一種braf基因v600e突變熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更為具體地說(shuō)，涉及一種BRAF基因V600E突變熒 光PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] BRAF基因是EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor，即上皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增 殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體）信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要成員，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)等過(guò)程。 在結(jié)直腸癌患者中，BRAF基因突變率約為15%。臨床研究發(fā)現(xiàn)EGFR靶向抗體愛(ài)必妥或帕 尼單抗對(duì)攜帶有BRAFV600E突變的KRAS野生型患者無(wú)效，而治療有效的患者中未發(fā)現(xiàn)有 BRAF突變，因此，美國(guó)國(guó)家癌癥綜合治療聯(lián)盟建議，在使用愛(ài)必妥或帕尼單抗等靶向藥物 時(shí)，須檢測(cè)腫瘤組織KRAS基因狀態(tài)，如果KRAS無(wú)突變，應(yīng)考慮檢測(cè)BRAF基因狀態(tài)。
[0003]BRAF蛋白的主要功能為絲蛋白激酶（MAPK)通路中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該 激酶將幫助信號(hào)從RAS轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEK1/2,是RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信號(hào)通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因 子，位于MAPK通路入口處，它將細(xì)胞表面的受體和RAS蛋白通過(guò)MEK和ERK與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄 因子相連接，激活多種因子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程。BRAF基因突變能夠?qū)е戮幋a 氨基酸的改變，從而可以通過(guò)模擬重要位點(diǎn)的磷酸化造成BRAF激酶的持續(xù)性活化，激活下 游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制地生長(zhǎng)。因而，針對(duì)BRAF及其下游激酶的小分子靶向 藥物，近年來(lái)在抗腫瘤藥物研發(fā)中倍受關(guān)注。
[0004] 研究表明，由于患者基因背景的不同，藥物在體內(nèi)的代謝、藥物治療的有效性以及 副反應(yīng)、甚至患者的預(yù)后都存在個(gè)體差異。因此，對(duì)藥物作用相關(guān)基因的檢測(cè)，可指導(dǎo)醫(yī)生 對(duì)患者準(zhǔn)確施藥，規(guī)避藥物副作用，同時(shí)提高病人乃至社會(huì)的醫(yī)療費(fèi)用效率。
[0005] 目前，國(guó)內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與ARMS-PCR技術(shù)檢測(cè)人BRAF基 因突變的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，然而此方法有很多不足之處：1)對(duì)于野生型背景的耐 受能力差，經(jīng)常出現(xiàn)假陽(yáng)性；2)沒(méi)有設(shè)置陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照（即內(nèi)標(biāo)），無(wú)法監(jiān)控假陰性；3) -般 沒(méi)有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒，以解決技術(shù) 背景所述的現(xiàn)有BRAF基因突變的試劑盒耐受能力差的問(wèn)題。
[0007] 本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包 括V600E突變檢測(cè)反應(yīng)液，且所述V600E突變檢測(cè)反應(yīng)液包括10 X PCR緩沖液、脫氧核糖核 苷三磷酸、用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針； 所述用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針的堿基對(duì)序列為：
[0009] 5, FAM-ATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGT-BHQ13，。
[0010] 優(yōu)選地，所述用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的堿基對(duì)序列為：
[0011]上游引物：5' -GGTGATTTTGGTCTAGCTTCGGA-3'；
[0012]下游引物：5'-AAATAGCCTCAATTCTTACCATCCA-3'。
[0013] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)試劑盒還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)為BRAF基因中相對(duì)保守的區(qū)域片 段，且所述區(qū)域片段的序列為：
[0014] 5 ' -CTACCTTCATCTCTTTCAGTTTTTCAAAATCCCACAGATGTGGCACGGAGCAACCCCAAGTCACCA CAAAAACCTATCGTTAGAGTCTTCCTGCCCAACAAACAGAGGACAGTGGTACCTGCAAGGTGTGG-3'。
[0015] 優(yōu)選地，所述V600E突變檢測(cè)反應(yīng)液還包括用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針，所述檢測(cè)內(nèi)標(biāo) 的探針的喊基對(duì)序列為：
[0016] 5 ' HEX-CACGGAGCAACCCCAAGTCACCA-BHQ13'。
[0017] 優(yōu)選地，所述V600E突變檢測(cè)反應(yīng)液還包括用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引 物；所述上游引物以及下游引物的堿基對(duì)序列為：
[0018]上游引物：5' -TTCAGTTTTTCAAAATCCCACAGA-3'；
[0019]下游引物：5' -CCACTGTCCTCTGTTTGTTGGG-3'。
[0020] 優(yōu)選地，所述10 X PCR緩沖液包括pH值為7. 5的200mmol/L的三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽溶液、濃度為30mmol/L的氯化鎂溶液、濃度為500mmol/L的氯化鉀溶液、體積比為 0. 2%的曲拉通溶液和體積比為10%的甲酰胺溶液。
[0021] 優(yōu)選地，所述脫氧核糖核苷三磷酸為dATP、dCTP、dGTP、dUTP或dTTP。
[0022] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)試劑盒還包括酶混合液，所述酶混合液包括1U/ μ 1~5U/ μ 1的 耐熱DNA聚合酶和0. 05U/ μ 1~0. 2U/ μ 1尿嘧啶DNA糖基化酶。
[0023] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為包含內(nèi)標(biāo)序列片段的 質(zhì)粒和BRAF基因V600E突變位點(diǎn)所在區(qū)域片段質(zhì)粒的混合物。
[0024] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)試劑盒還包括陰性對(duì)照，所述陰性對(duì)照為滅菌生理鹽水。
[0025] 本發(fā)明所提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒包括V600E突變檢測(cè) 反應(yīng)液，且所述V600E突變檢測(cè)反應(yīng)液包括10 X PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、用于擴(kuò) 增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針。本發(fā)明所提供的 BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和ARMS-PCR技術(shù) 的檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒具有很好的特異性，且操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)精度高，同時(shí) 在反應(yīng)體系中增加的內(nèi)標(biāo)能夠有效防止檢測(cè)呈假陰性。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng) 的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
[0027] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)弱陽(yáng)性 精密度參考品測(cè)試的擴(kuò)增曲線圖；
[0028] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性 精密度參考品測(cè)試的擴(kuò)增曲線圖；
[0029] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)野生型 人DNA測(cè)試的擴(kuò)增曲線圖；
[0030] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)含1 % BRAF基因突變的人DNA測(cè)試的擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明實(shí)施例提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒，以提供一種操作 快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬的BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒。
[0032] 為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，并使本發(fā)明實(shí) 施例的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù) 方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0033] 本發(fā)明實(shí)施例提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒包括V600E突變 檢測(cè)反應(yīng)液，且所述V600E突變檢測(cè)反應(yīng)液包括5 μ L的10 X PCR緩沖液、0. 2mmol/L的脫氧 核糖核苷三磷酸、〇·2 μ mol/L~0· 4 μ mol/L的用于擴(kuò)增革E1多核苷酸的上游引物以及下游 引物和〇·2 ymol/L~0· 4 ymol/L的用于檢測(cè)革巴多核苷酸的探針。
[0034] 本發(fā)明通過(guò)應(yīng)用DNAStar軟件包中的SeqMan和MegAlign軟件對(duì)Genbank中檢索 到的BRAF基因序列，在BRAF基因V600E位置進(jìn)行同源性比較，并針對(duì)該突變位置設(shè)計(jì)了 3套各包含有一條特異性引物ARMS引物、一條下游引物和一條探針的引物探針組合，經(jīng)優(yōu) 化，篩選出了擴(kuò)增效果相對(duì)較好的一對(duì)用于擴(kuò)增靶多核苷酸的探針和上下游引物，該探針 和引物源于人BRAF基因V600E突變所在外顯子區(qū)域。
[0035]其中，該探針的堿基對(duì)序列為：5' FAM-ATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGT-BHQ13'；
[0036] 用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的堿基對(duì)序列為：
[0037]上游引物：5 '-GGTGATTTTGGTCTAGCTTCGGA-3' ；
[0038]下游引物：5 ' -AAATAGCCTCAATTCTTACCATCCA-3 '。
[0039] 本發(fā)明實(shí)施例提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的突變位點(diǎn) 在檢測(cè)基因的具體位置為密碼子600處，且堿基的變化為GTG>GAG。由于采用了上述探針 和上下游引物，能夠在50ng/反應(yīng)的野生型DNA背景下實(shí)現(xiàn)1%突變型人BRAF基因100% 檢出且野生型人BRAF基因零檢出，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒具有很好的特異性以及極強(qiáng)的抗干 擾能力，大大降低了假陽(yáng)性率。
[0040] 本發(fā)明實(shí)施例提供的BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步包括內(nèi)標(biāo)， 即包括陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，該內(nèi)標(biāo)為C-KIT基因中相對(duì)保守的區(qū)域片段。在本檢測(cè)試劑盒中，該內(nèi) 標(biāo)可以監(jiān)控DNA提取和PCR反應(yīng)過(guò)程，監(jiān)控反應(yīng)體系是否有效，進(jìn)而防止樣本中可能存在的 抑制物干擾檢測(cè)，并使檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。其中，該內(nèi)標(biāo)的堿基對(duì)序列為：
[0041] 5 ' -CTACCTTCATCTCTTTCAGTTTTTCAAAATCCCACAGATGTGGCACGGAGCAACCCCAAGTCACCA CAAAAACCTATCGTTAGAGTCTTCCTGCCCAACAAACAGAGGACAGTGGTACCTGCAAGGTGTGG-3'。
[0042] 本發(fā)明實(shí)施例提供的V600E突變檢測(cè)反應(yīng)液還包括用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針，該探針 的堿基對(duì)序列為：5' HEX-CACGGAGCAACCCCAAGTCACCA-BHQ13'。
[0043] 同時(shí)，本發(fā)明實(shí)施例還提供了用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上下游引物，該上下游引物的堿基 對(duì)序列為：
[0044]上游引物：5 ' -TTCAGTTTTTCAAAATCCCACAGA-3 ' ；
[0045]下游引物：5 '-CCACTGTCCTCTGTTTGTTGGG-3'。
[0046] 進(jìn)一步，本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)試劑盒中的10XPCR緩沖液包括pH值為7.5的 200mmol/L的Tris-HCl(Trishydroxymethylaminomethane，即三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽 溶液）、濃度為30mmol/L的氯化鎂溶液、濃度為500mmol/L的氯化鉀溶液、體積比為0. 2% 的曲拉通溶液和體積比為10%的甲酰胺溶液。
[0047] 更進(jìn)一步，本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)試劑盒中的脫氧核糖核