一種戊型肝炎病毒熒光定量pcr檢測試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，更為具體地說，涉及一種戊型肝炎病毒熒光定量 PCR檢測試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 戊型肝炎病毒OfepatitisEvirus，HEV)是戊型肝炎（以下簡稱"戊肝"）的病原 體，主要通過糞一口途徑傳播，在人群中可引起散發(fā)、暴發(fā)和流行。HEV在病毒學(xué)分類上屬于 戊型肝炎科，哺乳動(dòng)物HEV至少可分為4種基因型，即基因1型、2型、3型和4型HEV(以下 分別簡稱HEV-1、HEV-2、HEV-3和HEV-4)。通過研究發(fā)現(xiàn)各基因型具有明顯的地域分布特 點(diǎn)：基因1型主要分布在亞洲和北非；基因2型主要分布在墨西哥及部分西非國家；基因3 型為全球分布，主要集中在歐美、日本等發(fā)達(dá)國家；基因4型則主要在我國和日本等亞洲國 家流行。HEV-1和HEV-2僅見于人，HEV-3和HEV-4為人畜共患型，可感染人、豬、鹿、貓等， 其中豬是其主要的動(dòng)物宿主。
[0003] HEV是單股正鏈無包膜RNA病毒，病毒體呈球形，直徑約為32-34nm。HEV基因組全 長約7. 2kb，5'端為戊基鳥嘌呤帽，3'端則為多聚腺嘌呤尾，包含三個(gè)部分重疊的開放閱讀 框。0RF1臨近5'末端，編碼一個(gè)長度約為1693個(gè)氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白包含戊基 轉(zhuǎn)移酶、木瓜樣半胱氨酸激酶、MacroDomain、RNA解旋酶、RNA依賴的RNA聚合酶等多個(gè)病 毒復(fù)制所需的功能性結(jié)構(gòu)域。0RF2位于3'末端，編碼長度為660aa的病毒衣殼蛋白，該蛋 白N末端含有一個(gè)信號(hào)序列可以將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行糖基化修飾和病毒組裝；研究 表明0RF2蛋白458-607位氨基酸含有HEV的中和表位。0RF3的絕大部分與0RF2重疊，編 碼一個(gè)長度僅為114aa的蛋白，對于病毒后期形態(tài)形成和釋放出胞具有至關(guān)重要的作用。
[0004] 而目前在臨床戊肝診斷的方法中，主要是采用基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Polymerase ChainReaction，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的技術(shù)及其改進(jìn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來 發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測裝置 能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號(hào)，通過檢測熒光 信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過軟件自動(dòng)分析獲 得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)（即Ct值）以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判 斷陰陽性結(jié)果，并得知樣本濃度的定值結(jié)果。因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測和定量 分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。但是，僅有極少量熒光PCR診 斷試劑盒在HEV診斷中使用，且缺乏完善的質(zhì)控體系，操作比較繁瑣，靈敏度不高，檢測范 圍小，因此，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確快速診斷的 需要。
[0005] 國內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測戊型肝炎病毒的方法，這些試 劑盒所提供的HEV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法，然而酚-氯仿法和柱提取 法存在很多不足之處：1)酚-氯仿法是最經(jīng)典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對于設(shè)備和 人員操作要求高，低病毒載量的標(biāo)本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法無 需高速離心，但是需頻繁更換離心管，用時(shí)長，特異性較差、準(zhǔn)確度差；2)無法有效去除樣 本中的PCR抑制物3)無法監(jiān)控假陰性；4) 一般沒有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的措施；5)現(xiàn)有方法 檢測靈敏度欠佳，可能出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種戊型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒及其使用方法， 以解決【背景技術(shù)】所述的現(xiàn)有HEV檢測方法準(zhǔn)確度差的問題。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種戊型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括 PCR反應(yīng)液，且所述PCR反應(yīng)液包括PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于擴(kuò) 增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于檢測靶多核苷酸的探針；
[0009] 所述用于檢測靶多核苷酸的探針的堿基對序列為：
[0010] 5 'FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGC-BHQ13 '。
[0011] 優(yōu)選地，所述用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的堿基對序列為：
[0014] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)為插入PUC18T載體的一段長為 128堿基對的人工合成DNA序列的重組體，且所述128堿基對的序列為：
[0016] 優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)液還包括用于檢測內(nèi)標(biāo)的探針，所述檢測內(nèi)標(biāo)的探針的堿 基對序列為：
[0017] 5 'HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13 '。
[0018] 優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)液還包括用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引物；所述上 游引物以及下游引物的堿基對序列為：
[0021] 優(yōu)選地，所述DNA聚合酶為1U/μ1~5U/μ1TthDNA聚合酶和1U/μ1~5U/μ1 H-TaqDNA聚合酶。
[0022] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括陽性對照，所述陽性對照是濃度為1.00~ 5. 00E+05copies/ml的HEV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄RNA。
[0023] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括陰性對照，所述陰性對照為陰性人造血清。
[0024] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括RNA洗脫液，所述RNA洗脫液包括0. 8~1. 2mol/ L的Tris-HCl和 0· 1 ~1.Omol/L的EDTA。
[0025] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括RT-PCR增強(qiáng)劑，所述RT-PCR增強(qiáng)劑為濃度是 100 ~500mmol/L的Mn(0Ac)2。
[0026] 優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括：
[0027] RNA提取溶液I:由質(zhì)量/體積比為0. 2%~1. 0%的十二烷基硫酸鈉、體積/體積 比為1. 0%~4. 0%的曲拉通，0. 2mol/L~1.Omol/L的異硫氰酸胍、100~400μg/ml的磁 珠組成；
[0028]RNA提取溶液II:濃度為100~300mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和濃度為 100~300mmol/L的氯化鈉；所述RNA提取溶液II的pH為6. 5±0. 2 ;
[0029] RNA提取溶液III :由體積/體積比為0. 1%~1. 0%的曲拉通、濃度為100~ 300mmol/L的氯化鈉；
[0030]RNA提取溶液IV:礦物油。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種戊型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒的使用方法，所述使 用步驟包括：
[0032]S01:取體積比為1000-1200:1的RNA提取溶液I和內(nèi)標(biāo)，混和均勻并形成RNA提 取試劑I-mix，瞬時(shí)離心后備用；
[0033]S02:取體積比為49:1的PCR反應(yīng)液和RT-PCR增強(qiáng)劑，混和均勻并形成PCR-mix， 瞬時(shí)離心后備用；
[0034]S03:在滅菌離心管中加入200μ1~1mlRNA提取溶液I-mix，加入100μ1~1ml 待測樣本，震蕩混勻，瞬時(shí)離心后備用；
[0035]S04:在步驟S03瞬時(shí)離心后備用的溶液中加入50μ1~400μ1RNA提取溶液II， 震蕩混勻，靜置；
[0036] S05 :靜置結(jié)束后瞬時(shí)離心，并將滅菌離心管置于磁珠分離器上，緩慢將溶液吸出 棄用，磁珠備用；
[0037] S06 :在備用的磁珠內(nèi)加入400μ1~1ml的RNA提取溶液III和100μ1~500μ1 的RNA提取溶液IV，震蕩混勻并瞬時(shí)離心，然后將滅菌離心管再次置于磁珠分離器上；
[0038] S07 :上清液分為兩層，將吸頭插入滅菌離心管底部，從底部開始緩慢將液體完全 吸出丟棄，靜置后，將管底殘余液體完全吸出丟棄，上清液中的上層液保留備用；
[0039] S08 :在上述保留備用的上清液的上層液中加入10 μ 1~100ul RNA洗脫液，將滅 菌離心管壁上磁珠洗脫到管底，吸打混勻，靜置后將滅菌離心管再次置于磁珠分離器上，然 后將洗脫下來的RNA吸至新的滅菌離心管中；
[0040] S09 :在八聯(lián)管中加入45μ1的PCR-mix，并取步驟S08的新的滅菌離心管中已處 理好的樣本RNA、陰性對照、陽性對照各5μ1加入到PCR-mix中，蓋好管蓋，形成待測樣品；
[0041]S10:將待測樣品放置在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行測試。
[0042] 本發(fā)明所提供的戊型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒包括PCR反應(yīng)液，且所述 PCR反應(yīng)液包括PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上 游引物以及下游引物和用于檢測靶多核苷酸的探針。本發(fā)明所提供的戊型肝炎病毒熒光定 量PCR檢測試劑盒能夠?qū)θ嘶騽?dòng)物的血清或血楽:標(biāo)本中的HEV進(jìn)行定量分析，且僅能檢測 出HEV的RNA，而不能檢測出其它病原體的RNA，進(jìn)而說明本發(fā)明所提供的檢測試劑盒具有 很好的特異性。本發(fā)明所提供的戊型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒在提取RNA時(shí)使用 吸附效果好、易于純化的磁珠法，該法能夠有效地去除復(fù)雜樣本中的PCR抑制物，從而獲得 高純度和高得率的RNA，大大提高了檢測靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。同時(shí)，本發(fā)明所提供的戊 型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒還具有操作快速、方法簡便、檢測范圍寬的特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0043] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng) 的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
[0044]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的戊型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒的使用方法流 程不意圖；
[0045]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的戊型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒中定量 參考品A(5.00E+06copies/ml)、B(5.00E+05copies/ml)、C(5.00E+04copies/ml)