一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病原菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]氟喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)G-桿菌，包括綠膿桿菌均有良好抗菌作用，對(duì)G+球菌也具一定抗菌活性。在氟喹諾酮類(lèi)較廣泛使用的品種中，對(duì)綠膿桿菌作用較強(qiáng)的為環(huán)丙氟哌酸，其次為氟嗪酸。氟嗪酸對(duì)一般陰性桿菌的作用與環(huán)丙氟哌酸相仿或稍弱，90年代后開(kāi)發(fā)的新品種多氟哌酸類(lèi)某些品種，不僅抗G-桿菌活性與環(huán)丙氟哌酸相似，而且抗G+球菌作用加強(qiáng)，對(duì)MRSA有效，對(duì)衣原體、支原體、厭氧菌亦有一定作用，明顯優(yōu)于環(huán)丙沙星。
[0004]國(guó)內(nèi)外的大量研究表明，由于氟喹諾酮藥物長(zhǎng)期和大量使用，副溶血弧菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性十分嚴(yán)重。常見(jiàn)的氟喹諾酮耐藥基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有:GyrA，GyrB,ParC, ParE等。耐藥性產(chǎn)生的直接后果是嚴(yán)重影響了臨床療效，尤其在人畜同藥的情況下，耐藥性通過(guò)水產(chǎn)產(chǎn)品等途徑弓I起的交叉?zhèn)鞑?，直接?duì)人體健康構(gòu)成威脅。
[0005]目前我國(guó)水產(chǎn)產(chǎn)品耐藥性檢測(cè)控制中，傳統(tǒng)方法是通過(guò)測(cè)定副溶血弧菌的最低抑菌濃度或抑菌圈大小測(cè)定副溶血弧菌的耐藥性。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)必須經(jīng)過(guò)繁瑣的副溶血弧菌分離純化、繁殖擴(kuò)增等步驟，檢測(cè)周期長(zhǎng)，最快也要48h左右。不利于臨床上及時(shí)的選藥治療。同時(shí)，藥敏試驗(yàn)是在體外用藥物試探性的檢驗(yàn)副溶血弧菌的表型耐藥特性，不能檢測(cè)副溶血弧菌的隱型耐藥性。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法。
[0008]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:
一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，包括如下步驟:
(1)收集副溶血弧菌活菌體1.0-1.2g，用7?8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，得到模板；
(2)將該模板與氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.3-0.5mmol/L的dNTP、終濃度為0.3-0.5mmol/L的GyrA_F、終濃度為0.3?
0.5mmol/L的GyrA-R、終濃度為0.5?0.8mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.5?0.8mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.5-0.6mmol/L的ParE-F、終濃度為0.5-0.6mmol/L的ParE-R和終濃度為0.02-
0.03U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F 和 ParE-R 分別如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR緩沖液的 10倍母液中包括 10?20mM氯化鉀、pH8.3的 12mMTris_HCl和0.01?0.02%氯化鈉，20?30mM MgCl2；
(3)步驟(2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送交測(cè)序。
[0009]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(I)為:收集副溶血弧菌活菌體1.0?
1.2g，用7?8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，10000?12000rpm離心10?15min后收集上清液，得到模板。
[0010]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.4mmo 1/L的dNTP、終濃度為0.4mmol/U^GyrA-F、終濃度為0.4mmo 1/L的GyrA-R、終濃度為0.7mmol/L 的 GyrB-F、終濃度為 0.7mmol/L 的 GyrB-R、終濃度為 0.5mmol/L的ParE-F、終濃度為0.5mmol/L的ParE-R和終濃度為0.02U/uL的TaqDNA聚合酶。
[0011]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述PCR緩沖液的10倍母液中包括15mM氯化鉀、pH8.3的 12mMTris-HCl和0.01%氯化鈉，30mM MgCl2。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:90?93°C預(yù)變性8?1min，然后進(jìn)入如下循環(huán):90?93 °C變性40s?50s、50?53°C退火40?50s、72?74 °C延伸50s?lmin，共30~35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸5~10min，2?4°C保存。
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:93°C預(yù)變性1min，然后進(jìn)入如下循環(huán):93 °0變性508、531退火508、72 °C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸10min，4°C 保存。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(3)的電泳條件為:2%瓊脂糖凝膠，80V電壓，時(shí)間40min。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
1、本發(fā)明的檢測(cè)方法敏感、特異、快速，可以檢測(cè)極微量的目的基因進(jìn)行檢測(cè)，而不需要經(jīng)過(guò)費(fèi)時(shí)的副溶血弧菌培養(yǎng)階段；
2、本發(fā)明的檢測(cè)方法在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物對(duì)多個(gè)氟喹諾酮耐藥基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，在檢測(cè)基因過(guò)程中可設(shè)立內(nèi)部對(duì)照；可指示出模板的數(shù)量;可同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)目的基因:消耗的時(shí)間和試劑少，減少準(zhǔn)備時(shí)間提尚效率;可大量地進(jìn)彳丁樣品和目的基因的檢測(cè)。
[0016]
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的電泳檢測(cè)結(jié)果圖。
[0018]
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下通過(guò)【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。
[0020]
實(shí)施例1
(I )LB培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)增殖副溶血弧菌，搖瓶培養(yǎng)條件為30°C，18h，120rpm，搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后離心收集副溶血弧菌活菌體1.0g，用8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融5次破碎細(xì)胞，12000pm離心I Omin后收集上清液，得到模板； (2)將該5uL模板與氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R(引物濃度分別為25mmol/L，用ImM Tris-HCl—0.1mM EDTA緩沖液稀釋)共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為
0.4mmol/L 的 dNTP、終濃度為 0.4mmol/L 的 GyrA_F、終濃度為 0.4mmol/L 的 GyrA-R、終濃度為
0.7mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.7mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.5mmol/L的ParE-F、終濃度為0.5mmol/L 的 ParE-R 和終濃度為0.02U/uL 的TaqDNA 聚合酶，其中GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R分別如SEQ ID USEQ ID 2^SEQ ID 3^SEQ ID 4^SEQ ID 5和SEQID 6,上述PCR緩沖液的1倍母液中包括15mM氯化鉀、pH8.3的12mMTr i s_HCl和0.0I %氯化鈉，30mM MgCl2;
上述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50uL，反應(yīng)條件如下:93°C預(yù)變性1min，然后進(jìn)入如下循環(huán):93 °C變性50s、53°C退火50s、72 °C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸10min，4°C 保存；
(3)步驟(2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5uLPCR產(chǎn)物，與IuL Loading buffer混勻后，點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠電泳板孔中，80V電壓，電泳40min，于紫外熒光成相儀下拍照判定，電泳結(jié)果如圖1所示，結(jié)果可見(jiàn)600bp左右、850bp左右、700bp左右的條帶，分別指示GryA基因、GryB基因、ParE基因。
[0021]同時(shí)將經(jīng)過(guò)純化的PCR產(chǎn)物50uL和20uL三基因的上下游引物一起送深圳華大基因有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。
[0022]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，SP依本發(fā)明專(zhuān)利范圍及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)收集副溶血弧菌活菌體1.0-1.2g，用7?8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，得到模板； (2)將該模板與氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.3-0.5mmol/L的dNTP、終濃度為0.3-0.5mmol/L的GyrA_F、終濃度為0.3?0.5mmol/L的GyrA-R、終濃度為0.5?0.8mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.5?0.8mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.5-0.6mmol/L的ParE-F、終濃度為0.5-0.6mmol/L的ParE-R和終濃度為0.02-0.03U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F 和 ParE-R 分別如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR緩沖液的 10倍母液中包括 10?20mM氯化鉀、pH8.3的 12mMTris_HCl和0.01?0.02%氯化鈉，20?30mM MgCl2； (3)步驟(2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送交測(cè)序。2.如權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(I)為:收集副溶血弧菌活菌體1.0?1.2g，用7?SmL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，10000?12000rpm離心1?15min后收集上清液，得到模板。3.如權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.4mmo I /L的dNTP、終濃度為 0.4mmol/L 的 GyrA-F、終濃度為 0.4mmol/L 的 GyrA-R、終濃度為 0.7mmol/L 的 GyrB_F、終濃度為0.7mmol/L 的 GyrB-R、終濃度為 0.5mmol/L 的 ParE_F、終濃度為 0.5mmol/L 的 ParE-R 和終濃度為0.02U/uL的TaqDNA聚合酶。4.如權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR緩沖液的10倍母液中包括15mM氯化鉀、pH8.3的12mMTris_HCl和0.01%氯化鈉，30mM MgCl2o5.如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:90?93°C預(yù)變性8?1min，然后進(jìn)入如下循環(huán):90-93 °C變性40s?50s、50?53°C退火40?50s、72?74 °C延伸50s?Imin，共30?35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸5?10!1^11，2~41保存。6.如權(quán)利要求5所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:93°C預(yù)變性1min，然后進(jìn)入如下循環(huán):93 °C變性50s、53°C退火50s、72 °C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸10min，4°C保存。7.如權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(3 )的電泳條件為:2%瓊脂糖凝膠，80V電壓，時(shí)間40min。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種副溶血弧菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟：（1）收集副溶血弧菌活菌體1.0~1.2g，用7~8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，得到模板；（2）將該模板與氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（3）步驟（2）的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送交測(cè)序。本發(fā)明的檢測(cè)方法敏感、特異、快速，可以檢測(cè)極微量的目的基因進(jìn)行檢測(cè)，而不需要經(jīng)過(guò)費(fèi)時(shí)的副溶血弧菌培養(yǎng)階段。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12Q1/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105567813
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511011330
【發(fā)明人】黃升謀
【申請(qǐng)人】湖北文理學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日