一種基于納米磁微粒時間分辨熒光的β-HCG定量檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明基于納米磁微粒時間分辨熒光的β-HCG定量檢測試劑盒，包括校準(zhǔn)品，結(jié)合抗β-HCG單克隆抗體的磁微粒懸浮液，銪標(biāo)記的抗β-HCG單克隆抗體，分析緩沖液，洗滌液、增強液和反應(yīng)管。通過磁性吸附將磁微粒-β-HCG-銪標(biāo)抗體的雙抗體夾心復(fù)合物與游離銪標(biāo)記β-HCG單克隆抗體分離，加入增強液并測量吸光度值。該發(fā)明利用磁微粒在液體中擴散，增加反應(yīng)結(jié)合面積，富集待測物質(zhì)和縮短反應(yīng)時間，同時還具有標(biāo)記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自發(fā)熒光干擾等優(yōu)點。本試劑盒靈敏度高，準(zhǔn)確性好，反應(yīng)時間短，既可以手工操作，也可實現(xiàn)自動化，可大幅降低誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。
【專利說明】
一種基于納米磁微粒時間分辨熒光的（3 -HCG定量檢測試 劑盒
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于生物分析化學(xué)、生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于納米磁微粒時 間分辨熒光的0-HCG定量檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】：
[0002] 人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG)是由胎盤絨毛膜的 合體滋養(yǎng)層產(chǎn)生的一種糖蛋白，由a和0二個亞單位通過離子鍵和疏水鍵結(jié)合而成。a 亞單位為垂體前葉激素所共有，它與FSH、LH和TSH的a亞單位結(jié)構(gòu)相同，而0亞單位為 HCG所特有，在免疫活性上可與FSH、LH和TSH等區(qū)別。游離0人絨毛膜促性腺激素（free 0-HCG)是指非結(jié)合狀態(tài)的HCG的0亞單位，血中HCG大部分以全分子形式存在，游離 0 -HCG約占總HCG的1~5 %。
[0003] P-HCG對妊娠早期診斷有重要意義，對與妊娠相關(guān)疾病、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤等疾病的 診斷和病程觀察都有一定價值。妊娠時，血中0 -HCG是在受孕后6~8天開始產(chǎn)生，50~ 80天達(dá)峰，之后平穩(wěn)下降，直至孕18周左右穩(wěn)定于一定濃度。
[0004] 唐氏綜合征又稱先天愚型，21三體綜合征，是導(dǎo)致弱智的常見病因之一。目前通過 孕早、中期檢測孕婦血中？4??4、0-1^6、4??和8超檢查，可檢測出約9〇%的唐氏綜合征 來。一部分孕有唐氏綜合征胎兒的孕婦，其血清0-HCG水平呈直性升高，妊娠中期唐氏綜 合征孕婦血清0 -HCG濃度比正常孕婦至少高2倍以上。
[0005] 目前0 -HCG檢測大多采用酶免疫分析（Enzymatic immunoassay，EIA)、化 學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA)和時間分辨焚光免疫分析 (time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)等。EIA存在靈敏度低，線性范圍窄，不易實 現(xiàn)自動化等方法學(xué)缺陷。CLIA具有無放射性輻射的危害、靈敏度高、檢測線性范圍寬、穩(wěn)定 性好、自動化程度高和應(yīng)用范圍寬等優(yōu)點，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。但也存在發(fā)光過程 短、樣品不能重復(fù)檢測、本底較高和易受環(huán)境物質(zhì)干擾等缺點。而且目前國內(nèi)使用大部分為 價格昂貴的進(jìn)口試劑，如Roche、Abbott、Beckman等。
[0006] 磁微粒免疫檢測技術(shù)是利用高分子材料合成一定大小的磁性固相微粒作載體，以 物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)的方法將高特異性和高親和力的抗體或抗原包被于磁微粒上。磁微 粒與傳統(tǒng)的微孔板相比具有以下的特點：表面積更大，能結(jié)合更多的蛋白分子；可以通過 共價鍵與探針分子連接，比微孔板的物理吸附更牢固；是一種流動的固相載體，使反應(yīng)更迅 速。在實際工作中，待測樣品往往含有較多的雜質(zhì)成分，快速分離純化目標(biāo)待測物是臨床檢 驗工作者的難點之一。磁微粒能特異性結(jié)合目標(biāo)待測物，在外加磁場作用下可定向運動，使 目標(biāo)待測物得以分離、濃集和純化，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡單、不影 響被分離細(xì)蛋白生物學(xué)性狀和功能等特點。
[0007] TRFIA技術(shù)是繼放射免疫分析之后，標(biāo)記物發(fā)展的一個新里程碑，已成為臨床超微 量生化檢驗中一項最有發(fā)展前景的分析手段。TRFIA以鑭系元素作為標(biāo)記物，最常用的是 銪元素。鑭系元素的熒光壽命長，Strokes位移大，能將非特異性信號降低到可以忽略的程 度，達(dá)到了極高的信噪比。銪標(biāo)記物具有制備簡便、儲存時間長、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、無放射性 污染、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點，克服了酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定、化學(xué) 發(fā)光僅能一次發(fā)光且易受環(huán)境干擾、電化學(xué)發(fā)光的非直接標(biāo)記等缺點。然而，目前國內(nèi)外廠 家多采用基于微孔板的TRFIA技術(shù)。由于微孔板的固液相反應(yīng)面積小，需要的反應(yīng)時間較 長，微孔板包被抗體或抗原是通過物理吸附包被，包被抗體或抗原標(biāo)準(zhǔn)化難且穩(wěn)定性較差， 使得檢測結(jié)果精密度較差?；谖⒖装宓腡RFIA技術(shù)自動化程度低，主要為半自動，或前處 理加上TRFIA檢測儀的準(zhǔn)全自動檢測。
[0008] 目前基于免疫磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫分析已在臨床得到廣泛應(yīng)用，但基于免疫磁 微粒時間分辨熒光免疫分析的P-HCG檢測尚無文獻(xiàn)報道。磁微粒時間分辨熒光技術(shù)結(jié)合 了磁微粒免疫檢測技術(shù)與時間分辨熒光免疫分析的特點，可以減少反應(yīng)所需的樣本量，加 快反應(yīng)時間，容易實現(xiàn)自動化和樣本即時檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于納米磁微粒時間分辨熒光的0 -HCG定量檢測試 劑盒。
[0010] 本發(fā)明的方法學(xué)基礎(chǔ)是雙抗體夾心免疫反應(yīng)：通過微粒與0 -HCG抗體連接形成 固相復(fù)合物，即免疫磁微粒，用免疫磁微粒捕獲樣本中的待測抗原0-HCG，再用銪標(biāo)記的 0 -HCG抗體結(jié)合到被捕獲的0 -HCG上，最終形成免疫磁微粒-0 -HCG抗原-銪標(biāo)抗體的復(fù) 合物。洗滌去除游離銪標(biāo)記物，加入增強液，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射出強烈的熒光，用時間 分辨儀測定其熒光強度，熒光強度與待測樣品中的0 -HCG濃度成正比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可 確定樣品中0 -HCG的濃度。
[0011] 本發(fā)明的基于納米磁微粒時間分辨熒光的0 -HCG定量檢測試劑盒包括：1)連接 抗0 -HCG抗體的磁微粒；2)銪標(biāo)記抗0 -HCG抗體；
[0012] 可選地，上述試劑盒還包括以下試劑和/或裝置中的任意一種或兒種：3)校準(zhǔn)品； 4)分析緩沖液；5)洗滌液（25x) ;6)增強液；7)反應(yīng)管。
[0013] 可選地，本發(fā)明的基于納米磁微粒時間分辨熒光的0 -HCG定量檢測試劑盒可以 包括：1)校準(zhǔn)品；2)連接抗0-HCG抗體的磁微粒；3)銪標(biāo)記抗0-HCG抗體。4)分析緩沖 液；5)洗滌液（25x) ;6)增強液；7)反應(yīng)管。
[0014] 上述連接抗0-HCG單克隆抗體的磁微粒的制備步驟為：磁微粒制備一磁微?；?化一與抗0 -HCG單克隆抗體連接，可選地，還包括抗體連接后洗滌一封閉一保存的步驟。 參照以上步驟可制得到偶聯(lián)高特異性抗0 -HCG單克隆抗體的免疫磁微粒。
[0015] 上述磁微粒具有超順磁性，其直徑優(yōu)選為10~50nm，每克磁微粒上所帶的羧基活 性基團的含量不低于〇. 4_〇1 ;所述的抗0 -HCG單克隆抗體優(yōu)選純度大于等于90%、稀釋 效價大于1 : 100萬；所述的偶聯(lián)劑為碳二亞胺。
[0016] 上述的含有羧基活性基團的磁微粒制備方法為：將FeCl3 *61120和FeCl2. 4H20以摩 爾比2 : 1加入到蒸餾水中，劇烈攪拌溶解；在氮氣環(huán)境下加0.5M氨水，65°C孵育45min; 然后蒸餾水洗滌，棄上清，60°C烘干即得磁微粒；將磁微粒超聲分散在10% (w/v)PEG8000 溶液，再加入10% (v/V)的無水乙醇；在氮氣環(huán)境下加入交聯(lián)劑N，N'_亞甲基雙丙烯酰胺， 61°C攪拌孵育30min;再加入3% (v/v)的過氧化苯甲酰、50% (v/v)的苯乙稀、25% (v/v) 的丙烯酸；反應(yīng)8-10h后蒸餾水反復(fù)洗滌，除去未包覆的Fe304磁粉，真空干燥后得到表面聯(lián) 有羧基的磁微粒。
[0017] 上述銪標(biāo)記抗0-HCG抗體的制備步驟：選用針對另一抗原位點的0-HCG單克隆 抗體進(jìn)行Eu 3+標(biāo)記，抗體與Eu3+標(biāo)記物的質(zhì)量比例可以為1 : 10至10 : 1，優(yōu)選為1 : 1、 2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1，最優(yōu)選質(zhì)量比例為5 : 1。標(biāo)記過程為：將抗0-HCG單克隆抗 體與N1-(P -異硫氰基芐基）-二乙三胺四乙酸銪鈉以1 : 5的比例混合，4°C靜置過夜，然 后采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-200分離柱，分別用含0. 85%NaCl(w/v)和50mmol/L Tris-HCl 洗脫游離Eu3+標(biāo)記物與抗體結(jié)合Eu 3+標(biāo)記物。
[0018] 上述校準(zhǔn)品的制備步驟為：用含2g/L BSA及l(fā)g/L似隊的Tris-HCl緩沖液，其濃 度優(yōu)選為 50mmol/L，pH 優(yōu)選為 7. 8,將 0-HCG 抗原配制成 0、5、20、50、500、5000mlU/mL 的 系列濃度的校準(zhǔn)溶液。分裝并儲存于2-8°C;
[0019] 上述分析緩沖液配方為：Tris-HCl(50mmol/L)，PEG6000(l. 5%，w/v)，BSA(0. 5%， w/v)，Proclin300 (0? 1 %，v/v)，牛 lgG (0? 02%，w/v)，Tween20 (0? 1 %，v/v)，NaCl (0? 84%， w/v)，pH7. 8的緩沖液；
[0020] 上述洗滌液（25X)配方為：Tris-HCl (1. 25mmol/L)，Tween20(2. 5 %，v/v)， NaCl (21 %，w/v)，pH7. 8 的緩沖液。
[0021] 上述增強液配方為：由P -萘甲酰三氟丙酮-NTA，15 ymol/L)，三辛基氧化磷 (T0P0,50ymol/L)，Triton X-100(0.1%，v/v)，醋酸（0.6%，v/v)組成，用 6.8nmol/L 的 鄰苯二甲酸氫鉀調(diào)整pH為3. 0~3. 2 ;
[0022] 上述反應(yīng)管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
[0023] 本發(fā)明的測定方法為：每反應(yīng)管加入50yl的用分析緩沖液以1 : 25稀釋的免疫 磁微粒，然后加入0 -HCG校準(zhǔn)品或樣品50 y 1，再加入用分析緩沖液1 : 50稀釋的Eu3+標(biāo) 記抗體100 y 1，室溫震蕩孵育30min，運用磁性分離技術(shù)將包被0 -HCG的免疫磁微粒與上 清分離洗滌，最后每孔加入200 y 1增強液，振搖5min后在時間分辨熒光檢測儀上測定熒光 值。
[0024] 與現(xiàn)有的0 -HCG檢測試劑盒相比，本發(fā)明試劑盒具有以下優(yōu)點： (1) 本試劑盒結(jié)合了磁分離技術(shù)和TRFIA技術(shù)，既擁有TRFIA技術(shù)的靈敏度高、儲存時 間長、線性范圍寬、無放射性污染等優(yōu)點，還通過免疫磁微粒的富集作用和磁微粒在液體中 充分?jǐn)U散而增大結(jié)合表面積擴大的作用，大大縮短反應(yīng)時間，提高檢測靈敏度； (2) 通過化學(xué)基團定向連接磁微粒與抗體，增加了抗體結(jié)合強度，減少了抗體用量，也 提高檢測的精密度； (3) 該技術(shù)既可以進(jìn)行手工操作，也能實現(xiàn)自動化。當(dāng)用于自動分析儀時，既能單個樣 本測量即時檢測，也能批量檢測，克服了傳統(tǒng)微孔板式TRFIA技術(shù)只能批量檢測的缺點。 【附圖說明】 圖1是本發(fā)明的試劑盒與雅培公司的微粒子化學(xué)發(fā)光試劑盒測定P-HCG的測定結(jié)果 比較圖，其中橫坐標(biāo)為本發(fā)明試劑盒測定的0 -HCG值，縱坐標(biāo)為雅培公司的微粒子化學(xué)發(fā) 光試劑盒測定值，兩種方法的直線相關(guān)方程為y = 〇. 989x-0. 618,相關(guān)系數(shù)R2= 0. 979。 【具體實施方式】 實施例1:本發(fā)明的試劑盒的制備： (1) 0-HCG校準(zhǔn)品的配制： 用濃度為50mmol/L，含2g/L BSA及l(fā)g/L似隊的Tris-HCl緩沖液，將-HCG抗原（購 自中國檢驗檢定研究院）配制成0、5、20、50、500、5000mlU/mL的系列濃度的校準(zhǔn)溶液。 (2) 結(jié)合抗0-HCG單克隆抗體的磁微粒懸浮液的制備： 將FeCl3 ? 6H20和FeCl2. 4H20以摩爾比2 : 1加入到蒸餾水中，劇烈攪拌溶解；在氮氣 環(huán)境下加〇. 5M氨水，65°C孵育45min ;然后大量蒸餾水洗滌，棄上清，60°C烘干即得磁微粒； 將磁微粒超聲分散在10% (w/v)PEG8000溶液，再加入10% (v/v)的無水乙醇；在氮氣環(huán)境 下加入交聯(lián)劑N，N'_亞甲基雙丙烯酰胺，61°C攪拌孵育30min;再加入3% (v/v)的過氧化 苯甲酰、50% (v/v)的苯乙烯、25% (v/v)的丙烯酸；反應(yīng)8-10h后蒸餾水反復(fù)洗滌，真空干 燥后得到表面聯(lián)有羧基的磁微粒。然后將磁微粒與抗0 -HCG單克隆抗體（購自Fitzgerald 公司，磁微粒與抗體質(zhì)量比1 : 10)在偶聯(lián)劑碳二亞胺（lg/L)的存在下，室溫反應(yīng)4~6 小時，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行洗滌和封閉，并用緩沖液調(diào)整pH和濃度，至pH為7. 8,濃度為0. 5mg/ mL，2~8°C冷藏備用。 (3) 銪標(biāo)記抗0 -HCG抗體的制備： 將另一株針對不同抗原表位的抗0 -HCG單克隆抗體lmg(購自Fitzgerald公司）加入 0? 5ml 50mmol/L的Na2C03緩沖液，用Millipore公司帶有濾膜的G-50的離心管lOOOOrpm 離心5min，再重復(fù)洗滌5次，倒轉(zhuǎn)離心收集抗體，體積控制在200微升左右，將離心純化抗體 加入到〇.2mg Eu3+標(biāo)記物（購自PerKinElmer公司）中，4°C靜置過夜。然后采用聚丙稀酰 胺葡聚糖S-200分離柱，分別用含0. 85% NaCl和50mmol/LTris-HCl洗脫游離Eu3+標(biāo)記物 與抗體結(jié)合Eu3+標(biāo)記物。逐管收集流出液（lml/管），并測量吸光度（A280nm)，合并峰管后 并以1. 0ml/瓶真空冷凍干燥2~8°C保存。 (4) 分析緩沖液配方為：1^8-11(：1(50臟〇1/1)，？￡66000(1.5%，￥八），85厶(0.5%，￥/ v)，Proclin300 (0? 1 %，v/v)，牛 lgG (0? 02%，w/v)，Tween20 (0? 1 %，v/v)，NaCl (0? 84%，w/ v)，pH7. 8的緩沖液； (5) 洗滌液（25x)配方為：Tris-HCl (1. 25mmol/L)，Tween20(2. 5%，v/v)，NaCl (21%， w/v)，pH7. 8的緩沖液。 (6) 增強液配方為：由萘甲酰三氟丙酮（0-NTA，15iim〇l/L)，三辛基氧化磷 (T0P0,50ymol/L)，Triton X-100(0.1%，v/v)，醋酸（0.6%，v/v)組成，用 6.8nmol/L 的 鄰苯二甲酸氫鉀調(diào)整pH為3. 0~3. 2。 實施例2 :本發(fā)明試劑的性能指標(biāo)檢查： (1) 試劑盒校準(zhǔn)品與相應(yīng)濃度的國家系列標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行分析測定，用雙對數(shù)數(shù)學(xué) 模型擬合，要求兩條劑量-反應(yīng)曲線不明顯偏離平行（t檢驗，|t| < 2.447);以企業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 品為對照品，用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，試劑盒校準(zhǔn)品的實測值與標(biāo)示值比值的平均值應(yīng)在 0. 9~1. 1范圍內(nèi)。劑量-反應(yīng)曲線的線性相關(guān)系數(shù)（r) = 0. 996。 (2) 靈敏度：將零值參考標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測量8次，計算其熒光值和標(biāo)準(zhǔn)差。以該均值加2 倍標(biāo)準(zhǔn)差的所得熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其濃度值，該值為其靈敏度，經(jīng)測定本試劑分析 靈敏度為20mlU/ml。 (3) 線性范圍：將抗原稀釋成不同濃度后進(jìn)行測定，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為5~ 5000mlU/ml，對于濃度大于5000mIU/mL的標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行稀釋測定。 (4) 精密度（CV% ):分別重復(fù)測定高、中、低濃度的樣本（預(yù)期濃度分別為：2、15、 5000mlU/mL)，測得本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)為2. 2 %~6. 2 %，批間變異系數(shù)為 3. 7%~8. 1%〇 表1 :批內(nèi)、批間精密度測試結(jié)果（n = 20)
(5) 特異性
(6) 穩(wěn)定性：開瓶后37°C放置7天，測定值應(yīng)符合上述各項要求。 實施例3本發(fā)明的試劑盒的使用方法 (1) 樣本收集：米集靜脈血2~3ml于肝素抗凝管，以3500~4000rpm離心3~5min 分離血漿。血漿樣品在2~8°C保存可以穩(wěn)定7天以上，如果需要長期保存，請在-20°C保 存。 (2) 試劑的準(zhǔn)備： ① 將待檢試劑盒在室溫（18~25°C )下平衡30分鐘。 ② 配制洗滌液：將濃縮洗液用去離子25倍稀釋，即為作洗滌液。 ③ 配制銪標(biāo)記物工作液：使用前1小時將每瓶標(biāo)記物用lmL去離子水溶解，用分析緩沖 液以1 : 50倍稀釋作為鋪標(biāo)抗體工作液。 ④ 免疫磁微粒：使用前需震蕩懸浮混勻。 (3) 操作步驟： ① 每反應(yīng)管加入50 y 1的稀釋磁微粒，然后加入50 y 1校準(zhǔn)品或樣品，再加入100 y 1 銪標(biāo)記抗體，室溫震蕩孵育反應(yīng)30min。 ② 將反應(yīng)管置于磁力分離架上2分鐘，使磁微粒凝集。 ③ 用洗滌液沖洗4次，每次洗滌液用量300 y 1，每次加入洗滌液后需靜置30秒，使磁微 粒重新凝集再吸棄上清。 ④ 每孔加增強液200 y 1，震蕩孵育5分鐘后上機測定。 實施例4本試劑盒的臨床對比實驗 本專利發(fā)明的試劑盒已進(jìn)行了臨床對比實驗，將本試劑盒和雅培公司的微粒子化學(xué)發(fā) 光試劑盒同時對154例臨床樣本的0-HCG濃度進(jìn)行測定。以本試劑盒測量值為橫坐標(biāo)，雅 培公司試劑盒測定值為縱坐標(biāo)，將兩組測定結(jié)果進(jìn)行回歸分析，所得直線相關(guān)方程為：y = 0. 989x-0. 618,相關(guān)系數(shù)R2= 0. 979。線性回歸系數(shù)為0. 989接近1，可見本方法制備的試 劑盒與醫(yī)院測值有較好的一致性。以SPSS13. 0統(tǒng)計分析軟件對相關(guān)系數(shù)進(jìn)行t檢驗（檢 驗水準(zhǔn)a = 〇. 05)，P < 0. 001?？梢妰煞N方法測定的-HCG值密切相關(guān)，說明試劑盒的 診斷能力較強，可推廣臨床應(yīng)用。 為了確定本試劑盒的臨床參考值，對215例非妊娠的健康對象的血漿樣本，采用本試 劑盒進(jìn)行P-HCG濃度測定，結(jié)果表明本試劑盒的參考范圍（參考區(qū)間）為：0-5mlU/ml。
【主權(quán)項】
1. 一種基于納米磁微粒時間分辨熒光的β -HCG定量檢測試劑盒，其特征在于包括：結(jié) 合抗β -HCG單克隆抗體的磁微粒懸浮液，銪標(biāo)記的抗β -HCG單克隆抗體，校準(zhǔn)品，分析緩 沖液，洗滌液、增強液。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述校準(zhǔn)品的制備步驟為：用含2g/L BSA 及l(fā)g/L恥隊的Tris-HCl緩沖液，其Tris-HCl濃度為50mmol/L，pH為7. 8,將β -HCG抗原 配制成0、5、20、50、500、5000mlU/mL的系列濃度的校準(zhǔn)溶液。3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述結(jié)合抗β -HCG單克隆抗體的磁微粒 懸浮液的制備方法如下：使含有羧基活性基團的磁微粒與抗β-HCG單克隆抗體在偶聯(lián)劑 的存在下，室溫反應(yīng)4~6小時，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行洗滌和封閉。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑 優(yōu)選為10~50nm，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團的含量不低于0. 4mmol ;所述的抗 β-HCG單克隆抗體優(yōu)選純度大于等于90%、稀釋效價大于1 : 100萬；所述的偶聯(lián)劑為碳 二亞胺。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的含有羧基活性基團的磁微粒制 備方法為：將FeCl3 · 6Η20和FeCl2. 4Η20以摩爾比2 : 1加入到蒸餾水中，劇烈攪拌溶解； 在氮氣環(huán)境下加〇. 5Μ氨水，65°C孵育45min ;然后蒸餾水洗滌，棄上清，60°C烘干即得磁微 粒；將磁微粒超聲分散在10% (w/v)PEG8000溶液，再加入10% (v/v)的無水乙醇；在氮氣 環(huán)境下加入交聯(lián)劑N，N'_亞甲基雙丙烯酰胺，61°C攪拌孵育30min;再加入3% (v/v)的過 氧化苯甲酰、50% (v/v)的苯乙烯、25% (v/v)的丙烯酸；反應(yīng)S-IOh后蒸餾水反復(fù)洗滌，除 去未包覆的Fe3O4磁粉，真空干燥后得到表面聯(lián)有羧基的磁微粒。6. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述銪標(biāo)記抗β -HCG抗體的制備方法為： 選用抗β -HCG單克隆抗體進(jìn)行Eu3+標(biāo)記，標(biāo)記過程如下：將抗β -HCG單克隆抗體與NI- (Ρ 一異硫氰基芐基）_二乙三胺四乙酸銪鈉以1 : 5的比例混合，4°C靜置過夜，然后采用聚丙 烯酰胺葡聚糖S-200分離柱，分別用含0. 85% NaCl (w/v)和50mmol/L Tris HCl洗脫游離 Eu3+標(biāo)記物與抗體結(jié)合Eu 3+標(biāo)記物。7. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述分析緩沖液配方為： Tns HCl (50mmol/L)，PEG6000(1. 5%，w/v)，BSA(0. 5%，w/v)，Proclin300(0. 1%，w/v)，牛 IgG(0. 02%，w/v)，Tween20(0. 1%，v/v)，NaCl (0· 84%，w/v)，ρΗ7· 8 的緩沖液。8. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液配方為：Tris-HCl (I. 25mmol/ L)，Tween20 (2· 5%，v/v)，NaCl (21 %，w/v)，ρΗ7· 8 的緩沖液。9. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述增強液配方包括：由β -萘甲酰三氟 丙酮（β -ΝΤΑ，15 μ mol/L)，三辛基氧化磷（Τ0Ρ0, 50 μ mol/L)，Triton Χ-100 (0· 1 %，v/v)， 醋酸（〇. 6%，v/v)組成，用6. 8nmol/L的鄰苯二甲酸氫鉀調(diào)整pH為3. 0~3. 2。10. 試劑盒的制備方法，其包括以下步驟： 1) 校準(zhǔn)品的制備； 2) 結(jié)合抗β-HCG單克隆抗體的磁微粒懇浮液的制備； 3) 銪標(biāo)記抗β -HCG單克隆抗體； 優(yōu)選地，還包括配制分析緩沖液，洗滌液、增強液。
【文檔編號】G01N33/542GK105891463SQ201410857408
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月31日
【發(fā)明人】王東生, 羅光成, 王強, 張國元, 劉萍
【申請人】川北醫(yī)學(xué)院