一種臨床檢測耳聾相關基因突變的hrm方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種臨床檢測耳聾相關基因突變的HRM方法及試劑盒。通過提取待測樣本DNA，使用如SEQ ID NO.1?30所示的引物進行PCR擴增和HRM掃描分析；根據掃描分析結果判斷耳聾相關基因突變類型，HRM掃描分型無突變峰的樣本為陰性，HRM掃描分型有突變峰的樣本為陽性。本發(fā)明的試劑盒包含上述引物、質控品、PCR試劑和飽和熒光染料等；該試劑盒全部引物能在同一溫度下進行PCR反應，檢測靈敏度高，特異性強，反應體系小，檢測樣本來源豐富，反應簡便迅速試劑價格低廉，高通量。本發(fā)明適用于臨床新生兒遺傳性耳聾基因篩查和優(yōu)生優(yōu)育孕前耳聾基因篩查，有助于指導優(yōu)生優(yōu)育和臨床個體化用藥。
【專利說明】
一種臨床檢測耳聾相關基因突變的HRM方法及試劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種用于臨床檢測五種常見耳聾相關基 因突變的HRM方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 耳聾是一種全球性的人類感覺神經缺陷，影響近6億人口的健康，每1000兒童中約 有2~6人在出生或幼年時即遭遇嚴重的聽力喪失，遺傳因素在發(fā)病中占有重要位置。約 80%遺傳性耳聾為非綜合征型(non-syndromic hearing loss ,NSHL)，即不伴有其他癥狀 的耳聾，其中常染色體隱性遺傳性非綜合征型耳聾(ARNSHL)占 NSHL的80%。迄今為止，已報 道的與ARNSHL有關的耳聾基因突變位點多達46個（Hilgert N, Smith RJ, Van Camp G.Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment:which ones should be analyzed in DNA diagnostics,Mutation research 2009;681:189-196·)，中國患者 中最常見的耳聾基因為GJB2、SLC26A4、mtDNA12S rRNA(Jiang Y，Huang S，Deng T，et al.Mutation Spectrum of Common Deafness-Causing Genes in Patients with Non-Syndromic Deafness in the Xiamen Area,China.PLoS 0ne.2015;10(8):e0135088·)。這 些基因突變的精準檢測對遺傳性耳聾疾病的臨床診斷、治療、預防以及指導優(yōu)生優(yōu)育均有 重要意義。
[0003] GJB2基因突變與ARNSHL的發(fā)生密切相關。約50%的ARNSHL患者存在GJB2基因突變 (Walsh T , Shahin H , EI kan-Mi Her T e t al . Whole exome sequencing and homozygosity mapping identify mutation in the cell polarity protein GPSM2 as the cause of nonsyndromic hearing loss DFNB82.American journal of human genetics 2010;87:90-94.)。6貝2基因位于人染色體13ql 1-12上，編碼區(qū)長度為681bp，編 碼產物是縫隙連接蛋白26(Connexin-26，Cx26)<Xx26蛋白含226個氨基酸，以六聚體的形式 在細胞縫隙連接處形成穿膜通道，是細胞間電解質(尤其是鉀離子的循環(huán)）、第二信使和代 謝產物的細胞間轉運的重要通路，在信息傳遞和物質交換中發(fā)揮重要作用（Nickel R， Forge A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness . Current opinion in otolaryngoIogy&head and neck surgery 2008;16:452-457.)?？p隙連接蛋白在內耳中的分布分為耳蝸基底膜上皮細胞(支 持細胞)縫隙連接系統(tǒng)和耳蝸側壁的結締組織(血管紋和螺旋韌帶)縫隙連接系統(tǒng)。Cx26的 表達具有細胞特異性，是耳蝸上皮細胞主要表達的兩種縫隙連接蛋白之一（Zhao HB，Yu N.Distinct and gradient distributions of connexin26 and connexin30 in the cochlear sensory epithelium of guinea pigs. The Journal of comparative neurology 2006;499:506-518.)，對鉀離子經內耳毛細胞循環(huán)回流入耳蝸內淋巴液起到調 控作用。目前研究顯示GJB2基因的突變幾乎覆蓋整個編碼區(qū)，突變位點在不同種族中存在 很大的差異，常見的突變位點包括235delC、299~300delAT、176dell6bp、35delG等，且多為 缺失突變（Dai P，Yu F，Han B et al.GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment. Journal of translational medicine 2009; 7: 26.)。我國大規(guī)模耳聾分子流行病學發(fā)現中國漢族人群以235delC突變 最常見，檢出率為13.96% (Zheng J，Ying Z，Cai Z et al.GJB2 Mutation Spectrum and Genotype-Phenotype Correlation in 1067 Han Chinese Subjects with Non-Syndromic Hearing Loss.PloS one 2015;10:6〇128691.)。6貝2基因序列中某些核苷酸的 缺失、插入、移碼等突變，可產生功能缺陷或無功能的Cx26蛋白，如235delC的純合性缺失、 使遺傳密碼發(fā)生移碼突變、產生無功能的縫隙連接蛋白，降低縫隙連接的通透性，影響通道 的正常開閉，進入耳蝸內淋巴循環(huán)的鉀離子減少，導致耳蝸內Corti器鉀中毒，從而引起感 音神經性耳聾（sensorineural hearing loss,SNHL)(Terrinoni A,Codispoti A1Serra V et al.Connexin 26(GJB2)mutations as a cause of the KID syndrome with hearing loss.Biochemical and biophysical research communications 2010;395:25-30·)〇因 此，編碼Cx26的GJB2基因突變檢測成為臨床精準診斷遺傳性耳聾及個體化治療的重要靶 點。
[0004] SLC26A4基因 （solute carrier family 26A，SLC26A)，屬于離子轉運體26A基因家 族，編碼跨膜蛋白Pendr in，其突變可導致伴有前庭水管擴大的NSHL，與Pendred綜合征的致 病基因相同。SLC26A4基因定位于人染色體7q31上，全長4930bp，含有21個外顯子，開放閱讀 框2343bp，編碼的Pendrin蛋白在內耳主要表達于內淋巴管、內淋巴囊、橢圓囊和球囊斑相 連的非感覺上皮以及外溝的外側壁，介導氯離子的轉運，維持內淋巴液的離子平衡。在伴有 前庭水管擴大的NSHL患者（或合并Pendre綜合征）中約50%攜帶SLC26A4突變(Alasti F， Van Camp G,Smith RJH.Pendred Syndrome/DFNB4. In:Pagon RA,Adam MP,Ardinger HH et al · eds .GeneReviews(R) · Seattle(WA) 1993 ·)。對SLC26A4基因全外顯子測序發(fā)現IVS7-2A>G是中國前庭水管擴大耳聾患者人群的熱點突變，占所有突變的57.63 % (Wang QJ，Zhao YL,Rao SQ et al.A distinct spectrum of SLC26A4 mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China.Clinical genetics 2007;72:245_254.)〇 IVS7-2A>G突變位于外顯子8剪切位點的位置，即內含子7的3'末端距外顯子8起始位置的2 個堿基處，突變后該位置的腺嘌呤被鳥嘌呤置換，使前體mRNA不能正常剪接，外顯子8完全 丟失，從而導致Pendrin的翻譯發(fā)生移框或提前終止，影響Pendrin的結構和功能，使攜帶該 突變的個體發(fā)生耳聾。
[0005]線粒體基因(mtDNA)具有母系遺傳特點，其突變與氨基糖戒類藥物致聾(Aminogly coside Antibiotic-Induced Deafness ,AAID)和非綜合征型耳聾有關。3%以上的感音神 經性耳聾患者中存在線粒體基因突變（Liu X，Dai P，Huang DL, et al .Large-scale screening of mtDNA A1555G mutation in China and its significance in prevention of aminoglycoside antibiotic induced deafness.Zhonghua yi xue za zhi.2006；86(19):1318-22.Jiang Y1Huang S1Deng T,et al.Mutation Spectrum of Common Deafness-Causing Genes in Patients with Non-Syndromic Deafness in the Xiamen Area,China.PLoS 0ne.2015;10(8) :e0135088.)。其中非綜合征型耳聾常見的 mtDNA突變位點是 12SrRNA的A1555G和C1494 T突變（Ding Y,Leng J,Fan F,Xia B,Xu P. The role of mitochondrial DNA mutations in hearing loss.Biochemi cal genetics 2013;51:588-602. )<X1494T和A1555G突變均位于mtDNA 12SrRNA的小核糖體亞 單位的編碼區(qū)域，其序列從細菌到哺乳動物高度保守。由C1494T或A1555G突變所形成新的 U-A或G-C堿基配對導致rRNA的二級結構與大腸桿菌16SRNA的相應區(qū)域更加相似，因而該突 變使線粒體DNA更容易與氨基糖戒類藥物結合(Hamasaki K,Rando RR.Specific binding of aminoglycosides to a human rRNA construct based on a DNA polymorphism which causes aminoglycoside-induced deafness . Biochemistry 1997；36:12323-12328.)。氨基糖甙類抗生素耳毒性的發(fā)生機制:氨基糖甙類抗生素進入耳蝸和前庭積累， 通過與12SrRNA C1494T或A1555G突變的線粒體相互作用，抑制線粒體蛋白合成，線粒體的 翻譯缺陷導致耳蝸和前庭細胞內ATP的生成下降，同時大量活性氧(ROS)產生，損傷線粒體 和細胞內的蛋白、脂類和核酸等，線粒體的轉運通道開放并啟動細胞死亡途徑，導致耳蝸和 前庭細胞功能的喪失或細胞死亡并出現聽力損失。攜帶線粒體A1555G突變者在沒有使用氨 基糖甙類抗生素的情況下也可出現耳聾。因此，mtDNA C1494T或A1555G突變的檢測對藥物 性耳聾的早期診斷和預防，以及指導攜有該突變的育齡女性優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。
[0006]目前，針對GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因突變位點的檢測，臨床常用方法有兩 種:一是DNA直接測序法，雖然其是目前公認金標準方法，但必須有DNA測序儀，試劑成本高， 而且操作煩鎖，靈敏度不高（只能檢出突變頻率高于25 %的突變）；二是基因芯片法(博奧生 物有限公司），其特點是高通量，但存在陽性檢出率和準確率較傳統(tǒng)方法低(尤其是SLC26A4 基因突變位點），試劑耗量大(25yL反應體系），檢測時間長，成本高等不足(王國建，張冠斌， 袁永一等.十五項遺傳性耳聾基因突變微陣列診斷芯片的臨床應用研究.中華耳科學雜志， 2014:6-10)。此外還有熒光定量法、限制性片段長度多態(tài)性分析、變性高效液相色譜等等， 但這些方法均存在檢測時間長、操作繁瑣、靈敏度低等不足。隨著國家二胎政策的推出，新 生兒出生缺陷篩查的日益普及，現有的耳聾相關基因突變檢測方法已不能滿足臨床需求， 迫切需要研發(fā)一種快速、準確、低成本、高靈敏度的耳聾相關基因檢測技術。
[0007] 高分辨溶解曲線(High Resolution Melting，HRM)技術是一種新的檢測技術，其 基本原理是基于DNA雙鏈中的A、T、C、G組成不同，在加熱變性時不同堿基序列的DNA雙鏈的 解鏈溫度和熔解曲線的形狀不同，根據熔解曲線的不同判斷是否存在突變。HRM技術使用的 是飽和熒光染料LCGreen，在PCR時以飽和的濃度加入，不會抑制PCR反應。在進行HRM分析 時，由于飽和染料占據了DNA雙鏈每一對堿基上的空位，當雙鏈解鏈時，染料立即與雙鏈脫 離，熒光信號會發(fā)生較大的變化，使用檢測靈敏度高。而且，操作簡便，樣品經PCR擴增后直 接進行HRM，PCR產物實現閉管式操作，無氣溶膠污染。由于HRM完全是基于核酸的物理性質 進行分析，因而無需序列特異性探針，檢測價格低。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種用于臨床檢測常見耳聾 相關基因5個位點突變的HRM方法?；谠摲椒?，本發(fā)明的目的還在于提供實施該方法的試 劑盒(基于HRM技術的GJB2、SLC26A4、mtDNAl 2SrRNA基因突變檢測PCR試劑盒）。
[0009] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：
[0010] -種用于臨床檢測耳聾相關基因突變的HRM方法，包括如下步驟:提取待測樣本 DNA;使用引物對A、B、C、D、E對樣本DNA進行PCR擴增;對PCR產物進行HRM分析;根據分析結果 判斷GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因突變類型，HRM掃描分型無突變峰的樣本為陰性，HRM 掃描分型有突變峰的樣本為陽性。
[0011] 其中，引物對A用于檢測GJB2基因編碼區(qū)第176位點16bp缺失突變（176dell6bp)， 其優(yōu)選為以下三對序列中的一對：
[0012] A_F1：CAGGCCGACTTTGTCTG,
[0013] A_R1:GGAGATGGGGAAGTAGTGAT;或
[0014] A_F2：TGAGCAGGCCGACTTTG,
[0015] A_R2:GAGATGGGGAAGTAGTGATCGTA;或
[0016] A_F3：CGACTTTGTCTGCAACACC,
[0017] A_R3:CCGGATGTGGGAGATGG。
[0018] 引物對B用于檢測GJB2基因編碼區(qū)第235位點C堿基缺失突變(235delC)，其優(yōu)選為 以下三對序列中的一對：
[0019] B_F1:CCACATCCGGCTATGGGCC，
[0020] B_R1:GTGCATGGCCACTAGGAG;或
[0021] B_F2:CTCCCACATCCGGCTATGGGC，
[0022] B_R2:CATGGCCACTAGGAGCGC;或
[0023] B_F3:CTCCCACATCCGGCTATGGGC，
[0024] B_R3:CACTAGGAGCGCTGGCG。
[0025]引物對C用于檢測SLC26A4基因 IVS7-2A>G位點突變，其優(yōu)選為以下三對序列中的 一對：
[0026] C_F1:ACAAGGAATTATTAAAACCAATGGAG，
[0027] C_R1:ATGGCAGTAGCAATTATCGT;或
[0028] C_F2:AACCAATGGAGTTTTTAACATCTTT，
[0029] C_R2:TATGAAATGGCAGTAGCAATTATCG;或
[0030] C_F3：AACCAATGGAGTTTTTAACATCTTT,
[0031] C_R3:TTGGCTCCATATGAAATGGCA。
[0032] 弓丨物對D用于檢測mtDNA 12SrRNA基因 C1494T突變，其優(yōu)選為以下三對序列中的一 對：
[0033] D_F1:GTACACACCGCCCGTCA，
[0034] D_R1:ATAAATGCGTAGGGGTTTTAGT;或
[0035] D_F2:GTACACACCGCCCGTCA，
[0036] D_R2:GGGTTTTAGTTAAATGTCCTTTGAAG;或
[0037] D_F3：GTACACACCGCCCGTCA,
[0038] D_R3：CGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCo
[0039] 引物對E用于檢測mtDNA 12SrRNA基因 A1555G突變，其優(yōu)選為以下三對序列中的一 對：
[0040] E_FI:CATTTAACTAAAACCCCTACGCA，
[0041 ] E_R1:TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGA;或
[0042] E_F2:ACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACC，
[0043] E_R2:ACACTTACCATGTTACGACTTG;或
[0044] E_F3:ACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACC，
[0045] E_R3:TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGA。
[0046] 上述引物通過如下方法設計得到：針對常見的GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因 突變位點，從PUBMED在線數據庫檢索GJB2、SLC26A4、mtDNAl2SrRNA基因突變位點的DNA序 列，通過NCBI BLAST軟件(http : //www.ncbi .nlm.nih · gov/BLAST/)進行比對，然后應用 LightScannerPr imer( IdahoTechnologyInc，USA)軟件針對這些突變區(qū)域設計引物。經過反 復試驗篩選和驗證，得到了一組擴增效率高、特異性好、能夠正確區(qū)分待檢測樣本耳聾相關 基因突變的引物。
[0047] -種基于HRM技術的耳聾相關基因突變檢測PCR試劑盒，包含上述引物對A、B、C、D 和/或E。
[0048] 優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括質控品，質控品包括兩組:①上海生工生物工程股份 有限公司合成的GJB2基因176de 116bp、235de IC突變陽性對照、臨界陽性對照和陰性對照； S L C 2 6 A 4基因 IV S 7 - 2 A > G突變陽性對照、臨界陽性對照和陰性對照品；m t D N A12 S r R N A A1555G、C1494T突變陽性對照、臨界陽性對照和陰性對照（表1)。②武漢市婦女兒童保健中 心提供的經DNA測序確認的上述位點突變陽性和陰性的臨床患者基因組DNA對照。
[0049] 衷1.耳礱相關基閔質棹品信息
[0051 ] 所述的試劑盒還包含PCR試劑(dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶buffer等）和飽和熒 光染料(如LC GREEN)等。
[0052]上述試劑盒的使用方法，包括如下步驟：提取待測樣本DNA;配制包含待測樣本 DNA、引物對、PCR試劑和飽和熒光染料的PCR反應體系進行PCR擴增;對PCR產物進行HRM分析 掃描。該使用方法不用于疾病的診斷。
[0053] 所述的PCR反應體系優(yōu)選為：Taq buffer(10 X ) IyL，dNTPs(IOmM) IyL，Taq(2U/yL) lyL，上游引物(F)0.5yL，下游引物(R)0.5yL，LC GREEN IyUMgCl2 0.8yL，ddH20 3.2yL，DNA IyL0
[0054] 所述的 PCR 擴增條件優(yōu)選為：951€2111丨11;95°(：158,60°(：158,72°(：158,45個循環(huán) ；72 〇C 7min, 94 〇C 30s, 28 〇C 30s 〇
[0055] 所述的HRM分析掃描條件優(yōu)選為:95 °C 5s，40 °C 30s，65 °C保溫，70 °C~90 °C掃描。
[0056] 本發(fā)明基于HRM技術的耳聾相關基因突變檢測PCR試劑盒可分為檢測系統(tǒng)和質控 系統(tǒng)兩個部分。檢測系統(tǒng)包括上述5種引物對，可由其中的任意一種組合而成。質控系統(tǒng)則 包括:①陰性對照，包括2種，第1種是不含耳聾相關基因突變的正常人DNA模板;第2種是人 工合成的野生型DNA質控品。正常情況下，所有陰性對照HRM分析無突變峰，若HRM分析出現 突變峰，則表明實驗過程中存在污染。②陽性對照，包括2種，第1種是經DNA測序證實含耳聾 相關基因突變的患者DNA模板;第2種是人工合成的含有待測耳聾基因突變位點陽性的DNA 質控品；正常情況下，陽性質控品應出現突變峰、而陰性質控品不出現突變峰，可作為判斷 陽性的標準;若陽性質控品不出現突變峰則說明實驗失敗。
[0057] 本發(fā)明提供的試劑盒具有如下優(yōu)點:①針對特定基因突變的全部引物能在同一溫 度下(60°C)進行穩(wěn)定的PCR反應，獲取特異性的基因片段;②檢測靈敏度高，特異性強，可以 檢測5%拷貝數突變;③小反應體系（IOyL)，標本和試劑用量少;④采用檢測樣本為DNA，來 源豐富，可支持組織、胸水等多種來源的標本;⑤反應簡便迅速，2小時即可獲得實驗結果， 便于臨床大樣本處理;⑥試劑價格低廉，高通量。試驗表明，本發(fā)明提供的HRM方法可快速檢 測耳聾相關基因的多種常見突變（圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10)，適用于 臨床新生兒遺傳性耳聾基因篩查和優(yōu)生優(yōu)育孕前耳聾基因篩查。本發(fā)明為耳聾相關基因突 變的快速檢測提供了一種新的檢測方法，可用于臨床指導用藥、突變攜帶者的生活指導和 優(yōu)生優(yōu)育。
【附圖說明】
[0058]圖1是實施例1不同突變含量的GJB2基因176dell6bp突變質控品檢測結果圖（標準 化的溶解曲線峰），百分比表示突變含量，QCl、QC2、QC3對應的突變含量為100%、0%、5%。 [0059]圖2是實施例1不同突變含量的GJB2基因235delC突變質控品檢測結果圖（標準化 的溶解曲線峰），百分比表示突變含量，QCl、QC2、QC4對應的突變含量為100%、0%、5%。
[0060]圖3是實施例1不同突變含量的SLC26A4基因 IVS7-2A>G突變質控品檢測結果圖（標 準化的溶解曲線峰），百分比表示突變含量，QC5、QC6、QC7對應的突變含量為100 %、0 %、 5%〇
[0061 ] 圖4是實施例1不同突變含量的mtDNA 12SrRNA基因 C1494T突變質控品檢測結果圖 (標準化的溶解曲線峰），百分比表示突變含量，QC8、QC9、QC10對應的突變含量為100 %、 0%、5%〇
[0062] 圖5是實施例1不同突變含量的mtDNA 12SrRNA基因 A1555G突變質控品檢測結果圖 (標準化的溶解曲線峰），百分比表示突變含量，QC8、QC9、QC11對應的突變含量為100 %、 0%、5%〇
[0063]圖6是實施例2臨床標本GJB2基因176dell6bp突變檢測結果圖，百分比表示突變含 量。
[0064]圖7是實施例2臨床標本GJB2基因235delC突變檢測結果圖，百分比表示突變含量。 [0065] 圖8是實施例2臨床標本SLC26A4基因 IVS7-2A>G突變檢測結果圖。
[0066] 圖9是實施例2臨床標本mtDNA 12SrRNA基因 C1494T突變檢測結果圖。
[0067] 圖10是實施例2臨床標本mtDNA 12SrRNA基因 A1555G突變檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0068]下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不 背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本 發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手 段。
[0069] 實施例1人工合成DNA質控品的耳聾相關基因突變檢測 [0070] (1)稀釋DNA質控品
[0071] DNA質控品為上海生工生物工程股份有限公司合成的耳聾相關基因5個突變位點 不同突變含量的DNA。采用無菌雙蒸水將DNA質控品稀釋至0. lng/yL。
[0072] (2)引物序列及檢測的突變位點如列表2所示。
[0073]表2.引物序列及檢測位點的信息
[0076] 采用表2中5對引物進行PCR反應，擴增得到目的DNA13PCR反應液包括10 Xbuffer (Biostar)、10ymol/L的上下游引物、10mmol/L dNTPs(羅氏公司）、2U Taq DNA聚合酶 (Biostar)、LC GREEN( IdahoTechnologyInc，USA)和無菌水。
[0077] IOyL的PCR反應體系：Taq buffer(10 X ) IyL，dNTPs(IOmM) IyL，Taq(2U/yL) IyL，上 游引物〇.5yL，下游引物0.5yL，LC GREEN IyUMgCl2 〇.8yL，ddH2〇 3.2yL，DNA lyL。其中DNA 為上海生工生物工程股份有限公司合成的耳聾相關基因5個突變位點不同突變含量的質控 品。
[0078] (3)加樣完成后，將反應管直接置于 LightScanner_32( IdahoTechnologyInc，USA) 儀器中進行反應。
[0079] 具體擴增條件為：951€2111丨11;95°(：158,60°(：158,72°(：158,45個循環(huán) ；721€7111丨11，94 〇C 30s, 28 〇C 30s 〇
[0080] 具體HRM分析掃描條件為:95 °C 5s，40 °C 30s，65 °C保溫，70 °C~90 °C掃描。
[0081] (4)結果判讀
[0082] 按照上述步驟（1)~（3)，分別對耳聾相關基因的5個突變位點進行檢測。結果表 明，陰性對照均為單一峰，即未分型；陽性對照均顯示為雜合雙峰或寬峰，即分型成功;針對 每個突變位點進行檢測時，僅存在突變的標本才會出現相應的雜合雙峰或寬峰。圖1-5為耳 聾相關基因5個突變位點不同突變含量質控品的檢測結果圖，突變型DNA解鏈溫度較低，突 變峰位于左側，而且突變含量越高突變峰越高。
[0083] 實施例2臨床標本的檢測 [0084] (1)提取患者外周血DNA模板
[0085] ①取抗凝血200yL，②使用TIANamp Genomic DNA Kit(中國TIANGEN公司）提取全 血標本DNA，按照說明書操作。
[0086] (2)按照實施例1的方法，對30例臨床耳聾患者標本(武漢市婦女兒童保健中心，湖 北武漢）以及上海生工生物工程股份有限公司合成的質控品進行耳聾基因突變雙盲檢測， 結果見圖6-10和表3-7。檢測結果與臨床報告結果(測序法)具有良好的一致性。
[0087] 表3.GJB2基因編碼區(qū)176dell6bp突變臨床標本檢測結果比較


[0099] 因此，實施例2結果表明本發(fā)明建立的HRM方法檢測耳聾基因突變的結果與金標準 測序方法具有良好的一致性。
[0100] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種基于HRM技術的耳聾相關基因突變檢測PCR試劑盒，其特征在于:包含引物對A、 B、C、D和/或E; 其中，引物對A用于檢測GJB2基因編碼區(qū)第176位點16bp缺失突變，其為以下三對序列 中的一對： A_F1:CAGGCCGACTTTGTCTG， A_R1:GGAGATGGGGAAGTAGTGAT;或 A_F2:TGAGCAGGCCGACTTTG， A_R2:GAGATGGGGAAGTAGTGATCGTA;或 A_F3：CGACTTTGTCTGCAACACC, A_R3：CCGGATGTGGGAGATGG； 弓丨物對B用于檢測GJB2基因編碼區(qū)第235位點C堿基缺失突變，其為以下三對序列中的 一對： B_F1:CCACATCCGGCTATGGGCC， B_R1:GTGCATGGCCACTAGGAG;或 B_F2:CTCCCACATCCGGCTATGGGC， B_R2:CATGGCCACTAGGAGCGC;或 B_F3:CTCCCACATCCGGCTATGGGC， B_R3：CACTAGGAGCGCTGGCG； 引物對C用于檢測SLC26A4基因 I VS7-2A>G位點突變，其為以下三對序列中的一對： C_F1:ACAAGGAATTATTAAAACCAATGGAG， C_R1:ATGGCAGTAGCAATTATCGT;或 C_F2：AACCAATGGAGTTTTTAACATCTTT, C_R2:TATGAAATGGCAGTAGCAATTATCG;或 C_F3：AACCAATGGAGTTTTTAACATCTTT, C_R3：TTGGCTCCATATGAAATGGCA； 引物對D用于檢測mtDNA 12 SrRNA基因 C1494T突變，其為以下三對序列中的一對： D_F1:GTACACACCGCCCGTCA， D_R1:ATAAATGCGTAGGGGTTTTAGT;或 D_F2：GTACACACCGCCCGTCA, D_R2:GGGTTTTAGTTAAATGTCCTTTGAAG;或 D_F3：GTACACACCGCCCGTCA, D_R3：CGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCC； 引物對E用于檢測mtDNA 12SrRNA基因 A1555G突變，其為以下三對序列中的一對： E_F1:CATTTAACTAAAACCCCTACGCA， E_R1:TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGA;或 E_F2:ACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACC， E_R2:ACACTTACCATGTTACGACTTG;或 E_F3:ACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACC， E_R3:TTTCCAGTACACTTACCATGTTACGA。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:包括陰性對照、陽性對照；陰性對照為不 含耳聾相關基因突變的正常人DNA或人工合成的野生型DNA，陽性對照為含有相應突變位點 的耳聾患者DNA或人工合成的突變型DNA。3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:包括臨界陽性對照，臨界陽性對照包括： 5%拷貝數突變的GJB2基因176dell6bp突變、235delC突變的DNA，5%拷貝數突變的SLC26A4 基因 IVS7-2A>G突變的DNA，5%拷貝數突變的mtDNA 12SrRNA基因 C1494T突變、A1555G突變 的 DNA。4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:包含PCR試劑和飽和熒光染料。5. 權利要求1-4任一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟:提取待測 樣本DNA;配制包含待測樣本DNA、引物對、PCR試劑和飽和熒光染料的PCR反應體系進行PCR 擴增;對PCR產物進行HRM分析掃描;該使用方法不用于疾病的診斷。6. 根據權利要求5所述的使用方法，其特征在于:所述的PCR反應體系為:Taq buffer 1 yL，dNTPs lyL，Taq lyL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，LC GREEN lyL，MgCl2 0.8yL， ddH20 3.2yL,DNA lyL〇7. 根據權利要求5所述的使用方法，其特征在于:所述的PCR擴增條件為:95 °C 2min; 95 。(：158,60。(：158,72。(：158,45個循環(huán)；721€711^11，94 1€3〇8,281€3〇8。8. 根據權利要求5所述的使用方法，其特征在于:所述的HRM分析掃描條件為:95°C5s， 40 °C 30s，65 °C 保溫，70 °C ~90 °C 掃描。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086186SQ201610459975
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】劉松梅, 袁二鳳, 黃景濤
【申請人】武漢大學