快速檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的rt-rpa檢測(cè)試劑盒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒及其用途，特別 涉及一種快速檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-RPA檢測(cè)試劑盒及其用途，本發(fā) 明屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 在發(fā)展中國(guó)家實(shí)驗(yàn)室中，由于PCR實(shí)施所需要的基礎(chǔ)設(shè)備和技術(shù)所限，大多數(shù)發(fā)展 中國(guó)家仍然集中在使用傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法，比如血清學(xué)方法、顯微鏡技術(shù)，或者培養(yǎng)以及鑒定 傳染性以及非傳染性疾病。在大多數(shù)情況下，盡管缺少使用這些方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，并且缺乏 綜合管理這些疾病的常規(guī)操作。因此，這些國(guó)家長(zhǎng)期持續(xù)的受到這些疾病的困擾，包括艾滋 病、麻疹以及肺結(jié)核病，以及2014年爆發(fā)的埃博拉病。為了填補(bǔ)傳統(tǒng)方法和PCR之間的空缺， 新的等溫分子診斷技術(shù)正在陸續(xù)被開(kāi)發(fā)，這些方法尤其適用于基礎(chǔ)設(shè)施、實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及試 驗(yàn)技術(shù)難于支持使用PCR進(jìn)行診斷的地方。與常規(guī)方法相比較，這些方法具有很高的敏感性 和特異性，因而促使不同的公司對(duì)這些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)商業(yè)化，比如，環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增（LAMP; Eiken,日本），RPA(RPA;Alere,USA and TwistDx，UK)，鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification，Becton Dickson,USA) ΙΑΜΡ技術(shù)已經(jīng)比較成熟，并且得到廣泛使用，到目 前為止，已經(jīng)超過(guò)1000份關(guān)于LAMP在不同疾病診斷中應(yīng)用的科研文章，可是，該技術(shù)距離在 發(fā)展中國(guó)家應(yīng)用仍然有較大的距離，而且該技術(shù)也有不足的地方，比如試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較麻煩 (3對(duì)引物），特異性相對(duì)較弱(能擴(kuò)增很多條帶），時(shí)間仍然相對(duì)較長(zhǎng)，以及易于污染等。
[0003] 重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱(chēng)為是可 以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)（由英國(guó)公司TwistDx Inc開(kāi)發(fā)）。不像其他的等溫?cái)U(kuò)增方法，RPA 擴(kuò)增能夠以非?？斓乃俣?20分鐘以?xún)?nèi)）擴(kuò)增出DNA/RNA，該擴(kuò)增可以在人體溫溫度下，或者 更低的溫度下進(jìn)行。RPA擴(kuò)增可以使用所有的基于PCR的擴(kuò)增檢測(cè)，尤其是實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)以 及試紙條檢測(cè)。RPA已經(jīng)被英國(guó)劍橋的Twist DX商業(yè)化，商業(yè)化的試劑盒以一種凍干的形式儲(chǔ) 存，以便于在條件差的環(huán)境下使用，可以根據(jù)使用者設(shè)計(jì)的特異引物和探針來(lái)進(jìn)行特異的 擴(kuò)增，目前該公司提供了商業(yè)化的彎曲桿菌、紅綢魚(yú)、李斯特菌以及沙門(mén)氏菌檢測(cè)試劑盒。 RPA技術(shù)自2006年問(wèn)世以來(lái)，快速的沖擊著田間分子檢測(cè)市場(chǎng)，目前該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng) 用到人類(lèi)疾病、獸醫(yī)藥物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)上，比如用于檢測(cè)土拉弗朗西斯菌、細(xì)螺旋體、 HIV-1DNA、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、天花病毒、B型鏈球菌、大腸桿菌產(chǎn)生的志賀毒素、中東呼吸 綜合征冠狀病毒、裂谷熱病毒、口蹄疫病毒、牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病 毒、施馬倫貝格病毒、牛病毒性腹瀉病毒、黃熱病毒以及戈登病毒等病原。
[0004] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)俗稱(chēng)"豬藍(lán)耳"，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重?fù)p害全世界養(yǎng) 豬業(yè)的重要的疾病，其主要臨床癥狀為母豬繁殖失敗以及仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。該病分別于 1987年和1990年出現(xiàn)在美國(guó)中西部和中歐，之后很快廣泛流行于北美、歐洲等養(yǎng)豬國(guó)家和 地區(qū)。1991年荷蘭和美國(guó)的調(diào)查者鑒定出PRRSV是豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)的病原。 PRRSV是一種動(dòng)脈炎病毒科(Ae ter i virus )，動(dòng)脈炎病毒屬的正鏈RNA病毒。其基因組全長(zhǎng)約 15Kb，含有9個(gè)開(kāi)放閱讀框?；谙到y(tǒng)進(jìn)化分析，PRRSV被分為基因1型（歐洲型）和基因2型 (北美洲型）。這兩種基因型病毒核苷酸序列一致性只有60% 1RRSV在1996年首次在中國(guó)出 現(xiàn)，至此之后，該病毒在中國(guó)廣泛的傳播。2006年，高致病性2型PRRSV(Type II Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)在中 國(guó)的豬場(chǎng)出現(xiàn)，其感染數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的豬，致死率高達(dá)20%-100%，其臨床特征為高熱，厭食， 豬身體出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)以及耳朵發(fā)紺，該病的晚期出現(xiàn)腹瀉的癥狀。至此，HP-PRRSV和經(jīng)典型 2型PRRSV(Type II classical Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，C-PRRSV)在我國(guó)共存。HP-PRRSV的危害遠(yuǎn)比C-PRRSV的危害要大的多，而在臨床樣品 中快速鑒定HP-PRRSV對(duì)于有效控制HP-PRRS起到關(guān)鍵的作用，因此快速、簡(jiǎn)便、敏感和特異 性的檢測(cè)HP-PRRSV對(duì)于疫病的防控以及流行病學(xué)調(diào)查至關(guān)重要。
[0005] Zheng Chai等（A SYBR Green-based real-time RT-PCR assay for simple and rapid detection and differentiation of highly pathogenic and classical type 2porcine reproductive and respiratory syndrome virus circulating in China .Arch Virol (2013) 158:407-415)建立了一種基于 SYBR Green 的實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測(cè)方法，該方法能夠同時(shí)檢測(cè)并區(qū)別HP-PRRSV和C-PRRSV，而且成本比較低廉，在臨床 上得到了較為廣泛的應(yīng)用。但是其缺點(diǎn)在于SYBR Green能夠結(jié)合所有的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且該 方法通過(guò)區(qū)分溶解溫度來(lái)區(qū)別HP-PRRSV和C-PRRSV，因此具有很強(qiáng)的非特異性，而且該方法 需要復(fù)雜的試驗(yàn)設(shè)備以及熟練的操作人員，該方法大約需要一個(gè)半小時(shí)的試驗(yàn)時(shí)間，比較 耗時(shí)。
[0006] Ha〇-tai Chen等（Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，Journal of Virological Methods 153(2008)266-268)建 立了一種針對(duì)PRRSV開(kāi)放閱讀框la設(shè)計(jì)3對(duì)引物來(lái)檢測(cè)HP-PRRSV的RT-LAMP檢測(cè)方法，該方 法能夠更加便捷和快速的對(duì)HP-PRRSV進(jìn)行檢測(cè)。但是通過(guò)RT-LAMP的擴(kuò)增結(jié)果可以看出，該 方法能夠出現(xiàn)很多擴(kuò)增條帶，因此同樣存在非特異性擴(kuò)增，而且該方法需要設(shè)計(jì)三對(duì)引物 來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，因此增加了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的難度，并且增加了其與其他檢測(cè)平臺(tái)相結(jié)合的難度。此 外，檢測(cè)溫度較高(64°C)，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)(45min)，并且需要核酸電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)， 增加了污染的可能性，或者通過(guò)與染料結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，同樣具有很強(qiáng)的非特異性。
[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明研發(fā)并評(píng)估了基于熒光探針的實(shí)時(shí)熒光RT-RPA試驗(yàn)（real-time RT-RPA)以快速檢測(cè)HP-PRRSV的方法。重組酶聚合酶技術(shù) (recombinase polymerase amp 1 if i cat ion，RPA)由于其具有快速、簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊儀器等 優(yōu)點(diǎn)，目前已被應(yīng)用于多種重要疾病病原的檢測(cè)中。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)建立RT-RPA試驗(yàn)以檢 測(cè)HP-PRRSV。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能快速、簡(jiǎn) 單、特異的鑒定高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)方法。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0010] 本發(fā)明是將RT_RPA(reverse transcription Recombinase Polymerase Amplificati〇n，RT-RPA)試驗(yàn)首次應(yīng)用到高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)的 檢測(cè)上。與C-PRRSV相比較，HP-PRRSV在NSP2區(qū)域缺失大約30個(gè)氨基酸，因此本發(fā)明選取了 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2缺失區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，本發(fā)明發(fā)明人同 時(shí)通過(guò)對(duì)來(lái)自于GenBank中的EF112445，EF517962，EF635006，EF641008，EU109503, EU144079,EU187484，EU200961，EU880431 和 EU880435 的 NSP2 基因同源序列進(jìn)行比對(duì)分析， 以進(jìn)一步確定HP-PRRSV的保守區(qū)域，以期能夠檢測(cè)到盡可能多的HP-PRRSV。
[0011] 特異性實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明方法能夠特異性的檢測(cè)HP-PRRSV，對(duì)豬瘟病毒、C型-豬繁 殖與呼吸綜合征病毒、豬2型圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒沒(méi)有擴(kuò)增。靈敏度實(shí)驗(yàn)表 明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-RPA引物和探針能夠在40°C，擴(kuò)增 20min條件下檢出最少70個(gè)拷貝的模板。本發(fā)明不僅僅對(duì)該方法的敏感性和特異性進(jìn)行評(píng) 估，并同時(shí)用臨床樣品對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，并與RT-qPCR相對(duì)應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果 證明本發(fā)明方法與RT-qPCR具有很高的符合度。因此，本發(fā)明的鑒定高致病性豬繁殖與呼吸 綜合征病毒的檢測(cè)方法能夠快捷、高效、靈敏的檢測(cè)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，為 高致