大腸桿菌熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性檢測(cè)樣品中大腸桿菌核酸的試劑 盒，屬于大腸桿菌的體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002 ]大腸桿菌(E. co 1 i )為革蘭氏陰性短桿菌，是埃希氏菌屬的代表菌，一般不致病，是 人和動(dòng)物腸道中正常的棲居菌;在一定條件下可引起腸道外感染，腸道外感染以泌尿道感 染最多見，常由一些特殊血清型的大腸埃希菌所致(如01、02、04、06、011、015、及017等血清 型），它們大多數(shù)能產(chǎn)生溶血素，在機(jī)體抵抗力降低、外傷或大腸埃希菌離開腸道侵入組織 器官時(shí)，引起多種化膿性感染，甚至導(dǎo)致內(nèi)毒素休克。
[0003] 某些血清型的大腸桿菌可引起人類腹瀉:腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌可引起嬰幼兒和旅 游者出現(xiàn)輕度腹瀉，也可呈嚴(yán)重的霍亂樣癥狀，為自限性，一般2-3天自愈;腸致病性大腸埃 希菌是嬰幼兒腹瀉的主要病原菌，有高度傳染性，成人少見;腸出血性大腸埃希菌可引起散 發(fā)性或爆發(fā)性出血性腸炎。
[0004] 在檢測(cè)中，PCR法由于其快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)逐漸呈現(xiàn)出要替代以細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué) 檢測(cè)為主的傳統(tǒng)檢測(cè)方法的趨勢(shì)。而對(duì)于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測(cè)的特異性和 敏感性的基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明分別針對(duì)大腸桿菌基因序列的保守區(qū)域特異的靶序列設(shè)計(jì)引物和Taqman 探針，利用real-time PCR的方法，用來快速檢測(cè)樣品中是否存在大腸桿菌的核酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是快速準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中是否存在大腸桿菌，提供一 種特異性檢測(cè)大腸桿菌的熒光PCR試劑盒。
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種特異性檢測(cè)樣品中大腸桿菌核酸的試劑盒，組分包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陰性 質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。其中PCR反應(yīng)液主要含有上述的引物和探針、反應(yīng)緩沖液、Mg2+和dNTP 等，酶混合液主要含有熱啟動(dòng)Taq酶，陰性質(zhì)控品為無 RNase和DNase水，陽性質(zhì)控品為含有 大腸桿菌檢測(cè)靶序列的重組質(zhì)粒。
[0008] PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增的引物為P1和P2，P1和P2為針對(duì)大腸桿菌基因組群特 異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性引物;PCR反應(yīng)液中用于熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)的寡 核苷酸探針為ProbeUProbel為針對(duì)大腸桿菌基因組群特異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩 選出的特異性探針，其中熒光報(bào)告基團(tuán)Χι為CY5,熒光淬滅基團(tuán)YiSBHQ(見表1)。
[0009] 表1檢測(cè)大腸桿菌的引物和探針序列
Probel | 5'-Xi-CGGGCCATACGCCGCAATACGCA -Υι 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本熒光PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)大腸桿菌的應(yīng)用方法，包括： 試劑盒選用的PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2XPCR緩沖液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探針0.2 μL、熱啟動(dòng)Taq酶混合液0.4 μL、樣品DNA 2μ 1，加滅菌水至終體系20 μL。
[0010] 試劑盒的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C，2min;進(jìn)入循環(huán)階段:94°C變性10s，56°C退火 50s，72 °C延伸15s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
[0011] 質(zhì)量控制:每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陰、陽性對(duì)照，陰性對(duì)照無 Ct值(或Ct值為0)，陽性對(duì)照 Ct值< 30，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立。
[0012] 結(jié)果判讀： 陽性：出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，Ct值< 35;可疑：出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，但Ct值> 35;陰性:沒 有出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，或者曲線雖然超過了閾值，但不呈"S"型;對(duì)可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)還是出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照沒有污染，可判斷為陽性。
[0013] 樣本要求：臨床樣本類型包括患者糞便、肛拭子、嘔吐物和分離培養(yǎng)物；臨床樣本 采集后應(yīng)帶冰運(yùn)輸，-20°C保存，不能反復(fù)凍融;從臨床樣本提取DNA，建議采用性能穩(wěn)定可 靠的商品化試劑盒，具體方法參見相應(yīng)商品化試劑盒說明書，提取的DNA應(yīng)立即檢測(cè)，否則， 應(yīng)將DNA分裝后-80°C~_20°C保存。
[0014] 本發(fā)明提供的試劑盒具有很好的特異性，可以檢出大腸桿菌，但不能檢出非大腸 桿菌病原體的核酸;對(duì)大腸桿菌核酸的檢測(cè)下限為10拷貝每反應(yīng)體系；只需要2小時(shí)即可完 成檢測(cè)，可為大腸桿菌的疾病監(jiān)測(cè)和臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)大腸桿菌陽性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖。從左至右的每組 曲線對(duì)應(yīng)濃度依次為2 X 106-2X 102C〇pieSAil，試劑盒對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)限為10拷貝每反 應(yīng)體系。橫坐標(biāo)為反應(yīng)循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測(cè)信號(hào)的A Rn值。
[0016] 圖2為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系檢測(cè)10種細(xì)菌基因組DNA的擴(kuò)增曲線圖。10種細(xì) 菌包括:大腸桿菌和9種陰性對(duì)照微生物。大腸桿菌出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，而其他9種病原微生 物未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。需要指出的是，這里列出 的實(shí)施例僅僅為示例性說明的目的，而不應(yīng)將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的任何限制。其中使 用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實(shí)施例中具體選擇的試劑，應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應(yīng)試劑以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0018]引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成 利用Blast工具對(duì)Genbank和國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中的大腸桿菌基因組序列進(jìn)行分析，分別選擇 其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測(cè)靶序列。大腸桿菌檢測(cè)靶序列為堿性磷酸酶基因；并針對(duì)檢測(cè) 靶序列設(shè)計(jì)和合成引物和探針(見表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成， 大腸桿菌的檢測(cè)探針5 '端標(biāo)記CY5熒光基團(tuán)；3 '端標(biāo)記BHQ熒光淬滅基團(tuán)。
[0019] 檢測(cè)菌種的準(zhǔn)備 本實(shí)施例中所使用的大腸桿菌以及其他陰性對(duì)照菌株(傷寒沙門菌，腸炎沙門菌，小腸 結(jié)腸炎耶爾森菌，土拉弗朗西斯菌，肺炎克雷伯菌，痢疾志賀菌，福氏志賀菌，流感嗜血桿 菌，鮑氏志賀菌)均購(gòu)買于中國(guó)藥品生物制品檢定所。
[0020] 菌株DNA的抽提 選用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(貨號(hào)：51306)提取菌株DNA。具體步驟試劑盒參 考