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豬德爾塔冠狀病毒熒光定量pcr檢測試劑盒及非診斷性檢測方法

文檔序號:9804673閱讀:1383來源:國知局
豬德爾塔冠狀病毒熒光定量pcr檢測試劑盒及非診斷性檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒的分子生物學檢測技術領域,特別是涉及豬德爾塔冠狀病毒熒光 定量PCR檢測試劑盒及非診斷性檢測方法。
【背景技術】
[0002] 豬丁型冠狀病毒又稱豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV),是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒, 2009-2010年H)CoV在中國香港首次報道該病毒。2014年初,在美國首次報道發(fā)病豬群,此后 至少有19個州有該新型冠狀病毒的報道。
[0003] 目前檢測豬德爾塔冠狀病毒所采用的方法主要還是傳統(tǒng)常規(guī)的病毒分離培養(yǎng)觀 察鑒定、Elisa方法及普通PCR檢測。傳統(tǒng)常規(guī)的分離培養(yǎng)鑒定法,操作煩瑣、耗時長、漏診率 高;ELISA方法相對簡便、快速,但對于微量或雜質較多的樣品,其特異性和靈敏度較低,可 能造成誤判。PCR作為一種新型的分子生物學技術,自誕生以來,由于它的特異性、敏感性 高,能在短時間內得到大量的目的片段,使之成為當今發(fā)明研究的重要手段之一。但常規(guī)的 PCR在操作中容易造成污染,假陽性較高,使之在檢測上受到一些限制。因此,有必要建立一 種快速、靈敏、準確度高的豬德爾塔冠狀病毒檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒,使其能夠 快速、有效地對豬德爾塔冠狀病毒進行檢測,準確性、特異性和敏感性高,穩(wěn)定性好。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術方案:
[0006] 豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒,包括PCR反應液,所述PCR反應液包括 具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探針:上游引物:5 ' -AGCCACCCACCAAACCAA-3 ',下游引 物:5 ' -TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3 ',Taqman探針:5 ' -TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3 '。
[0007] 作為進一步地改進,所述Taqman探針的核苷酸序列的3'端標記MGB焚光淬滅基團。
[0008] 所述Taqman探針的核苷酸序列的5 '端標記FAM熒光報告基團。
[0009] 所述試劑盒還包括酶混合物,所述酶混合物包含HotMaster Taq DNA polymerase 和Quant RTase〇
[0010] 所述試劑盒還包括陽性對照,所述陽性對照為豬德爾塔冠狀病毒基因組cDNA。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供熒光定量PCR檢測豬德爾塔冠狀病毒的非診斷性方 法,可對豬德爾塔冠狀病毒快速、有效檢測,且準確性、特異性和敏感性高。采用如下技術方 案:
[0012] 豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR非診斷性檢測方法,采用具有如下核苷酸序列的 引物和Taqman探針進行熒光定量PCR:上游引物:5 ' -AGCCACCCACCAAACCAA-3 ',下游引物: 5 ' -TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3 ',Taqman探針:5 ' -TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3 ' 〇
[0013] 作為進一步地改進,所述Taqman探針的核苷酸序列的3'端標記MGB焚光淬滅基團。
[0014] 所述Taqman探針的核苷酸序列的5'端標記FAM熒光報告基團。
[0015] 所述熒光定量PCR的20μ1反應體系包括:上游引物0.4μ1;下游引物0.4μ1; Taqman 探針0·8μ1;檢測樣品RNA lyl;2XQuant One Step Probe qRT-PCR Master Mix 10μ1; HotMaster Taq DNA polymerase 0·8μ1;Quant RTase 0·28μ1;余量為滅菌去離子水。
[0016] 所述熒光定量PCR反應條件為:50 °C 30min,為第一步循環(huán);92 °C 3min,為第二步循 環(huán);92°(:108,601€208,68 1€208為第三步45個循環(huán),所述第三步每個循環(huán)的延伸結束時進行 熒光信號檢測。
[0017] 由于采用上述技術方案,本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點:
[0018] (1)本發(fā)明根據(jù)國內已發(fā)現(xiàn)的CH/SXD1/2015豬德爾塔冠狀病毒株(Genbank: KT021234.1)的N基因序列設計引物,合成特異性引物及Taqman-MGB探針,采用熒光定量PCR 方法快速靈敏地檢測豬德爾塔冠狀病毒,且準確性、特異性和敏感性高,穩(wěn)定性好。
[0019] (2)本發(fā)明一方面采用了高拷貝的靶基因,一方面采用Taqman-MGB探針熒光定量 PCR檢測法,使得利用Taqman-MGB探針法熒光定量PCR檢測豬德爾塔冠狀病毒的靈敏度約是 普通PCR的100倍。
[0020] (3)由于采用定量檢測技術-Taqman-MGB熒光定量PCR(Real-time PCR),該方法 (Real-time PCR)具有單管封閉操作防污染、自動化程度高、特異性強、可實時監(jiān)控等優(yōu)點, 有效地解決了傳統(tǒng)方法只能終點檢測的局限。
[0021] (4)由于探針的3'端的淬滅基團為不發(fā)光的熒光基團,并且與報告基團在空間上 的位置更接近,實驗靈敏度更高,特異性更強。
[0022] (5)Taqman_MGB探針法熒光定量PCR方法簡便、快速,整個過程(包括加樣)可在一 個小時內完成,計算機自動報告結果,無需電泳及其他后續(xù)的工作,即方便了操作又減少了 污染。
【附圖說明】
[0023] 上述僅是本發(fā)明技術方案的概述,為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術手段,以下 結合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0024]圖1是檢測豬德爾塔冠狀病毒的熒光定量PCR擴增曲線。
[0025]圖2是豬德爾塔冠狀病毒Taqman-MGB探針法熒光定量PCR特異性檢測結果;圖中, 1:豬德爾塔冠狀病毒;2:滅菌的去離子水;3:豬流行性腹瀉病毒;4:豬傳染性胃腸炎病毒。 [0026]圖3是豬德爾塔冠狀病毒Taqman-MGB探針法熒光定量PCR的敏感性檢測結果;圖 中,1:1 X 108PFU/mL; 2:1 X 107PFU/mL; 3:1 X 106PFU/mL; 4:1 X 105PFU/mL; 5:1 X 104PFU/mL; 6:1 X 103PFU/mL; 7:1 X 102PFU/mL; 8:1 X lO^FU/mL; 9:陰性樣品(滅菌的去離子水)。
【具體實施方式】
[0027] 除非特別指明,以下實施例中所用毒株由北京億森寶生物科技有限公司保存。
[0028] 除非特別指明,以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑,且可從正規(guī)渠道商 購獲得。
[0029] 實施例1熒光定量PCR檢測豬德爾塔冠狀病毒的非診斷性方法
[0030] 1、設計引物和Taqman-MGB探針
[0031 ] 根據(jù)國內已發(fā)現(xiàn)CH/SXD1 /2015豬德爾塔冠狀病毒株(Genbank: KT021234.1)的N基 因序列,找出豬德爾塔冠狀病毒基因序列的特異性保守序列,并設計多對引物和探針。經(jīng)過 比對篩選,最終確定一組最佳引物和一條Taqman-MGB探針,目的片段為63bp,其核苷酸序列 為序列表中序列4。
[0032] 上游引物(PDCoV-F) :5'-AGCCACCCACCAAACCAA-3'(序列 1)
[0033] 下游引物(PDCoV-R) :5'-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3'(序列2)
[0034] Taqman探針(PDCoV-MGB) :5'FAM-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-MGB_3'(序列 3) 〇
[0035] 其中探針的5'端標記FAM報告熒光基團,也可以選擇HEX等其他基團。焚光探針的 3 '端標記MGB淬滅熒光基團。淬滅熒光基團選擇MGB的原因在于,TaqMan-MGB探針與傳統(tǒng)的 TaqMan-TAMRA探針比較具有以下優(yōu)勢:(1)提高TM值一平均15bases可提高18°C,這樣可以 使探針的長度縮短,尤其對AT含量高的序列設計有很大的幫助,并且提高配對與非配對模 板間的TM值差異。(2)提高信噪比一由于在探針的3'端的淬滅基團為不發(fā)光的熒光基團,并 且與報告基團在空間的位置更接近,實驗結果更精確,分辨率更高。
[0036] 2、豬德爾塔冠狀病毒RNA提取
[0037]利用總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司,貨號DP419)提取豬德爾塔冠 狀病毒基因組RNA。放置于-20 °C備用。
[0038] 3、熒光定量PCR擴增:
[0039] 按照如下反應體系進行Taqman-MGB探針法熒光定量PCR:
[0040]
[0041]
[0042] 將一定量的檢測樣品即豬德爾塔冠狀病毒RNA模板加入PCR管中(1次重復),放置 于熒光定量PCR儀中進行擴增。同時設置陰性對照,陰性對照為滅菌的去離子水。
[0043] 熒光定量PCR反應條件如下:50 °C30min,為第一步循環(huán);92°C 3min,為第二步循環(huán); 92°(:108,601€208,681€20 8為第三步45個循環(huán),所述第三步每個循環(huán)的延伸結束時進行熒 光信號檢測。
[0044]實驗結果如圖1,結果顯示豬德爾塔冠狀病毒RNA使用熒光定量PCR檢測為
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