一種沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌復合增菌的選擇性培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及致病菌的檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種沙門氏菌、單增李斯特菌和副 溶血弧菌復合增菌的選擇性培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品安全是一個全球性的重大公共衛(wèi)生問題，食品污染和食源性疾病在發(fā)達國家 和發(fā)展中國家仍普遍存在。我國細菌性食源性疾病主要由沙門氏菌（Salmonella)和副溶 血弧菌（Vibrioparahaemolyticus))引發(fā)。單增李斯特菌（ListeriaMonocytogenes)雖 發(fā)病率不高，但其致死率遠高于其他常見食源性病原菌。海產(chǎn)類食品作為高蛋白、低脂肪的 "白肉"，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者喜愛，但易受細菌污染導致腐敗變質(zhì)，影響產(chǎn) 品安全。因此沙門氏菌、副溶血弧菌和單增李斯特菌是進出口水產(chǎn)品常檢項目。
[0003]目前對于沙門氏菌、副溶血弧菌和單增李斯特菌主要采用常規(guī)培養(yǎng)、生化鑒定，大 多要耗費4-6天時間，而且程序復雜，所用試劑繁多，費事費力，檢出效率低，檢測靈敏度度 低，假陰性比較嚴重。近年來酶聯(lián)熒光免疫檢測（VIDAS)聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)、金標試紙 法、API法、聚合酶免疫檢測方法（EIA)和DNA探針技術(shù)等新技術(shù)逐漸應(yīng)用于微生物檢測， 大大提高檢測的靈敏度和簡化了操作。但能夠滿足要求的檢測靈敏度仍然需要離不開前增 菌或選擇性增菌。現(xiàn)有的增菌方法主要是根據(jù)所要檢測的菌株進行各自的增菌處理，即不 同的菌株采用各自的選擇性增菌培養(yǎng)基進行增菌處理，費時費力，不符合現(xiàn)在檢測方法一 平臺的同時檢測多種致病菌的發(fā)展趨勢。國內(nèi)外現(xiàn)有研究中，涉及共增菌培養(yǎng)基技術(shù)的研 究主要包括：沙門氏菌和志賀氏菌共增技術(shù)、沙門氏菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌共增技 術(shù)（SEL)、沙門氏菌、大腸桿菌及單增李斯特菌共增技術(shù)以及廣譜增菌肉湯（UPB)等，除SEL 外其余均屬于無選擇性增菌培養(yǎng)基，不能滿足多種背景微生物多時對特定目標菌進行增菌 的要求。目前的檢測方法中，不同致病菌有獨立的檢測方法，需要分別進行增菌。因此得到 一種能同時富集沙門氏菌、副溶血弧菌和單增李斯特菌的共增培養(yǎng)基，對實現(xiàn)共檢具有重 要的意義。迄今為止，未見關(guān)于沙門氏菌、副溶血弧菌及單增李斯特菌選擇性共增菌技術(shù)的 報道。
[0004] 此外，冰鮮水產(chǎn)品在捕撈、加工、保藏過程中會受到各種損傷，使菌體處于亞致死 狀態(tài)，容易產(chǎn)生假陰性，容易造成漏檢。亞致死態(tài)的菌體雖然具有一定的活性，但是失去了 正常菌體的部分生理特性，這會導致在復合增菌培養(yǎng)時，選擇性培養(yǎng)基中的選擇性物質(zhì)在 抑制非目標菌時，同時對處于亞致死狀態(tài)的目標菌也進行了抑制，使處于亞致死狀態(tài)的目 標菌無法生長，從而導致檢測結(jié)果與實際不一致。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧 菌復合增菌的選擇性培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠同時對目標菌沙門氏菌、 副溶血弧菌和單增李斯特菌進行復合增菌并抑制其他非目標菌，且對處于亞致死狀態(tài)的目 標菌抑制作用小，使亞致死狀態(tài)的目標菌也能進行增菌，增菌效果好；本發(fā)明提供的培養(yǎng)基 制備方法操作簡單，效率高。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌復合增菌 的選擇性培養(yǎng)基，按重量份數(shù)計包括如下組分： 胰蛋白胨15-20份，蛋白胨2-4份，氯化鈉8-12份，磷酸二氫鈉2-3份，葡萄糖2-3 份，甘露醇2-3份，七葉苷0. 01-0. 03份，檸檬酸鈉0. 5-1. 5份，脫脂奶粉4-6份，滅菌蒸餾 水1000份，lmol/L的氫氧化鉀溶液0. 1-1份，lmol/L的鹽酸溶液0. 1-1份，亞碲酸鉀溶液 0. 8-1. 2份，叮啶黃溶液0. 8-1. 2份，萘啶酮酸溶液0. 8-1. 2份。
[0007] 所述亞碲酸鉀溶液由0. 00005份亞碲酸鉀和10份滅菌蒸餾水組成；所述吖啶黃溶 液由〇. 1份吖啶黃和10份滅菌蒸餾水組成；所述萘啶酮酸溶液由〇. 01份萘啶酮酸和10份 濃度為〇. 〇5mol/L的氫氧化鈉溶液組成。
[0008] 在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，以沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌為目標菌，胰蛋白 胨、蛋白胨、氯化鈉和磷酸二氫鈉作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基為菌類提供營養(yǎng)源。葡萄糖、甘露醇作為 生長促進劑，能夠促進菌類生長。脫脂奶粉作為復蘇促進劑，能夠促進處于亞致死狀態(tài)的目 標菌復蘇。檸檬酸鈉作為目標菌可以利用的碳源，而其對于其他眾多菌類則無法被利用。七 葉苷、亞碲酸鉀溶液、吖啶黃溶液和萘啶酮酸溶液是作為抑制劑，它們具有選擇性的抑制作 用，對目標菌的抑制作用較小，對其他眾多菌類的抑制效果較強。
[0009] 作為優(yōu)選，按重量份數(shù)計所述選擇性培養(yǎng)基的組分為：胰蛋白胨17份，蛋白胨3 份，氯化鈉10份，磷酸二氫鈉2. 5份，葡萄糖2. 5份，甘露醇2. 5份，七葉苷0. 02份，檸檬酸 鈉1份，脫脂奶粉5份，滅菌蒸餾水1000份，lmol/L的氫氧化鉀溶液0? 1-1份，lmol/L的鹽 酸溶液〇. 1-1份，亞碲酸鉀溶液1份，叮啶黃溶液1份，萘啶酮酸溶液1份。
[0010] 作為優(yōu)選，所述選擇性培養(yǎng)基還包括0. 1-0. 5份茶皂素。茶皂素對常規(guī)的金色葡 萄球菌、酵母菌、霉菌等具有較強的抑制作用，而對本發(fā)明的目標菌抑制作用不明顯，適用 作本發(fā)明培養(yǎng)基的組分。
[0011] -種沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌復合增菌的選擇性培養(yǎng)基的制備方 法，包括如下步驟： 亞碲酸鉀溶液的配制：稱取亞碲酸鉀0. 00005份加入到10份滅菌蒸餾水中，得到亞碲 酸鉀溶液并備用； 吖啶黃溶液的配制：稱取吖啶黃〇. 1份加入到10份滅菌蒸餾水中，得到吖啶黃溶液并 備用；萘啶酮酸溶液的配制：稱取萘啶酮酸0. 01份加入到10份濃度為0. 05mol/L的氫氧化 鈉溶液中，得到萘啶酮酸溶液并備用； 稱取胰蛋白胨15-20份，蛋白胨2-4份，氯化鈉8-12份，磷酸二氫鈉2-3份，葡萄糖2-3 份，甘露醇2-3份，七葉苷0. 01-0. 03份，檸檬酸鈉0. 5-1. 5份，脫脂奶粉4-6份，先后加入到 1000份滅菌蒸餾水中，混合均勻后用lmol/L的氫氧化鉀溶液和lmol/L的鹽酸溶液將所得 混合物pH調(diào)節(jié)至7. 5,高壓滅菌15min，然后等待混合物冷卻至50°C，在無菌條件下，向混合 物中添加亞碲酸鉀溶液0. 16-0. 24份，叮啶黃溶液0. 16-0. 24份，萘啶酮酸溶液0. 16-0. 24 份，混合均勻后，制得半成品培養(yǎng)基； 在無菌環(huán)境下，將待檢測的樣品經(jīng)均質(zhì)器處理后添加到半成品培養(yǎng)基中，混合2min 后，在37°C下培養(yǎng)4-8小時，然后向半成品培養(yǎng)基中均勻添加亞碲酸鉀溶液0. 64-0. 96份， 吖啶黃溶液〇. 64-0. 96份，萘啶酮酸溶液0. 64-0. 96份；再繼續(xù)在37°C下培養(yǎng)16-20小時。
[0012] 在本發(fā)明的培養(yǎng)基的制備過程中，將培養(yǎng)基的配制分為兩步，在半成品培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)基中除了添加營養(yǎng)源物質(zhì)外，只添加了少量的抑制劑，這在一定程度上抑制了非目標 菌生長的同時，盡量減少抑制劑對亞致死狀態(tài)的目標菌的抑制作用，再加上加量的目標菌 的專屬營養(yǎng)源，能夠使亞致死狀態(tài)的目標菌復蘇、生長。在亞致死狀態(tài)的目標菌復蘇后，再 添加較大劑量的抑制劑，對非目標菌進行較大程度的抑制，此時原先亞致死狀態(tài)的目標菌 已復蘇，具有較強的活力，抑制劑對其的抑