一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病原菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]四環(huán)素類抗生素包括金霉素、土霉素及半合成衍生物甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺基四環(huán)素等。本品為廣譜抑菌劑，高濃度時(shí)具殺菌作用。常見的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及厭氧菌，多數(shù)立克次體屬、支原體屬、衣原體屬、非典型分枝桿菌屬、螺旋體也對(duì)本品敏感。
[0004]國內(nèi)外的大量研究表明，由于四環(huán)素藥物長期和大量使用，副溶血弧菌對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥性十分嚴(yán)重。常見的四環(huán)素耐藥基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有:TetA，TetB, TetC,TetD, TetE, TetG等。四環(huán)素耐藥性菌株通過水產(chǎn)產(chǎn)品以及食物鏈等途徑引起的交叉?zhèn)鞑ィ苯訉?duì)人體健康構(gòu)成威脅。
[0005]目前我國水產(chǎn)產(chǎn)品致病菌耐藥性檢測(cè)控制中，在四環(huán)素藥耐藥性檢測(cè)研究方面，對(duì)病原菌耐藥性基因的研究內(nèi)容較少。傳統(tǒng)方法是通過測(cè)定副溶血弧菌的最低抑菌濃度或抑菌圈大小測(cè)定副溶血弧菌的耐藥性。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)必須經(jīng)過繁瑣的副溶血弧菌分離純化、繁殖擴(kuò)增等步驟，檢測(cè)周期長，最快也要48h左右。不利于及時(shí)的選藥治療。同時(shí)，藥敏試驗(yàn)是在體外用藥物試探性的檢驗(yàn)副溶血弧菌的表型耐藥特性，不能檢測(cè)副溶血弧菌的隱型耐藥性。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法。
[0008]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:
一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，包括如下步驟:
(1)收集副溶血弧菌活菌體0.6-0.8g，用6?8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，得到模板；
(2)將該模板與四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.3-0.4mmol/L的dNTP、終濃度為0.3-0.4mmoI/L的TetA-F、終濃度為0.3?0.4mmol/L的TetA-R、終濃度為0.3-0.4mmol/L的TetB_F、終濃度為0.3-0.4mmol/L的TetB-R、終濃度為0.5-0.6mmol/L的TetD-F、終濃度為0.5-0.6mmol/L的TetD-R和終濃度為0.05-
0.08U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 TetA-F、TetA-R、TetB-F、Te tB_R、TetD-F 和 TetD-R 分別如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR緩沖液的 10倍母液中包括30?40mM氯化鈉、pH8.3的15mMTris_HCl、0.01?0.02%甘油和0.05-0.08%硫酸銨，30~40mM MgCl2;
(3)步驟(2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送交測(cè)序。
[0009]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(I)為:收集副溶血弧菌活菌體0.6?
0.8g，用6?8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，10000?12000rpm離心10?15min后收集上清液，得到模板。
[0010]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.35mmol/L的dNTP、終濃度為0.35mmol/L的TetA-F、終濃度為0.35mmol/L的TetA-R、終濃度為0.35mmol/L的TetB-F、終濃度為0.35mmol/L的TetB-R、終濃度為
0.55mmol/L的TetD-F、終濃度為0.55mmol/L的TetD-R和終濃度為0.06U/uL的TaqDNA聚合酶。
[0011]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述PCR緩沖液的10倍母液中包括35mM氯化鈉、pH8.3的 15mMTris-HCl、0.01%甘油和0.06%硫酸銨，35mM MgCl2o
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:90?95°C預(yù)變性8~12min，然后進(jìn)入如下循環(huán):94?95 °C變性50?60s、54?55°C退火I?I.2min、72?74 °C延伸45?50s，共30?35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸8?1min，2?4°C保存。
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:93°C預(yù)變性1min，然后進(jìn)入如下循環(huán):94 °C變性60s、54°C退火lmin、74 °C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸10min，4°C 保存。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(3)的電泳條件為:2%瓊脂糖凝膠，80V電壓，時(shí)間40min。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
1、本發(fā)明的檢測(cè)方法敏感、特異、快速，可以檢測(cè)極微量的目的基因，而不需要經(jīng)過費(fèi)時(shí)的副溶血弧菌培養(yǎng)階段；
2、本發(fā)明的檢測(cè)方法在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物對(duì)多個(gè)四環(huán)素耐藥基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，在檢測(cè)基因過程中可設(shè)立內(nèi)部對(duì)照；可指示出模板的數(shù)量;可同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)目的基因:消耗的時(shí)間和試劑少，減少準(zhǔn)備時(shí)間提高效率;可大量地進(jìn)行樣品和目的基因的檢測(cè)。
[0016]
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的電泳檢測(cè)結(jié)果圖。
[0018]
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。
[0020]
實(shí)施例1
(I )LB培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)增殖副溶血弧菌，搖瓶培養(yǎng)條件為33°C，24h，120rpm，搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后離心收集副溶血弧菌活菌體0.8g，用8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融5次破碎細(xì)胞，12000rpm離心I Omin后收集上清液，得到模板；
(2)將該5uL模板與四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R(引物濃度分別為25mmol/L，用ImM Tris-HCl—0.1mM EDTA緩沖液稀釋)共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為
0.35mmol/L 的 dNTP、終濃度為 0.35mmol/L 的 TetA-F、終濃度為 0.35mmol/L 的 TetA-R、終濃度為 0.35mmol/L 的 TetB-F、終濃度為 0.35mmol/L 的 TetB-R、終濃度為 0.55mmol/lJ^TetD-Fj#濃度為0.55mmol/L的TetD-R和終濃度為0.06U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分別如SEQ ID USEQ ID 2^SEQ ID 3^SEQ ID 4^SEQ ID5和SEQ ID 6，上述PCR緩沖液的10倍母液中包括35mM氯化鈉、pH8.3的15mMTris_HCl、0.01%甘油和 0.06%硫酸銨，35111]\1 MgCl2;
上述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50uL，反應(yīng)條件如下:93°C預(yù)變性1min，然后進(jìn)入如下循環(huán):94 °C變性60s、54°C退火lmin、74 °C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸10min，4°C 保存；
(3)步驟(2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5uLPCR產(chǎn)物，與IuL Loading buffer混勻后，點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠電泳板孔中，80V電壓，電泳40min，于紫外熒光成相儀下拍照判定，電泳結(jié)果如圖1所示，結(jié)果可見450bp左右、650bp左右、550bp左右的條帶，分別指示TetA基因、TetB基因、TetD基因。
[0021]同時(shí)將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物50uL和20uL三基因的上下游引物一起送深圳華大基因有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。
[0022]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，SP依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)收集副溶血弧菌活菌體0.6-0.8g，用6?8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，得到模板； (2)將該模板與四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.3-0.4mmol/L的dNTP、終濃度為0.3-0.411111101/1的了6七44、終濃度為0.3?0.4mmol/L的TetA-R、終濃度為0.3-0.4mmol/L的TetB_F、終濃度為0.3-0.4mmol/L的TetB-R、終濃度為0.5-0.6mmol/L的TetD-F、終濃度為0.5-0.6mmol/L的TetD-R和終濃度為0.05-0.08U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 TetA-F、TetA-R、TetB-F、Te tB_R、TetD-F 和 TetD-R 分別如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR緩沖液的 10倍母液中包括30?40mM氯化鈉、pH8.3的15mMTris_HCl、0.01?0.02%甘油和0.05-0.08%硫酸銨，30~40mM MgCl2; (3)步驟(2)的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送交測(cè)序。2.如權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(I)為:收集副溶血弧菌活菌體0.6-0.8g，用6?8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，10000?12000rpm離心1?15min后收集上清液，得到模板。3.如權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.35mmol/L的dNTP、終濃度為 0.35mmol/L 的 TetA-F、終濃度為 0.35mmol/L 的 TetA-R、終濃度為 0.35mmol/lJ^TetB-Fj#濃度為 0.35mmol/L 的 TetB-R、終濃度為 0.55mmol/L 的 TetD-F、終濃度為 0.55mmol/L 的 TetD-R和終濃度為0.06U/uL的TaqDNA聚合酶。4.如權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR緩沖液的10倍母液中包括35mM氯化鈉、pH8.3的15mMTris_HCl、0.01%甘油和0.06%硫酸銨，35mM MgCl2。5.如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:90?95°C預(yù)變性8?12min，然后進(jìn)入如下循環(huán):94?95 °C變性50?60s、54?55°C退火I?1.2min、72?74 °C延伸45?50s，共30~35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸8?10111；[11，2~4°(3保存。6.如權(quán)利要求5所述的一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:93°C預(yù)變性1min，然后進(jìn)入如下循環(huán):94 °C變性60s、54°C退火Imin、74 °C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸1min，4°C保存。7.如權(quán)利要求1所述的一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(3 )的電泳條件為:2%瓊脂糖凝膠，80V電壓，時(shí)間40min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種副溶血弧菌四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟：（1）收集副溶血弧菌活菌體0.6~0.8g，用6~8mL去離子水重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，得到模板；（2）將該模板與四環(huán)素類藥物耐藥基因檢測(cè)引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（3）步驟（2）的PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送交測(cè)序。本發(fā)明的檢測(cè)方法敏感、特異、快速，可以檢測(cè)極微量的目的基因進(jìn)行檢測(cè)，而不需要經(jīng)過費(fèi)時(shí)的副溶血弧菌培養(yǎng)階段。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/02
【公開號(hào)】CN105567812
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511011329
【發(fā)明人】黃升謀
【申請(qǐng)人】湖北文理學(xué)院
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日