，JE14的攻擊毒株為人源的4型HEV;JE15，JE16，JE51，JE52的攻擊毒株為豬源的4型HEV。其結(jié)果顯示(圖3-A-J):1)兩個(gè)不同基因型的0RF2的對(duì)應(yīng)區(qū)域的抗原片段在檢測(cè)系列血時(shí)無明顯差別；2)同一基因型的0RF2的不同抗原片段有不同的抗原性，兩端的PS1_1，pS4_l，pSl-6，pS4-6抗原的抗原性最佳；3)0RF2的N端和C端表現(xiàn)出互補(bǔ)性；4)兩個(gè)不同基因型的0RF3的對(duì)應(yīng)區(qū)域的抗原片段顯示出基因型的特異性；5)0RF3的pSl_8，pS4_8抗原和IgM抗體反應(yīng)性最好；6)抗0RF2抗原的抗體在系列血清中出現(xiàn)的時(shí)間要比抗0RF3抗原的抗體早，且持續(xù)時(shí)間短；7)在系列血清中抗pSl-l，pS4-l，pSl-6，pS4_6抗原的抗體出現(xiàn)時(shí)間早于轉(zhuǎn)氨酶的升高。綜上，本發(fā)明人選擇pSl-l，pS4-l，pSl-6，pS4-6抗原作為檢測(cè)抗HEVIgM抗體的最佳抗原。實(shí)施例2本實(shí)施例涉及抗原組合物，戊型肝炎的一型和四型的0RF2抗原的兩端組合，即對(duì)應(yīng)亞型的N端和C端組合。具體為將pSl-6的C末端與pSl-1的N末端組合或?qū)S4-6的C末端與pS4-l的N末端組合而成的。在實(shí)施例1的試驗(yàn)中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)0RF2蛋白的N端和C端抗原在檢測(cè)抗HEVIgM抗體時(shí)具有互補(bǔ)性，將pSl-1和pSl-6，pS4-l和pS4-6分別組合包被檢測(cè)上述十只猴子的系列血清，結(jié)果顯示(圖4-A-J)，組合抗原的檢出時(shí)間和單個(gè)看抗原的檢出時(shí)間幾乎一致，但是組合包被抗原后的試劑靈敏性增強(qiáng)，其檢測(cè)陽(yáng)性率是兩個(gè)個(gè)體抗原的檢測(cè)率的累加。例如，pSl-l和pSl-6組合后除了JE16，可以檢測(cè)出其他所有的系列血中的抗體，相比之下，基于pSl-l單一抗原的試劑卻又三份血清陰性，而僅以pSl-6為基礎(chǔ)的試劑也有兩份血清陰性?？乖慕M合比例為基于各自單獨(dú)包被的濃度l:1。實(shí)施例3本實(shí)施例涉及一種利用前述抗原組合物及其中的任何一種抗原用于間接ELISA方法檢測(cè)HEVIgM抗體的試劑盒。9試驗(yàn)采用間接ELISA法，使用96孔聚苯乙烯板進(jìn)行包被，使用pH9.6的碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋成0.5mg/ml。采用梯度稀釋法選擇最佳包被濃度，即將欲包抗原梯度稀釋進(jìn)行包被，分別選取確證陽(yáng)性和陰性的樣品作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，隨著抗原包被濃度的減小，其P/N值會(huì)逐漸變大，達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，本發(fā)明人選擇此時(shí)的抗原濃度作為ELISA的抗原包被濃度。選擇的抗原pSl-l，pSl-6，pS4-l，pS4-6，pSl-l+pSl-6和pS4-l+pS4-6的最適包被濃度分別為0.5，2.0，0.5，2.0，0.5+2.0和0.5+2.0yg/ml，每孔加100溶液，37t:，2h，然后fC過夜，pH7.4的PBST洗滌三次后，每孔加入含20%牛血清的包被緩沖液200iU，37t:封閉2h，去除封閉液，保存于4t:備用。使用100份抗HEVIgG和IgM雙陰性的獻(xiàn)血源血清進(jìn)行CUT-OFF值的確定，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。pSl-l，pSl-6，pS4-l，pS4-6，pSl-l+pSl-6和pS4-l+pS4-6抗原包被板的平均值加標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.241±0.071，0.359±0.123，0.345±0.097forpS4_l，0.366±0.127，0.174-/+0.055和0.251-/+0.029。當(dāng)CUT-OFF值設(shè)為平均值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)所有的陰性樣品呈陰性。其值大約等于每個(gè)板子的三個(gè)陰性對(duì)照的平均值依次加上0.21，0.36，0.29，0.38，0.16和0.09。進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，使用含5X牛血清的PBST將待測(cè)樣品1:10稀釋，100ul/孔加入包被有抗原的微孔板中，37°C孵育30min，PBST洗滌5遍，然后每孔加入lOOulHRP標(biāo)記的濃度為0.liig/ml的抗人IgM抗體，空白孔除夕卜，37t:，30min孵育后，去除液體，并用PBST洗滌5遍，加入TMB底物，37。C顯色15min，在波長(zhǎng)450nm和630nm處讀取各空A值。實(shí)施例4本試驗(yàn)例涉及利用1型HEV0RF2的C末端抗原、位點(diǎn)為371_660aa的pSl_6間接ELISA方法檢測(cè)HEVIgM抗體的試劑盒。本實(shí)施例所采用的方法與實(shí)施例3相同，結(jié)果顯示其抗原性較佳，試劑靈敏性增強(qiáng)。對(duì)于1型HEV0RF2的C末端抗原、位點(diǎn)為351391至lj640660aa的其它pSl-6抗原片段進(jìn)行了類似的試驗(yàn)，其結(jié)果與該實(shí)施例的結(jié)果一致。實(shí)施例5本試驗(yàn)例涉及利用4型HEV0RF2的N末端抗原、位點(diǎn)為l_124aa的pS4_l間接ELISA方法檢測(cè)HEVIgM抗體的試劑盒。本實(shí)施例所采用的方法與實(shí)施例3相同，結(jié)果顯示其抗原性較佳，試劑靈敏性增強(qiáng)。對(duì)于4型HEV0RF2的N末端抗原、位點(diǎn)為120到104144aa的其它pS4_l抗原片段進(jìn)行了類似的試驗(yàn)，其結(jié)果與該實(shí)施例的結(jié)果一致。實(shí)施例6本實(shí)施例涉及一種利用間接ELISA方法檢測(cè)樣本中HEVIgM抗體的體外方法。本發(fā)明人使用所建立組合抗原包被的ELISA方法檢測(cè)了三份臨床患者系列血清，其結(jié)果見圖5-A-C。以1028為例，隨著轉(zhuǎn)氨酶逐漸趨于正常，抗0RF3的抗體逐漸升高，達(dá)到峰值后降低，而系列血清中抗0RF2組合抗原IgM抗體隨著轉(zhuǎn)氨酶的降低漸漸降低，當(dāng)轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常時(shí)，抗體也基本檢測(cè)不到。截止到檢測(cè)的最后一份樣品，患者血清中抗0RF2抗體和轉(zhuǎn)氨酶都基本恢復(fù)正常，而抗0RF3抗體卻還很強(qiáng)。所以，相對(duì)抗0RF3的IgM抗體，抗0RF2的抗體持續(xù)的時(shí)間短。10權(quán)利要求一種戊型肝炎病毒抗原，其特征在于所述抗原的抗原片段為pS1-6、pS4-6、pS1-1或pS4-1；所述pS1-6為1型HEVORF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為351～391到640～660aa；所述pS4-6為4型HEVORF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為365～405到654～674aa；所述pS1-1為1型HEVORF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1～20到90～130aa；所述pS4-1為4型HEVORF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1～20到104～144aa。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒抗原，其特征在于所述pSl-6為1型HEVORF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為371660aa;所述pS4-6為4型HEV0RF2的C末端抗原，其位點(diǎn)為385674aa;所述pSl-l為1型HEVORF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1110aa所述pS4-l為4型HEVORF2的N末端抗原，其位點(diǎn)為1124aa。3.—種戊型肝炎病毒抗原組合物，其特征在于所述的抗原組合物為將pSl-6的C末端和pSl-l的N末端組合、pS4-6的C末端和pS4-l的N末端組合、pSl-6的C末端與pS4-l的N末端組合或pSl-l的N末端與pS4-6的C末端組合。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的戊型肝炎病毒抗原組合物，其特征在于所述的抗原組合物為將pSl-6的C末端與pSl-l的N末端組合或?qū)S4-6的C末端與pS4-l的N末端組合而成的。5.—種檢測(cè)戊型肝炎病毒IgM抗體的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒含有權(quán)利要求1所述的任一抗原或權(quán)利要求3所述的任一抗原組合物。6.權(quán)利要求1或2所述的抗原在檢測(cè)戊型肝炎病毒抗體中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求3或4所述的抗原組合物在檢測(cè)戊型肝炎病毒抗體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種戊型肝炎病毒抗原，該抗原的抗原片段為pS1-6、pS4-6、pS1-1或pS4-1；pS1-6為1型HEVORF2的C末端抗原，位點(diǎn)為351～391到640～660aa；pS4-6為4型HEVORF2的C末端抗原，位點(diǎn)為365～405到654～674aa；pS1-1為1型HEVORF2的N末端抗原，位點(diǎn)為1～20到90～130aa；pS4-1為4型HEVORF2的N末端抗原，位點(diǎn)為1～20到104～144aa。本發(fā)明還涉及含有所述抗原的組合物及其含有所述任一抗原或抗原組合物的試劑盒以及在檢測(cè)戊型肝炎病毒抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的戊型肝炎病毒抗原其抗原性強(qiáng)、特異性強(qiáng)；本發(fā)明所提供的試劑盒和應(yīng)用可盡早檢測(cè)樣品中出現(xiàn)的抗HEVIgM抗體，從而實(shí)現(xiàn)在HEV感染的早期進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)診斷。文檔編號(hào)G01N33/53GK101735311SQ20081022731公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月26日優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日發(fā)明者宋曉國(guó),張賀秋,王佑春,馬紅霞申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品標(biāo)準(zhǔn)化研究中心;中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所